Способ определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток Российский патент 2023 года по МПК G01N33/15 

Изобретение относится к области иммуноонкологии. В частности, настоящее изобретение относится к способу определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток.

Область иммуноонкологии претерпела значительные изменения в лечении онкологических заболеваний. Уильям Б. Коли, признанный в настоящее время отцом иммунотерапии, впервые попытался использовать иммунную систему для лечения рака в конце 19 века. Коли вводил более чем тысяче пациентов смеси живых и инактивированных бактерий, таких как Streptococcus pyogenes и Serratia marcescens, желая вызвать сепсис, который сопровождался сильным иммунным и противоопухолевым ответом. Его коктейль из бактерий стал широко известен как «токсин Коли» и представляет собой первое задокументированное активное вмешательство иммунотерапии рака (McCarthy E.F. The toxins of William B. Coley and the treatment of bone and soft-tissue sarcomas. Iowa Orthop. J., 2006, 26, 154-8. doi: doi.org/10.3390/toxins12040241). Коли добился постремиссий при нескольких типах злокачественных новообразований, включая саркому, лимфому и рак яичка. Однако отсутствие известного механизма действия токсина Коли и риск преднамеренного заражения онкологических больных патогенными бактериями заставили онкологов принять хирургию и лучевую терапию в качестве альтернативных стандартных методов лечения в начале 20-го века.

За последнее десятилетие на основе обширного развития доклинических исследований на животных и клинических испытаний были полностью изучены эффективность и механизмы иммунотерапии. Значительные и продолжительные клинические ответы при использовании иммунотерапии обеспечивают новый прорыв в лечении различных рефрактерных карцином, что постепенно меняет схему лечения опухолей. Например, применение иммунотерапии химерных антигенных рецепторов Т-клеток стало новой прорывной терапией, поскольку ее успешность в борьбе с рефрактерной В-лимфоцитарной лейкемией составляет более 90% (Holzinger A., Barden M., Abken H. The growing world of CAR T cell trials: a systematic review. Cancer Immunol Immunother., 2016, 65(12), 1433-1450. doi: 10.1007/s00262-016-1895-5).

Другим классом выдающихся методов лечения является терапия ингибиторами иммунных контрольных точек, которые в настоящее время являются первой линией лечения пациентов с немелкоклеточным раком легких (НМРЛК), меланомой и почечно-клеточной карциномой; они также являются вариантом лечения некоторых прогрессирующих и рефрактерных типов опухолей, таких как опухоли мочевого пузыря и опухоли головы и шеи (Rieth J., Subramanian S. Mechanisms of intrinsic tumor resistance to immunotherapy. Int. J. Mol. Sci., 2018, 1340. doi: 10.3390/ijms19051340).

Биологическая терапия рака включает в себя лечение природными молекулами, созданными организмом или изготовленными в лаборатории. Эти методы лечения либо помогают иммунной системе бороться с раком, либо атакуют рак напрямую. К ним относятся лечение моноклональными антителами, приемный перенос клеток, генная терапия, лечение цитокинами, противораковыми вакцинами, онколитическими вирусами, иммуноконъюгатами и применение таргетной терапии.

Моноклональные антитела играют огромную роль в противораковой терапии. Цетуксимаб является анти-EGFR моноклональным антителом. Его механизм действия включает блокирование сигнала пролиферации раковых клеток посредством ингибирования сигнальных путей EGFR/Pi3K/AKT/mTOR или EGFR/Ras/Raf/MAPK/ERK. Блокирование сигнала приводит к ингибированию клеточного деления в G1 фазе из-за отсутствия необходимых факторов транскрипции с последующей элиминацией клеток путем апоптоза (Zhuang X., Wang Z., Fan J., et al. Structure-guided and phage-assisted evolution of a therapeutic anti-EGFR antibody to reverse acquired resistance. Nat. Commun., 2022, 13(1), 4431. doi: 10.1038/s41467-022-32159-6).

