СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ ВОЗРАСТНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ КОЖИ Российский патент 2023 года по МПК A61K35/28 A61K8/64 A61K8/67 A61K8/98 A61K38/18 A61K8/14 A61Q19/08 

Настоящее изобретение относится к косметологии и может быть использовано для профилактики и коррекции возрастных изменений кожи.

Из существующего уровня техники известно косметическое средство, обладающее омолаживающим действием, которое содержит фракции икры осетровых и лососевых рыб, натуральные растительные экстракты и масла, а также эфирные масла (RU 2 290 170 C1, опубл. 2006.12.27). Данное косметическое средство при воздействии на кожу очищает ее, улучшает ее питание и внешний вид, но обладает слабыми регенерирующими свойствами. Известен также способ омоложения кожи лица и шеи. Способ проводят в три этапа, первые два из которых являются подготовительными. На первом этапе осуществляют забор крови у пациента, выделение из нее плазмы и ее обогащение тромбоцитами с последующим интрадермальным введением очищенной и обогащенной плазмы крови под кожу. Через два дня на втором этапе производят подкожные инъекции гиалуроновой кислоты. Затем через 2-3 дня, на третьем этапе, осуществляют лазерное воздействие на разные слои кожи, совершая от двух до пяти проходов по различным участкам лица и/или шеи за одну процедуру. Во время одного прохода осуществляют попеременно как короткоимпульсное, так и длинноимпульсное воздействие лазерным излучением с длиной волны 1564-2940 нм. При этом процедуру повторяют с интервалами 3-5 дней, увеличивая энергию импульсов лазерных лучей от 35 мДж до 65 мДж. (RU 2552668 С2, опубликовано: 2015.06.10). Способ обладает хорошим косметическим эффектом, однако предполагает выполнения трех инвазивных процедур, а, следовательно, небезопасен и не применим в домашних условиях.

Также известна композиция для омоложения кожи, включающая экстракт плаценты, экстракты левзеи, таволги, чистотела и эфирные масла (RU 2 228 736 C2, опубликовано: 2004.05.20). Недостатками данного технического решения являются то, что компоненты обладают слабо выраженным регенеративным эффектом и высокой аллергенностью.

Наиболее близким аналогом к заявляемому техническому решению является косметическое средство на основе продуктов секреции мезенхимных стволовых/стромальных клеток жировой ткани человека (RU 2 620 342, опубликовано: 2016.05.11). Известное косметическое средство содержит в качестве основного компонента культуральную среду, кондиционированную мезенхимными стромальными клетками жировой ткани человека, содержащую продукты секреции, включающие VEGF в концентрации не менее 4 нг/млн клеток, FGF basic в концентрации не менее 5.8 пкг/млн клеток, PEDF в концентрации не менее 10 нг/млн клеток, PAI-1 в концентрации не менее 35 нг/млн клеток, а также комплекс из по крайней мере 20 белков. При этом средство дополнительно содержит энхансеры трансдермального проникновения, в качестве которых использованы диметилизосорбид в количестве не менее 1,5% по отношению к массе готового косметического средства, и/или гиалуроновая кислота или ее производные в количестве не менее 1% по отношению к массе готового косметического средства, и/или липосом различного состава.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание косметического средства, обладающего выраженным регенеративным и геропрофилактическим эффектом для ежедневного применения в бытовых условиях.

Задача решается за счет того, что заявленное средство содержит в своем составе экстракт и кондиционную культуру стволовых клеток человека, которые обладают наибольшим регенераторным потенциалом и, при этом, минимальными аллергизирующими свойствами вследствие малой экспрессии стволовыми клетками белков основного комплекса гистосовместимости. Экстракт может быть дополнен гелевой основой, пенетраторами, косметическими отдушками.

Техническим результатом, обеспечиваемым приведенной совокупностью признаков, является то, что после 12 недель регулярного применения косметического средства снижается выраженность морщин, нормализуется пигментация кожи лица, повышается тургор кожи, уменьшает проявления возраст-обусловленного птоза и возраст-обусловленных нарушений микроциркуляции.

Сущность изобретения состоит в наращивании и последующем лизисе стволовых клеток человека, удалении клеточного дебриса и на основе оставшегося лизата и кондиционной культуры изготовление заявляемого косметического средства.

При этом для культивирования использовали среды DMEM (SIGMA-ALDRICH), Ham’s F-12 (MP Biomedicals) и фетальную бычью сыворотку (HyClone, США) в соотношении 6:3:1, соответственно.

