Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинантного антитела и гуманизированного моноклонального антитела Российский патент 2022 года по МПК C07K16/10 A61K39/395 A61K39/215 A61P31/14 

Область техники

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии ивирусологии и касается средства и способа терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызванных различными штаммами вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2.

Предшествующий уровень техники.

31 декабря 2019 года во Всемирную организацию здравоохранения (ВОЗ) поступила информация о вспышке пневмонии неизвестной этиологии в городе Ухань (Китайская Народная Республика). Возбудителем заболевания оказался одноцепочечный РНК-содержащий вирус SARS-CoV-2, относящийся к семейству Coronaviridae, к линии Beta-CoV B.

Коронавирус SARS-CoV-2 может передаваться воздушно-капельным, воздушно-пылевым, контактным, фекально-оральным способами, а также через контаминированные предметы и поверхности (фомиты), через кровь, от матери ребенку и от животных к человеку (Механизмы передачи вируса SARS-CoV-2 и их значение для выбора мер профилактики, Резюме научных исследований, 9 июля 2020 г. ВОЗ). За несколько месяцев вирус распространился по всему миру, и в январе 2020 года ВОЗ объявила эпидемию, связанную с SARS-CoV-2, чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения международного значения, а в марте 2020 года охарактеризовала распространение болезни как пандемию.

Заболевание, которое вызывает SARS-CoV-2 получило собственное название COVID-19. Это потенциально тяжёлая острая респираторная инфекция, которая может протекать как в легкой, так и в тяжелой форме, и сопровождаться такими осложнениями, как пневмония, острый респираторный дистресс-синдром, острая дыхательная недостаточность, острая сердечная недостаточность, острая почечная недостаточность, септический шок, кардиомиопатии, и др. В настоящее время число заболевших COVID-19 более 185 млн человек, а погибших- более 4 млн человек и эти числа продолжают расти. Очевидно, что во всем мире в настоящее время есть острая необходимость в разработке безопасных и эффективных средств профилактики и лечения.

Кроме того, с конца 2020 года начали появляться новые варианты вируса SARS-CoV-2, содержащие точечные аминокислотные замены, позволяющие приобретать частичную или полную резистентность к иммунному ответу, выработанному на исходный вариант вируса. Один из таких новых вариантов В.1. 617.2 Delta, впервые изолированный в Индии, способен индуцировать образование клеточного синцития, что дополнительно помогает уходит от вирус-нейтрализующих антител.

Одним из перспективных подходов к терапии коронавирусной инфекции является применение антител против определенных антигенных детерминант вируса. Это обусловлено двумя основными причинами: высокой специфичностью антител и технологичностью их промышленного производства. (В.С. Смирнов, Арег А. Тотолян. Некоторые возможности иммунотерапии при коронавирусной инфекции. Инфекция и иммунитет 2020, Т. 10, № 3, с. 446–458).

В настоящее время в мире проводится более 50 клинических исследований, связанных с моноклональными антителами (Deb P, Molla MMA, Saif-Ur-Rahman KM. An update to monoclonal antibody as therapeutic option against COVID-19. Biosaf Health. 2021 Apr;3(2):87-91. doi: 10.1016/j.bsheal.2021.02.001. Epub 2021 Feb 10. PMID: 33585808; PMCID: PMC7872849). (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2590053621000197#s0005).

В настоящий момент разрешено к экстренному использованию два препарата на основе моноклональных антител. 21 ноября 2020 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) выдало разрешение на экстренное использование (EUA) препарата REGEN-COV (Regeneron Pharmaceuticals), для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени у людей в возрасте от двенадцати лет и старше с массой тела не менее 40 кг (88 фунтов) с положительными результатами прямого тестирования на вирус SARS-CoV-2 и которые имеют высокий риск развития тяжелой формы COVID-19. Сюда входят лица в возрасте 65 лет и старше или лица, страдающие определенными хроническими заболеваниями. REGEN-COV состоит из двух моноклональных антител: казиривимаба (REGN10933) и имдевимаба (REGN10987), которые связываются с неперекрывающимися эпитопами S белка SARS-CoV-2. Результаты клинических исследований данного препарата показали, что он способен снижать вирусную нагрузку, с большим эффектом у пациентов, у которых иммунный ответ еще не был инициирован или у которых исходно была высокая вирусная нагрузка (Weinreich DM, Sivapalasingam S, Norton T, Ali S, Gao H, Bhore R, Musser BJ, Soo Y, Rofail D, Im J, Perry C, Pan C, Hosain R, Mahmood A, Davis JD, Turner KC, Hooper AT, Hamilton JD, Baum A, Kyratsous CA, Kim Y, Cook A, Kampman W, Kohli A, Sachdeva Y, Graber X, Kowal B, DiCioccio T, Stahl N, Lipsich L, Braunstein N, Herman G, Yancopoulos GD; Trial Investigators. REGN-COV2, a Neutralizing Antibody Cocktail, in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):238-251. doi: 10.1056/NEJMoa2035002. Epub 2020 Dec 17. PMID: 33332778; PMCID: PMC7781102).

Другой препарат на основе моноклонального антитела - бамланивимаб (LY-CoV555,

разработчик: Eli Lilly) получил разрешение FDA на экстренное применение для лечения COVID-19 от легкой до умеренной степени тяжести у негоспитализированных взрослых и детей. Однако результаты клинических исследований неоднозначны. Среди госпитализированных пациентов с COVID-19 одновременное применение бамланивимаба с ремдесивиром не было эффективно. (ACTIV-3/TICO LY-CoV555 Study Group, Lundgren JD, Grund B, Barkauskas CE, Holland TL, Gottlieb RL, Sandkovsky U, Brown SM, Knowlton KU, Self WH, Files DC, Jain MK, Benfield T, Bowdish ME, Leshnower BG, Baker JV, Jensen JU, Gardner EM, Ginde AA, Harris ES, Johansen IS, Markowitz N, Matthay MA, Østergaard L, Chang CC, Davey VJ, Goodman A, Higgs ES, Murray DD, Murray TA, Paredes R, Parmar MKB, Phillips AN, Reilly C, Sharma S, Dewar RL, Teitelbaum M, Wentworth D, Cao H, Klekotka P, Babiker AG, Gelijns AC, Kan VL, Polizzotto MN, Thompson BT, Lane HC, Neaton JD. A Neutralizing Monoclonal Antibody for Hospitalized Patients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Mar 11;384(10):905-914. doi: 10.1056/NEJMoa2033130. Epub 2020 Dec 22. PMID: 33356051; PMCID: PMC7781100). Клинические исследования на амбулаторных пациентах показали, что только одна из трех доз исследуемого препарата (2800 мг LY-CoV555) достоверно ускоряла естественное снижение вирусной нагрузки. (Chen P, Nirula A, Heller B, Gottlieb RL, Boscia J, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Shen L, Durante M, Oakley G, Schade AE, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Skovronsky DM; BLAZE-1 Investigators. SARS-CoV-2 Neutralizing Antibody LY-CoV555 in Outpatients with Covid-19. N Engl J Med. 2021 Jan 21;384(3):229-237. doi:10.1056/NEJMoa2029849. Epub 2020 Oct 28. PMID: 33113295; PMCID: PMC7646625).

Наилучший эффект наблюдался при комбинированной терапии двумя моноклональными антителами: бамланивимаб и этесевимаб. (Gottlieb RL, Nirula A, Chen P, Boscia J, Heller B, Morris J, Huhn G, Cardona J, Mocherla B, Stosor V, Shawa I, Kumar P, Adams AC, Van Naarden J, Custer KL, Durante M, Oakley G, Schade AE, Holzer TR, Ebert PJ, Higgs RE, Kallewaard NL, Sabo J, Patel DR, Klekotka P, Shen L, Skovronsky DM. Effect of Bamlanivimab as Monotherapy or in Combination With Etesevimab on Viral Load in Patients With Mild to Moderate COVID-19: A Randomized Clinical Trial. JAMA. 2021 Feb 16;325(7):632-644. doi: 10.1001/jama.2021.0202. PMID: 33475701; PMCID: PMC7821080).

