ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
Изобретение относится к области пространственной детекции биомолекул. В частности, в данном изобретении предложен способ получения пространственной информации о нуклеиновых кислотах в образце, панель нуклеиновых кислот, используемая в способе, и способ получения панели нуклеиновых кислот.
ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
Пространственное расположение клеток в ткани существенным образом влияет на их функции. Для исследования такой пространственной гетерогенности необходимо количественное определение и анализ генома или транскриптома клетки и знание пространственных координат. Однако, взятие небольших кусочков ткани или даже единичных клеток для геномного или транскриптомного анализа является очень трудоемким, дорогостоящим и характеризуется низкой точностью. Таким образом, существует потребность в разработке способа, который позволит с высокой производительностью получать пространственную информацию о биомолекуле (например, нуклеиновой кислоте) на уровне одиночных клеток или даже на субклеточном уровне (например, о расположении, распределении и/или экспрессии нуклеиновой кислоты).
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для пространственной детекции нуклеиновых кислот в уровне техники комбинируют технологию чипов и технологию высокопроизводительного секвенирования ДНК, осуществляя захват нуклеиновой кислоты и мечение ее позиционной меткой в образце ткани, а также ее секвенирование и анализ. В уровне техники для получения чипа, позволяющего решать вышеуказанную задачу, зонд, способный захватывать нуклеиновую кислоту, фиксируют на чипе путем точечного нанесения или способом, основанным на использовании микрочастиц. Однако, размер активной области чипа, полученного способом точечного нанесения капель на плоскость с применением системы точечного нанесения в микрообъемах, составляет до 200 микрометров, а разрешающая способность достигает лишь уровня 20 клеток; размер активной области чипа, полученного способом на основе микрочастиц с распределением по поверхности микрочастиц, меченных позиционными метками, составляет до 10 микрометров, а разрешающая способность достигает лишь уровня одиночных клеток, а субклеточный уровень не может быть достигнут.В данном изобретения предложена новая панель нуклеиновых кислот для пространственной детекции нуклеиновых кислот, способ ее получения и способ пространственной детекции нуклеиновых кислот с применением панели, позволяющий одновременно с высокой точностью определять субклеточную локализацию и с высокой производительностью определять локализацию в ткани, обладающий большой практической ценностью.
Получение панели нуклеиновых кислот
В первом аспекте данного изобретения предложен способ изготовления панели нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновых кислотах в биологическом образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление многочисленных видов последовательностей-носителей, каждый вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель в направлении от 5' к 3' содержит позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида
последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации;
(2) связывание многочисленных видов последовательностей-носителей с поверхностью твердой подложки (например, чипа);
(3) предоставление первого праймера и осуществление реакции элонгации праймера с использованием последовательности-носителя в качестве матрицы, так что область первой иммобилизующей последовательности и позиционной последовательности в последовательности-носителе образует двойную цепь, при этом цепь, которая гибридизуется с последовательностью-носителем, представляет собой молекулу первой нуклеиновой кислоты, молекула первой нуклеиновой кислоты в направлении от 5' к 3' содержит последовательность, комплементарную первой иммобилизующей последовательности и позиционной последовательности; причем первый праймер содержит на своем 3'-конце область, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, область, комплементарная первой иммобилизующей последовательности, содержит последовательность, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, или ее фрагмент и имеет свободный 3'-конец.
В некоторых воплощениях последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные последовательности нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК.
В некоторых воплощениях на стадии (3) при осуществлении реакции элонгации последовательность-носитель секвенируют для получения информации о последовательности позиционной последовательности, содержащейся в последовательности-носителе.
В некоторых воплощениях многочисленные виды
последовательностей-носителей на стадии (1) предоставлены посредством следующих стадий:
(i) предоставление многочисленных видов матриц последовательностей-носителей, матрица последовательности-носителя содержит последовательность, комплементарную последовательности-носителю;
(ii) с использованием каждого вида матрицы последовательности-носителя в качестве матрицы, осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с получением продукта амплификации каждого вида матрицы последовательности-носителя, при этом продукт амплификации содержит множество копий последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации.
В некоторых воплощениях амплификацию по типу катящегося кольца осуществляют для получения DNB (наношарика ДНК), образованного конкатемером последовательности-носителя. В таких воплощениях на стадии (i) предоставлена кольцевая матричная последовательность. Способ получения кольцевых молекул нуклеиновых кислот является стандартным способом в области техники и может быть выбран в соответствии с нуждами специалиста в области техники. Например, вначале может быть получена линейная матрица нуклеиновой кислоты, а затем при помощи лигазы (например, ДНК-лигазы) может быть выполнена циркуляризация линейной нуклеиновокислотной матрицы.
В некоторых воплощениях для получения кластера ДНК, образованного популяцией клонов последовательности-носителя, выполняют мостиковую ПЦР-амплификацию, эмульсионную ПЦР-амплификацию или амплификацию с множественным вытеснением цепи.
В некоторых воплощениях способ дополнительно включает следующие стадии:
(4) предоставление молекулы второй нуклеиновой кислоты, содержащей захватывающую последовательность;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
(5) лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты с молекулой первой нуклеиновой кислоты (например, лигируют молекулу второй нуклеиновой кислоты с молекулой первой нуклеиновой кислоты при помощи лигазы).
В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность ДНК. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность РНК.
В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность, и иммобилизующая область содержит двуцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты, такую как двуцепочечная последовательность ДНК. В некоторых воплощениях захватывающая последовательность, содержащаяся в молекуле второй нуклеиновой кислоты, представляет собой одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты, такую как одноцепочечная последовательность ДНК или одноцепочечная последовательность РНК. Легко понять, что в таких воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты имеет частично двуцепочечную структуру, что означает, что ее иммобилизующая область имеет двуцепочечную структуру, а ее захватывающая последовательность имеет одноцепочечную структуру.
В некоторых воплощениях двуцепочечная нуклеиновокислотная последовательность имеет длину от 1 пн (пар нуклеотидов) до 50 пн, например, от 10 пн до 50 пн, от 10 пн до 40 пн или от 10 пн до 30 пн.
В других воплощениях способ дополнительно включает следующие стадии:
(4) предоставление молекулы второй нуклеиновой кислоты, причем молекула второй нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент второй иммобилизующей последовательности и захватывающую последовательность;
комплемент второй иммобилизующей последовательности обеспечивает гибридизацию со своей комплементарной нуклеотидной последовательностью;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
(5) гибридизация комплемента второй иммобилизующей последовательности со второй иммобилизующей последовательностью в условиях, обеспечивающих отжиг, таким образом происходит лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты с последовательностью-носителем;
(6) возможно, лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и молекулы второй нуклеиновой кислоты, которые гибридизованы с последовательностью-носителем, соответственно (например, лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты и молекулы первой нуклеиновой кислоты при помощи лигазы).
В таких воплощениях каждая последовательность-носитель дополнительно содержит вторую иммобилизующую последовательность на своем 5'-конце, и вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности. В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации (например, она может применяться в качестве сайта связывания праймера для мостиковой ПЦР).
В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность ДНК. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность РНК.
В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность граничит с позиционной последовательностью.
В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность имеет длину от 1 до 50 пн, например, от 10 пи до 50 пи, от 10 пи до 40 пи, от 10 пи до 30 пн или от 10 пн до 20 пн.
В некоторых воплощениях на стадии (3) первый праймер дополнительно содержит последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI) на 5'-конце содержащейся в нем области, комплементарной первой иммобилизующей последовательности, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит последовательность UMI на 5'-конце содержащегося в ней комплемента первой иммобилизующей последовательности; или на стадии (4) молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, и последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности;
последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3. по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100, от 5 до 50, от 5 до 20, например, 10) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т.
В некоторых воплощениях когда первый праймер содержит последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI) на 5'-конце содержащейся в нем области, комплементарной первой иммобилизующей последовательности, первый праймер может дополнительно содержать дополнительную последовательность на 5'-конце последовательности UMI.
В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 20) остатков дезокситимидина.
В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип. В некоторых воплощениях твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования. В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип для высокопроизводительного секвенирования, такой как чип для высокопроизводительного секвенирования, используемый в платформах для секвенирования Illumina, MGI или Thermo Fisher.
Во втором аспекте данного изобретения предложен способ изготовления панели нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в биологическом образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление многочисленных видов последовательностей-носителей, каждый вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, последовательность-носитель в направлении от 5' к 3' содержит: матрицу захватывающей последовательности, позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,
матрица захватывающей последовательности содержит последовательность, комплементарную захватывающей последовательности, и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени;
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации; и первая иммобилизующая последовательность также содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER (урацил-специфический реагент для вырезания), фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами);
(2) связывание многочисленных видов последовательностей-носителей с поверхностью твердой подложки (например, чипа);
(3) предоставление первого праймера (обозначаемого праймер-зонд), первый праймер содержит в направлении от 5' к 3' область связывания, область расщепления и область, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, и область, комплементарная первой иммобилизующей последовательности, содержит последовательность, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, или ее фрагмент и имеет свободный 3'-конец; область связывания содержит линкер, который может быть лигирован с поверхностью твердой подложки; область расщепления содержит сайт расщепления;
осуществления реакции элонгации праймера с использованием первого праймера в качестве праймера и последовательности-носителя в качестве матрицы, так что область первой иммобилизующей последовательности, позиционная последовательность и матрица захватывающей последовательности последовательности-носителя образуют двуцепочечную цепь, где цепь, гибридизованная с последовательностью-носителем, представляет собой молекулу первой нуклеиновой кислоты, и молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность; молекула первой нуклеиновой кислоты также может обозначаться захватывающим зондом;
(4) связывание первого праймера с поверхностью твердой подложки; причем стадии (3) и (4) выполняют в любом порядке;
(5) возможно, осуществление расщепления в сайте расщепления, содержащемся в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя для разрезания последовательности-носителя, так что продукт элонгации на стадии (3) отделяется от матрицы (т.е. последовательности-носителя) с образованием продукта элонгации, так что молекула первой нуклеиновой кислоты (захватывающий зонд) лигируется с поверхностью твердой подложки (например, чипа).
Поскольку захватывающий зонд (т.е. молекулу первой нуклеиновой кислоты) получают, используя последовательность-носитель в качестве матрицы и осуществляя элонгацию праймера, захватывающий зонд содержит комплемент уникальной позиционной последовательности, соответствующей положению данного вида захватывающего зонда (данного вида последовательности-носителя) на панели, и захватывающую последовательность, которая может гибридизоваться со всей захватываемой молекулой нуклеиновой кислоты или ее частью. Положение данного вида захватывающего зонда на панели можно определять путем анализа комплемента позиционной последовательности.
В этой связи, выражение «каждый вид последовательности-носителя» обозначает последовательности-носители, содержащие одинаковую позиционную последовательность.
В некоторых воплощениях многочисленные виды последовательностей-носителей на стадии (1) предоставляют посредством следующих стадий:
(i) предоставление многочисленных видов матриц
последовательностей-носителей, матрица последовательности-носителя содержит последовательность, комплементарную последовательности-носителю;
(ii) осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с использованием каждого вида матрицы последовательности-носителя в качестве матрицы, с получением продукта амплификации каждого вида матрицы последовательности-носителя, при этом продукт амплификации содержит множество копий последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации.
В некоторых воплощениях амплификацию по типу катящегося кольца осуществляют с получением DNB, образованного конкатемером последовательности-носителя. В таких воплощениях на стадии (i) предоставляют кольцевую матричную последовательность. Способ получения кольцевых молекул нуклеиновых кислот является стандартным способом в области техники и может быть выбран в соответствии с нуждами специалиста в области техники. Например, вначале может быть получена линейная матрица нуклеиновой кислоты, а затем при помощи лигазы (например, ДНК-лигазы) может быть выполнена циркуляризация линейной матрицы нуклеиновой кислоты.
В некоторых воплощениях каждый вид последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный конкатемером множества копий последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях стадия (1) содержит следующие стадии:
(1а) предоставление матрицы кольцевой нуклеиновой кислоты, кольцевая матрица нуклеиновой кислоты содержит матрицу последовательности-носителя одного вида, матрица последовательности-носителя содержит последовательность, комплементарную последовательности-носителю, что означает, что матрица последовательности-носителя в направлении от 5' к 3' содержит комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность;
(1б) осуществление амплификации по типу катящегося кольца (RCA) с применением матрицы кольцевой нуклеиновой кислоты в качестве матрицы для получения наношарика ДНК (DNB), образованного конкатемером последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях для получения кластера ДНК, образованного популяцией клонов последовательности-носителя, выполняют мостиковую ПЦР-амплификацию, эмульсионную ПЦР-амплификацию или амплификацию с множественным вытеснением цепи.
В некоторых воплощениях сайт расщепления, содержащийся в первой иммобилизующей последовательности, представляет собой сайт расщепления для фермента никазы. В некоторых воплощениях фермент никаза выбран из USER, BamHI и BmtI. В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях сайт расщепления представлен SEQ ID NO: 14.
В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность дополнительно содержит область гибридизации праймера для секвенирования и/или область гибридизации праймера для амплификации; причем область гибридизации праймера для секвенирования обеспечивает отжиг праймера для секвенирования и инициацию реакции секвенирования, а область гибридизации праймера для амплификации обеспечивает отжиг праймера для амплификации и инициацию реакции элонгации и реакции амплификации.
В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину более 1 пн, например, более 10 пн или более 20 пн. В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину от 20 до 100 пн, например, от 20 до 80 пн.
В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину более 1 пн, например, более 10 пн. В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину от 10 до 100 пн, такую как от 10 до 50 пн, такую как от 10 до 30 пн, такую как 20 пн.
В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибрид изо в аться с поли-А хвостом мРНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 20) остатков дезокситимидина.
В некоторых воплощениях захватывающая последовательность имеет длину более 1 пн. В некоторых воплощениях захватывающая последовательность имеет длину от 1 до 100 пн, такую как от 10 до 50 пн, такую как от 10 до 30 пн.
В некоторых воплощениях последовательность-носитель дополнительно содержит комплемент последовательности UMI (также обозначаемой областью метки зонда), расположенной в направлении по ходу транскрипции от матрицы захватывающей последовательности и против хода транскрипции от первой иммобилизующей последовательности, комплемент последовательности UMI является комплементарным последовательности UMI, а последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5; например, от 5 до 100, от 5 до 50, от 5 до 20, например, 10) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой один из А, С, G и Т. В некоторых воплощениях комплемент последовательности UMI расположен между позиционной последовательностью и матрицей захватывающей последовательности. В других воплощениях комплемент последовательности UMI расположен между первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью. В таких воплощениях на стадии (3), когда осуществляют реакцию элонгации праймера, используя последовательность-носитель в качестве матрицы, молекула первой нуклеиновой кислоты/захватывающий зонд, которая гибридизуется с последовательностью-носителем, будет соответственно содержать последовательность UMI (также обозначаемую меткой зонда).