Для приготовления культуральных сред использовали стерильную деионизированную воду с удельным сопротивлением не менее 20 МОм (класс очистки MQ).

Фильтрацию смеси для культивирования клеток проводили на фильтр-установке (Sarstedt, Германия).

На начальных этапах в культуральную среду добавляли антибиотики: Amphotericin B (SIGMA-ALDRICH), Penicillin/Streptomycin (SIGMA-ALDRICH), Tylosin (SIGMA-ALDRICH). Антибиотики соответствуют категории для применения in vitro.

В качестве стволовых клеток использовали мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК) жировой ткани человека. Жировую ткань получали методом аппаратной липосакции передней брюшной стенки здоровых пациенток, после получения добровольного информированного согласия пациента.

Для исключения контаминации в культуральных образцах, полученных из жировой ткани пациентов, а так е в их крови, проводилось обязательное тестирование иммуноферментными методами и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. При обнаружении антигенов HIV1-Ag, HBs-Ag, Anti-HBcor-Ag, а также антител Anti-HIV-1, Anti-HIV-2, Anti-HTLV-I, Anti-HTLV-II, Anti-HCV, Anti-CMV, к микоплазме, к токсоплазме, к хламидиям, к гонорее и положительной реакции Вассермана, образцы исключались из дальнейшего процесса и уничтожались.

Для выделения ММСК из жировой ткани использовали механо-ферментативный метод. В изотонический раствор коллагеназы (БиолоТ, Санкт-Петербург) добавляли жировую ткань с соблюдением пропорции по объему 1:2. Инкубацию проводили в течение 2-х часов при температуре 37⁰С. Полученную после ферментации дезагрегированную ткань центрифугировали и двухкратно отмывали от раствора коллагеназы культуральной средой.

Для наращивания пула ММСК использовали стандартный протокол культивирования. Добавляли фетальную бычью сыворотку (SIGMA-ALDRICH) в культуральную среду DMEM/Ham`s F12 (SIGMA-ALDRICH) в пропорции 1:9. Клетки снимали по достижении монослоя раствором трипсина в концентрации 0.25%.

Культивирование клеток осуществлялось при температуре 37°С, 5% СО₂ и 95% влажности. Смену культуральной среды проводили каждые 72 часа.

В процессе культивирования ММСК по паракринному механизму выделяют в культуральную среду факторы роста и цитокины. Для получения действующего вещества (актива) ММСК культивировали по указанному выше протоколу. ММСК снимали на холоду и разрушали физическими методами - чередованием глубокой заморозки и разморозки, а так же воздействием ультразвука. Полученную дезагригированную массу фильтровали от лизосом, митохондрий, мембран, ядер для отделения белков, миРНК, факторов роста, цитокинов, которые содержатся в цитоплазме. Кондиционную среду с цитокинами и факторами роста собирали, и повторно фильтровали чрез фильты с размером пор 220 нм для стерилизации. Для получения актива профильтрованную взвесь помещали в кондиционную среду.

Полученный актив имеет следующий состав:

1) специфические регуляторы роста:

- Liposomal FGF (20,0*10^-6 г/л);

- Liposomal PDGF (20,0*10^-6 г/л);

- Liposomal EGF (20,0*10^-6 г/л);

- Liposomal SCF (20,0*10^-6 г/л);

2) неорганические соли:

- CaCI₂ • 2H₂0 (0,2 г/л);

- Fe(N0₃)₃ • 9H₂0 (0,0001 г/л);

- MgS0₄ (0,099 г/л);

- KCI (0,4 г/л);

- NaCI (6,4 г/л);

3) аминокислоты:

- L-Alanyl-L-Glutamine (0,869 г/л);

- L-Arginine • HCI (0,084 г/л);

- Glycine (0,03 г/л);

- L-Histidine • HCI • H₂0 (0,042 г/л);

- L-lsoleucine (0,105 г/л);

- L-Lysine • HCI (0,146 г/л);

- L-Methionine (0,03 г/л);

- L-Phenylalanine (0,066 г/л);

- L-Threonine (0,095 г/л);

- L-Tryptophan (0,016 г/л);

- L-Valine (0,094 г/л);

4) витамины:

- Choline Chloride (0,004 г/л);

- Folic Acid (0,004 г/л);

- D-Pantothenic Acid • Са (0,004 г/л);

- Pyridoxal • HCI (0,004 г/л);

- Riboflavin (0,0004 г/л);

- Thiamine • HCI (0,004 г/л);

5) прочее:

- D-Glucose (1,0 г/л);

- HEPES (5,958 г/л);

- Pyruvic Acid • Na (0,11 г/л);

- L-Glutamine (0,584 г/л).