Кроме того, перспективным направлением для терапии и экстренной профилактики инфекционных заболеваний является использование однодоменных антител (наноантител), которые в природе можно найти у представителей семейства верблюдовые. Благодаря относительно небольшому размеру однодоменные антитела обладают благоприятными биофизическими свойствами и дешевле в производстве, чем стандартные моноклональные антитела. Они могут быть получены с использованием прокариотических или эукариотических систем экспрессии. Их небольшой размер, а также длинные, определяющие комплементарность участки тяжелой цепи позволяют им нацеливаться на вогнутые эпитопы. Кроме того, наноантитела можно распылять и доставлять прямо в легкие пациента с Covid-19 с помощью ингалятора, что представляет собой лучшую альтернативу внутривенно вводимым классическим антителам (Ram Sasisekharan. Preparing for the Future — Nanobodies for Covid-19? April 22, 2021 N Engl J Med 2021; 384:1568-1571 DOI: 10.1056/NEJMcibr2101205)

В настоящее время нет препаратов на основе однодоменных антител, разрешенных к применению для лечения COVID-19.

Известно решение (CN112500480A, опуб. 16.03.2021), в котором разработаны варианты однодоменного антитела против вируса SARS-CoV-2, соответствующий вектор экспрессии, а также линия клеток, способная экспрессировать вышеуказанные варианты однодоменного антитела, и способ получения вариантов данного антитела.

Известно решение (CN111825762A, опуб. 27.12.2020), в котором разработано несколько вариантов наноантитела к домену RBD S белка вируса SARS-COV-2, а также способ применения вариантов наноантитела для приготовления лекарственных средств для ингибирования вирусной инфекции SARS-COV-2 и приготовлении реагентов или наборов для тестирования вируса SARS-COV-2.

В патенте (CN112094342A, опуб. 18.12.2020) представлено биэпитопное специфическое антитело, происходящее из альпака, или его антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с доменом RBD SARS-CoV-2 с высоким сродством, что может использоваться для профилактики, лечения и / или диагностики инфекции SARS-CoV-2.

Известно решение (CN112062839A, опуб. 11.12.2020), в котором описано создание наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.

Также известно решение (CN112062840A, опуб. 11.12.2020) предусматривающее разработку наноантитела к S белку SARS-CoV-2, а также способ его использования для приготовления реагента для лечения и / или диагностики инфекции, вызванной коронавирусом SARS-CoV-2.

В патенте (CN111303279A, опуб. 19.06.2020) описано создание гуманизированного однодоменного антитела против коронавируса SARS-CoV-2, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей однодоменное антитело, а также создание кассеты экспрессии, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток, содержащей вышеописанную молекулу нуклеиновой кислоты. Кроме того, разработан способ применения однодоменного антитела или созданной молекулы нуклеиновой кислоты или созданной экспрессионной кассеты, рекомбинантного вектора, рекомбинантной бактерии или линии трансгенных клеток при производстве продукта, который может применяться для предотвращения и / или лечение заболеваний, вызванных инфицированием новым коронавирусом SARS-CoV-2; а также для подавления заражения новым коронавирусом SARS-CoV-2. При этом продукт может: связываться с новым коронавирусом SARS-CoV-2; обнаруживать связывание нового коронавируса SARS-CoV-2; связываться с белком S нового коронавируса SARS-CoV-2; обнаруживать белок S нового коронавируса SARS-CoV-2. Также разработана фармацевтическая композиция, содержащая созданное однодоменное антитело и фармацевтически приемлемый наполнитель, разбавитель или носитель.

Данное решение, как наиболее близкое к заявляемому, было выбрано авторами патента за прототип. Однако, недостатком прототипа является отсутствие данных по возможности применения полученных антител для терапии заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 вариантов Alpha, Beta, Gamma,Delta(вариантов, вызывающих опасение)кроме того, однодоменные антитела быстро выводятся из организма в следствии низкой молекулярной массы и, таким образом, требуют многократного введения.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в создании препарата для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызываемого вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2, лишенного указанного недостатка.

Раскрытие сущности изобретения

Технической задачей заявленной группы изобретений является расширение арсенала средств для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2.

Технический результат заключается в создании эффективного средства, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасение (Alpha, Beta, Gamma,Delta).

Указанная технический задача решается тем, что получено средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, а также Fc-фрагмент человеческого IgG1 (компонент 1 - GamP2C5) и гуманизированное моноклональное антитело, имеющее CDR1 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:6, CDR1 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:9 (компонент 2 - GamXRH19).

При этом рекомбинантное антитело может иметь аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

Также гуманизированное моноклональное антитело может иметь последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:11 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO:12.

В то же время техническая задача решается тем, что создан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся системном введении эффективного количества созданного средства.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена электрофореграмма анализа рекомбинантного антитела GamP2C5 в денатурирующих условиях.

1 – маркер молекулярного веса

2 – образец рекомбинантного антитела GamP2C5

На фиг. 2 представлена электрофореграмма анализа рекомбинантного антитела GamP2C5 в неденатурирующих условиях.

1 – маркер молекулярного веса

2 – образец рекомбинантного антитела GamP2C5

На фиг. 3представлено схематическое изображение аминокислотной последовательности GamP2C5

1 – глицин-сериновый линкер;

2 –последовательность однодоменного антитела;

2 - шарнирный регион;

3 - Fc-фрагмент IgG1 человека.

На фиг. 4 представлена электрофореграмма анализа гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19.

1 – образец гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в денатурированных условиях;

2 – маркер молекулярного веса;

3 – образец гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в неденатурированных условиях;

На фиг. 5 представлено схематическое изображение гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19.

На фиг. 6 представлены результаты анализа специфической активности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в непрямом ИФА.

Ось ординат – оптические единицы, ОД450нм

Ось абсцисс – концентрация антитела GamXRH19, мкг/мл

- уровень сигнала антитела GamXRH19 на бычий сывороточный альбумин (отрицательный контроль);

- уровень сигнала антитела GamXRH19 на RBD;

На фиг. 7 представлена хроматограмма ВЭЖХ пробы рекомбинантного антитела GamP2C5 в буфере №2.

Ось ординат – единицы оптической плотности 280нм, mAu

Ось абсцисс – время удерживания пиков, мин

На фиг. 8 представлена хроматограмма ВЭЖХ пробы рекомбинантного антитела GamXRH19 в буфере №2.

Ось ординат – единицы оптической плотности 280нм, mAu

Ось абсцисс – время удерживания пиков, мин

На фиг. 9представлены результаты выживаемости животных, которым вводили рекомбинантное антитело GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (компонент 2), и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 вариант Delta.

Ось ординат – выживаемость, %

Ось абсцисс – время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни

- мыши, смесь компонента 1 и 2 (10 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, смесь компонента 1 и 2 (10 мг/мл) спустя 6 часов после заражения вирусом;

- мыши, смесь компонента 1 и 2 (20 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, смесь компонента 1 и 2 (20 мг/мл) спустя 6 часов после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS);

На фиг. 10представлены результаты выживаемости животных, которым вводили рекомбинантное антитело GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированное моноклональное антитело XRH19 (компонент 2), и животных из группы плацебо в течение 15 суток после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020.

Ось ординат – выживаемость, %

Ось абсцисс – время после заражения животных вирусом SARS-CoV-2, дни

- мыши, получившие смесь компонента 1 и 2 (10 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие смесь компонента 1 и 2 (20 мг/мл) спустя 1 час после заражения вирусом;

- мыши, получившие фосфатно-солевой буфер (PBS);

Реализация изобретения.