В некоторых воплощениях для получения вышеупомянутой последовательности UMI или комплементарной ей последовательности, матричная последовательность последовательности-носителя (т.е. матрица последовательности-носителя) содержит матрицу последовательности UMI в соответствующем положении, и матрица последовательности UMI представляет собой последовательность, состоящую из модифицированных оснований, модифицированные основания способны образовывать комплементарные пары посредством водородных связей с различными стандартными основаниями (например, С, G, А, Т, U); например, модифицированное основание может представлять собой инозин, который способен образовывать комплементарные пары с основаниями А, С и U. Не ограничиваясь какой-либо конкретной теорией, полагают, что когда матрица последовательности-носителя содержит матрицу последовательности UMI, каждый раз, когда происходит амплификация в процессе амплификации по типу катящегося кольца, основания, способные образовывать комплементарные пары с матрицей последовательности UMI, присоединяются случайным образом, так что продукт амплификации каждый раз имеет уникальную последовательность UMI, образующуюся случайным образом, благодаря чему продукт амплификации каждый раз отличается. Так, например, можно определить количество копий различных захваченных молекул нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях матрица последовательности UMI содержит множество (например, по меньшей мере 10, например, от 10 до 100) инозинов. В некоторых воплощениях матрица последовательности UMI имеет длину более 1 пи. В некоторых воплощениях матрица последовательности UMI имеет длину более 5 пи. В некоторых воплощениях матрица последовательности UMI имеет длину от 5 до 100 пн, такую как от 5 до 50 пн, такую как от 5 до 20 пн, такую как от 5 до 15 пн, такую как 10 пн.
В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип. В некоторых воплощениях твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования. В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип для секвенирования (MGI), такой как чип для секвенирования на платформе BGISEQ-500. В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой матричный чип высокой плотности, который может быть получен, например, способом, описанным в патенте CN 103180496 В.
Последовательность-носитель (например, DNB) может быть лигирована с поверхностью твердой подложки любым подходящим способом, известным в области техники. В некоторых воплощениях не являющиеся исчерпывающими примеры способа включают гибридизацию нуклеиновых кислот, связывание биотин-стрептавидин, связывание с сульфгидрильными группами, фото активируемое связывание, ковалентное связывание, связывание антитело-антиген, создание физических ограничений при помощи гидрогеля или других пористых полимерных материалов и т.д. или любую их комбинацию.
В некоторых воплощениях твердая подложка выбрана из следующих материалов: стекло, силикон, материал с полилизиновым покрытием, нитроцеллюлоза, полистирол, циклические олефиновые сополимеры (COCs), циклические олефиновые полимеры (COPs), полипропилен, полиэтилен или поликарбонат и т.д.
В некоторых воплощениях на стадии (3) при выполнении реакции элонгации праймера последовательность-носитель (например, содержащуюся в ней позиционную последовательность) секвенируют, чтобы получить информацию о последовательности позиционной последовательности, содержащейся в последовательности-носителе.
В некоторых воплощениях перед стадией (3) дополнительно включают стадию секвенирования последовательности-носителя (например, содержащейся в ней позиционной последовательности). В некоторых воплощениях после выполнения секвенирования выполняют промывание для удаления дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфаты), добавленных к синтетической цепи при секвенировании.
В некоторых воплощениях линкер представляет собой линкерную группу, способную связываться с активирующей группой (например, NH2). В таких воплощениях поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой (например, NH2). В некоторых воплощениях линкер содержит -SH, -DBCO (дибензоциклооктин), -NHS и тому подобное. В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях линкер представляет собой DBCO, а сложный эфир азидо-dPEG®8-NHS присоединен к поверхности твердой подложки.
В некоторых воплощениях сайт расщепления, содержащийся в области расщепления первого праймера, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом. В некоторых воплощениях сайт расщепления представляет собой сайт расщепления ферментом. В некоторых воплощениях сайт фермента представляет собой сайт фермента USER (UUU).
В некоторых воплощениях область расщепления первого праймера отличается от сайта расщепления, содержащегося в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях амплификация включает ПЦР.
Панель нуклеиновых кислот и набор
В третьем аспекте данного изобретения предложена панель нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающая в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид последовательности-носителя занимает определенное положение в панели, каждый вид последовательности-носителя содержит множество копий
последовательности-носителя, и последовательность-носитель в направлении от 5' к 3' содержит позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации.
В некоторых воплощениях каждый вид указанной последовательности-носителя (т.е. последовательности-носители, содержащие одинаковую позиционную последовательность) занимает область (т.е. активную область) на поверхности твердой подложки, имеющую диаметр менее 1 микрометра, например, приблизительно 900 нанометров, приблизительно 800 нанометров, приблизительно 700 нанометров, приблизительно 600 нанометров или приблизительно 500 нанометров.
В некоторых воплощениях панель нуклеиновых кислот дополнительно содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, причем молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности и комплемент позиционной последовательности, и образует двуцепочечную структуру вследствие гибридизации с первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью последовательности-носителя. Легко понять, что в молекуле первой нуклеиновой кислоты только комплемент первой иммобилизующей последовательности и комплемент позиционной последовательности комплементарны соответствующим последовательностям последовательности-носителя и таким образом образуют двойную цепь, так что двойная цепь, образованная первой иммобилизующей последовательностью и последовательностью-носителем, представляет собой неполную двойную цепь, то есть частично двуцепочечную структуру.
В некоторых воплощениях каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, гибридизованную с ней.
В некоторых воплощениях последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные последовательности нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК.
В некоторых воплощениях панель нуклеиновых кислот дополнительно содержит молекулу второй нуклеиновой кислоты, причем молекула второй нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой первой нуклеиновой кислоты, тем самым оказываясь иммобилизованной на панели нуклеиновых кислот, и молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации.
В некоторых воплощениях каждая молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты.
В некоторых воплощениях 5'-конец молекулы второй нуклеиновой кислоты лигирован с 3'-концом молекулы первой нуклеиновой кислоты.
В других воплощениях панель нуклеиновых кислот дополнительно содержит молекулу второй нуклеиновой кислоты, причем молекула второй нуклеиновой кислоты гибридизована с последовательностью-носителем, тем самым оказываясь иммобилизованной на панели нуклеиновых кислот.
В таких воплощениях каждая последовательность-носитель дополнительно содержит вторую иммобилизующую последовательность на своем 5' конце, вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и
молекула второй нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент второй иммобилизующей последовательности и захватывающую последовательность; комплемент второй иммобилизующей последовательности гибридизуется во второй иммобилизующей последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации.
В некоторых воплощениях каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит молекулу второй нуклеиновой кислоты, гибридизованную с ней.
В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации (например, она может применяться в качестве сайта связывания праймера для мостиковой ПЦР).
В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность граничит с позиционной последовательностью.
В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты имеет модификацию 5'-конца. В некоторых воплощениях модификация представляет собой фосфорилирование или модификацию биотином.
В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность ДНК. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную последовательность РНК.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой продукт амплификации, образованный путем амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю, и амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный конкатемером последовательности-носителя. В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный путем амплификации по типу катящегося кольца с использованием в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством мостиковой ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством эмульсионной ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством амплификации с множественным вытеснением цепи с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях молекула первой нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI), и последовательность UMI расположена на 5'-конце комплемента первой иммобилизующей последовательности; или молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, и последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности;
последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100, от 5 до 50, от 5 до 20, например, 10) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т.
В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип. В некоторых воплощениях твердую подложку можно применять в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования. В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип для высокопроизводительного секвенирования, такой как чип для высокопроизводительного секвенирования, используемый в платформах для секвенирования Illumina, MGI или Thermo Fisher.
В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 20) остатков дезокситимидина.
В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину более 1 нт (нуклеотида), например, более 5 нт. В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину от 5 до 50 нт, такую как от 10 до 50 нт, от 10 до 30 нт или от 20 до 30 нт. В некоторых воплощениях длина позиционной последовательности, содержащейся в различных видах последовательности-носителя может быть одинаковой или различной.
В некоторых воплощениях захватывающая последовательность имеет длину более 1 нт. В некоторых воплощениях захватывающая последовательность имеет длину от 1 до 100 нт, такую как от 1 до 50 нт, такую как от 10 до 30 нт.
В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину более 1 нт, такую как более 10 нт. В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину от 10 до 200 нт. В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину от 20 до 100 нт, такую как от 20 до 50 нт.
В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность имеет длину более 1 нт, такую как более 10 нт. В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину от 10 до 200 нт, например, от 10 до 100 нт, от 10 до 50 нт, от 10 до 30 нт или от 10 до 20 нт.
В четвертом аспекте данного изобретения предложен набор для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, содержащий: (1) панель нуклеиновых кислот по третьему аспекту, не содержащую молекулу второй нуклеиновой кислоты; и (2) молекулу второй нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации.
В некоторых воплощениях набор содержит: (i) панель нуклеиновых кислот, включающую в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид последовательности-носителя занимает отличное от другого вида положение в панели, при этом каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель в направлении от 5' к 3' содержит позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации;
панель нуклеиновых кислот также содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности и комплемент позиционной последовательности и гибридизуется с первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;
и (ii) молекулу второй нуклеиновой кислоты, иммобилизующая область которой содержит двуцепочечную последовательность ДНК.
Легко понять, что для лигирования молекулы второй нуклеиновой кислоты, описанной в (ii) с молекулой первой нуклеиновой кислоты, содержащейся в панели нуклеиновых кислот, описанной в (i), может применяться лигаза. Таким образом, в некоторых воплощениях набор дополнительно содержит лигазу.
В других воплощениях набор содержит: (i) панель нуклеиновых кислот, включающую в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, причем каждый вид последовательности-носителя занимает на панели отличное от другого вида положение, каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель содержит в направлении от 5' к 3': вторую иммобилизующую последовательность, позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,
вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности;
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации;
панель нуклеиновых кислот также содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности и комплемент позиционной последовательности и гибридизуется с первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;
и (ii) молекулу второй нуклеиновой кислоты, иммобилизующая область которой содержит комплемент второй иммобилизующей последовательности.
В некоторых воплощениях вторая иммобилизующая последовательность граничит с позиционной последовательностью.
Легко понять, что в условиях, обеспечивающих отжиг, молекула второй нуклеиновой кислоты, описанная в (ii), может гибридизоваться с комплементарной областью последовательности-носителя, содержащейся в панели нуклеиновых кислот, описанной в (i), поэтому молекула второй нуклеиновой кислоты может быть лигирована с молекулой первой нуклеиновой кислоты при помощи лигазы. Таким образом, в некоторых воплощениях набор дополнительно содержит лигазу.
В другом аспекте данное изобретение также относится к применению панели нуклеиновых кислот по третьему аспекту или набора по четвертому аспекту для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце или для изготовления детектирующего реагента для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце.
В некоторых воплощениях пространственная информация о нуклеиновой кислоте включает расположение, распределение и/или экспрессию нуклеиновой кислоты.
В некоторых воплощениях образец представляет собой образец ткани, такой как образец ткани, содержащий клетки. В некоторых воплощениях образец представляет собой срез ткани. В некоторых воплощениях срез ткани готовят из фиксированной ткани, например, фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPE) ткани или ткани, подвергнутой глубокой заморозке.
В пятом аспекте данное изобретение также относится к панели нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающей в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид последовательности-носителя занимает отличное от другого вида положение в панели, при этом каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель содержит в направлении от 5' к 3': матрицу захватывающей последовательности, позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность, где
матрица захватывающей последовательности содержит последовательность, комплементарную захватывающей последовательности, и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей или частью захватываемой нуклеиновой кислоты, включая в себя: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени;
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации; и первая иммобилизующая последовательность также содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER, фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR;
панель нуклеиновых кислот также содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты (также обозначаемую захватывающим зондом), и молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3': связывающую область, область расщепления и область, комплементарную последовательности-носителю,
связывающая область содержит линкер, способный связываться с поверхностью твердой подложки;
область расщепления содержит сайт расщепления;
область, комплементарная последовательности-носителю, содержит последовательность, которая может быть комплементарна последовательности-носителю, и содержит в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность, и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле первой нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
и область, комплементарная последовательности-носителю первой молекулы нуклеиновой кислоты гибридизуется с последовательностью-носителем с образованием двойной цепи.
В некоторых воплощениях последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные последовательности нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные последовательности ДНК.
В некоторых воплощениях каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит вышеупомянутую молекулу первой нуклеиновой кислоты, гибрид изо ванную с ней.
В некоторых воплощениях линкер молекулы первой нуклеиновой кислоты представляет собой линкерную группу, способную соединяться с активирующей группой (например, NH2), и поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой (например, NH2). В некоторых воплощениях линкер содержит -SH, -DBCO или -NHS. В некоторых воплощениях линкер представляет собой 
(DBCO) a 
(сложный эфир азидо-dPEG®8-NHS) присоединен к поверхности твердой подложки.
В некоторых воплощениях сайт расщепления, содержащийся в первой иммобилизующей последовательности, представляет собой сайт расщепления для фермента никазы. В некоторых воплощениях фермент никаза выбран из USER, BamHI, BmtI и тому подобного. В некоторых приведенных в качестве примера воплощениях сайт расщепления приведен в SEQ ID NO: 14.
В некоторых воплощениях сайт расщепления, содержащийся в области расщепления молекула первой нуклеиновой кислоты, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом. В некоторых воплощениях сайт расщепления представляет собой сайт расщепления ферментом. В некоторых воплощениях сайт расщепления представляет собой сайт расщепления фермента USER (UUU).
В некоторых воплощениях область расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты отличается от сайта расщепления, содержащегося в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях панель нуклеиновых кислот получают способом, описанным во втором аспекте.
В некоторых воплощениях множественные копии последовательности-носителя представляют собой продукт амплификации, образованный путем амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю, и амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный конкатемером последовательности-носителя. В некоторых воплощениях множественные копии последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный путем амплификации по типу катящегося кольца с использованием в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством мостиковой ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством эмульсионной ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством амплификации с множественным вытеснением цепи с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
В некоторых воплощениях последовательность-носитель дополнительно содержит комплемент последовательности UMI, расположенный в направлении по ходу транскрипции от матрицы захватывающей последовательности и против хода транскрипции от первой иммобилизующей последовательности, комплемент последовательности UMI комплементарен последовательности UMI, а последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую по меньшей мере из 1 (например, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3. по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5, например, от 5 до 100, от 5 до 50,от 5 до 20, например, 10) нуклеотида N, где каждый N независимо представляет собой один из А, С, G и Т;
и область молекулы первой нуклеиновой кислоты, комплементарная последовательности-носителю, дополнительно содержит последовательность UMI. расположенную в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и в направлении по ходу транскрипции от комплемента первой иммобилизующей последовательности.
В некоторых воплощениях комплемент последовательности UMI расположен между позиционной последовательностью и матрицей захватывающей последовательности или между первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью.
В некоторых воплощениях каждая копия каждого вида последовательности-носителя (т.е. последовательностей-носителей, содержащих одинаковую позиционную последовательность) содержит уникальный комплемент последовательности UMI. Соответственно, молекула первой нуклеиновой кислоты (захватывающий зонд), гибридизованная с каждой из копий последовательности-носителя, также имеет уникальную последовательность UMI.