Цетуксимаб подавляет лиганд-зависимую активацию EGFR и ингибирует пути взаимодействия, вызывающие прогрессию клеточного цикла, рост клеток и ангиогенез. Кроме того, связывание цетуксимаба инициирует интернализацию и деградацию EGFR, что приводит к прекращению сигнала. Более того, в отличие от ингибиторов тирозинкиназы EGFR, цетуксимаб потенциально может провоцировать иммунологические противоопухолевые эффекты, такие как ADCC (антителозависимая клеточная опосредованная цитотоксичность), поскольку он имеет основу из IgG1 человека. Терапевтический эффект цетуксимаба, по-видимому, зависит от цитотоксического ответа иммунной системы, индуцированного против раковых клеток, покрытых EGFR-связанными антителами (ADCC), и активации системы комплемента.

Активность ADCC моноклональных антител против рака была хорошо описана для трастузумаба (Герцептин), антитела против рака молочной железы (Carter P., Presta L., Gorman C.M., et. al. Humanization of an anti-p185HER2 antibody for human cancer therapy. Proc. Natl. Acad. Sci USA., 1992, 89(10), 4285-9. doi: 10.1073/pnas.89.10.4285), и ритуксимаба (Ритуксан), антитела против В-клеточной лимфомы (Reff M.E., Carner K., Chambers K.S., et.al. Depletion of B cells in vivo by a chimeric mouse human monoclonal antibody to CD20. Blood, 1994, 83(2), 435-45). Считается, что эта активность ADCC имеет решающее значение для их противоопухолевого действия. Исследования показывают, что цетуксимаб способен вызывать ADCC против EGFR-экспрессирующей плоскоклеточной карциномы пищевода (Liu Z., Lee F.T., Hanai N. et.al. Cytokine enhancement of in vitro antibody-dependent cellular cytotoxicity mediated by chimeric anti-GD3 monoclonal antibody KM871. Cancer Immun., 2002, 2, 13). Однако, ни одно опубликованное исследование не было посвящено способу определения его специфической активности биологическим методом на культуре клеток.

Технической задачей, на решение которой направлено изобретение, является создание способа определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток, включающий все перечисленные ниже этапы:

a) засев клеточной линии А431 (10000 клеток) в 96 луночный планшет;

b) внесение серийных разведений цетуксимаба (7812,5 нг/мл - 30,5 нг/мл) в трех повторностях, в планшет с клетками, через 4 часа после засева клеток;

c) инкубирование клеточной линии А431 (10000 клеток) с цетуксимабом (7812,5 нг/мл - 30,5 нг/мл) в 96-луночном планшете в течение 96 часов при 37°C в трех повторностях;

d) внесение 10 мкл MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, 5 мг/мл в каждую лунку и инкубирование в течение 4 часов;

e) растворение кристаллов формазана в 100 мкл предварительно нагретого до 37°С лизирующего буфера с pH 4,7, состоящего из 100 мл ацетатного буферного раствора (2,05 г натрия ацетата безводного и 450 мл воды очищенной), 40 г натрия лаурилсульфата, 100 мл диметилформамида;

f) смешивание с помощью шейкера в течении 3 часов при поддержании скорости на уровне 450 об/мин и температуры 37°С;

g) проведение колориметрической оценки с использованием планшетного спектрофотометра при длине волны 570 нм.

Технический результат от реализации изобретения заключается в оценке специфической активности препарата, которая позволяет охарактеризовать фармакологическое действие препарата и может быть направлена на изучение механизмов его терапевтических эффектов при клиническом применении.

Данное изобретение может быть использовано для более эффективной терапии онкологических заболеваний при адаптировании лечения к конкретному пациенту.