Технической задачей заявленной группы изобретений является создание препарата для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе моноклональных и однодоменных антител и их модификаций. Моноклональные и однодоменные антитела, обладающие высокой специфичностью к RBDS-белка вируса SARS-CoV-2 и обладающие вирус-нейтрализующей активностью, рассматриваются в качестве перспективных средств для терапиии экстренной профилактики COVID 19. Вместе с тем, моноклональные и однодоменные антитела, как средства для терапии COVID 19 имеют как преимущества, так и недостатки. Однодоменные антитела способны взаимодействовать с трудно доступными эпитопами антигенов за счет длинных антиген-связывающих участков (CDR), однако быстро выводятся из организма за счет низкой молекулярной массы, а также лишены Fc-зависимых функций. Однако упомянутые недостатки могут быть эффективно нивелированы за счет присоединения к однодоменным антителам Fc-фрагмента IgG человека и получения, таким образом, рекомбинантного антитела.

Для этого разработано средство на основе рекомбинантного антитела (GamP2C5) и гуманизированного моноклонального антитела (GamXRH19),специфически связывающихся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2.

Для получения рекомбинантного антитела GamP2C5 осуществляли иммунизацию альпака рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови животного. Далее у животных выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, из которых получали РНК. На основе РНК синтезировали кДНК. На матрице, полученной кДНК ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Таким образом, была получена библиотека ампликонов последовательностей однодоменных антител.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только мононуклеарных клеток, а также цельной крови, лимфатических узлов, селезенки, тимуса или других клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих однодоменные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей однодоменных антител.

Селекцию антител проводили методом фагового дисплея с использованием паннинга на антигене (RBD). Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование других подходов селекции, таких как паннинг на вирусных частицах, паннинг в растворе биотинилированного антигена, паннинг с использованием конкурентного связывания и элюции. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование других методов селекции, таких как рибосомный дисплей, дрожжевой дисплей. В результате селекции было отобрано однодоменное антитело, специфически связывающиеся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2. В последующих экспериментах было показано, что данное антитело обладает вируснейтрализующей активностью.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности однодоменных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре однодоменных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие петли (CDR домены) однодоменных антител, то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов могут быть использованы в целях осуществления данного изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями, могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.

Рекомбинантное антитело GamP2C5, представляющее собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека, специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью, имеющее аминокислотную последовательность SEQIDNO:10. Данное антитело было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности рекомбинантного антитела в клетках-продуцентах СНО.

Нуклеотидные последовательности рекомбинантного антитела GamP2C5 были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности однодоменного антитела и нуклеотидной последовательности Fc-фрагмента иммуноглобулина G1 человека. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая рекомбинантное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность рекомбинантного антитела (SEQIDNO:10) могут ь быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, экспрессирующая рекомбинантное антитело GamP2C5 (SEQIDNO:10). Таким образом, была получена: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая рекомбинантное антитело GamP2C5. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии.

Кроме того, была разработана технологическая схема культивирования клетки-продуцента рекомбинантного антитела GamP2C5 в волновых биореакторах объемом 200л. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для культивирования клетки-продуцента можно использовать биореакторы любого другого типа и объема. Таким образом, все технологические схемы культивирования клетки-продуцента рекомбинантного антитела GamP2C5 могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.

Также, разработана технологическая схема хроматографической очистки рекомбинантного антитела GamP2C5 с использованием аффинной хроматографии на протеине А, анионообменной хроматографии и мультимодальной хроматографии. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения для очистки антител могут использоваться различные технологические схемы с применением различных сорбентов. Таким образом, все технологические схемы очистки рекомбинантного антитела GamP2C5 могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.

Для получения гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 осуществляли иммунизацию мышей линии Balb/c рекомбинантным RBD вируса SARS-CoV-2, полученным в клеточной линии СНО и очищенным металл-аффинной и эксклюзионной хроматографией. Эффективность иммунизации подтверждали оценкой титра специфических к RBD антител в сыворотке крови мышей. Далее у мышей выделяли спленоциты, которые затем сливали с линией мышиной миеломы Sp2/0-Ag-14, получая таким образом, гибридомы. Селекцию гибридом проводили на питательной среде RPMI-1640 («Sigma», США) с добавлением HAT Media Supplement (Hybri-Max®, «Sigma», США). Отбор клонов, продуцирующих антитела специфичные к RBD, осуществляли методом твердофазного ИФА.

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения, возможно использование не только спленоцитов, а также цельной крови, лимфатических узлов клеток и органов иммунизированного животного, экспрессирующих моноклональные антитела. Также специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения возможно использование синтетических библиотек последовательностей моноклональных антител.

В результате селекции и отбора клонов, был отобран клон гибридомы, продуцирующий мышиное моноклональное антитело XR19, специфичное к RBD и обладающее выраженной вирус-нейтрализующей и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта Delta. Далее участки генома отобранного клона гибридомы, кодирующие антиген-связывающие участки (CDR домены) антитела XR19 были сиквенированы и использованы для создания гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19. Таким образом, были получены нуклеотидные последовательности кодирующие гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQIDNO:11 тяжелая цепь и SEQIDNO:12 легкая цепь).

Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения последовательности моноклональных антител, специфических к RBD вируса SARS-CoV-2, могут содержать в себе аминокислотные замены, которые не сказываются на вторичной и третичной структуре моноклональных антител и не влияют на их способность связывать и нейтрализовать RBD вируса SARS-CoV-2. Более того, поскольку в связывании с антигеном участвуют только антигенсвязывающие участки (CDR домены) то, как известно специалистам в данной области, любой иммуноглобулин или его аналог, содержащий такие же аминокислотные последовательности CDR доменов может быть использован в целях осуществления заявленного изобретения. Более того, последовательности CDR доменов могут содержать замены/делеции/вставки аминокислот, которые при парном выравнивании аминокислотных последовательностей обеспечивают гомологичность не менее 70% и не оказывают качественного влияния на способность связываться с антигеном. Таким образом, все иммуноглобулины или их аналоги, содержащие последовательности CDR доменов, гомология которых составляет не менее 70% с предлагаемыми последовательностями могут быть использованы в целях осуществления заявленного изобретения.

Гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (изотип IgG1 человека), специфически связывающееся с RBD доменом S белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей и протективной активностью, было получено путем экспрессии нуклеотидной последовательности тяжелой и легкой цепи в клетках-продуцентах СНО.

Нуклеотидные последовательности тяжелой и легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 были созданы генно-инженерным путем на основе нуклеотидной последовательности иммуноглобулина G1 человека и нуклеотидных последовательностей антиген-связывающих участков антитела XR19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения нуклеотидная последовательность, кодирующая гуманизированное моноклональное антитело, может отличаться, основываясь на принципе вырожденности генетического кода. Таким образом, все последовательности нуклеотидов, кодирующие аминокислотную последовательность гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQIDNO:11 тяжелая цепь и SEQIDNO:12 легкая цепь), могут быть использованы в целях осуществления настоящего изобретения.

С помощью методов генной инженерии была получена клетка-продуцент, экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 (SEQIDNO:11тяжелая цепь и SEQIDNO:12 легкая цепь). Таким образом, была получена: клетка-продуцент на основе клеточной линии СНО, экспрессирующая гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19. Специалистам в данной области известно, что в целях осуществления настоящего изобретения в качестве продуцента можно использовать другие эукариотические системы экспрессии.

Изучена фармакокинетика однодоменных антител и их модификаций. Продемонстрировано что модификация однодоменных антител и их олигомеров Fc-фрагментом IgG1 человека, позволяет увеличить время их циркуляции в организме с нескольких часов до нескольких недель.

Таким образом, авторами заявленного изобретения были получены варианты антител, специфически связывающееся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, обладающее вируснейтрализующей активностью и обладающие улучшенной фармакокинетикой по сравнению с однодоменными антителами.

Кроме того, была разработана оптимальная формуляция средства антитела GamP2C5 (компонент 1) и антитела GamXRH19 (компонент 2), обеспечивающая наибольшую стабильность.

Таким образом, авторами патента было получено средство на основе антител, специфически связывающихся с RBDS белка вируса SARS-CoV-2, предназначенного для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19.