В некоторых воплощениях последовательность-носитель удаляют с панели нуклеиновых кислот благодаря сайту расщепления, содержащемуся в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя. В таких воплощениях панель нуклеиновых кислот включает в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами захватывающих зондов (молекул первой нуклеиновой кислоты), присоединенных к ее поверхности, и каждый вид захватывающего зонда (молекулы первой нуклеиновой кислоты) занимает определенное положение в панели и ориентирован таким образом, чтобы иметь свободный 3'-конец, позволяющий захватывающему зонду (молекуле первой нуклеиновой кислоты) служить праймером для элонгации, при этом каждый вид захватывающего зонда (молекулы первой нуклеиновой кислоты) содержит в направлении от 5' к 3': связывающую область, область расщепления, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность, где
связывающая область содержит линкер, способный связываться с поверхностью твердой подложки;
область расщепления содержит сайт расщепления;
позиционная последовательность соответствует положению данного вида захватывающего зонда на панели;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей или частью захватываемой нуклеиновой кислоты и содержит: (1а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (1б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени.
В некоторых воплощениях каждый захватывающий зонд каждого вида захватывающего зонда (т.е. захватывающих зондов, содержащих одинаковую позиционную последовательность/комплемент позиционной последовательности) имеет уникальную последовательность UMI, и последовательность UMI расположена в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и в направлении по ходу транскрипции от области расщепления. В некоторых воплощениях последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности, например, между захватывающей последовательностью и комплементом позиционной последовательности. В других воплощениях последовательность UMI расположена на 5'-конце комплемента позиционной последовательности, например, между областью расщепления и комплементом позиционной последовательности.
В некоторых воплощениях каждый вид вышеупомянутой последовательности-носителя (т.е. последовательностей-носителей, содержащих одинаковую позиционную последовательность) или каждый вид захватывающего зонда занимает на поверхности твердой подложки область (т.е. активную область), имеющую диаметр менее 1 микрометра, например, приблизительно 900 нанометров, приблизительно 800 нанометров, приблизительно 700 нанометров, приблизительно 600 нанометров или приблизительно 500 нанометров. В некоторых воплощениях каждый вид вышеупомянутой последовательности-носителя или каждый вид захватывающего зонда занимает активную область диаметром приблизительно 500 нанометров.
В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип. В некоторых воплощениях твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования. В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой чип для секвенирования (MGI), такой как для платформы BGISEQ-500. В некоторых воплощениях твердая подложка представляет собой матричный чип высокой плотности, который может быть получен, например, способом, описанным в патенте CN 103180496 В.
В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину более 1 пн, такую как более 10 пн или более 20 пн. В некоторых воплощениях первая иммобилизующая последовательность имеет длину от 20 до 100 пн, такую как от 20 до 80 пн.
В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину более 1 пн, такую как более 10 пн. В некоторых воплощениях позиционная последовательность имеет длину от 10 до 100 пн, такую как от 10 до 50 пн, такую как от 10 до 30 пн, такую как 20 пн.
В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т. В некоторых воплощениях олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 20) остатков дезокситимидина.
В некоторых воплощениях захватывающая последовательность имеет длину более 1 пн. В некоторых воплощениях захватывающая последовательность имеет длину от 1 до 100 пн, такую как от 10 до 50 пн, такую как от 10 до 30 пн.
Способ детектирования
В шестом аспекте данного изобретения предложен способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по третьему аспекту или получение панели нуклеиновых кислот способом по первому аспекту; причем
панель нуклеиновых содержит многочисленные виды последовательностей носителя, присоединенные к поверхности твердой подложки (например, чипа), каждый вид последовательности-носителя занимает определенное положение в панели, и каждый указанный вид последовательности носителя содержит множество копий последовательности-носителя;
каждая копия последовательности-носителя содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты и молекулу второй нуклеиновой кислоты, гибридизованные с ней, и молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты не лигированы друг с другом;
молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующей положению данного вида последовательности-носителя на панели,
молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы второй нуклеиновой кислоты, и положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением последовательности-носителя на панели нуклеиновых кислот;
(3) (i) лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и молекулы второй нуклеиновой кислоты, которые гибридизованы с каждой копией последовательности-носителя (например, с применением лигазы);
осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве праймера лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот и применением захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, так чтобы получить продукт элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с захваченной молекулой нуклеиновой кислоты, имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации; и/или
осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве праймера захваченной молекулы нуклеиновой кислоты, и применением лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, так чтобы получить удлиненную молекулу захваченной нуклеиновой кислоты, причем удлиненная молекула захваченной нуклеиновой кислоты имеет позиционную последовательность в качестве метки пространственной информации;
альтернативно, (ii) осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве праймера молекулы второй нуклеиновой кислоты и применением захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, так чтобы получить удлиненную молекулу второй нуклеиновой кислоты, причем удлиненная молекула второй нуклеиновой кислоты содержит последовательность, комплементарную захваченной нуклеиновой кислоте; лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и удлиненной молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с каждой копией последовательности-носителя (например, с применением лигазы), так что удлиненная молекула второй нуклеиновой кислоты, лигированная с молекулой первой нуклеиновой кислоты, имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул нуклеиновых кислот, несущих метки пространственной информации, причем часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь и захваченную молекулу нуклеиновой кислоты или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ информации о последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4).
В таких воплощениях до захвата нуклеиновой кислоты-мишени на стадии (2) молекула первой нуклеиновой кислоты не лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты в панели нуклеиновых кислот.
В седьмом аспекте данного изобретения предложен способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по первому аспекту или получение панели нуклеиновых кислот способом по третьему аспекту; где
панель нуклеиновых содержит многочисленные виды последовательностей-носителей, присоединенные к поверхности твердой подложки (например, чипа), каждый вид последовательности-носителя занимает определенное положение в панели, и каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя;
каждая копия последовательности-носителя содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, гибридизованную с ней, и молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты;
молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующей положению данного вида последовательности-носителя на панели,
молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы второй нуклеиновой кислоты, и положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением последовательности-носителя на панели нуклеиновых кислот;
(3) (iii) осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве праймера лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот и применением захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, так чтобы получить продукт элонгации, в котором цепь, гибридизованная с захваченной молекулой нуклеиновой кислоты, имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации; и/или
осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве праймера захваченной молекулы нуклеиновой кислоты, и применением лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, так чтобы получить удлиненную молекулу захваченной нуклеиновой кислоты, причем удлиненная последовательность захваченной нуклеиновой кислоты имеет позиционную последовательность в качестве метки пространственной информации;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул нуклеиновых кислот, несущих метки пространственной информации, причем часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь и захваченную молекулу нуклеиновой кислоты или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ информации о последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4).
В таких воплощениях до захвата нуклеиновой кислоты-мишени на стадии (2) молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты в панели нуклеиновых кислот.
В некоторых воплощениях способа по шестому или седьмому аспекту многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой DNB, образованный конкатемером последовательности-носителя, или множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя.
В некоторых воплощениях способа по шестому или седьмому аспекту последовательность-носитель и молекула первой нуклеиновой кислоты представляют собой одноцепочечные ДНК. В некоторых воплощениях молекула второй нуклеиновой кислоты представляет собой одноцепочечную ДНК или одноцепочечную РНК.
В восьмом аспекте данного изобретения предложен способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот согласно пятому аспекту или получение панели нуклеиновых кислот способом согласно второму аспекту; причем панель нуклеиновых содержит многочисленные виды последовательностей-носителей, присоединенные к поверхности твердой подложки (например, чипа), каждый вид последовательности-носителя занимает определенное положение в панели, и каждый указанный вид последовательности-носителя содержит многочисленные копии последовательности-носителя;
каждая копия последовательности-носителя содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, гибридизованную с ней, и молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующий положению данного вида последовательности-носителя в панели, и захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы первой нуклеиновой кислоты, и таким образом положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением молекулы первой нуклеиновой кислоты в панели нуклеиновых кислот;
(3) осуществление реакцию элонгации праймера с применением в качестве праймера молекулы первой нуклеиновой кислоты и применением захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, гибридизованная с захваченной молекулой нуклеиновой кислоты, имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул нуклеиновых кислот, несущих метки пространственной информации, причем часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь и захваченную молекулу нуклеиновой кислоты или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ информации о последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4).
В некоторых воплощениях перед стадией (2) способ дополнительно включает расщепление в сайте расщепления, содержащемся в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя для разрезания последовательности-носителя и, в тоже время, лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты (захватывающего зонда) с поверхностью твердой подложки (например, чипа); В таких воплощениях панель нуклеиновых кислот содержит многочисленные виды захватывающих зондов, присоединенных к поверхности твердой подложки (например, чипа), каждый вид захватывающего зонда занимает определенное положение в панели, и захватывающий зонд содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующей положению вида захватывающего зонда в панели, и захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью захватывающего зонда, и положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением захватывающего зонда на панели;
(3) осуществление реакции элонгации праймера с использованием захватывающего зонда в качестве праймера и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонагцию праймера, при этом полученный продукт элонгации содержит комплемент позиционной последовательности в качестве метки пространственной информации и последовательность, комплементарную молекуле захваченной нуклеиновой кислоты, с образованием молекулы ДНК, несущей метку пространственной информации; возможно, создают цепь, комплементарную молекуле ДНК, несущей метку пространственной информации, и/или возможно, амплифицируют молекулу ДНК, несущую метку пространственной информации;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул ДНК, несущих метки пространственной информации, и/или их комплементов или ампликонов, причем часть содержит метку пространственной информации или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ информации о последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4).
В некоторых воплощениях способа по восьмому аспекту молекула первой нуклеиновой кислоты и захватывающий зонд представляют собой молекулы ДНК, такие как одноцепочечные ДНК.
В некоторых воплощениях способа по любому из аспектов с шестого по восьмой, пространственная информация о нуклеиновой кислоте включает расположение, распределение и/или экспрессию нуклеиновой кислоты.
В некоторых воплощениях способа по любому из аспектов с шестого по восьмой образец представляет собой образец ткани, такой как срез ткани. В некоторых воплощениях срез ткани готовят из фиксированной ткани, например, фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPE) ткани или ткани, подвергнутой глубокой заморозке.
В некоторых воплощениях способа по любому из аспектов с шестого по восьмой способ применяют в недиагностических целях.
В некоторых воплощениях способа, описанного в любом из аспектов с шестого по восьмой, на стадии (5) можно применять любой способ анализа нуклеиновых кислот. В некоторых воплощениях эта стадия может включать секвенирование. В некоторых воплощениях можно применять способы анализа, специфичные к последовательности. Например, можно осуществлять специфичную к последовательности реакцию амплификации, например, используя праймеры, специфичные к позиционному домену и/или к специфической последовательности-мишени (например, конкретной детектируемой ДНК). Примером способа анализа является специфичная к последовательности реакция ПЦР. Таким образом, в некоторых воплощениях данная стадия может включать специфичную к последовательности реакцию ПЦР.
В некоторых воплощениях способа, описанного в любом из аспектов с шестого по восьмой, информация, полученная при анализе последовательности на стадии (5), может применяться для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце (т.е. информации о положении). В некоторых воплощениях пространственная информация может быть выведена из характера информации, полученной в ходе анализа последовательности, например, может быть обнаружено присутствие конкретной нуклеиновой кислоты, что может само по себе быть информативным в отношении использованного образца ткани, и/или пространственная информация (например, пространственная локализация) может быть выведена из положения образца ткани в панели, вкупе с информацией, полученной при секвенировании. Таким образом, способ может включать простое сопоставление информации, полученной при анализе последовательности, с положением в образце ткани, например, благодаря позиционной метке и сопоставлению с положением в образце ткани. В некоторых воплощениях пространственную информацию можно удобно получать путем сопоставления данных анализа последовательности с изображением образца ткани. Следовательно, в таких воплощениях способ согласно любому из аспектов с шестого по восьмой дополнительно включает стадию (6): сопоставление информации, полученной при анализе последовательности на стадии (5), с изображением образца, где изображение образца получают до или после стадии (3). В некоторых воплощениях изображение образца получают с применением световой, светлопольной, темнопольной, фазовоконтрастной, флуоресцентной, отражательной, интерференционной, конфокальной микроскопии или их комбинации.
В некоторых воплощениях способа по шестому аспекту способ применяют для определения транскриптома в образце. В таких воплощениях на стадии (3)(i) создают молекулу кДНК из захваченной молекулы РНК с применением лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера для обратной транскрипции, указанная молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и возможно, молекулу кДНК амплифицируют; или на стадии (3)(ii) создают молекулу кДНК из захваченной молекулы РНК с применением молекулы второй нуклеиновой кислоты в качестве праймера для обратной транскрипции, и молекулу первой нуклеиновой кислоты и молекулу кДНК, гибридизованные с каждой последовательностью-носителем, лигируют (например, с применением лигазы) для создания молекулы кДНК, имеющей в качестве метки пространственной информации комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и возможно, молекулу кДНК амплифицируют; и на стадии (4) по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов высвобождают с поверхности панели, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может быть первой и/или второй цепью молекулы кДНК или ее ампликоном, и где часть содержит последовательность, несущую пространственную информацию, или комплементарную ей цепь. В некоторых воплощениях на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.
В некоторых воплощениях способа по седьмому аспекту способ применяют для определения транскриптома в образце. В таких воплощениях на стадии (3)(iii) создают молекулу кДНК из захваченной молекулы РНК с применением лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера для обратной транскрипции, молекула кДНК имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации, и возможно, молекулу кДНК амплифицируют; и на стадии (4) по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов высвобождают с поверхности панели, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может быть первой и/или второй цепью молекулы кДНК или ее ампликоном, и причем часть содержит последовательность, несущую пространственную информацию, или комплементарную ей цепь. В некоторых воплощениях на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.
В некоторых воплощениях способа по восьмому аспекту способ применяют для определения транскриптома в образце. В таких воплощениях на стадии (3) создают молекулу кДНК из захваченной молекулы РНК с использованием захватывающего зонда в качестве праймера для обратной транскрипции, молекула кДНК имеет метку пространственной информации, и возможно, молекулу кДНК амплифицируют; на стадии (4) по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов высвобождают с поверхности панели, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может быть первой и/или второй цепью молекулы кДНК или ее ампликоном, и причем часть содержит последовательность метки пространственной информации или комплементарную ей цепь. В некоторых воплощениях на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.
В некоторых воплощениях способа по любому из аспектов с шестого по восьмой до или после высвобождения с поверхности панели молекулы нуклеиновой кислоты (например, молекулы ДНК), несущей метку пространственной информации, или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации, образуется комплементарная цепь или вторая цепь кДНК.
Стадия образования второй цепи ДНК (например, кДНК) может осуществляться на панели in situ, либо как отдельная стадия синтеза второй цепи, либо как начальная стадия реакции амплификации. Альтернативно, первая цепь ДНК, например, кДНК (т.е. цепь, синтезированная с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы) может быть высвобождена с панели и затем может быть осуществлен синтез второй цепи, например, в реакции протекающей в растворе, либо в виде отдельной стадии или в реакции амплификации.