В исследовании использовались клеточные линии эпидермоидной карциномы человека А431 (ATCC CRL-1555), клеточные линий аденокарциномы простаты человека DU 145 (ATCC HBT-81) и PC-3 (ATCC CRL-1435), колоректальной аденокарциномы человека Caco-2 (ATCC HTB-37) и карциномы легкого A549 (ATCC CCL-185). Клетки А549 культивируют в среде Ham's F-12 с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го СО₂ при 37°С до образования монослоя. Клетки Caco-2 культивируют в среде EMEM с добавлением 20%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го СО₂ при 37°С до образования монослоя. Клетки DU 145 культивируют в среде EMEM с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го СО₂ при 37°С до образования монослоя. Клетки PC-3 культивируют в среде Ham's F-12 с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го СО₂ при 37°С до образования монослоя. Клетки А431 культивируют в среде DMEM 12 с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, L-глутамина и 1% пенициллина-стрептомицина в атмосфере 5%-го СО₂ при 37°С до образования монослоя.

Более подробно изобретение представлено в нижеприведенных примерах.

Пример 1 Проточная цитометрия

Клеточные линии для исследования были отобраны на основании базы данных Human protein atlas на основании установленной экспрессии мРНК EGFR. В качестве контроля была взята клеточная линия А431 с гиперэкспрессией EGFR. Окраску проводили антителами к EGFR. Клетки переносили из культурального планшета в пробирки для проточной цитометрии, отмывали центрифугированием в PBS и добавляли в каждую пробирку по 10 мкл флуоресцентного конъюгата Ат к EGFR с r-фикоэритрином и соответствующие изотипические антитела, инкубировали на льду в течение 30 минут. Клетки промывали буфером FACS (PBS, 0,2% (w/v) BSA, 10 мМ азида натрия) и оценивали количество клеток с экспрессией EGFR при помощи программного обеспечения ACEA Novo Express software v1.3.1.

Анализ экспрессии мРНК EGFR в клеточных линиях A431, Caco2, PC-3, DU 145, A549

Согласно полученным данным, все исследованные клеточные культуры эпидермоидной карциномы A431, Caco2, аденокарциномы предстательной железы PC-3, DU 145, карциномы легкого A549 экспрессировали EGFR на поверхности клеток. Линия А431 отличалась гиперэкспрессией EGFR. Остальные клеточные линии имели сравнимый уровень экспрессии.

Пример 2 MTT тест

Каждую клеточную линию (5000 - 30000 клеток) инкубировали с цетуксимабом (1000 мкг/мл - 1,9 нг/мл) в 96-луночном планшете в трех повторностях. После инкубации в течение 48, 72, 96 часов при 37°C, добавляли MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, Sigma, St. Louis, MO) добавляли в каждую лунку и проводили инкубацию в течение 4 ч. Затем надосадочную жидкость удаляли и растворяли кристаллы формазана в ДМСО или лизирующем буфере (натрия ацетат, натрия лаурилсульфат, диметилформамид, вода очищенная, pH 4,7). Колориметрическая оценка была протестирована с использованием планшетного спектрофотометра при 560\670 нм. Ингибирование пролиферации показано как процент роста клеток, индуцированных цетуксимабом, по сравнению с ростом, индуцированным контрольным mAb (препарат Эрбитукс®).

Поиск дозазависимого эффекта.

Для эксперимента использовали линии клеток А549, DU 145, А431, PC-3, Caco-2. Инкубирование клеток с образцом 96ч, концентрация препарата 5000-7,8 мкг/мл. После получений первых результатов было решено исключить из испытания клеточную линию Caco-2 из-за ее длительного времени удвоения ~80 часов. Так как в данном случае длительность анализа будет более 96 часов. Клеточная линия PC-3 также была исключена из испытаний ввиду получения неудовлетворительных результатов: при проведении анализа в одинаковых условиях, оптическая плотность в контрольных лунках (клетки+пит.среда), полученные с использованием данной клеточной линии, были в 2 раза ниже результатов, полученных при использовании клеточной линии DU-145 с аналогичным временем удвоения.