Кроме того, авторами заявленного изобретения разработан способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся во введении в организм млекопитающих в эффективном количестве любого из разработанных вариантов антител.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Получение иммуногена - рецептор-связывающего домена (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2.

На первом этапе работы был получен иммуноген - рецептор-связывающий домен (RBD) S белка вируса SARS-CoV-2. Для этого аминокислотную последовательность рецептор-связывающего домена (RBD) поверхностного Spike-белка вируса SARS-CoV-2 (а.о. 319 - 541, UniProtKB: locus SPIKE_SARS2, accession P0DTC2) модифицировали c N-конца сигнальным пептидом щелочной фосфатазы SEAP (MLLLLLLLGLRLQLSLGI) и с С-конца последовательностью глицин-серинового линкера и гистидиновой метки (GSHHHHHHHHH). На основе аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность, которая была синтезирована ЗАО «Евроген». После этого нуклеотидную последовательность полученного полипептида клонировали в плазмиду для транзиентной экспрессии в клетках млекопитающих. Далее, культуру клеток CHO тарифицировали полученной плазмидой с помощью набора CHO Gro (Mirus Bio, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. По истечении этого срока культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Рецептор-связывающий домен (RBD) очищали металл-аффинной хроматографией на системе AKTA start («GE Healthcare Life Sciences», США), используя колонки HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера на 20 мМ фосфат натрия, 500 мМ натрия хлорид (рН=7,2) проводили на колонке ХК 26/100 («GE Healthcare Life Sciences», США), упакованной сорбентом Superdex 200 pg («GE Healthcare Life Sciences», США). Таким образом, в результате проведенной работы был получен очищенный рекомбинантный RBDS белка вируса SARS-CoV-2.

Пример 2. Получение рекомбинантного антитела GamP2C5

Альпака (Lama pacos - представитель семейства Cameliedae) иммунизировали полученным RBD (100мкг на иммунизацию) 5 раз с промежутками в 10-14 дней. Через 7 дней после последней иммунизации у альпака отбирали 50,0 мл периферической крови и выделяли мононуклеарные клетки на градиенте фиколла 1,077 (Панэко, Россия). Изолированные мононуклеарные клетки использовали для выделения тотальной РНК реагентом Trizol (Invitrogene, США) согласно протоколу фирмы-производителя. Выделенную РНК использовали в качестве матрицы для синтеза кДНК со случайными праймерами и ревертазой SuperScriptIII (Invitrogene, США). На матрице, полученной кДНК, ставили гнездовую ПЦР, позволяющую амплифицировать последовательности однодоменных антител. Для этой процедуры использовали высокоточную полимеразу Q5 (NEB, Великобритания) и специфические праймеры, содержащие на концах сайты рестрикции. Далее, ампликоны гидролизовали рестриктазами и клонировали в фагмидный вектор, гидролизованный по тем же сайтам. Затем, клетки E.coli (штамм TG1), трансформировали фагмидными векторами, полученными в результате клонирования.

Суспензию бактериальных клонов-трансформантов клеток E.coli (штамм TG1) использовали для продукции рекомбинантных бактериофагов с использованием бактериофага-помощника M13KO7 (NEB, Великобритания) согласно протоколу фирмы-производителя. Рекомбинантные бактериофаги осаждали путем преципитации полиэтиленгликолем (PEG/NaCl). Таким образом, получена библиотека рекомбинантных бактерифагов с титром 10¹² трансдуцирующих единиц/мл суспензии.

Селекцию специфических рекомбинантных бактериофагов осуществляли путем паннинга на антигене исходной библиотеки бактериофагов. Для этого рекомбинантный RBD (пример 1) иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем добавляли суспензию 10¹¹ рекомбинантных бактерифагов и инкубировали 1 час при комнатной температуре. Не связавшиеся бактерифаги отмывали коллоидным 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Связавшиеся бактериофаги элюировали при помощи раствора трипсина (0,1 мг/мл). Элюированные бактериофаги использовали для трансдукции клеток E.coli TG1, которые затем высевали на агаризованные чашки в разведении, позволяющем изолировать индивидуальные колонии. Полученные колонии использовали для наращивания бактериальной массы и выделения плазмидной ДНК. Плазмиды секвенировали для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих однодоменные антитела. Было определено 8 индивидуальных последовательностей.

Для продукции однодоменных антител к интенсивно делящимся клеткам E.coli TG1, полученных из колоний на предыдущем этапе, добавляли 1,0 мкМ изопропил тиогалактопиранозид (IPTG) (Хеликон, Россия), спустя 4 часа бактериальную массу использовали для выделения рекомбинантных белков на колонке HisTrap FF 5 мл («GE Healthcare Life Sciences», США) с использованием хроматографической системы AKTA start («GE Healthcare Life Sciences», США), согласно протоколу фирмы-производителя.

Очищенные однодоменные антитела, далее изучали в реакции вирус-нейтрализации. Реакцию нейтрализации вируса SARS-CoV-2 ставили в варианте постоянная доза вируса – разведения образца однодоменных антител. Готовили образцы однодоменных антител в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой, далее смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2, инкубировали 1 час при 37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Исходные концентрации препаратов однодоменных антител составляла 0,5-1 мг/мл. Конечные разведения однодоменных антител составили 1/20-1/1280. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр однодоменных антител принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х.

Данные по вируснейтрализующей активности выбранных антител представлены в таблице 1.

Таблица 1. Вируснейтрализующая активность полученных однодоменных антител.

Название образца антитела Вируснейтрализующая активность, нг/мл Однодоменное антитело p2g1 332 Однодоменное антитело p2c5 664 Однодоменное антитело p5f8 295 Однодоменное антитело p2h1 8300 Однодоменное антитело p2h2 12500 Однодоменное антитело p3d3 4300 Однодоменное антитело p2d1 9310 Однодоменное антитело p2d5 1900

Как видно из представленных данных, все 8 образцов обладали выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от 1 до 12,5 мкг/мл), из которых 3 образца обладали наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью (рабочая концентрация от менее 1 мкг/мл). Три образца однодоменных антител, обладающих наиболее выраженной вируснейтрализующей активностью, были выбраны для дальнейших исследований.

Константы взаимодействия (KD) однодоменных антител p2c5, p5f8 и p2g1 определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBD ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученных однодоменных антител. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). Полученные данные представлены в таблице 2

Таблица. 2. Константа равновесной диссоциации полученных однодоменных антител с рекомбинантным RBD.

Название образца антитела Константа равновесной диссоциации Однодоменное антитело p2g1 8,2*10е^-9 М Однодоменное антитело p2c5 2,8*10е^-9 М Однодоменное антитело p5f8 3,5*10е^-9 М

Далее, основываясь на данных вирус-нейтрализации и констант равновесных диссоциаций, клон р2с5 был взят в дальнейшую работу для получения рекомбинантного антитела GamP2C5.рекомбинантное антитело представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина человека. Данная модификация однодоменных антител позволит улучшить их фармакокинетические свойства за счет добавления Fc-фрагмента IgG1 человека и его правильного гликозилирования в эукариотических клетках-продуцентах. Кроме того, модификация Fc-фрагментом позволит антителам активировать систему комплимента и связываться с Fc-рецепторами на поверхности иммунокомпитентных клеток.

На первом этапе работы разработали дизайн аминокислотной последовательности рекомбинантного антитела (SEQIDNO:10) которое представляет собой однодоменное антитело, модифицированное Fc-фрагментом иммуноглобулина G1 человека. На основе аминокислотной последовательности были получены нуклеотидные последовательности рекомбинантных антител, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHOGro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученного препарата рекомбинантного антитела GamP2C5, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях (фиг. 2 и фиг. 1). Схематичное изображение рекомбинантного антитела GamP2C5 представлено на фиг. 3.