Когда синтез второй цепи осуществляют на панели (т.е. in situ), способ может включать возможную стадию удаления захваченной молекулы нуклеиновой кислоты (например, РНК) перед синтезом второй цепи, например, с применением фермента, расщепляющего РНК (РНКазы), например, РНКазы Н. Способы для этого хорошо известны и описаны в области техники. Однако, данная стадия обычно является необязательной, и в большинстве случаев РНК подвергается деградации естественным образом. Стадия удаления образца с панели обычно также обеспечивает удаление РНК с панели.
В некоторых воплощениях вторая цепь ДНК (например, кДНК) образуется в единственной реакции, и синтез второй цепи может осуществляться любым подходящим способом, известным в области техники. Например, первую цепь кДНК, отделяющуюся от субстрата панели, можно инкубировать со случайными праймерами, например, с гексамерными праймерами, и ДНК полимеразой, например, полимеразой, обеспечивающей вытеснение цепи, для осуществления реакции синтеза ДНК с применением первой цепи в качестве матрицы. Таким образом, в некоторых воплощениях в синтезе комплементарной цепи или второй цепи используют случайный праймер и полимеразу, обеспечивающую вытеснение цепи.
В некоторых воплощениях способа по любому из аспектов с шестого по восьмой, перед анализом последовательности дополнительно включают стадию амплификации молекул нуклеиновых кислот (например, молекулы ДНК) или молекул кДНК, несущих метку пространственной информации. В некоторых воплощениях стадию амплификации выполняют после высвобождения с панели молекул нуклеиновых кислот (например, молекул ДНК) или молекул кДНК, несущих метки пространственной информации, или стадию амплификации выполняют на панели in situ (т.е. когда молекулы первой нуклеиновой кислоты и/или последовательности-носители и/или захватывающие зонды все еще лигированы с поверхностью твердой подложки). В некоторых воплощениях стадия амплификации включает ПЦР.
В некоторых воплощениях способа, описанного в любом из аспектов с шестого по восьмой на стадии (4) молекула высвобождается с поверхности панели следующим способом: (1) расщеплением нуклеиновой кислоты; (2) денатурацией и/или (3) физическим способом. В некоторых воплощениях молекула высвобождается под воздействием на твердую подложку нагретой воды или буфера.
В некоторых воплощениях перед секвенированием дополнительно включают стадию очистки высвобожденной молекулы.
В некоторых воплощениях после приведения в контакт образца с панелью и перед стадией (3) дополнительно включают стадию регидратации образца.
В некоторых воплощениях перед стадией (4) способ дополнительно включает стадию промывания панели для удаления остатков образца (например, ткани).
В некоторых воплощениях панель содержит по меньшей мере один маркер ориентации для ориентации образца на панели.
В некоторых воплощениях на стадии (5) анализ последовательности включает стадию секвенирования. В некоторых воплощениях стадия секвенирования включает реакцию секвенирования на основе обратимых меченых красителем терминаторов.
Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте по любому из аспектов с шестого по восьмой данного изобретения можно применять для детектирования РНК, в транскриптомном анализе, для детектирования ДНК, в геномном анализе и тому подобном. Пространственная информация имеет огромное значение для исследований, связанных с транскриптомикой и геномикой, особенно полезна в исследовании транскриптомных или геномных вариаций в различных клетках или участках тканей, таких как сравнительное исследование нормальных и патологических клеток или тканей, или исследование транскриптомных или геномных изменений в ходе заболевания и т.д.
Например, патофизиологический анализ при болезни Альцгеймера показывает, что его патологический процесс затрагивает взаимодействие нейронов и клеток глии, а смежные транскриптомные и эпигенетические исследования также обнаружили серьезное нарушение функции нейронов в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера и аномалии врожденного иммунного ответа. Однако, исследования на уровне популяции не смогли выявить сложных изменений в клетках и в популяциях клеток, в частности, в указанных редких типах клеток. В то же время обычные исследования на уровне одиночных клеток не позволяют выявить различия в характеристиках специфических типов клеток в различных областях ткани и изменения в клеточном составе в процессе нейродегенерации. Следовательно, для дальнейшего изучения патогенетического механизма и процесса развития заболеваний необходимо получить информацию о транскриптоме одиночных клеток наряду с пространственными характеристиками.
Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте по любому из аспектов с шестого по восьмой данного изобретения позволяет иммобилизовать молекулы нуклеиновых кислот в различных областях образца ткани мозга на чипе благодаря захватывающей последовательности с позиционной меткой, лигированной с чипом, и осуществить секвенирование, так что полученные результаты транскриптомного анализа, включающие информацию о точном положении, позволяют обнаружить изменения в определенных типах клеток в различных областях в ходе прогрессирования болезни Альцгеймера. В частности, поскольку размеры активной области DNB или кластера ДНК на чипе по данному изобретению относятся к нанометровому диапазону, а диаметр клетки составляет приблизительно 12 мкм, чип по данному изобретению позволяет получить информацию о пространственном расположении с разрешением на субклеточном уровне.
Данное изобретение также включает в себя следующие приведенные в качестве примера воплощения.
Воплощение 1. Способ изготовления панели нуклеиновых кислот, применяющейся для получения пространственной информации о биомолекуле (например, нуклеиновой кислоты) в биологическом образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление матрицы кольцевой нуклеиновой кислоты, содержащей матричную последовательность некоего захватывающего зонда, и матричная последовательность содержит в направлении от 5' к 3' линкерную область, область пространственной метки и захватывающую область; при этом
линкерная область содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER, фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR;
область пространственной метки содержит последовательность пространственной метки, и последовательность пространственной метки соответствует положению данного захватывающего зонда в панели;
захватывающая область содержит захватывающую последовательность, способную захватывать биомолекулу (например, нуклеиновую кислоту) в образце; при этом захватывающая последовательность содержит: (1а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (16) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной молекулы-мишени (например, нуклеиновой кислоты-мишени);
(2) осуществление амплификации по типу катящегося кольца (RCA) с применением матрицы кольцевой нуклеиновой кислоты в качестве матрицы для получения наношарика ДНК (DNB), который образуется конкатемером последовательности, комплементарной последовательности матрицы (т.е. последовательности, комплементарной матрице);
(3) лигирование DNB с поверхностью твердой подложки (например, чипа);
(4) предоставление праймера-зонда и, используя комплементарную матрице последовательность, содержащуюся в DNB, в качестве матрицы, осуществление реакции элонгации праймера с получением продукта элонгации, причем цепь, гибридизованная с последовательностью, комплементарной матрице, представляет собой захватывающий зонд; возможно, амплификации продукта элонгации; при этом праймер-зонд содержит в направлении от 5' к 3' область связывания, область расщепления и линкерную область праймера; причем
область связывания содержит линкер, который может быть связан с поверхностью твердой подложки;
область расщепления содержит сайт расщепления;
линкерная область праймера комплементарна всей или части последовательности линкерной области комплементарной матрице последовательности, содержащейся в DNB (т.е. последовательности, комплементарной линкерной области последовательности матрицы) и имеет свободный 3'-конец, позволяющий праймеру-зонду служить праймером и инициировать реакцию элонгации; предпочтительно, линкерная область праймера содержит последовательность линкерной области последовательности матрицы или ее фрагмент;
(5) связывание праймера-зонда с поверхностью твердой подложки; причем стадии (4) и (5) выполняют в любом порядке;
(6) выполнение расщепления в сайте расщепления, содержащемся в линкерной области, для разрезания DNB, так что продукт элонгации на стадии (4) отделяется от матрицы DNB, образующей продукт элонгации, таким образом, захватывающий зонд лигируется с поверхностью твердой подложки (например, чипа);
предпочтительно, матрица кольцевой нуклеиновой кислоты, DNB и захватывающий зонд представляют собой ДНК;
предпочтительно, для получения твердой подложки (например, чипа) с многочисленными видами захватывающих зондов, присоединенных к ее поверхности, на стадии (1) предоставляют многочисленные виды матриц кольцевых нуклеиновых кислот, и каждый вид матрицы кольцевой нуклеиновой кислоты содержит уникальную матричную последовательность захватывающего зонда.
Воплощение 2. Способ по воплощению 1, где сайт расщепления, содержащийся в линкерной области, представляет собой сайт расщепления для фермента никазы;
предпочтительно, фермент никаза выбран из USER, BamHI и BmtI.
Воплощение 3. Способ по воплощению 1 или 2, где линкерная область дополнительно содержит область гибридизации праймера для секвенирования и/или область гибридизации праймера для амплификации; где область гибридизации праймера для секвенирования обеспечивает отжиг праймера для секвенирования и инициацию реакции секвенирования, а область гибридизации праймера для амплификации обеспечивает отжиг праймера для амплификации и инициацию реакции элонгации и реакции амплификации.
Воплощение 4. Способ по любому из воплощений 1-3, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 (например, по меньшей мере 20) остатков дезокситимидина.
Воплощение 5. Способ по любому из воплощений 1-4, где последовательность матрицы дополнительно содержит область метки зонда, расположенную в направлении против хода транскрипции от захватывающей области и в направлении по ходу транскрипции от линкерной области, и область метки зонда содержит последовательность, комплементарную метке зонда, состоящую из модифицированных оснований, а модифицированные основания способны при помощи водородных связей образовывать комплементарные пары с различными видами стандартных оснований (например, С, G, А, Т, U);
предпочтительно, область метки зонда расположена между областью пространственной метки и областью захвата, или между линкерной областью и областью пространственной метки;
предпочтительно, последовательность, комплементарная метке зонда, содержит множество (например, по меньшей мере 10) инозинов.
Воплощение 6. Способ по любому из воплощений 1-5, имеющий один или более следующих признаков:
(1) линкерная область имеет длину более 1 пн, например, более 10 пн или более 20 пн; предпочтительно, линкерная область имеет длину от 20 до 100 пн;
(2) область пространственной метки имеет длину более 1 пн, например, более 10 пн; предпочтительно, область пространственной метки имеет длину от 10 до 100 пн;
(3) захватывающая область имеет длину более 1 пн; предпочтительно, захватывающая область имеет длину от 1 до 100 пн;
(4) область метки зонда имеет длину более 1 пн, например, более 5 пн; предпочтительно, область метки зонда имеет длину от 5 до 100 пн.
Воплощение 7. Способ по любому из воплощений 1-6, где твердая подложка представляет собой чип;
предпочтительно, твердую подложку можно применять в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования.
Воплощение 8. Способ по любому из воплощений 1-7, где на стадии (4) при осуществлении реакции элонгации праймера последовательность, комплементарную последовательности пространственной метки, секвенируют для получения информации о последовательности пространственной метки, содержащейся в соответствующем захватывающем зонде.
Воплощение 9. Способ по любому из воплощений 1-7, в котором перед стадией (4) дополнительно включена стадия секвенирования последовательности, комплементарной последовательности пространственной метки, содержащейся в DNB;
предпочтительно, после выполнения секвенирования дНТФ, добавленные к синтетической цепи вследствие секвенирования, удаляют путем промывания.
Воплощение 10. Способ по любому из воплощений 1-9, где линкер представляет собой линкерную группу, способную соединяться с активирующей группой (например, NH2), и поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой (например, NH2);
предпочтительно, линкер содержит -SH, -DBCO или -NHS;
предпочтительно, линкер представляет собой 
(DBCO), а 
(сложный эфир азидо-dPEG®8-NHS) присоединен к поверхности твердой подложки.
Воплощение 11. Способ по любому из воплощений 1-10, где сайт расщепления, содержащийся в области расщепления, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом;
предпочтительно, сайт расщепления, представляет собой сайт расщепления ферментом;
предпочтительно, сайты расщепления, содержащиеся в области расщепления и в линкерной области, различаются.
Воплощение 12. Способ по любому из воплощений 1-11, где амплификация включает ПЦР.
Воплощение 13. Панель нуклеиновых кислот, полученная способом по любому из воплощений 1-12.
Воплощение 14. Панель нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о биомолекуле (например, нуклеиновой кислоте) в образце, включающая в себя твердую подложку (например, чип) с многочисленными видами захватывающих зондов, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид захватывающего зонда занимает определенное положение в панели и ориентирован таким образом, что имеет свободный 3'-конец, позволяющий захватывающему зонду служить праймером для элонгации, при этом каждый вид захватывающего зонда содержит в направлении от 5' к 3': связывающую область, область расщепления, последовательность пространственной метки и захватывающую последовательность, где
связывающая область содержит линкер, который может быть связан с поверхностью твердой подложки;
область расщепления содержит сайт расщепления;
последовательность пространственной метки соответствует положению данного вида захватывающего зонда на панели;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой биомолекулой (например, нуклеиновой кислотой) или ее частью и содержит: (1а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (1б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной молекулы-мишени (например, нуклеиновой кислоты-мишени).
Воплощение 15. Панель нуклеиновых кислот по воплощению 14, где каждый захватывающий зонд каждого вида захватывающих зондов (т.е. захватывающие зонды, содержащие одинаковую последовательность пространственной метки) имеет уникальную последовательность метки зонда, и последовательность метки зонда расположена в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и в направлении по ходу транскрипции от области расщепления;
предпочтительно, последовательность метки зонда расположена между захватывающей последовательностью и последовательностью пространственной метки или между областью расщепления и последовательностью пространственной метки.
Воплощение 16. Панель нуклеиновых кислот по воплощению 14 или 15, где каждый вид захватывающего зонда (т.е. захватывающие зонды, содержащие одинаковую последовательность пространственной метки) занимает область (т.е. активную область) диаметром менее 1 микрона на поверхности твердой подложки;
предпочтительно, каждый вид захватывающего зонда занимает активную область диаметром приблизительно 500 нанометров.
Воплощение 17. Панель нуклеиновых кислот по любому из воплощений 14-16, где твердая подложка представляет собой чип;
предпочтительно, твердую подложку можно применять в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования.
Воплощение 18. Панель нуклеиновых кислот по любому из воплощений 14-17, полученная способом по любому из воплощений 1-12.
Воплощение 19. Способ получения пространственной информации о биомолекуле в образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по любому из воплощений 13-18 или получение панель нуклеиновых кислот способом по любому из воплощений 1-12; панель нуклеиновых кислот содержит многочисленные виды захватывающих зондов, присоединенных к поверхности твердой подложки (например, чипа), каждый вид захватывающего зонда занимает определенное положение в панели, и захватывающий зонд содержит последовательность пространственной метки, соответствующий положению данного вида захватывающего зонда в панели, и захватывающую последовательность, способную захватывать биомолекулу в образце;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом, так что захватывающая последовательность захватывающего зонда связывается с биомолекулой в исследуемом образце, и таким образом, положение биомолекулы можно сопоставить с положением захватывающего зонда в панели нуклеиновых кислот, и образуется биомолекула, меченная пространственной меткой;
(3) высвобождение с поверхности панели биомолекулы, меченной пространственной меткой; и
(4) прямой или косвенный анализ последовательности биомолекулы, высвобожденной на стадии (3).