Приготовление геля: к активу добавляли консервант, Sodium benzoate (SIGMA-ALDRICH) в количестве ХХХ, для предотвращения контаминации продукта и продления его срока годности, а также гелеобразователи – Hydroxyethylcellulose (USA) и Carbomer (USA) в количестве ХХХ и ХХХ соответственно, для связывания действующих веществ и придания стабильной формы продукту.

Гомогенизация продукта осуществлялась механически без дополнительного нагрева субстанции. Полученный в результате гомогенизации гель, содержит в качестве основных действующих компонентов факторы роста и цитокины (актив).

Желаемый косметический эффект достигается следующим образом:

При биологическом старении кожи, а также ее повреждении количество фибробластов кожи уменьшается, за счет снижения их пролиферативной активности. Вместе с этим ухудшается способность клеток воспринимать факторы роста. Активность металлопротеиназ возрастает, что приводит к повышению разрушения эластина и коллагена, одновременно снижается синтез компонентов аморфного вещества дермы и соединительной ткани.

Активация клеточных элементов кожи происходит посредством воздействия компонентов лизата стволовых клеток и кондиционной среды – факторов роста и цитокинов на клетки кожи. Последние оказывают следующие эффекты:

1) иммуномодулирование,

2) трофический и антиапоптотический эффект,

3) формирование стромы,

4) поддержка роста и дифференцировки стволовых клеток,

5) препятствие образованию рубцовой ткани,

6) хемоаттракция (регуляция миграции клеток).

Присутствие в геле этих факторов, а также незаменимых аминокислот и витаминов обеспечивает косметический эффект, наиболее ярко выраженный спустя 12 недель ежесуточного вечернего нанесения (перед сном) на чистую кожу лица.

Клиническая апробация выполнялась на базе ФГБОУ ВО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России при участии 35 женщин-добровольцев, в возрасте 26 - 55 лет под дерматологическим и косметологическим контролем. Средний возраст испытуемых составил 45 лет. Один доброволец из-за случайных причин (переезд в другой населенный пункт) не вернулся в конце исследования и не заполнили оценочную анкету. Остальные добровольцы, отобранные к участию в испытаниях, выполнили требования по критериям включения и подписали форму добровольного информированного согласия для участия в испытании.

Они были также проинформированы о цели испытания, методологии и возможных побочных эффектах.

Важным критерием включения в испытания было отсутствие признаков раздражения и каких-либо изменений, требующих медикаментозного лечения. Добровольцы, которые были отобраны для участия в испытаниях, получили заявляемое косметическое средство и специально подготовленный опросник. Они также были обязаны выполнять следующее:

1. Регулярно пользоваться полученным косметическим средством в течение 12 недель.

2. Не использовать во время испытаний другие косметические средства со сходным эффектом,

3. Давать подробную характеристику используемому косметическому средству, используя для этого полученный опросник.

4. В случае развития на коже лица каких - либо нежелательных побочных явлений прекратить использование косметических средств и немедленно сообщить об этом дерматологу.

Спустя 12 недель применения было выявлено следующее:

1. По заключению дерматолога - испытуемое косметическое средство, используемое по назначению, безопасно для здоровья человека, и не имеет прямых противопоказаний для их использования.

2. По заключению косметолога, спустя 12 недель регулярного применения косметических средств выявлено следующее:

1). Средство снижает выраженность морщин, изменения пигментации кожи лица у 100 % добровольцев, при этом максимально выраженный эффект наблюдается у 68% добровольцев.

2). Средство повышает тургор кожи, уменьшает проявления возраст-обусловленного птоза и возраст-обусловленных нарушений микроциркуляции у 100 % испытуемых, при этом максимально выраженный эффект наблюдается у 76,5% добровольцев.

Вышеуказанные свойства испытуемого косметического средства были отражены в общей оценке (не менее 99,8 % положительных высказываний). По сравнению с другими аналогичными средствами, используемыми добровольцами ранее, заявляемое средство было оценено следующим образом: «лучше» – 96 % добровольцев, «одинаково» – 4 % добровольцев, хуже – 0% добровольцев. При этом 96 % добровольцев заявили о своем намерении покупать данное косметическое средство.