Далее, при помощи, анализа литературных данных и методов биоинформатики в последовательности рекомбинантного антитела GamP2C5 были идентифицированы последовательности CDR1-CDR3.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено рекомбинантного антитела GamP2C5, имеющее аминокислотную последовательность SEQIDNO:10, а также идентифицированы последовательности CDR1, CDR2, CDR3, имеющие аминокислотные последовательности SEQIDNO:1, SEQIDNO:2 и SEQIDNO:3 соответственно.

Пример 3. Получение гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19.

Мышей линии BALB/c (10 самок 5–6-недельного возраста массой 15–20 г) иммунизировали препаратом рекомбинантного RBD вируса SARS-CoV-2, полученного в примере 1. Схема иммунизации включала 4 подкожные инъекции антигена с интервалом введения 21 день. Доза препарата составила 50 мкг на инъекцию. Через 18 дней после последней инъекции осуществляли взятие крови из параорбитального синуса и определяли титр специфических антител с помощью твердофазного иммуноферментного анализа. Для этого планшеты сенсибилизировали антигеном, в 50 мМ карбонат-бикарбонатном буфере с pH 9,6. Образцы крови мышей разбавляли 10-кратным титрованием в буфере для ИФА (0.1М фосфатно-солевой буфер с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (Serva, Германия) и 0,1% Твин 20 (Serva, Германия) и инкубировали в лунках планшет в течение 30 минут при 37 °С. Лунки отмывали трехкратным внесением 0,9% натрия хлорида с добавлением 0,1% Твин 20 (отмывочного буфера) и добавляли антитела против иммуноглобулинов мыши, меченые пероксидазой хрена (кат. № AS302-HRP, Хема, Россия) в рабочем разведении на 30 минут при 37°С. После 5-кратной отмывки отмывочным буфером в лунки добавляли хромоген-субстратную смесь (кат. № R055, Хема, Россия) на 15 минут, останавливали реакцию 5% раствором серной кислоты и считывали оптическую плотность при 450 нм на планшетном ридере HyPo (Biosan, Латвия). Удовлетворительным считали титр антител не менее 1:100 000.

Далее животным с наибольшим уровнем продукции антител через 20 дней после иммунизации делали внутрибрюшную инъекцию (бустер-доза) антигена в количестве 50 мкг. На четвертые сутки с момента бустерной инъекции селезенку асептически извлекали, спленоциты получали путем перфузии средой RPMI1640 (Sigma-Aldrich, США).

Процедуру слияния иммунных спленоцитов и клеток миеломы SP2/0-Ag14 проводили по методике, предложенной G.Kohler и C.Milstein в модификации De St.Fazekas, S.Groth и D.Scheidegger. В качестве индуктора слияния клеток использовали 50% раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 1450 (Sigma-Aldrich, США). Гибридные клетки культивировали in vitro в СО2-инкубаторе при температуре 37 °C и содержании диоксида углерода равном 5%. Для культивирования использовали ростовую среду RPMI-1640, содержащую 2 мМ L-глютамина, с добавлением 20% фетальной телячьей сыворотки (Thermo Scientific, США) и 80 мг/л гентамицина (Россия). С целью проведения селекции гибридных клеток в ростовую среду добавляли HAT (Sigma-Aldrich, США), содержащий гипоксантин (Н), аминоптерин (А) и тимидин (т) в рабочем разведении.

Первичный скрининг гибридных культур проводили, начиная с 10-х суток после гибридизации. Специфическую активность антителопродукции гибридных культур определяли в культуральной жидкости без разведения методом ИФА аналогично описанному в разделе «Контроль иммунного ответа» трижды с интервалом 2–3 дня по мере интенсивности роста клеток. Пробы считали положительными, если оптическая плотность в лунках с исследуемыми образцами превышала на 0,5 значение оптической плотности в контрольных лунках со средой культивирования.

Клонирование культур гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений при расчетной посевной концентрации одна клетка на лунку. Продуцирующую активность отдельных клонов определяли, начиная с 10-х суток, дважды с интервалом три дня методом иммуноферментного анализа по схеме, описанной выше. После выделения положительных клонов их клетки размножали в достаточном количестве, образцы замораживали в ростовой среде RPMI, содержащей 20% фетальной телячьей сыворотки и 8% диметилсульфоксида (Serva, Германия), и помещали на хранение в контейнер с жидким азотом.

Культуральные и секреторные свойства полученных клонов изучали в процессе культивирования in vitro в 24-луночных планшетах (Flow Laboratories, Великобритания) в течение десяти пассажей.

После клонирования образцы культуральной жидкости от моноклональных культур изучали методом конкурентного ИФА. Рекомбинантный белок - рецептор ACE2 (Vaxine, Австралия) сорбировали в лунках планшет в концентрации 0,5 мкг/мл в 0,1М фосфатном буфере, pH 7,2 в течение 12-16 часов при температуре +4 С. После однократной отмывки отмывочным буфером (см Контроль иммунного ответа) планшет в лунки вносили 50 мкл образцов культуральной жидкости и 50 мкл разведения белка RBD, меченого пероксидазой хрена (Faizyme, ЮАР) и инкубировали 30 минут при 37 С. После 5х кратной отмывки отмывочным буфером реакцию проявляли с помощью хромоген-субстратной смеси и фотометрии при 450 нм. В контрольной лунке вместо образца культуральной жидкости помещали среду культивирования. Отбирали культуры, которые давали максимальное ингибирование взаимодействия ACE2 и RBD-пероксидаза (не менее 90%). Методику вторичного скрининга повторяли у выбранных клонов на всех этапах получения моноклональных антител с целью получения антител, в итоге выбрали моноклональное антитело XR19, дающее максимальную удельную активность ингибиции.

Далее, проводили сиквенирование отобранного клона гибридомы, для определения нуклеотидных последовательностей кодирующих. Для этого, клетки гибридомы линии XR19 лизировали с помощью 1 мл TRIzol reagent (Thermofisher scientific) c последующим выделением тотальной РНК. 5 мкг тотальной РНК использовали для синтеза кДНК с помощью набора SuperScriptIVTMfirst-strandsynthesissystem (Invitrogen). Последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи амплифицировали методом ПЦР с использованием панели праймеров, специфично отжигающихся в начале и конце последовательностей вариабельных доменов мыши. Полученные ПЦР-продукты секвенировали по Сэнгеру на приборе Genetic Analyzer 3500 Applied Biosystems.

Таким образом, были получены последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19, представленные в таблице 3.

Таблица. 3. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела XR19.

Нуклеотидная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи CAGGTGCAACTGCAACAGAGTGGAGCTGAACTTGTCAGACCTGGCACCTCTGTGAAGGTGAGCTGCAAAGCATCAGGCTATGCCTTCACCAACTACCTGATCGAGTGGGTGAAGCAGAGACCAGGACAAGGTCTCGAGTGGATTGGGATGATCAATCCTGGCAGTGGAGTGACCAACTACGATGAGAAGTTCAAAGGGAAAGCCACACTGACTGCCGACAAGAGCTCTAGCACAGTCTACATGCAGTTGAGCAGTCTGACCTCTGATGACTCAGCAGTGTACTTCTGTGCCACCTACTACAGGTATGACGATGCCTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTCACAGTGAGCGCT Аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGMINPGSGVTNYDEKFKGKATLTADKSSSTVYMQLSSLTSDDSAVYFCATYYRYDDAYWGQGTLVTVSA Нуклеотидная последовательность вариабельного домена легкой цепи GACATTCAGATGACACAGTCTCCTGCCAGTCTGTCAGCCAGCGTTGGAGAGACTGTGACCATCACCTGTGGTGCAAGCGAGAACATCTATGGCGTTCTGAACTGGTACCAGAGGAAGCAAGGCAAGTCTCCACAGTTGCTGATCTATGGAGCTACCAACCTTGCTGATGGCATGAGTAGCAGGTTCTCAGGCAGTGGCTCAGGCAGACAGTACAGTCTGAAGATCAGCTCACTTCATCCTGACGATGTTGCCACCTACTACTGTCAGAACGTGCTCTCCAGT Аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи DIQMTQSPASLSASVGETVTITCGASENIYGVLNWYQRKQGKSPQLLIYGATNLADGMSS

Далее аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепей антитела XR19 были гуманизированы при помощи биоинформатического ресурса Abisysdatabase (http://www.abysis.org/abysis/). Полученные аминокислотные последовательности гуманизированного моноклонального антитела XR19 (GamXRH19), представлены в таблице 4.