Воплощение 20. Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, включающий следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по любому из воплощений 13-18 или получение панели нуклеиновых кислот способом по любому из воплощений 1-12; панель нуклеиновых кислот содержит многочисленные виды захватывающих зондов, присоединенных к поверхности твердой подложки (например, чипа), каждый вид захватывающего зонда занимает определенное положение в панели, и захватывающий зонд содержит последовательность пространственной метки, соответствующую положению данного вида захватывающего зонда в панели, и захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью захватывающего зонда, и таким образом положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением захватывающего зонда в панели;
(3) осуществление реакции элонгации праймера в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, используя захватывающий зонд в качестве праймера и используя захваченную молекулу нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, полученный продукт элонгации содержит последовательность пространственной метки и последовательность, комплементарную молекуле захваченной нуклеиновой кислоты, при этом образуется молекула ДНК, меченная пространственной меткой; возможно, создают цепь, комплементарную молекуле ДНК, меченной пространственной меткой, и/или возможно, амплифицируют молекулу ДНК, меченную пространственной меткой;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул ДНК, несущих метки пространственной информации, и/или комплементарных им цепей или ампликонов, причем часть содержит последовательность пространственной метки или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4);
предпочтительно, пространственная информация о нуклеиновой кислоте включает расположение, распределение и/или экспрессию нуклеиновой кислоты; предпочтительно, захватывающий зонд представляет собой молекулу ДНК; предпочтительно, образец представляет собой образец ткани, такой как срез
ткани;
предпочтительно, срез ткани готовят из фиксированной ткани, например, фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPE) ткани или ткани, подвергнутой глубокой заморозке.
Воплощение 21. Способ по воплощению 20, где на стадии (5) анализ последовательности включает секвенирование или сайт-специфическую реакцию ПЦР.
Воплощение 22. Способ по воплощению 20 или 21, дополнительно включающий стадию (6): сопоставления информации, полученной при анализе последовательности на стадии (5), с изображением образца, где изображение образца получено до или после стадии (3).
Воплощение 23. Способ по любому из воплощений 20-22, который применяют для определения транскриптома в образце, где:
на стадии (3) осуществляют синтез молекулы кДНК с захваченной молекулы РНК, используя захватывающий зонд в качестве праймера для ОТ, причем молекула кДНК мечена пространственной меткой, и возможно, амплифицируют молекулу кДНК;
на стадии (4) высвобождают с поверхности панели по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может быть первой и/или второй цепью молекулы кДНК или ее ампликоном, и причем часть содержит последовательность пространственной метки или комплементарную ей цепь;
предпочтительно, на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.
Воплощение 24. Способ по любому из воплощений 20-23, в котором до или после высвобождения с поверхности панели молекулы ДНК, меченной пространственной меткой, или молекулы кДНК, меченной пространственной меткой, образуется комплементарная цепь или вторая цепь кДНК;
предпочтительно, в синтезе комплементарной цепи или второй цепи используют случайный праймер и полимеразу, обеспечивающую вытеснение цепи.
Воплощение 25. Способ по любому из воплощений 20-24, дополнительно включающий стадию амплификации молекулы ДНК или молекулы кДНК, меченной пространственной меткой, перед анализом последовательности;
предпочтительно, стадию амплификации осуществляют после высвобождения с поверхности панели молекулы ДНК или молекулы кДНК, меченной пространственной меткой, или стадию амплификации осуществляют на панели in situ:
предпочтительно, стадия амплификации включает ПЦР.
Воплощение 26. Способ по любому из воплощений 20-25, в котором анализ последовательности дополнительно включает стадию очистки высвобожденной молекулы.
Воплощение 27. Способ по любому из воплощений 20-26, дополнительно включающий перед стадией (4) стадию промывания панели для удаления остатков образца (например, ткани).
Воплощение 28. Способ по любому из воплощений 20-27, в котором на стадии (4) молекула высвобождается с поверхности панели следующим способом: (1) расщеплением нуклеиновой кислоты; (2) денатурацией и/или (3) физическим способом;
предпочтительно, молекула высвобождается путем ферментативного расщепления захватывающего зонда в области расщепления.
Воплощение 29. Способ по любому из воплощений 20-28, в котором на стадии (6) получают изображение образца с применением световой, светлопольной, темнопольной, фазовоконтрастной, флуоресцентной, отражательной, интерференционной, конфокальной микроскопии или их комбинации.
Полезный эффект
В данном изобретении предложены новая панель для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте и способ ее получения. Когда панель нуклеиновых кислот применяют для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте, можно в то же время осуществить высокоточное позиционирование на субклеточном уровне и высокопроизводительное позиционирование на уровне ткани. Панель по данному изобретению и способ детекции, основанный на применении панели, имеют большое практическое значение для позиционирования на клеточном уровне, позиционирования на субклеточном уровне, позиционирования на уровне органелл, клеточного взаимодействия, взаимодействия органелл, исследования молекулярных путей, диагностики заболеваний и тому подобного.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
На Фиг. 1 показана схема синтеза кДНК после захвата мРНК в Примере 2.
На Фиг. 2 показано схематическое изображение молекулы, высвобождающейся с чипа в Примере 2.
На Фиг. 3 показаны результаты оценки степени фрагментации кДНК при помощи анализатора 2100 в Примере 2.
На Фиг. 4 показаны результаты сопоставления последовательности 25 пн первой цепи, полученной при секвенировании кДНК в Примере 3, и файл fq позиционной последовательности на захватывающем чипе.
На Фиг. 5 показан график экспрессии мРНК в срезе ткани в Примере 3.
На Фиг. 6 показано схематическое изображение праймера-зонда и несущей последовательности, содержащейся в DNB, из воплощения, приведенного в качестве иллюстрации в Примере 4.
На Фиг. 7 показано схематическое изображение зонда, лигированного с чипом в Примере 4.
На Фиг. 8 показана схема синтеза кДНК захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в Примере 5.
На Фиг. 9 показано схематическое изображение молекулы, высвобождающейся с чипа в Примере 5.
На Фиг. 10 показаны результаты оценки степени фрагментации кДНК при помощи анализатора 2100 в Примере 5.
На Фиг. 11 показаны результаты сопоставления последовательности 20 пн первой цепи, полученной при секвенировании кДНК в Примере 6, и файл fq позиционной последовательности на захватывающем чипе.
На Фиг. 12 показана экспрессия мРНК в срезе ткани в Примере 6.
ОПИСАНИЕ ПРИМЕРОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Данное изобретение будет более подробно описано ниже, с отсылкой к следующим примерам, которые приведены для иллюстрации изобретения, не ограничивая его объем.
Если не указано иное, эксперименты и способы, описанные в Примерах, проводили согласно стандартным методам, хорошо известным в области техники и описанным в различных источниках. Кроме того, в тех случаях, когда в Примерах не указаны особые условия, их осуществляли в соответствии со стандартными условиями или условиями, рекомендованными производителем. Все использованные реагенты или инструменты, для которых не указаны рекомендации производителя, представляли собой стандартные продукты, приобретенные коммерческим путем. Специалисты в области техники поймут, что Примеры приведены в качестве иллюстрации для описания изобретения и не предназначены для ограничения объема заявленного изобретения. Все публикации и другие источники, упомянутые в данном документе, включены во всей полноте путем ссылки.
Пример 1. Получение захватывающего чипа (1)
1. Конструировали и синтезировали следующую библиотеку ДНК. Последовательность синтезировали в Beijing Liuhe BGI.
5'-фосфорил-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA (Линкер А, SEQ ID NO: 1) NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (комплемент позиционной последовательности, N обозначает любое основание, такое как С, G, А или Т) CTGATAAGGTCGCCA (комплемент второй иммобилизующей последовательности. SEQ ID NO: 2) CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT (Линкер В, SEQ ID NO: 3)-3'. Где Линкер А содержал часть комплемента первой иммобилизующей последовательности и сайт циркуляризации, а Линкер В содержал другую часть комплемента первой иммобилизующей последовательности, сайт расщепления и сайт циркуляризации.
2. Амплификация библиотеки in situ
Получение наношарика ДНК (DNB): готовили 40 мкл следующей реакционной смеси и добавляли 80 фмоль вышеуказанной библиотеки ДНК, при этом праймер DNB имел последовательность GGCCTCCGACTTAAGTCGGATCGT (SEQ ID NO: 4), и его синтезировали в Beijing Liuhe BGI.
Вышеуказанную реакционную смесь помещали в ПЦР-машину для проведения реакции. Условия реакции были следующими: 95°С в течение 3 мин, 40°С в течение 3 мин; после завершения реакции смесь помещали на лед, добавляли 40 мкл смеси фермента I и 2 мкл смеси фермента II из набора для секвенирования DNBSEQ, которые были необходимы для получения DNB, а также 1 мкл АТФ (100 мМ матричный раствор, Thermo Fisher) и 0,1 мкл лигазы Т4 (производства BGI). После тщательного перемешивания вышеуказанную реакционную смесь переносили в ПЦР машину с температурой 30°С и проводили реакцию в течение 20 мин для образования DNB. DNB загружали согласно методике, описанной в наборе BGISEQ500 SE50, на чип BGISEQ500 для секвенирования.
3. Секвенирование и расшифровка позиционной последовательности: Расшифровку и секвенирование позиционной последовательности осуществляли в соответствии с инструкциями к набору для секвенирования BGISEQ500 SE50, длина прочтения составляла 25 пн. Файл fq, сформированный в результате секвенирования, хранили для дальнейшего использования.
4. Иммобилизация захватывающей последовательности: синтезировали следующую последовательность ДНК в Beijing Liuhe BGI: 5'-фосфорил-CTGATAAGGTCGCCA (комплемент второй иммобилизующей последовательности, SEQ ID NO: 5) NNNNNNNNNN (UMI) TTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN (захватывающая последовательность, SEQ ID NO: 6)-3', где N обозначает любое основание (например, С, G, А или Т). Чип для секвенирования извлекали из секвенатора, в чип вводили расщепляющий реагент Hole 7 из набора BGISEQ500 SE50 (удостоверяясь, что чип полностью покрыт реагентом, и не образовались пузырьки). Чип оставляли при 60°С и проводили реакцию в течение 10 мин. После завершения реакции в чип секвенатора вводили соответствующее количество 5×SSC (стандартный солевой раствор, приобретали в Shanghai Shenggong), чтобы произвести замену предыдущего реагента в чипе. Захватывающую последовательность разводили 5×SSC до 1 мкМ и добавляли к чипу соответствующее количество разведенной захватывающей последовательности, так чтобы чип был заполнен захватывающей последовательностью. Чип оставляли при комнатной температуре приблизительно на 30 мин, чтобы захватывающая последовательность полностью гибридизовалась с DNB.
5. Разрезание чипа: Полученный чип разрезали на несколько кусочков меньшего размера, подбирая размер каждого кусочка в соответствии с задачами эксперимента, и погружали чип в 50 мМ трис-буфер с рН 8,0 и хранили при 4°С для дальнейшего применения.
Пример 2. Захват мРНК ткани и синтез к ДНК
1. Приготовление срезов замороженной ткани. Срезы ткани мозжечка мыши готовили в соответствии со стандартными процедурами для криостатных срезов.
2. Захват мРНК. Брали чип подходящего размера, полученный в Примере 1, соответствующий размеру среза ткани, и оставляли при комнатной температуре. После испарения жидкости с чипа прикрепляли к чипу срез ткани за счет разницы температур между чипом и срезом ткани в криотоме. Прикрепленный срез ткани оставляли при комнатной температуре, добавляли к чипу реакционный раствор 5×SSC (и полностью покрывая область с прикрепленной тканью) и проводили реакцию при 30°С в течение 30 минут, чтобы мРНК в ткани полностью гибридизовалась с захватывающей областью на чипе.
3. Синтез кДНК. Чип двукратно промывали при помощи 5×SSC при комнатной температуре, готовили 200 мкл следующей реакционной смеси для реакции обратной транскрипции, реакционный раствор добавляли к чипу, чтобы полностью его покрыть, проводили реакцию при 42°С в течение 90-180 мин. В качестве праймера для синтеза кДНК с мРНК использовали полиТ, 3'-конец мРНК имел метку TSO (AAGTCGGAGGCCAAGCGGTC/rG//rG//iXNA_G/) (SEQ ID NO: 7) для синтеза комплементарной цепи кДНК. Схема вышеуказанного процесса приведена на Фиг. 1.
4. Лигирование области, обеспечивающей позиционирование в пространстве, с захватывающей областью. После синтеза кДНК чип дважды промывали 5×SSC. Готовили 1 мл следующей реакционной смеси, соответствующий ее объем вводили в чип, чтобы заполнить его следующим реакционным раствором для лигирования, и разрыв, показанный на Фиг. 1, лигировали. Реакцию проводили в течение 30 минут при комнатной температуре. После реакции чип промывали 5×SSC при температуре 55°С три раза, каждый раз в течение 5 мин.
5. Высвобождение кДНК. После синтеза на чипе первой цепи кДНК к чипу добавляли соответствующее количество раствора формамида и проводили реакцию при 55°С в течение 10 минут для высвобождения с чипа цепи кДНК. Высвобожденная молекула имела структуру, показанную на Фиг. 2. Собирали реакционный раствор, высвобождающийся из чипа, для очистки цепи кДНК использовали магнитные частицы 2× ХР и в завершение использовали 45 мкл буфера ТЕ (Трис-ЭДТА) (Thermo Fisher) для выделения продукта. Для количественного определения одноцепочечной кДНК использовали набор Qubit для определения оцДНК.
6. Амплификация кДНК. Готовили 100 мкл следующей реакционной смеси:
Вышеуказанную реакционную смесь помещали в ПЦР-машину и для проведения реакции устанавливали следующую программу: 95°С в течение 3 мин, 11 циклов (98°С в течение 20 сек, 58°С в течение 20 сек, 72°С в течение 3 мин), 72°С в течение 5 мин, поддержание температуры 4°С. После завершения реакции для очистки и выделения вновь использовали частицы ХР. Для определения концентрации дцДНК использовали набор Qubit, а для оценки степени фрагментации кДНК использовали анализатор 2100. Результаты, полученные на анализаторе 2100, показаны на Фиг. 3. Длина кДНК соответствовала нормальной.
Пример 3. Конструирование и секвенирование библиотеки кДНК
1. Прерывание с применением Tn5 (траспозаза). Исходя из концентрации кДНК, к 20 иг кДНК добавляли 0,5 мкМ фермента Tn5 и соответствующий буфер (баркодирование с применением фермента Тп5 осуществляли согласно способу, описанному в наборе для конструирования библиотеки stLFR (прочтение длинных фрагментов в одной пробирке)), и тщательно перемешивали с получением 20 мкл реакционной смеси. Реакцию проводили при 55°С в течение 10 мин, добавляли 5 мкл 0,1% SDS и тщательно перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут для завершения стадии прерывания с применением Tn5.
2. ПЦР амплификация. Готовили 100 мкл следующей реакционной смеси:
После смешивания ее помещали в ПЦР-машину и устанавливали следующую программу: 95°С в течение 3 мин, 11 циклов (98°С в течение 20 сек, 58°С в течение 20 сек, 72°С в течение 3 мин), 72°С в течение 5 мин, поддержание температуры 4°С. После завершения реакции для очистки и выделения вновь использовали частицы ХР. Для определения концентрации дцДНК использовали набор Qubit.