Изобретение относится к области медицины, а именно к средству для коррекции возрастных изменений кожи. Средство для коррекции возрастных изменений кожи, выбранных из морщин, пигментации кожи лица, возраст-обусловленного птоза и возраст-обусловленных нарушений микроциркуляции, содержит продукты разрушения стволовых клеток человека, представленные специфическими регуляторами роста и аминокислотами, неорганические соли, витамины, кондиционную среду, получаемую при культивировании стволовых клеток человека, и такие компоненты, как D-Glucose, HEPES, Sodium pyruvate, L-Glutamine, при этом специфические регуляторы роста представлены Liposomal FGF, Liposomal PDGF, Liposomal EGF, Liposomal SCF, аминокислоты представлены L-Alanyl-L-Glutamine, L-Arginine⋅HCl, Glycine, L-Histidine⋅HCl⋅H₂О, L-lsoleucine, L-Lysine⋅HCI, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Valine, неорганические соли представлены CaCl₂⋅2H₂O, Fe(NO₃)₃⋅9H₂O, MgSО₄, KCl, NaCl, витамины представлены Choline Chloride, Folic Acid, Calcium-D-pantothenate, Pyridoxal⋅HCI, Riboflavin, Thiamine⋅HCl, а компоненты в средстве представлены в определенных количествах. Вышеописанное изобретение позволяет после 12 недель регулярного применения косметического средства снизить выраженность морщин, нормализовать пигментацию кожи лица, повысить тургор кожи, уменьшить проявления возраст-обусловленного птоза и возраст-обусловленных нарушений микроциркуляции. 1 з.п. ф-лы.

1. Средство для коррекции возрастных изменений кожи, выбранных из морщин, пигментации кожи лица, возраст-обусловленного птоза и возраст-обусловленных нарушений микроциркуляции, содержит продукты разрушения стволовых клеток человека, представленные специфическими регуляторами роста и аминокислотами, неорганические соли, витамины, кондиционную среду, получаемую при культивировании стволовых клеток человека, и такие компоненты, как D-Glucose, HEPES, Sodium pyruvate, L-Glutamine, при этом специфические регуляторы роста представлены Liposomal FGF, Liposomal PDGF, Liposomal EGF, Liposomal SCF, аминокислоты представлены L-Alanyl-L-Glutamine, L-Arginine⋅HCl, Glycine, L-Histidine⋅HCl⋅H₂О, L-lsoleucine, L-Lysine⋅HCI, L-Methionine, L-Phenylalanine, L-Threonine, L-Tryptophan, L-Valine, неорганические соли представлены CaCl₂⋅2H₂О, Fe(NO₃)₃⋅9H₂О, MgSО₄, KCl, NaCl, витамины представлены Choline Chloride, Folic Acid, Calcium-D-pantothenate, Pyridoxal⋅HCl, Riboflavin, Thiamine⋅HCl, а компоненты в средстве представлены в следующем количестве:

специфические регуляторы роста:

Liposomal FGF 20,0*10^-6 г/л Liposomal PDGF 20,0*10^-6 г/л Liposomal EGF 20,0*10^-6 г/л Liposomal SCF 20,0*10^-6 г/л

аминокислоты:

L-Alanyl-L-Glutamine 0,869 г/л L-Arginine⋅HCl 0,084 г/л Glycine 0,03 г/л L-Histidine⋅HCl⋅H₂О 0,042 г/л L-lsoleucine 0,105 г/л L-Lysine⋅HCl 0,146 г/л L-Methionine 0,03 г/л) L-Phenylalanine 0,066 г/л L-Threonine 0,095 г/л L-Tryptophan 0,016 г/ L-Valine 0,094 г/л

неорганические соли:

CaCl₂⋅2H₂О 0,2 г/л Fe(NO₃)₃⋅9H₂О 0,0001 г/л MgSО₄ 0,099 г/л KCl 0,4 г/л NaCl 6,4 г/л

витамины:

Choline Chloride 0,004 г/л Folic Acid 0,004 г/л Calcium-D-pantothenate 0,004 г/л Pyridoxal⋅HCl 0,004 г/л Riboflavin 0,0004 г/л Thiamine⋅HCl 0,004 г/л

прочее:

D-Glucose 1,0 г/л HEPES 5,958 г/л Sodium pyruvate 0,11 г/л L-Glutamine 0,584 г/л

2. Средство по п.1 отличающееся тем, что в качестве стволовых клеток применяются мультипотентные стромальные мезенхимальные клетки, получаемые из жировой ткани человека.