Таблица 4. Гуманизированные нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных доменов тяжелой и легкой цепи антитела GamXRH19.

Гуманизированная аминокислотная последовательность вариабельного домена тяжелой цепи QVQLQQSGAELVKPGASVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQAPGQGLEWIGMINPGSGVTNYDEKFKGRVTLTADKSTSTVYMQLSSLTSDDTAVYFCATYYRYDDAYWGQGTLVTVSA Гуманизированная аминокислотная последовательность вариабельного домена легкой цепи DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCGASENIYGVLNWYQRKPGKSPKLLIYGATNLADGMSSRFSGSGSGRQYTLTISSLQPEDFVATYYCQNVLS

Далее, при помощи, анализа литературных данных и методов биоинформатики в последовательности легкой и тяжелой цепи антитела GamXRH19, были идентифицированы последовательности CDR1-CDR3.

Далее, был разработан дизайн аминокислотной последовательности полноразмерных тяжелых и легких цепей гуманизированного антитела GamXRH19. Аминокислотная последовательность гуманизированной тяжелой представлена SEQIDNO:11 и аминокислотная последовательность гуманизированной легкой представлена SEQIDNO:12. На основе аминокислотных последовательностей были получены нуклеотидные последовательности антитела GamXRH19, которые были синтезированы в компании ЗАО «Евроген». Полученные нуклеотидные последовательности клонировали в вектор для экспрессии в эукариотических клетках. Далее проводили трансфекцию клеток линии СНО полученными экспрессионными векторами с использованием системы CHOGro (MirusBio, США) в соответствии с протоколом производителя. Клетки культивировали в колбах Эрленмейера в течение 10 дней. После чего культуральную жидкость осветляли центрифугированием при 5000g. Антитело очищали аффинной хроматографией на системе AKTA start (Cytiva, Швеция), используя колонки MAbSelect SuRe 1 мл (Cytiva, Швеция) в соответствии с протоколом производителя. Дополнительную очистку и замену буфера проводили на колонке ХК 26/100 (Cytiva, Швеция), упакованной сорбентом Superdex 200 pg (Cytiva, Швеция). Чистоту полученного препарата гуманизированного моноклонального антитела XRH19, определяли методом вертикального электрофореза в полиакриламидном геле в неденатурирующих условиях и денатурирующих условиях (фиг. 4). Схематичное изображение гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 представлено на фиг. 5.

Таким образом, в результате проведенной работы было получено гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19, имеющее аминокислотную последовательность тяжелых и легких цепей SEQIDNO:11 и SEQIDNO:12 соответственно. Кроме того, были идентифицированы последовательности CDR1, CDR2, CDR3 легкой цепи антитела GamXRH19, имеющие аминокислотные последовательности SEQIDNO:4, SEQIDNO:5 и SEQIDNO:6 соответственно и последовательности CDR1, CDR2, CDR3 тяжелой цепи антитела GamXRH19, имеющие аминокислотные последовательности SEQIDNO:7, SEQIDNO:8 и SEQIDNO:9 соответственно.

Пример 4. Изучение специфической активности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в непрямом ИФА.

Для определения специфической активности антитела GamXRH19 метод непрямого ИФА. Для этого рекомбинантный RBDS белка вируса SARS-CoV-2 иммобилизовали в лунке иммунологического планшета в 50,0 мМ карбонатно-бикарбонатном буфере в течение ночи. Не связавшийся белок удаляли, а лунку блокировали 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем лунки промывали 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере и добавляли раствор 5% раствором сухого молока в фосфатном буфере, содержащим различные разведения гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19. Каждое разведение вносили в 3-х повторах, инкубировали 1 час при 37⁰ С при слабом перемешивании. Затем проводили 3-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. После отмывки вносили раствор конъюгата, меченного перексидазой и инкубировали 1 час при 37ºС при слабом перемешивании. Далее проводили 5-х кратную отмывку 0,1% раствором детергента Твин-20 в фосфатном буфере. Далее вносили раствор субстрата ТМБ и инкубировали 10 мин при комнатной температуре без перемешивания, после чего реакцию останавливали добавлением раствора серной кислоты и проводили измерение на спектрофотометре. Результаты исследования представлены на фиг. 6. Было продемонстрировано, что антитело GamXRH19 обладает специфической активность в концентрации как минимум 3,3 нг/мл.

Таким образом, в данном примере была изучена специфическая активность антитела GamXRH19 в непрямом ИФА и определена его минимальная рабочая концентрация.

Пример 5. Определение константы аффинности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19.

Константы взаимодействия (KD) гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 определяли путем детекции изменения показателей поверхностного плазмонного резонанса на приборе Biacore3000 (General Electric, Швеция). Для этого рекомбинантный RBDS-белка вирусма SARS-CoV-2 ковалентно иммобилизировали на поверхности декстранового матрикса чипа СМ5 (General Electric, Швеция), а затем пропускали над поверхностью чипа различные концентрации полученного антитела XRH19. Обработку данных и вычисление констант проводили в автоматическом режиме при помощи программы Bioevaluation (General Electric, Швеция). В результате константа равновесной диссоциации GamXRH19 составила 4*10^-9М, что демонстрирует высокую аффинность антитела к рекомбинантному RBD.

Таким образом, в данном примере была продемонстрирована высокая аффинность антитела GamXRH19 к рекомбинантный RBDS-белка вируса SARS-CoV-2.

Пример 6. Определение вируснейтрализующей активности гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19, в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2.

Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанного гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. На первом этапе работы подготовили образцы антитела XRH19 в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2 различных штаммов, инкубировали 1 час при 37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр антитела принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации, представленные в таблице 5.

Таблица. 5.Вирус-нейтрализующие титры гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в отношении вируса SARS-CoV-2 различных штаммов.

Штамм вируса SARS-CoV-2 Минимальная вирус-нейтрализующая концентрация SARS-CoV-2 strains B.1.1.1 (PMVL-1, S: D614G; hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020) 80 нг/мл B.1.1.7 (hCoV-19/Netherlands/NoordHolland_20432/2020, VOC 202012/01) Alpha, V1 не нейтрализует in vitro B.1.351 (hCoV-19/Russia/SPE-RII-27029S/2021) Beta, V2 не нейтрализует in vitro B.1.1.28/P.1 (hCoV-19/Netherlands/NoordHolland_10915/2021)Gamma, V3 не нейтрализует in vitro B.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N) Delta 20 нг/мл

Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус-нейтрализующая активность гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе варианта, вызывающего опасение Delta.

Пример 7. Определение вируснейтрализующей активности рекомбинантного антитела GamP2C5, в отношении различных штаммов вируса SARS-CoV-2.

Целью данного эксперимента являлась оценка способности разработанного рекомбинантного антитела GamP2C5 нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. На первом этапе работы подготовили образцы рекомбинантного антитела GamP2C5 в культуральной среде ДМЕМ с 2% инактивированной фетальной бычьей сывороткой. Затем полученные образцы антител смешивали со 100 БОЕ вируса SARS-CoV-2 различных штаммов, инкубировали 1 час при 37ºС и добавляли к клеткам Vero E6. Клетки инкубировали при 37°С в 5% СО2. Через 96 часов производили учет развития цитопатического действия вируса на культуру клеток визуально по оценке нарушения монослоя клеток. За вируснейтрализующий титр антитела принимали высшее их разведение, при котором происходит подавление цитопатического действия в 2-х лунках из 3-х. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации, представленные в таблице 6.