3. Секвенирование. После вышеуказанного прерывания брали 80 фмоль амплифицированного продукта для получения DNB. Готовили 40 мкл следующей реакционной смеси:
Вышеуказанную реакционную смесь помещали в ПЦР-машину для проведения реакции, условия реакции были следующими: 95°С в течение 3 мин, 40°С в течение 3 мин. После завершения реакции смесь помещали на лед, добавляли 40 мкл смеси фермента I и 2 мкл смеси фермента II из набора для секвенирования DNBSEQ, необходимых для получения DNB, а также 1 мкл АТФ (100 мМ матричный раствор, Thermo Fisher) и 0,1 мкл лигазы Т4 (производства BGI). После тщательного перемешивания вышеуказанную реакционную смесь переносили в ПЦР-машину с температурой 30°С и проводили реакцию в течение 20 мин для образования DNB. Загружали DNB в чип для секвенирования MGISEQ2000 согласно способу, описанному в наборе РЕ50 от MGISEQ2000, и, руководствуясь соответствующими инструкциями, осуществляли секвенирование, выбирая настройки РЕ50, при этом секвенирование первой цепи подразделяли на два этапа, т.е. секвенировали 25 пн и затем проводили 15 циклов реакции без регистрации оптического сигнала, после чего секвенировали 10 пн последовательности UMI и секвенировали 50 пн второй цепи.
Анализ данных
1. Последовательности 25 пн, полученные при секвенировании первой цепи кДНК, сопоставляли путем выравнивания с последовательностями, соответствующими позиции на захватывающем чипе, записанными в файле fq (результаты секвенирования получали на стадии 3 в Примере 1). Результаты сопоставления показаны на Фиг. 4, где светящаяся зона представляла область, где результаты секвенирования 25 пн кДНК точно совпадали с захватывающим чипом, и эта область представляла область захватывающего чипа, предназначенную для захвата ткани. Это свидетельствовало, что использование области пространственного позиционирования в захватывающем чипе позволяет точно локализовать область захвата ткани.
2. Проводили дальнейший анализ DNB, для которых результаты секвенирования кДНК соответствовали захватывающему чипу, и анализировали сиквенсы второй цепи кДНК (экспрессия мРНК в исследуемой ткани) в этих прочтениях DNB, путем их выравнивая с геномом мыши. Для прочтений DNB, выровненных с геномом мыши, информацию о мРНК мыши сопоставляли с результатами секвенирования 25 пн, соответствующих положению на захватывающем чипе. Как показано на Фиг. 5, в левой части показана общая картина экспрессии мРНК в проанализированном срезе ткани, общая картина демонстрирует, что данный захватывающий чип позволяет анализировать различия в экспрессии мРНК в тканях; в правой части показан уровень тканевой экспрессии генов, экспрессируемых в мозжечке мыши, выбранных случайным образом, что свидетельствует, что данный чип позволяет анализировать различия в экспрессии определенного гена во всей ткани.
Пример 4. Получение захватывающего чипа (2)
1. Конструировали и синтезировали следующую библиотеку ДНК. Последовательность синтезировали в Beijing Liuhe BGI.
5'-фосфорил-GAACGACATGGCTTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCTGCGCCTTCCCGATG(иммобилизующая последовательность 1, SEQ ID NO: 12)NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (матрица позиционной последовательности, N представляет собой любое основание, например, С, G, А или Т)IIIIIIIIII(матрица UMI, I представляет собой инозин)ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ (захватывающая последовательность, SEQ ID NO: 13)CCTCAGC(сайт расщепления, SEQ ID NO: 14)CCTTGGCTCACA(иммобилизующая последовательность 2, SEQ ID NO: 15). При этом иммобилизующая последовательность 1 содержала частичную последовательность комплемента первой иммобилизующей последовательности и сайт циркуляризации и иммобилизующая последовательность 2 содержала частичную последовательность комплемента первой иммобилизующей последовательности и сайт циркуляризации.
2. Амплификация библиотеки in situ
Получение наношарика ДНК (DNB): готовили 40 мкл следующей реакционной смеси и добавляли 80 фмоль вышеуказанной библиотеки ДНК, праймер DNB имел последовательность GACATGGCTACGTGTGAGCCAAGG (SEQ ID NO: 16) и был синтезирован Beijing Liuhe BGI.
Вышеуказанную реакционную смесь помещали в ПЦР-машину для реакции, условия реакции были следующими: 95°С в течение 3 мин, 40°С в течение 3 мин; после проведения реакции смесь помещали на лед, добавляли 40 мкл смеси фермента I и 2 мкл смеси фермента II из набора для секвенирования DNBSEQ, необходимых для получения DNB, а также 1 мкл АТФ (100 мМ матричный раствор, Thermo Fisher) и 0,1 мкл лигазы Т4 (производства BGI). После тщательного перемешивания вышеуказанную реакционную смесь переносили в ПЦР машину с температурой 30°С и проводили реакцию в течение 20 мин для образования DNB. DNB загружали на чип для секвенирования BGISEQ500 согласно методике, описанной в наборе BGISEQ500 SE50. 3. Расшифровка пространственной информации
(1) Модификация поверхности чипа:
Поверхность вышеупомянутого чипа для платформы BGISEQ-500 приводили в контакт со сложным эфиром Azido-dPEG®8-NHS, имевшем следующую структуру:
Модификацию поверхности чипа осуществляли согласно следующему способу: готовили 100 мл NHS-PEG8-азидо (564,58 г/моль) в концентрации 45 мкмоль, следующим способом:
Хранили при -20°С, избегая повторного замораживания и оттаивания.
DBCO-праймер имел концентрацию 1 мкмоль, разведения готовили при помощи PBS.
(2) Присоединение праймера-зонда:
Синтезировали следующие последовательности праймера-зонда в Beijing Liuhe BGI:
DBCO(линкерная группа)-UUU(сайт расщепления USER)TTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCT GCGCCTTCCCGATG(SEQ ID NO: 17, данная последовательность содержала комплемент первой иммобилизующей последовательности, последовательность сайта для ПЦР-амплификации, промежуточную последовательность. 1 мкмоль вышеупомянутого праймера-зонда разводили PBS и вносили в чип, модифицированный азидо, и проводили реакцию при комнатной температуре в течение 1 часа или в течение ночи.
(3) Расшифровка пространственной информации. Позиционную последовательность расшифровывали и секвенировали согласно инструкциям к набору для секвенирования BGISEQ500 SE50, длина секвенирования составляла 30 пн (первые 20 пн относились к последовательности, хранящей пространственную информацию, а последние 10 пн относились к последовательности метки зонда). Файл fq, сформированный в результате секвенирования, хранили для дальнейшего использования.
(4) Синтез захватывающей области:
Для элонгации последовательности олиго-dT готовили смешанный раствор dTTP и полимеразы Hifi, в качестве матицы использовали DNB, последовательность зонда, содержащую область пространственного позиционирования, использовали в качестве праймера, a dTTP использовали в качестве субстрата.
4. Высвобождение зонда, содержащего пространственную информацию
Готовили 1 мкмоль праймера Spatial_RNA_BbvCI (разведенного 5×SSC), последовательность праймера CCTCAGCCAACTCCT (SEQ ID NO: 18) синтезировали в Beijing Liuhe BGI. Гибридизацию осуществляли при комнатной температуре в течение 30 минут. Готовили систему для разрезания при помощи BbvCI (1,5 мл): 15 мкл RE + 150 мкл 10× буфера CS + 1335 мкл ddH2O и вводили в чип после расшифровки области пространственного позиционирования, реакцию проводили при 37°С в течение 1 часа или в течение ночи. Промывание проводили двукратно, добавляя WB2 из набора для секвенирования (MGI), затем осуществляли реакцию с применением формамида при 55°С в течение 15 мин, после чего двукратно промывали WB2. Схематическое строение полученного зонда представлено на Фиг. 7, последовательность зонда была следующей:
UUU(область расщепления)TTTTTCCCGTAGCCATGTCGTTCTGCGCCTTCCCGATG(комплемент первой иммобилизующей последовательности, SEQ ID NO: 19)NNNNNNNNNNNNNNNNNNN (комплемент позиционной последовательности, такой же, как матрица позиционной последовательности в последовательности библиотеки ДНК на стадии 1)NNNNNNNNNN(последовательность UMI, которая представляла собой последовательность, комплементарную последовательности случайных оснований, полученную с матрицы UMI, которую использовали в качестве матрицы на стадии 1)ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ(захватывающая последовательность, SEQ ID NO: 20).
5. Разрезание чипа
Полученный чип разрезали на несколько частей меньшего размера, размер частей корректировали в зависимости от задач эксперимента и погружали чип в 50 мМ трис-буфер с рН 8,0 и хранили при 4°С для дальнейшего применения.
Пример 5. Захват мРНК ткани и синтез к ДНК
1. Приготовление срезов замороженной ткани. Срезы ткани мозжечка мыши готовили в соответствии со стандартными процедурами для криостатных срезов.
2. Захват мРНК. В зависимости от размера среза ткани брали чип подходящего размера, полученный в Примере 4, и оставляли при комнатной температуре. После испарения жидкости с чипа срез ткани прикрепляли к захватывающему чипу за счет разницы температур между чипом и срезом ткани в криотоме. Прикрепленный срез ткани оставляли при комнатной температуре, добавляли к чипу реакционный раствор 5×SSC (полностью покрывая область с прикрепленной тканью) и проводили реакцию при 30°С в течение 30 минут, чтобы мРНК в ткани полностью гибридизовалась с захватывающей областью на чипе.
3. Синтез кДНК. Чип двукратно промывали при помощи 5×SSC при комнатной температуре, готовили 200 мкл следующей реакционной смеси для обратной транскрипции, реакционный раствор добавляли к чипу, чтобы он был полностью покрыт, проводили реакцию при 42°С в течение 90-180 мин. Для синтеза кДНК с мРНК в качестве праймера использовали полиТ, а 3'-конец мРНК имел метку TSO (CGTAGCCATGTCGTTCTGCG/rG//rG//iXNA_G/) (SEQ ID NO: 21) для синтеза комплементарной цепи кДНК. Схема вышеуказанного процесса приведена на Фиг. 8.
4. Высвобождение кДНК. После синтеза на чипе первой цепи кДНК готовили реакционную систему для фермента USER и осуществляли реакцию согласно инструкциям для применения фермента USER. Высвобожденная молекула имела структуру, показанную на Фиг. 9. Собирали реакционный раствор, высвобождающийся из чипа, для очистки первой цепи кДНК использовали магнитные частицы 2×ХР и в завершение для выделения продукта использовали 45 мкл буфера ТЕ (Thermo Fisher).
5. Амплификация кДНК. Готовили 100 мкл следующей реакционной смеси:
Вышеуказанную реакционную смесь помещали в ПЦР-машину и для проведения реакции устанавливали следующую программу: 95°С в течение 3 мин, 11 циклов (98°С в течение 20 сек, 58°С в течение 20 сек, 72°С в течение 3 мин), 72°С в течение 5 мин. поддержание температуры 4°С. После завершения реакции для очистки и выделения вновь использовали частицы ХР. Для определения концентрации дцДНК использовали набор Qubit, а для оценки степени фрагментации кДНК использовали анализатор 2100. Результаты, полученные на анализаторе 2100, показаны на Фиг. 10, свидетельствующие, что кДНК имела нормальную длину.
Пример 6. Конструирование и секвенирование библиотеки кДНК
1. Прерывание с применением Tn5. Исходя из концентрации кДНК, брали 20 нг кДНК и добавляли 0,5 мкМ фермента Tn5 и соответствующий буфер (баркодирование при помощи фермента Tn5 осуществляли согласно способу, описанному в наборе для конструирования библиотеки stLFR) и тщательно перемешивали с получением 20 мкл реакционной смеси. Реакцию проводили при 55°С в течение 10 мин, добавляли 5 мкл 0,1% SDS и тщательно перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут для завершения стадии прерывания при помощи Tn5.
2. ПЦР амплификация. Готовили 100 мкл следующей реакционной смеси:
После смешивания ее помещали в ПЦР-машину и устанавливали следующую программу: 95°С в течение 3 мин, 11 циклов (98°С в течение 20 сек, 58°С в течение 20 сек, 72°С в течение 3 мин), 72°С в течение 5 мин, поддержание температуры 4°С. После завершения реакции для очистки и выделения вновь использовали частицы ХР. Концентрацию дцДНК определяли при помощи набора Qubit.
3. Секвенирование. Для получения DNB брали 80 фмоль продукта амплификации после вышеуказанного прерывания. Готовили 40 мкл следующей реакционной смеси:
Вышеуказанную реакционную смесь помещали в ПЦР-машину для проведения реакции, условия реакции были следующими: 95°С в течение 3 мин, 40°С в течение 3 мин. После завершения реакции смесь помещали на лед, добавляли 40 мкл смеси фермента I и 2 мкл смеси фермента II из набора для секвенирования DNBSEQ, необходимых для получения DNB, а также 1 мкл АТФ (100 мМ матричный раствор, Thermo Fisher) и 0,1 мкл лигазы Т4 (производства BGI). После тщательного перемешивания вышеуказанную реакционную смесь переносили в ПЦР машину с температурой 30°С и проводили реакцию в течение 20 мин для образования DNB. Загружали DNB в чип для секвенирования MGISEQ2000 согласно способу, описанному в наборе РЕ50 от MGISEQ2000 и, руководствуясь соответствующими инструкциями, осуществляли секвенирование с пользовательскими настройками, при этом секвенирование первой цепи подразделяли на два этапа, т.е. секвенировали 20 пн, а затем секвенировали 10 пн последовательности метки зонда и секвенировали 50 пн второй цепи.
Анализ данных:
1. Последовательности 20 пн, полученные при секвенировании первой цепи кДНК, сопоставляли путем выравнивания с последовательностями, несущими информацию о пространственном расположении на чипе, записанными в файле fq (результаты секвенирования получали на стадии 3 в Примере 4). Результаты сопоставления показаны на Фиг. 11, где светящаяся зона представляла область, где результаты секвенирования 20 пн кДНК точно совпадали с захватывающим чипом, и эта область представляла область захватывающего чипа, предназначенную для захвата ткани. Это свидетельствовало, что использование области пространственного позиционирования в захватывающем чипе позволяет точно локализовать область захвата ткани.
2. Проводили дальнейший анализ DNB, для которых результаты секвенирования кДНК соответствовали захватывающему чипу, и анализировали сиквенсы второй цепи кДНК (экспрессия мРНК в исследуемой ткани) в этих прочтениях DNB, путем их выравнивая с геномом мыши. Для прочтений DNB, выровненных с геномом мыши, информацию мРНК мыши сопоставляли с результатами секвенирования 20 пн, соответствующих положению на захватывающем чипе. Как показано на Фиг. 12, в левой части показана общая картина экспрессии мРНК в проанализированном срезе ткани, общая картина демонстрирует, что данный захватывающий чип позволяет проанализировать различия экспрессии мРНК в тканях; в правой части показан уровень экспрессии в ткани случайным образом выбранных генов, экспрессируемых в мозжечке мыши, что свидетельствует, что данный чип позволяет проанализировать различия в экспрессии определенного гена во всей ткани.
