СПОСОБ ОБОГАЩЕНИЯ МОЛОКА ВИТАМИНОМ ГРУППЫ В МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАЦИИ ЛАКТОБАКТЕРИЯМИ Российский патент 2023 года по МПК A23C9/123 A23C9/158 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в пищевой промышленности для получения ферментированных молочных продуктов с повышенным содержанием микронутриентов - водорастворимых витаминов группы B, обогащение которыми происходит в процессе его естественной ферментации молочнокислыми бактериями in situ.

Витамины группы B - это важные эссенциальные нутриенты, принимающие участие во многих метаболических и регуляторных процессах, протекающих во всех формах клеточной жизни. К водорастворимым витаминам группы B относятся: B₁ (тиамин), B₂ (рибофлавин), B₃ (пантотеновая кислота), B₅ (никотиновая кислота), B₆ (пиридоксин) и B₉ (фолиевая кислота). Они не синтезируются организмом млекопитающих, от чего их поступление в значительной мере зависит от питательности рациона. Рекомендованная суточная норма потребления водорастворимых витаминов группы B с пищей для человека во многом зависит от возраста и исчисляется в мг или мкг. В связи с крайне низкой токсичностью верхний допустимый уровень потребления для витаминов группы B не установлен (Коденцова В. М. Градации уровней потребления витаминов: возможные риски при чрезмерном потреблении // Вопросы питания. 2014. Т. 83. №. 3. С. 41-51). Среди населения Российской Федерации признаки дефицита витаминов группы B и/или недостаточное потребление обнаруживаются и достаточно широко распространены в популяции (Коденцова В. М. и др. Витаминная обеспеченность взрослого населения Российской Федерации: 1987-2017 гг // Вопросы питания. 2018. Т. 87. №. 4. С. 62-68).

Одним из недавно установленных источников витаминов группы B являются микроорганизмы, населяющие желудочно-кишечный тракт (Peterson C. T. et al. B vitamins and their role in immune regulation and cancer // Nutrients. 2020. V. 12(11): 3380). Важным преимуществом микробных витаминов перед пищевыми добавками является их выработка и всасывание в толстом кишечнике, где они могут выполнять различные важные функции и действовать как питательные вещества для хозяина и микробиоты, регуляторы активности популяций иммунных клеток, медиаторы эффективности лекарственных средств, протекторы выживания или приспособленности определенных бактерий, супрессоры колонизации патогенными бактериями (Uebanso T. et al. Functional roles of B vitamins in the gut and gut microbiome // Molecular nutrition & food research. 2020. Vol. 64(18): 2000426). Использование же синтетических витаминов, например фолиевой кислоты, может иметь некоторые неблагоприятные последствия для здоровья человека, такие как маскировка симптомов дефицита витамина B₁₂ и, возможно, возникновение определенных видов рака (Cavalcanti de Albuquerque M. A. et al. Supplementation with fruit and okara soybean by-products and amaranth flour increases the folate production by starter and probiotic cultures // International Journal of Food Microbiology. 2016. Vol. 236. pp. 26-32). Кроме того, синтетические витамины требуют больше времени для метаболизма человеком, чем витамины в их натуральной форме (Cavalcanti de Albuquerque M.A., Moreno de LeBlanc A.D., LeBlanc J.G., & Bedani R. Lactic Acid Bacteria: A Functional Approach (1st ed.). CRC Press. 2020).

Естественными представителями микробиоты кишечника являются бактерии различных видов родов Bifidobacterium и Lactobacillus, которые находят широкое применение в качестве пробиотиков. В настоящее время показано, что некоторые штаммы лакто- и бифидобактерий могут продуцировать семь из восьми витаминов группы B (Uebanso T. et al. Functional roles of B vitamins in the gut and gut microbiome // Molecular nutrition & food research. 2020. Vol. 64(18): 2000426). Применение витаминпродуцирующих лактобактерий, особенно штаммов, синтезирующих рибофлавин и фолиевую кислоту, может применяться в качестве дополнительного лечения у пациентов, страдающих широким спектром воспалительных заболеваний, таких как колит, мукозит и даже рак толстой кишки (LeBlanc J. G. et al. Application of vitamin-producing lactic acid bacteria to treat intestinal inflammatory diseases // Applied microbiology and biotechnology. 2020. Vol. 104 (8). pp. 3331-3337). Биологическая активность витаминов, продуцируемых молочнокислыми бактериями, доказана на животных моделях реверсией дефицита витаминов (Carrizo S. L. et al. Quinoa pasta fermented with lactic acid bacteria prevents nutritional deficiencies in mice // Food Research International. 2020. Vol. 127: 108735).