Таблица. 6. Вирус-нейтрализующие титры рекомбинантного антитела GamP2C5 в отношении вируса SARS-CoV-2 различных штаммов.

Штамм вируса SARS-CoV-2 Минимальная вирус-нейтрализующая концентрация SARS-CoV-2 strains B.1.1.1 (PMVL-1, S: D614G; hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020) 10 нг/мл B.1.1.7 (hCoV-19/Netherlands/NoordHolland_20432/2020, VOC 202012/01) Alpha, V1 10 нг/мл B.1.351 (hCoV-19/Russia/SPE-RII-27029S/2021) Beta, V2 20 нг/мл B.1.1.28/P.1 (hCoV-19/Netherlands/NoordHolland_10915/2021)Gamma, V3 40 нг/мл B.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N) Delta не нейтрализует in vitro

Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус-нейтрализующая активность рекомбинантного антитела GamP2C5 в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасение Alpha, Beta и Gamma.

Пример 8. Получение формуляции компонента 1(рекомбинантного антитела GamP2C5).

Препарат для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) получали путем подбора формулирующего буфера. Для сравнения использовали различные физиологические буферные системы, представленные в таблице 7.

Таблица 7. Состав буферных систем для разработки средства.

Название Состав Буфер №1 Трис 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,5 Буфер №2 Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2 Буфер №3 Трис 20мМ, цитрат натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2 Буфер №4 Трис 20мМ, глицин 200 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,0

Рекомбинантного антитела GamP2C5 переводили в каждую буферную систему при помощи эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200 pg и ужимали до концентрации 20 мг/мл. Далее образцы инкубировали при 37ºС в течении недели и далее анализировали их стабильность и чистоту при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа представлены в таблице 8. Примеры хроматограмм ВЭЖХ анализа представлены на фиг. 7.

Таблица. 8. Процентное содержание целевых и примесных пиков рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) в различных буферных растворах.

Название Буфер №1 Буфер №2 Буфер №3 Буфер №4 Процентное содержание целевого пика GamP2C5 (компонент 1) 93,29 % 98,43 % 92,37 % 92,31 % Процентное содержание суммы примесных пиков GamP2C5 (компонент 1) 6,71 % 1,57 % 7,63 % 7,69 %

В результате было продемонстрировано, что наибольшая стабильность 1-ого компонента наблюдается в буфере №2 Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2.

Таким образом, в данном примере было полученосредство на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и подобран оптимальный буферный состав.

Пример 9. Получение формуляции компонента 2 (гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19).

Препарат для терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 на основе гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) получали путем подбора формулирующего буфера. Для сравнения использовали различные физиологические буферные системы, представленные в таблице 9.

Таблица 9. Состав буферных систем для разработки средства.

Название Состав Буфер №1 Трис 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,5 Буфер №2 Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2 Буфер №3 Трис 20мМ, цитрат натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2 Буфер №4 Трис 20мМ, глицин 200 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,0

Гуманизированное моноклональное антитело GamXRH19 переводили в каждую буферную систему при помощи эксклюзионной хроматографии на сорбенте Superdex 200 pg и ужимали до концентрации 20 мг/мл. Далее образцы инкубировали при 37⁰С в течении недели и далее анализировали их стабильность и чистоту при помощи ВЭЖХ. Результаты анализа представлены в таблице 10. Примеры хроматограмм ВЭЖХ анализа представлены на фиг.8.

Таблица. 10. Процентное содержание целевых и примесных пиков гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) в различных буферных растворах.

Название Буфер №1 Буфер №2 Буфер №3 Буфер №4 Процентное содержание целевого пика XRH19 (компонент 2) 88,8 % 95,95% 88,55 % 82,61 % Процентное содержание суммы примесных пиков XRH19 (компонент 2) 11,2 % 4,05 % 11,45 % 17,39 %

В результате было продемонстрировано что наибольшая стабильность компонента 2 наблюдается в буфере №2 Фосфат натрия 20мМ, Хлорид натрия 150 мМ, полисорбат 80 0,05%, рН 7,2.

Таким образом, в данном примере было получено средство на основе гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) и подобран оптимальный буферный состав.

Пример 10. Определение вируснейтрализующей активности средства на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2).

Целью данного эксперимента являлась оценка способности каждого из компонентов средства и их смеси в оптимальном буферном растворе нейтрализовать вирус SARS-CoV-2 различных штаммов. Методика данного анализа описана в примерах 6 и 7. В результате были определены следующие рабочие вируснейтрализующие концентрации компонентов препарата, представленные в таблице 11.

Таблица. 11. Вирус-нейтрализующие титры рекомбинантного антитела GamP2C5 в отношении вируса SARS-CoV-2 различных штаммов.

Штамм вируса SARS-CoV-2 Минимальная вирус-нейтрализующая концентрация компонента 1 Минимальная вирус-нейтрализующая концентрация компонента 2 Минимальная вирус-нейтрализующая концентрация смеси компонентов Wuhan 10 нг/мл 40 нг/мл 10 нг/мл Alpha, V1 10 нг/мл не нейтрализует in vitro 150 нг/мл Beta, V2 20 нг/мл не нейтрализует in vitro 150 нг/мл Gamma, V3 40 нг/мл не нейтрализует in vitro 40 нг/мл Delta не нейтрализует 10 нг/мл 40 нг/мл

Таким образом, в данном примере продемонстрирована выраженная вирус-нейтрализующая активность средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) против различных штаммов SARS-CoV-2 включая варианты, AlphaV1, BetaV2, GammaV3, Delta. Кроме того, было показано, что компонент 1 обладает вирус-нейтрализующей активностью в отношение вариантов, вызывающих опасение AlphaV1, BetaV2 и GammaV3, а компонент 2 в отношение вариантов, вызывающих опасение Delta.

Пример 11. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19 при помощи средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2).

Терапевтическую эффективность и эффективность при экстренной профилактике рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2), а также их смеси оценивали на модели инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2, у АСЕ2-трансгенных мышей. Данные животные были выбраны, так как они высоко чувствительны к инфекции SARS-CoV-2. Летальность животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 составляет 100%.

В работе использовали вирус SARS-CoV-2 варианта Delta B.1.617.2 (T19R G142D E156G F157del R158del L452R T478K D614G P681R D950N), изолированный в 2021 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10⁷ TCID50/мл и 3,5х10⁷ БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10⁵ TCID50 на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 12.

Таблица 12. Дизайн экспериментального изучения эффективности рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2), а также их смеси.

Препарат Доза препарата Путь введения Время введения Инфицирование интраназально в дозе TCID50 Оценка эффективности Смесь компонентов 1 и 2 10 мг/кг в/б Через 1 час после заражения 10⁵ 10 шт. Анализ выживаемости Смесь компонентов 1 и 2 10 мг/кг в/б Через 6 часов после заражения 10⁵ 10 шт. Смесь компонентов 1 и 2 20 мг/кг в/б Через 1 час после заражения 10⁵ 10 шт. Смесь компонентов 1 и 2 20 мг/кг в/б Через 6 часов после заражения 10⁵ 10 шт. Плацебо - в/б Через 1 час после заражения 10⁵ 10 шт.

В течение 30 суток после заражения оценивали вес и выживаемость животных.

На фиг. 9 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. В результате исследования было показано, что однократное системное введение смеси двух компонентов препарата в дозах 10и 20 мг/кг животным через час и через 6 часов после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 варианта Delta. В контрольной группе животных после заражения получивших плацебо наблюдалось снижение массы тела. К10 суткам все животные из группы контроля погибли.

Таким образом, можно сделать вывод, что разработанное средство на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 в том числе варианта Delta.

Пример 12. Способ терапии и экстренной профилактики заболевания COVID-19, вызванного различными штаммами вируса SARS-CoV-2, при помощи средства на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2).