Несмотря на то, что частные воплощения данного изобретения были подробно описаны, специалисту в области техники будет понятно, что на основании всех опубликованных сведений возможны различные модификации и изменения деталей, и объем правовой охраны данного изобретения будет распространяться на все эти изменения. Данное изобретение и все его эквиваленты изложены во всей полноте в прилагающейся формуле изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СПОСОБ И ПРОДУКТ ДЛЯ ЛОКАЛИЗОВАННОЙ ИЛИ ПРОСТРАНСТВЕННОЙ ДЕТЕКЦИИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В ОБРАЗЦЕ ТКАНИ | 2012 |
|
RU2603074C2 |
| СПОСОБ АМПЛИФИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ | 2019 |
|
RU2811465C2 |
| ПОДАВЛЕНИЕ ОШИБОК В СЕКВЕНИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТАХ ДНК ПОСРЕДСТВОМ ПРИМЕНЕНИЯ ИЗБЫТОЧНЫХ ПРОЧТЕНИЙ С УНИКАЛЬНЫМИ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ ИНДЕКСАМИ (UMI) | 2016 |
|
RU2704286C2 |
| ПРОСТРАНСТВЕННОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ ПРОФИЛЕЙ ОБРАЗЦОВ БИОЛОГИЧЕСКИХ ТКАНЕЙ | 2016 |
|
RU2733545C2 |
| СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ | 2016 |
|
RU2761432C2 |
| СПОСОБ И КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ АНАЛИЗА КЛЕТОЧНЫХ КОМПОНЕНТОВ | 2016 |
|
RU2717491C2 |
| ПРЯМОЙ ЗАХВАТ, АМПЛИФИКАЦИЯ И СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК-МИШЕНИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММОБИЛИЗИРОВАННЫХ ПРАЙМЕРОВ | 2011 |
|
RU2565550C2 |
| ТРАНСПОЗИЦИЯ С СОХРАНЕНИЕМ СЦЕПЛЕНИЯ ГЕНОВ | 2015 |
|
RU2736728C2 |
| СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ДНК-ПРОФИЛИРОВАНИЯ | 2015 |
|
RU2708337C2 |
| ТРАНСПОЗИЦИЯ С СОХРАНЕНИЕМ СЦЕПЛЕНИЯ ГЕНОВ | 2015 |
|
RU2709655C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая панель нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, набор для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце (варианты), способ изготовления панели нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в биологическом образце и способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце (варианты). В одном варианте реализации панель нуклеиновых кислот включает в себя твердую подложку с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, где множественные копии последовательности-носителя представляют собой продукт амплификации, образованный посредством амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю. Изобретение расширяет арсенал средств для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце. 6 н. и 51 з.п. ф-лы, 12 ил., 12 табл., 6 пр.
1. Панель нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, где пространственная информация включает расположение и/или распределение нуклеиновой кислоты, и указанная панель нуклеиновых кислот включает в себя твердую подложку с многочисленными видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, где каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, при этом каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель содержит в направлении от 5' к 3' позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность, причем
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации;
где множественные копии последовательности-носителя представляют собой продукт амплификации, образованный посредством амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю;
и где каждый указанный вид последовательности-носителя, содержащий одинаковую позиционную последовательность, занимает область, имеющую диаметр менее 1 микрометра.
2. Панель нуклеиновых кислот по п. 1, где пространственная информация дополнительно включает экспрессию гена или мРНК.
3. Панель нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, дополнительно содержащая молекулу первой нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности и комплемент позиционной последовательности, и где молекула первой нуклеиновой кислоты гибридизуется с первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;
предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты.
4. Панель нуклеиновых кислот по п. 3, дополнительно содержащая молекулу второй нуклеиновой кислоты, лигированную с молекулой первой нуклеиновой кислоты, и молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность;
где захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
предпочтительно, каждая молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты.
5. Панель нуклеиновых кислот по п. 3, где каждая последовательность-носитель дополнительно содержит вторую иммобилизующую последовательность на своем 5'-конце, и вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности;
вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации.
6. Панель нуклеиновых кислот по п. 5, дополнительно содержащая молекулу второй нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3': комплемент второй иммобилизующей последовательности и захватывающую последовательность;
где комплемент второй иммобилизующей последовательности гибридизуется со второй иммобилизующей последовательностью последовательности-носителя с образованием двойной цепи;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит гибридизованную с ней молекулу второй нуклеиновой кислоты.
7. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-6, где амплификация выбрана из амплификации по типу катящегося кольца (RCA), мостиковой ПЦР-амплификации, амплификации с множественным вытеснением цепи (MDA) или эмульсионной ПЦР-амплификации.
8. Панель нуклеиновых кислот по п. 1, где множественные копии последовательности-носителя представляют собой DNB (наношарик ДНК), образованный конкатемером последовательности-носителя; предпочтительно множественные копии последовательности-носителя представляют собой DNB, образованный посредством амплификации по типу катящегося кольца с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
9. Панель нуклеиновых кислот по п. 1, где множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя;
например, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством мостиковой ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю;
например, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством эмульсионной ПЦР-амплификации с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю;
например, множественные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный посредством амплификации с множественным вытеснением цепи с применением в качестве матрицы последовательности, комплементарной последовательности-носителю.
10. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-9, где молекула первой нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность уникального молекулярного идентификатора (UMI), и последовательность UMI расположена на 5'-конце комплемента первой иммобилизующей последовательности; или молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, и последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности;
последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую из по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 нуклеотидов N, где каждый N независимо представляет собой один из А, С, G и Т;
предпочтительно, последовательности UMI, содержащиеся в каждой из молекул первой нуклеиновой кислоты, отличаются от друг от друга.
11. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-10, где твердая подложка представляет собой чип;
предпочтительно, твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования;
предпочтительно, твердая подложка представляет собой чип для высокопроизводительного секвенирования, такой как чип для высокопроизводительного секвенирования, используемый в платформах для секвенирования Illumina, MGI или Thermo Fisher.
12. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 1-11, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 остатков дезокситимидина.
13. Панель нуклеиновых кислот по п. 1 или 2, где последовательность-носитель дополнительно содержит матрицу захватывающей последовательности, расположенную в направлении против хода транскрипции от позиционной последовательности, матрица захватывающей последовательности содержит последовательность, комплементарную захватывающей последовательности, и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени;
и первая иммобилизующая последовательность последовательности-носителя также содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER (урацил-специфический реагент для вырезания), фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR (короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами);
и панель нуклеиновых кислот дополнительно содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3': связывающую область, область расщепления и область, комплементарную последовательности-носителю,
связывающая область содержит линкер, способный связываться с поверхностью твердой подложки;
область расщепления содержит сайт расщепления;
область, комплементарная последовательности-носителю, содержит последовательность, которая может быть комплементарна
последовательности-носителю, и содержит в направлении от 5' к 3': комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность, и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле первой нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
и область молекулы первой нуклеиновой кислоты, комплементарная последовательности-носителю, гибридизуется с последовательностью-носителем с образованием двойной цепи;
предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты.
14. Панель нуклеиновых кислот по п. 13, где последовательность-носитель дополнительно содержит комплемент последовательности UMI, расположенный в направлении по ходу транскрипции от матрицы захватывающей последовательности и против хода транскрипции от первой иммобилизующей последовательности, комплемент последовательности UMI комплементарен последовательности UMI, последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую из по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 нуклеотидов N, и каждый N независимо представляет собой один из А, С, G и Т;
и область молекулы первой нуклеиновой кислоты, комплементарная последовательности-носителю, дополнительно содержит последовательность UMI, расположенную в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и в направлении по ходу транскрипции от комплемента первой иммобилизующей последовательности;
предпочтительно, комплемент последовательности UMI расположен между позиционной последовательностью и матрицей захватывающей последовательности или между первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью;
предпочтительно, каждая копия каждого вида последовательности-носителя, содержащего одинаковую позиционную последовательность, содержит комплемент последовательности UMI, отличающийся от других.
15. Панель нуклеиновых кислот по п. 13 или 14, где линкер молекулы первой нуклеиновой кислоты представляет собой линкерную группу, способную соединяться с активирующей группой, и поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой;
предпочтительно, линкер содержит -SH,
или -NHS;
предпочтительно, линкер представляет собой 
, а 
(сложный эфир азидо-dPEG®8-NHS) присоединен к поверхности твердой подложки.
16. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 13-15, где сайт расщепления, содержащийся в области расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом;
предпочтительно, сайт расщепления, содержащийся в области расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты, представляет собой сайт расщепления ферментом;
предпочтительно, область расщепления молекулы первой нуклеиновой кислоты отличается от сайта расщепления, содержащегося в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя.
17. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 13-16, где твердая подложка представляет собой чип;
предпочтительно, твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования;
предпочтительно, твердая подложка представляет собой чип для высокопроизводительного секвенирования, такой как чип для высокопроизводительного секвенирования, используемый в платформах для секвенирования Illumina, MGI или Thermo Fisher.
18. Панель нуклеиновых кислот по любому из пп. 13-17, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 остатков дезокситимидина.
19. Набор для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, где пространственная информация включает расположение и/или распределение нуклеиновой кислоты, содержащий: (1) панель нуклеиновых кислот по п. 3; и (2) молекулу второй нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность;
где захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации.
20. Набор по п. 19, где пространственная информация дополнительно включает экспрессию гена или мРНК.
21. Набор по п. 19 или 20, где иммобилизующая область молекулы второй нуклеиновой кислоты содержит двуцепочечную последовательность нуклеиновой кислоты; предпочтительно двуцепочечная последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой двуцепочечную последовательность ДНК.
22. Набор для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, где пространственная информация включает расположение и/или распределение нуклеиновой кислоты, содержащий: (1) панель нуклеиновых кислот по п. 5; и (2) молекулу второй нуклеиновой кислоты, содержащую в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность, и где иммобилизующая область молекулы второй нуклеиновой кислоты содержит комплемент второй иммобилизующей последовательности;
и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации.
23. Набор по п. 22, где пространственная информация дополнительно включает экспрессию гена или мРНК.
24. Набор по любому из пп. 19-23, где, когда молекула первой нуклеиновой кислоты, содержащаяся в панели нуклеиновых кислот, не содержит последовательность UMI, тогда молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, и указанная последовательность UMI расположена на 5'-конце захватывающей последовательности;
последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую из по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 нуклеотидов N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т.
25. Способ изготовления панели нуклеиновых кислот для получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в биологическом образце, где пространственная информация включает расположение и/или распределение нуклеиновой кислоты, и указанный способ включает следующие стадии:
(1) предоставление многочисленных видов последовательностей-носителей, где каждый вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя, и последовательность-носитель содержит в направлении от 5' к 3' позиционную последовательность и первую иммобилизующую последовательность,
позиционная последовательность имеет уникальную последовательность нуклеотидов, соответствующую положению данного вида последовательности-носителя на панели;
первая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности и инициацию реакции элонгации;
(2) связывание многочисленных видов последовательностей-носителей с поверхностью твердой подложки;
(3) предоставление первого праймера и осуществление реакции элонгации праймера с применением в качестве матрицы последовательности-носителя, так что область первой иммобилизующей последовательности и позиционная последовательность последовательности-носителя образуют двойную цепь, где цепь, которая гибридизуется с последовательностью-носителем, представляет собой молекулу первой нуклеиновой кислоты, молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' первую иммобилизующую последовательность и последовательность, комплементарную позиционной последовательности; где первый праймер содержит область, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, на своем 3'-конце; область, комплементарная первой иммобилизующей последовательности, содержит последовательность,
комплементарную первой иммобилизующей последовательности, или ее фрагмент и имеет свободный 3'-конец;
где на стадии (1) многочисленные виды последовательностей-носителей предоставлены посредством следующих стадий:
(1) предоставление множества видов матриц последовательностей-носителей, где матрица последовательности-носителя содержит последовательность, комплементарную последовательности-носителю;
(2) осуществление реакции амплификации нуклеиновой кислоты с применением в качестве матрицы каждого вида матрицы последовательности-носителя с получением продукта амплификации каждого вида матрицы последовательности-носителя, где продукт амплификации содержит множество копий последовательности-носителя;
и где каждый указанный вид последовательности-носителя, содержащий одинаковую позиционную последовательность, занимает область, имеющую диаметр менее 1 микрометра.
26. Способ по п. 25, где пространственная информация дополнительно включает экспрессию гена или мРНК.
27. Способ по п. 25 или 26, где амплификацию по типу катящегося кольца выполняют с получением DNB, образованного конкатемером последовательности-носителя; или
мостиковую ПЦР-амплификацию, эмульсионную ПЦР-амплификацию или амплификацию с множественным вытеснением цепи выполняют с получением кластера ДНК, образованного популяцией клонов последовательности-носителя.
28. Способ по любому из пп. 25-27, дополнительно включающий следующие стадии:
(4) предоставление молекулы второй нуклеиновой кислоты, содержащей захватывающую последовательность;
где захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации,
(5) лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты с молекулой первой нуклеиновой кислоты; предпочтительно с использованием лигазы.
29. Способ по п. 28, где молекула второй нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' иммобилизующую область и захватывающую последовательность, и иммобилизующая область содержит двуцепочечную последовательность ДНК.
30. Способ по п. 28, где каждая последовательность-носитель дополнительно содержит вторую иммобилизующую последовательность на своем 5'-конце, и вторая иммобилизующая последовательность обеспечивает отжиг своей комплементарной нуклеотидной последовательности; где способ дополнительно включает следующие стадии:
(4) предоставление молекулы второй нуклеиновой кислоты, содержащей в направлении от 5' к 3' комплемент второй иммобилизующей последовательности и захватывающую последовательность;
где комплемент второй иммобилизующей последовательности обеспечивает гибридизацию со своей комплементарной нуклеотидной последовательностью;
захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и захватывающая последовательность имеет свободный 3'-конец, позволяющий молекуле второй нуклеиновой кислоты служить праймером для элонгации;
(5) гибридизация комплемента второй иммобилизующей последовательности со второй иммобилизующей последовательностью в условиях, обеспечивающих отжиг, и тем самым лигирование молекулы второй нуклеиновой кислоты с последовательностью-носителем;
(6) возможно, лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с последовательностью-носителем, соответственно; предпочтительно с использованием лигазы.
31. Способ по любому из пп. 28-30, где на стадии (3) первый праймер дополнительно содержит уникальный молекулярный идентификатор (UMI) на 5'-конце своей области, комплементарной первой иммобилизующей последовательности, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит последовательность UMI на 5'-конце своего комплемента первой иммобилизующей последовательности; или на стадии (4) молекула второй нуклеиновой кислоты дополнительно содержит последовательность UMI, расположенную на 5'-конце захватывающей последовательности;
последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую из по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 нуклеотидов N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т.
32. Способ по п. 25 или 26, в котором:
на стадии (1) последовательность-носитель дополнительно содержит матрицу захватывающей последовательности, расположенную в направлении против хода транскрипции от позиционной последовательности, матрица захватывающей последовательности содержит последовательность, комплементарную захватывающей последовательности, и захватывающая последовательность способна гибридизоваться со всей захватываемой нуклеиновой кислотой или ее частью и содержит: (а) олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК; и/или (б) случайную или вырожденную олигонуклеотидную последовательность; или (в) конкретную последовательность для конкретной нуклеиновой кислоты-мишени; и первая иммобилизующая последовательность последовательности-носителя также содержит сайт расщепления, и расщепление может быть выбрано из ферментативного расщепления ферментом никазой, ферментативного расщепления ферментом USER, фоторасщепления, химического расщепления или расщепления на основе CRISPR;
на стадии (3) область первой иммобилизующей последовательности, позиционная последовательность и матрица захватывающей последовательности последовательности-носителя образуют двойную цепь, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность; причем
первый праймер содержит в направлении от 5' к 3' связывающую область, область расщепления и область, комплементарную первой иммобилизующей последовательности, связывающая область содержит линкер, способный связываться с поверхностью твердой подложки, и область расщепления содержит сайт расщепления;
и способ дополнительно включает следующие стадии:
(4) связывание первого праймера с поверхностью твердой подложки; причем стадии (3) и (4) выполняют в любом порядке;
(5) возможно, осуществление расщепления в сайте расщепления, содержащемся в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя для разрезания последовательности-носителя, так что продукт элонгации на стадии (3) отделяется от матрицы, на которой образовался такой продукт элонгации, и, таким образом, молекула первой нуклеиновой кислоты связывается с поверхностью твердой подложки.