Витаминпродуцирующие штаммы лактобактерий могут быть использованы для обогащения молока водорастворимыми витаминами группы B. Традиционным способом обогащения пищевых продуктов микронутриентами является добавление химически синтезированных витаминов. Создание ферментированных продуктов с использованием витаминпродуцирующих штаммов лактобактерий является многообещающим подходом. Благодаря разумному выбору видов и штаммов микроорганизмов, а также условий их культивирования, повышение концентрации витаминов может происходить в процессе естественной ферментации in situ, что повышает привлекательность продукта для потребителя из-за дополнительных функциональных свойств и снижает производственные затраты. Для потребителей же увеличение потребления витаминов будет происходить в рамках их обычной диеты с привычным набором продуктов без образования нежелательных побочных эффектов.

Количество водорастворимых витаминов группы B, синтезируемых молочнокислыми бактериями, обычно сильно колеблется и зависит не только от вида или штамма лактобактерий, но также от условий культивирования (Capozzi V. et al. Lactic acid bacteria producing B-group vitamins: a great potential for functional cereals products // Applied Microbiology and Biotechnology. 2012. Vol. 96(6). pp. 1383-1394).

Известен способ производства ферментированного молока путем ферментации симбиотической культуры бифидобактерий и дрожжей (патент CN 103859024), где в качестве сырья используют сырое молоко с добавлением 2-6 % обезжиренного молока, 6-12 % сахарозы, 1-3% глюкозы, 0,01-0,05% витамина C. Основным недостатком изобретения является низкое содержание витаминов группы B в конечном продукте: содержание витамина В₁ составляло 4-8 частей на миллион (ppm), содержание витамина B₂ - 35-50 частей на миллион (ppm) с необходимостью введения в состав дополнительных компонентов, что повышает производственные затраты.

Известен способ производства кислого молока с высоким содержанием витамина B₂ для снижения уровня холестерина (патент CN1596678), где в качестве заквасочных культур используются штаммы Lactobacillus helveticus JCM1004 и Lactococcus lactis subsp. ATCC 15577; Streptococcus thermophilus и/или Bacillus bulgaricus. Основным недостатком способа является использование культур, которые в процессе ферментации молока накапливают только витамин B₂ в количестве 0,75-1,10 мкг/мл.

Наиболее близким к заявляемому способу является патент CN111789161 (Preparation method and application of fermented milk rich in vitamin B) (прототип), в котором ферментированное молоко, обогащенное витаминами группы B, получают путем сквашивания смешанной культурой Lactobacillus plantarum Bama06 и Streptococcus thermophilus grx11 в соотношении 2:1 (об./об.) смеси коровьего молока с соевым молоком с добавлением 3,0-5,0 % конопляного масла и 0,1%-0,3% мальтита в течение 8-16 ч при 37°С. Содержание витаминов В₂, В₅, В₆ и фолиевой кислоты в перемешанных кисломолочных продуктах составляло 3,23 мг/л, 8,12 мг/л, 3,01 мг/л и 0,78 мг/л, соответственно. Недостатком изобретения является необходимость введения в состав дополнительных компонентов, таких как соевое молоко, конопляное масло и мальтит, противопоказанием к употреблению которых может быть индивидуальная непереносимость и развитие аллергий. Также в патенте не показано, каким было начальное содержание витаминов группы B в смеси до ферментации.

Технической задачей предлагаемого изобретения является повышение содержания витаминов группы B в молоке в процессе естественной ферментации с использованием витаминпродуцирующих молочнокислых бактерий и получение функциональных продуктов без внесения дополнительных компонентов. Польза данных продуктов для здоровья будет усиливаться как за счет обогащения ферментированного молока естественными формами витаминов, так и за счет высокого содержания витаминпродуцирующих лактобактерий, которые могут продуцировать витамины не только в молоке, но, потенциально, и в кишечнике.

Поставленная задача решается путем разработки способа обогащения молока витаминами группы В методом ферментации молока штаммами лактобактерий Lactobacillus acidophilus B-2213 или Lactobacillus salivarius B-2214 при дозе инокулируемой посевной культуры 5 - 20 % объемных в течение 6 - 24 ч при температуре 30-40°С.

Технический результат настоящего изобретения заключается в получении продукта, в котором повышенное содержание витаминов группы B достигается в результате его естественной ферментации штаммом L. acidophilus B-2213 до конечного содержания витаминов группы B: B₅ - 31,450 мкг/л, B₆ - 0,806 мкг/л, B₃ - 4,734 мкг/л или штаммом L. salivarius B-2214 до конечного содержания витаминов B₅ - 20,76 и B_с - 12,506 мкг/л.

Достижение технического результата подтверждается примерами.

Пример 1.