Для оценки широты терапевтических свойств средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) использовали вирус SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020, изолированный в 2020 году в ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России, хранящийся в Государственной коллекции вирусов. Инфекционный титр вируса 10⁷ TCID50/мл и 3,5х10⁷ БОЕ/мл. Животных заражали вирусом SARS-CoV-2 интраназально в дозе 10⁵ TCID50 на животное, далее вводили препарат моноклональных антител или плацебо, согласно таблице 13.

Таблица 13. Дизайн экспериментального изучения широты протективной активности средства на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2), а также их смеси.

Препарат Доза препарата Путь введения Время введения Инфицирование интраназально в дозе TCID50 Оценка эффективности Смесь компонентов 1 и 2 10 мг/кг в/б Через 1 час после заражения 10⁵ 5 шт. Анализ выживаемости Смесь компонентов 1 и 2 20 мг/кг в/б Через 1 час после заражения 10⁵ 5 шт. Плацебо - в/б Через 1 час после заражения 10⁵ 5 шт.

В течение 30 суток после заражения оценивали выживаемость животных.

На фиг. 10 представлены данные выживаемости животных после заражения вирусом SARS-CoV-2 штамма штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020. В результате исследования было показано, что однократное системное введение смеси двух компонентов препарата в дозах 10 и 20 мг/кг животным через час после заражения позволяет защитить животных от инфекции, вызванной вирусом SARS-CoV-2 штамма hCoV-19/Russia/Moscow_PMVL-1/2020.

Таким образом, можно сделать вывод, что разработанное средство на основе рекомбинантного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) может быть использовано для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2 различных вариантов и штаммов.

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают эффективность созданного препарата на основе рекомбинатного антитела GamP2C5 (компонент 1) и гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19 (компонент 2) для терапии и экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасения Alpha, Beta, Gamma и Delta, и его промышленную применимость.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ФГБУ "НИЦЭМ им. Н.Ф.Гамалеи" Минздрава России

<120> Средство и способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 на основе рекомбинатного антитела и гуманизированного моноклонального антитела.

SEQ ID NO:1.

<160> 4

<170> BISSAP1.3.6

<210> 1

<211> 8

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR1 рекомбинантного антитела GamP2C5

<400> 1

Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr Asp

1 5

SEQ ID NO:2.

<210> 2

<211> 8

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR2 рекомбинантного антитела GamP2C5

<400>2

Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr

1 5

SEQIDNO:3.

<210> 3

<211> 15

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR3 рекомбинантного антитела GamP2C5

<400>3

Lys Ser Trp Ala Cys Ser Ser Gly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp

1 5 10 15

SEQIDNO:4.

<210> 4

<211> 6

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR1 легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400>4

Glu Asn Ile Tyr Gly Val

1 5

SEQIDNO:5.

<210> 5

<211> 3

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR2 легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400>5

Gly Ala Thr

1

SEQIDNO:6.

<210> 6

<211> 9

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR3 легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400>6

Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro Arg Thr

1 5

SEQIDNO:7.

<210> 7

<211> 8

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR1 тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400>7

Gly Tyr Ala PheThrAsn Tyr Leu

1 5

SEQIDNO:8.

<210>8

<211> 8

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR2 тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400>8

Gly Tyr Ala PheThrAsn Tyr Leu

1 5

SEQIDNO:9.

<210>9

<211> 10

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность CDR3 тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400>9

Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Tyr

1 5 10

SEQIDNO:10.

<210>10

<211>352

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность рекомбинантного антитела GamP2C5

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser GlyGlyGly Ser Val Gln Ala GlyGly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Cys Ser Tyr

20 25 30

Asp Met Ser Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val

35 40 45

Ser Ile Ile Arg Arg Asp Gly Ser Thr Ala Tyr Thr Asp Ala Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys AsnThr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Glu Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr TyrCys Lys

85 90 95

Ser Trp Ala Cys Ser SerGly Glu Tyr Leu Tyr Gln Gly Asp TrpGly

100 105 110

Gln GlyThr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

115 120 125

Thr His ThrCys Pro ProCys Pro Ala Pro Glu Leu LeuGlyGly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

145 150 155 160

Arg Thr Pro Glu Val ThrCys Val ValVal Asp Val Ser His Glu Asp

165 170 175

Pro Glu Val Lys PheAsnTrp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

180 185 190

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

195 200 205

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu AsnGly Lys Glu

210 215 220

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

225 230 235 240

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

245 250 255

Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

260 265 270

Cys Leu Val Lys GlyPhe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

275 280 285

Ser AsnGly Gln Pro Glu AsnAsn Tyr Lys ThrThr Pro Pro Val Leu

290 295 300

Asp Ser Asp Gly Ser PhePhe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

305 310 315 320

Ser Arg Trp Gln GlnGlyAsn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

325 330 335

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

340 345 350

SEQIDNO:11.

<210>11

<211>447

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность тяжелой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400> 11

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala PheThrAsn Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Met Ile Asn Pro Gly Ser Gly Val ThrAsn Tyr Asp Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp AspThr Ala Val Tyr PheCys

85 90 95

Ala Thr Tyr Tyr Arg Tyr Asp Asp Ala Tyr TrpGly Gln GlyThr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser GlyGlyThr Ala Ala Leu GlyCys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser TrpAsn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His ThrPhe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val ValThr Val Pro Ser SerSer

180 185 190

Leu GlyThr Gln Thr Tyr Ile CysAsn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

ThrCys Pro ProCys Pro Ala Pro Glu Leu LeuGlyGly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val ThrCys Val ValVal Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys PheAsnTrp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu AsnGly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu ThrCys Leu

355 360 365

Val Lys GlyPhe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu AsnAsn Tyr Lys ThrThr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser PhePhe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln GlnGlyAsn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

SEQIDNO:12.

<210>12

<211>215

<212>PRT

<213>ArtificialSequence

<220>

<223>аминокислотная последовательность легкой цепи гуманизированного моноклонального антитела GamXRH19

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile ThrCysGly Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Gly Val

20 25 30

Leu AsnTrp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Gly Ala ThrAsn Leu Ala Asp Gly Met Ser Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Arg Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Val Ala Thr Tyr TyrCys Gln Asn Val Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Arg ThrPheGlyGlyGlyThr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

GlyThr Ala Ser Val ValCys Leu LeuAsnAsnPhe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser GlyAsn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser SerThr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser PheAsn Arg Gly Glu Cys

210 215

Группа изобретений относится к области биотехнологии, иммунологии и вирусологии. Описаны средства и способа терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызванных различными штаммами вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2. Создано средство, которое содержит рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, а также Fc-фрагмент человеческого IgG1 и гуманизированное моноклональное антитело, имеющее CDR1 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:6, CDR1 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:9. Также раскрыт способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызванных различными штаммами вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 созданным средством. Группа изобретений обеспечивает создание эффективного средства, обладающего вируснейтрализующей активностью и протективной активностью в отношении вируса SARS-CoV-2, в том числе вариантов, вызывающих опасение (Alpha, Beta, Gamma, Delta). 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 10 ил., 13 табл, 12 пр.

1. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, содержащее рекомбинантное антитело, имеющее CDR1, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:1, CDR2, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, CDR3, представленный аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:3, а также Fc-фрагмент человеческого IgG1, и гуманизированное моноклональное антитело, имеющее CDR1 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:4, CDR2 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:5, CDR3 лёгкой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:6, CDR1 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:7, CDR2 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:8, CDR3 тяжёлой цепи, представленный последовательностью SEQ ID NO:9.

2. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 по п.1, где рекомбинантное антитело имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:10.

3. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 по п.1, где гуманизированное моноклональное антитело имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:11 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO:12.

4. Средство для терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2 по п.1, где рекомбинантное антитело имеет последовательность SEQ ID NO: 10 и гуманизированное моноклональное антитело имеет последовательность тяжелой цепи SEQ ID NO:11 и последовательность легкой цепи SEQ ID NO:12.

5. Способ терапии и экстренной профилактики заболеваний, вызываемых вирусом SARS-CoV-2, заключающийся в системном введении эффективного количества средства по п.1-4.