33. Способ по п. 32, где каждый вид последовательности-носителя представляет собой DNB, образованный конкатемером множества копий последовательности-носителя.
34. Способ по п. 32 или 33, где на стадии (1) сайт расщепления, содержащийся в первой иммобилизующей последовательности, представляет собой сайт расщепления для фермента никазы;
предпочтительно, фермент никаза выбран из USER, BamHI и BmtI.
35. Способ по любому из пп. 32-34, где на стадии (1) последовательность-носитель дополнительно содержит комплемент последовательности UMI, расположенный в направлении по ходу транскрипции от матрицы захватывающей последовательности и против хода транскрипции от первой иммобилизующей последовательности, где комплемент последовательности UMI комплементарен последовательности UM1, и последовательность UMI представляет собой нуклеотидную последовательность, состоящую из по меньшей мере 1, по меньшей мере 2, по меньшей мере 3, по меньшей мере 4 или по меньшей мере 5 нуклеотидов N, где каждый N независимо представляет собой любой из А, С, G и Т;
и на стадии (3) область первой иммобилизующей последовательности, позиционная последовательность, матрица захватывающей последовательности и комплемент последовательности UMI последовательности-носителя образуют двойную цепь, так что молекула первой нуклеиновой кислоты содержит в направлении от 5' к 3' комплемент первой иммобилизующей последовательности, комплемент позиционной последовательности и захватывающую последовательность, а также последовательность UMI, расположенную в направлении против хода транскрипции от захватывающей последовательности и по ходу транскрипции от комплемента первой иммобилизующей последовательности;
при этом, предпочтительно, комплемент последовательности UMI расположен между позиционной последовательностью и матрицей захватывающей последовательности или между первой иммобилизующей последовательностью и позиционной последовательностью.
36. Способ по любому из пп. 32-35, где линкер первого праймера представляет собой линкерную группу, способную присоединяться к активирующей группе, и поверхность твердой подложки модифицирована активирующей группой;
предпочтительно, линкер содержит -SH, 
или -NHS;
предпочтительно, линкер представляет собой 
, а 
(сложный эфир азидо-dPEG®8-NHS) присоединен к поверхности твердой подложки.
37. Способ по любому из пп. 32-36, где сайт расщепления, содержащийся в области расщепления первого праймера, представляет собой сайт, в котором контролируемое расщепление может осуществляться химическим, ферментативным или фотохимическим способом;
предпочтительно, сайт расщепления, содержащийся в области расщепления первого праймера, представляет собой сайт расщепления ферментом;
предпочтительно, область расщепления первого праймера отличается от сайта расщепления, содержащегося в первой иммобилизующей последовательности последовательности-носителя.
38. Способ по любому из пп. 25-37, где олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит последовательность, способную гибридизоваться с поли-А хвостом мРНК;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность, способная захватывать мРНК, содержит олигонуклеотидную последовательность поли-Т;
предпочтительно, олигонуклеотидная последовательность поли-Т содержит по меньшей мере 10 остатков дезокситимидина.
39. Способ по любому из пп. 25-38, где на стадии (3) при осуществлении реакции элонгации последовательность-носитель секвенируют с получением информации о последовательности позиционной последовательности, содержащейся в последовательности-носителе.
40. Способ по любому из пп. 25-39, в котором перед стадией (3) включена стадия секвенирования последовательности-носителя;
предпочтительно, после выполнения секвенирования выполняют промывание для удаления дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов), добавленных к синтетической цепи в ходе секвенирования.
41. Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, где пространственная информация включает расположение и/или распределение нуклеиновой кислоты, и указанный способ включает следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по п. 4 или 6 или получение панели нуклеиновых кислот способом по любому из пп. 28-31; где
панель нуклеиновых содержит многочисленные виды последовательностей-носителей, присоединенных к поверхности твердой подложки, каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, и каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя;
каждая последовательность-носитель содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты, и молекула первой нуклеиновой кислоты лигирована с молекулой второй нуклеиновой кислоты, или каждая последовательность-носитель содержит молекулу первой нуклеиновой кислоты и молекулу второй нуклеиновой кислоты, которые с ней гибридизованы;
молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующий положению данного вида последовательности-носителя на панели;
молекула второй нуклеиновой кислоты содержит захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
где каждый указанный вид последовательности-носителя, содержащий одинаковую позиционную последовательность, занимает область, имеющую диаметр менее 1 микрометра;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы второй нуклеиновой кислоты, и таким образом, положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением последовательности-носителя на панели нуклеиновых кислот;
(3) (i) когда молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты не лигированы друг с другом, лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с каждой последовательностью-носителем;
осуществление реакции элонгации праймера, с использованием лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера и с использованием захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с захваченной молекулой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты; и/или
осуществление реакции элонгации праймера с использованием захваченной молекулы нуклеиновой кислоты в качестве праймера и с использованием лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением удлиненной молекулы захваченной нуклеиновой кислоты, причем удлиненная захваченная нуклеиновая кислота в качестве метки пространственной информации имеет позиционную последовательность;
альтернативно, (ii) когда молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты не лигированы друг с другом, осуществление реакции элонгации праймера с использованием молекулы второй нуклеиновой кислоты в качестве праймера и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением удлиненной молекулы второй нуклеиновой кислоты, причем удлиненная молекула второй нуклеиновой кислоты содержит последовательность, комплементарную захваченной нуклеиновой кислоте; лигирование молекулы первой нуклеиновой кислоты и удлиненной молекулы второй нуклеиновой кислоты, гибридизованных с каждой последовательностью-носителем, причем удлиненная молекула второй нуклеиновой кислоты, лигированная с молекулой первой нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты;
альтернативно, (iii) когда молекула первой нуклеиновой кислоты и молекула второй нуклеиновой кислоты лигированы друг с другом, осуществление реакции элонгации праймера с использованием в качестве праймера лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с молекулой захваченной нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты; и/или
осуществление реакции элонгации праймера с использованием в качестве праймера молекулы захваченной нуклеиновой кислоты и с использованием соединенных вместе лигированных молекул первой и второй нуклеиновых кислот в качестве матрицы, в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением удлиненной молекулы захваченной нуклеиновой кислоты, причем удлиненная молекула захваченной нуклеиновой кислоты в качестве метки пространственной информации имеет позиционную последовательность;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул нуклеиновых кислот, несущих метки пространственной информации, причем эта часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь и молекулу захваченной нуклеиновой кислоты или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4).
42. Способ по п. 41, где пространственная информация дополнительно включает экспрессию гена или мРНК.
43. Способ по п. 41 или 42, где лигирование, указанное на стадии (3)(i) или стадии (3)(ii) осуществляют с использованием лигазы.
44. Способ по любому из пп. 41-43, применяемый для определения транскриптома в образце, где:
(а) на стадии (3) (i) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, используя лигированные молекулы первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера для обратной транскрипции, где молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК; или на стадии (3)(ii) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, используя молекулу второй нуклеиновой кислоты в качестве праймера для обратной транскрипции, лигируют молекулу первой нуклеиновой кислоты и молекулу кДНК, гибридизованную с каждой последовательностью-носителем, предпочтительно используя лигазу, с получением молекулы кДНК, которая в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК; или на стадии (3)(iii) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, используя лигированные молекулы первой и второй нуклеиновых кислот в качестве праймера для обратной транскрипции, где молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК;
и
(б) на стадии (4) высвобождают с поверхности панели по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой первую и/или вторую цепь молекулы кДНК или ее ампликон, и где указанная часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь;
предпочтительно, на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.
45. Способ получения пространственной информации о нуклеиновой кислоте в образце, где пространственная информация включает расположение и/или распределение нуклеиновой кислоты, и указанный способ включает следующие стадии:
(1) предоставление панели нуклеиновых кислот по любому из пп. 13-18 или получение панели нуклеиновых кислот способом по любому из пп. 32-37; где панель нуклеиновых кислот содержит твердую подложку с многочисленнымии видами последовательностей-носителей, присоединенных к ее поверхности, каждый вид последовательности-носителя занимает в панели отличное от другого вида положение, и каждый указанный вид последовательности-носителя содержит множество копий последовательности-носителя;
каждая последовательность-носитель содержит гибридизованную с ней молекулу первой нуклеиновой кислоты, и молекула первой нуклеиновой кислоты содержит комплемент позиционной последовательности, соответствующий положению данного вида последовательности-носителя на панели, и захватывающую последовательность, способную захватывать нуклеиновую кислоту в образце;
где каждый указанный вид последовательности-носителя, содержащий одинаковую позиционную последовательность, занимает область, имеющую диаметр менее 1 микрометра;
(2) приведение панели нуклеиновых кислот в контакт с исследуемым образцом в условиях, обеспечивающих отжиг, так что нуклеиновая кислота в исследуемом образце отжигается с захватывающей последовательностью молекулы первой нуклеиновой кислоты, и таким образом, положение нуклеиновой кислоты можно сопоставить с положением молекулы первой нуклеиновой кислоты на панели нуклеиновых кислот;
(3) осуществление реакции элонгации праймера с использованием молекулы первой нуклеиновой кислоты в качестве праймера и с использованием молекулы захваченной нуклеиновой кислоты в качестве матрицы, в условиях, обеспечивающих элонгацию праймера, с получением продукта элонгации, в котором цепь, которая гибридизуется с молекулой захваченной нуклеиновой кислоты, в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты;
(4) высвобождение с поверхности панели по меньшей мере части молекул нуклеиновых кислот, несущих метки пространственной информации, причем эта часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь и молекулу захваченной нуклеиновой кислоты или комплементарную ей цепь; и
(5) прямой или косвенный анализ последовательности молекулы нуклеиновой кислоты, высвобожденной на стадии (4).
46. Способ по п. 45, где пространственная информация дополнительно включает экспрессию гена или мРНК.
47. Способ по п. 45 или 46, применяемый для определения транскриптома в образце, в котором:
на стадии (3) с захваченной молекулы РНК синтезируют молекулу кДНК, с использованием молекулы первой нуклеиновой кислоты в качестве праймера для обратной транскрипции, причем молекула кДНК в качестве метки пространственной информации имеет комплемент позиционной последовательности, содержащийся в молекуле первой нуклеиновой кислоты, и, возможно, амплифицируют молекулу кДНК;
на стадии (4) высвобождают с поверхности панели по меньшей мере часть молекул кДНК и/или их ампликонов, причем высвобожденная молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой первую и/или вторую цепь молекулы кДНК или ее ампликон, и где указанная часть содержит позиционную последовательность или комплементарную ей цепь;
предпочтительно, на стадии (1) захватывающая последовательность содержит олигонуклеотидную последовательность, способную захватывать мРНК.
48. Способ по любому из пп. 41-47, где многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой DNB, образованный конкатемером последовательности-носителя, или многочисленные копии последовательности-носителя представляют собой кластер ДНК, образованный популяцией клонов последовательности-носителя.
49. Способ по любому из пп. 41-48, где на стадии (5) анализ последовательности включает секвенирование или специфичную к последовательности реакцию ПЦР.
50. Способ по любому из пп. 41-49, дополнительно включающий стадию (6): сопоставление информации, полученной путем анализа последовательности на стадии (5), с изображением образца, где изображение образца получают до или после стадии (3);
предпочтительно, изображение образца получают с применением световой, светлопольной, темнопольной, фазовоконтрастной, флуоресцентной, отражательной, интерференционной, конфокальной микроскопии или их комбинации.
51. Способ по любому из пп. 41-50, в котором до или после высвобождения с поверхности панели молекулы нуклеиновой кислоты, несущей метку пространственной информации, или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации, синтезируют комплементарную цепь или вторую цепь кДНК;
предпочтительно, в синтезе комплементарной цепи или второй цепи используют случайный праймер и полимеразу, обеспечивающую вытеснение цепи.
52. Способ по любому из пп. 41-51, который, перед анализом последовательности, дополнительно включает стадию амплификации молекулы нуклеиновой кислоты или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации;
где, предпочтительно, стадию амплификации осуществляют после высвобождения с панели молекулы нуклеиновой кислоты или молекулы кДНК, несущей метку пространственной информации, или стадию амплификации выполняют на панели in situ;
предпочтительно, стадия амплификации включает ПЦР.
53. Способ по любому из пп. 41-52, который, перед анализом последовательности, дополнительно включает стадию очистки высвобожденной молекулы нуклеиновой кислоты.
54. Способ по любому из пп. 41-53, который, перед стадией (4), дополнительно включает стадию промывания панели для удаления остатков образца.
55. Способ по любому из пп. 41-54, в котором на стадии (4) молекула нуклеиновой кислоты высвобождается с поверхности панели следующим способом: (1) расщеплением нуклеиновой кислоты; (2) денатурацией и/или (3) физическим способом.
56. Способ по любому из пп.41-55, где образец представляет собой образец ткани, такой как срез ткани;
предпочтительно, срез ткани готовят из фиксированной ткани, например, фиксированной формалином и заключенной в парафин (FFPE) ткани или ткани, подвергнутой глубокой заморозке.
57. Способ по любому из пп. 25-56, где твердая подложка представляет собой чип;
предпочтительно, твердая подложка может применяться в качестве платформы для секвенирования, такой как чип для секвенирования;
предпочтительно, твердая подложка представляет собой чип для высокопроизводительного секвенирования, такой как чип для высокопроизводительного секвенирования, используемый в платформах для секвенирования Illumina, MGI или Thermo Fisher.
| ДВИГАТЕЛЬ ДИЗЕЛЯ ДЛЯ ТЕПЛОВОЗА | 1926 |
|
SU6512A1 |
| НАБОР ИЗ ДВУХ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ АМПЛИФИКАЦИИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ ВИРУСА ГЕПАТИТА А, СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А С ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ (ВАРИАНТЫ) И НАБОР ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА А | 2003 |
|
RU2406762C2 |
| ГЕНОМНЫЙ ОТБОР И СЕКВЕНИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ КОДИРОВАННЫХ МИКРОНОСИТЕЛЕЙ | 2010 |
|
RU2609630C2 |
| RU 99117594 A, 27.06.2001 | |||
| US 5340474 A1, 23.08.1994 | |||
| WO 2017019456 A2, 02.02.2017 | |||
| EP 2946345 A4, 07.09.2016 | |||
| Печь для пирогенетического разложения нефти | 1926 |
|
SU5739A1 |
| Пожарный извещатель | 1930 |
|
SU23190A1 |