Стерильное обезжиренное молоко инокулируют посевной культурой штамма лактобактерий Lactobacillus acidophilus B-2213, которую получают путем центрифугирования ночных культур, выращенных в среде MRS, при 5000 об/мин в течение 5 мин с восстановлением объема стерильным физиологическим раствором, в интервале варьирования дозировки инокулята от 5 до 15 % об., продолжительности ферментации от 6 ч до 24 ч при температуре от 30 до 40°С. Условия эксперимента и результаты оценки накопления витаминов методом капиллярного электрофореза на системе Капель^®-105М (Люмэкс, Санкт-Петербург) представлены в таблице 1.

Таблица 1. Условия варьирования и количественное содержание витаминов группы B в ферментированном и не ферментированном молоке № Доза, %об Продолжительность, ч Температура, °C Концентрация B_5, мкг/л Концентрация B_6, мкг/л Концентрация B_3, мкг/л 1 5 6 30 21,910 н/о^* н/о 2 15 6 30 2,283 н/о н/о 3 5 24 30 9,801 н/о н/о 4 15 24 30 18,680 н/о н/о 5 5 6 40 1,975 н/о н/о 6 15 6 40 3,865 н/о н/о 7 5 24 40 16,020 н/о н/о 8 15 24 40 18,790 н/о н/о 9 10 15 35 31,450 0,806 4,734 Не ферментированное молоко н/о н/о н/о

^*-не обнаружено.

Штамм Lactobacillus acidophilus B-2213 выделяет и накапливает никотиновую кислоту (таблица 1). При продолжительности ферментации 15 ч, дозировке посевной культуры 10 % и температуре ферментации 35°С также определяются витамины B₆ и B₃.

При снижении показателей ниже установленных интервалов варьирования витамины группы B в ферментированном молоке не обнаруживаются. Увеличение выбранных показателей и интервалов варьирования приводит к отсутствию роста или снижению концентраций витаминов и численности жизнеспособных клеток штамма L. acidophilus B-2213.

Пример 2.

Стерильное обезжиренное молоко инокулируют посевной культурой штамма лактобактерий Lactobacillus salivarius B-2214, которую получают путем центрифугирования ночных культур, выращенных в среде MRS, при 5000 об/мин в течение 5 мин с восстановлением объема стерильным физиологическим раствором, в интервале варьирования дозировки инокулята от 5 до 15 % об., продолжительности ферментации от 6 ч до 24 ч при температуре от 30 до 40°С. Условия эксперимента и результаты оценки накопления витаминов методом капиллярного электрофореза на системе Капель^®-105М (Люмэкс, Санкт-Петербург) представлены в таблице 2.

Таблица 2. Условия варьирования и количественное содержание витаминов группы B в ферментированном и не ферментированном молоке № Доза, %об Продолжительность, ч Температура, °C Концентрация B_5, мкг/л Концентрация B_с, мкг/л 1 5 6 30 12,56 н/о^* 2 15 6 30 12,61 н/о 3 5 24 30 13,43 н/о 4 15 24 30 13,52 н/о 5 5 6 40 14,26 5,667 6 15 6 40 14,28 8,029 7 5 24 40 16,87 7,033 8 15 24 40 15,98 6,904 9 10 15 35 20,76 12,506 Не ферментированное молоко н/о н/о

^*-не обнаружено.

Штамм Lactobacillus salivarius B-2214 выделяет и накапливает никотиновую и фолиевую кислоту (таблица 2).

При снижении показателей ниже установленных интервалов варьирования витамины группы B в ферментированном молоке не обнаруживаются. Увеличение выбранных показателей и интервалов варьирования приводит к отсутствию роста или снижению концентраций витаминов, а также численности жизнеспособных клеток штамма L. salivarius B-2214.

Таким образом, штаммы L. acidophilus B-2213 и L. salivarius B-2214 могут быть использованы для обогащения молока водорастворимыми витаминами группы B в процессе его естественной ферментации.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в молочной промышленности. Способ обогащения молока витамином группы B – никотиновой кислотой заключается в его ферментации лактобактериями Lactobacillus acidophilus B-2213 или Lactobacillus salivarius B-2214 при дозе вносимого инокулята 5-15% объемных в течение 6-24 часов при температуре 30-40°С. Изобретение позволяет повысить содержание никотиновой кислоты в ферментированном молоке и получить функциональный продукт без внесения дополнительных компонентов. 2 табл., 2 пр.

Способ обогащения молока витамином группы B – никотиновой кислотой, заключающийся в его ферментации лактобактериями Lactobacillus acidophilus B-2213 или Lactobacillus salivarius B-2214 при дозе вносимого инокулята 5-15% объемных в течение 6-24 часов при температуре 30-40°С.