На Фиг. 1 представлены результаты МТТ-теста при использовании клеточной линии PC-3

На Фиг. 2 представлены результаты МТТ-теста при использовании клеточной линии Du-145

На Фиг. 3 представлены результаты МТТ-теста при использовании клеточной линии Caco-2

На Фиг. 4 представлены результаты МТТ-теста при использовании клеточной линии А431

На Фиг. 5 представлены результаты МТТ-теста при использовании клеточной линии А549

Анализ используемых красителей

Для проведения испытаний по определению ингибирования пролиферации могут использоваться различные красители, определяющие число жизнеспособных клеток в лунке планшета. В рамках данного эксперимента были проведены следующие анализы: МТТ - тест, анализ жизнеспособных клеток с использованием резазурина, анализ жизнеспособных клеток с использованием люминесцентного красителя CellTiterGlo.

По полученным результатам можно сделать вывод, что такие красители как резазурин и CellTiterGlo неэффективны в определении концентрации клеток А431, если она превышает 50000 тысяч клеток.

Для МТТ красителя подбирали значение концентрации самого тетразола и растворитель. В качестве растворителя были использованы ДМСО и лизирующий буфер (натрия ацетат, натрия лаурилсульфат, диметилформамид, вода очищенная, pH 4,7). Отличие растворителей заключается в том, что для растворения большого количества кристаллов формазана необходим больший объем раствора ДМСО, в отличие от лизирующего буфера. Таким образом появляется возможность не удалять из планшета остальные растворы и исключить потери кристаллов формазана, что в свою очередь влияет на точность анализа и коэффициент вариации.

Пример 3 Иммуноферментный анализ

Связывание цетуксимаба с рецептором EGFR проверяли с помощью иммуноферментного анализа на клетках. Клетки A431, А549, Du-145 были засеяны в 96-луночный планшет с концентрацией 20000 клеток/лунку. На следующий день клетки промывали и фиксировали 4% параформальдегидом. Для блокировки клеток использовали 1% BSA, после чего добавляли серийно разведенные образцы. Затем образцы инкубировали 1 час при комнатной температуре с клетками чтобы обеспечить связывание. Связывание цетуксимаба с EGFR на поверхности клеток было обнаружено с помощью HRP-конъюгированного кроличьего античеловеческого IgG в течение 1 часа при комнатной температуре. Несвязанное вторичное детектирующее антитело удаляли путем трехкратной промывки промывочным буфером. Активность HRP в каждой лунке определяли по конверсии субстрата ТМБ, который желтеет в кислых условиях и может быть считан при 450 нм.

Анализ связывания EGFR и препарата цетуксимаб методом иммуноферментного анализа

Ввиду отсутствия видимого доза зависимого эффекта, при постановке МТТ-теста с концентрациями исследуемого образца (5000-100мкг/мл), был проведен анализ по определению связывания препарата цетуксимаб c EGFR методом иммуноферментного анализа на клеточных линиях А431, А549 и DU 145. Связывание было подтверждено на всех клеточных линиях, однако степень связывания клеточных линий A549 и DU-145 гораздо ниже чем у клеточной линии А431. При одинаковых количествах клеток и испытуемого препарата, оптическая плотность в точке с максимальной концентрацией препарата составляла: 1,5 ЕОП для клеток А431; 0,698 ЕОП для клеток А549; 0,293 ЕОП для клеток Du-145. На данном этапе была исключена из анализа клеточная линия DU-145.

На Фиг. 6 представлены результаты определения связывания препарата цетуксимаб с ERGF на поверхности клеток методом иммуноферментного анализа (связывание цетуксимаба с клеточной линией А431 и А549)

На Фиг. 7 представлены результаты определения связывания препарата цетуксимаб с ERGF на поверхности клеток методом иммуноферментного анализа (связывание цетуксимаба с клеточной линией А431 и Du-145)

Пример 4 Подбор оптимальной концентрации клеток

Ввиду большого количества сайтов связывания на клеточной линии А431, подбор соотношения концентраций клеток и препарата упрощается при использовании данной клеточной линии. Для клеточной линии А549 рабочий диапазон концентраций будет находиться в области с более низкими концентрациями препарата.

Проводили анализ роста клеточной линии А431 в 96 луночном планшете, засевали 2, 5, 10, 15, 20, 30 тысяч клеток в соответствующие лунки планшета, инкубировали 24, 48, 72, 96 часов, в каждой контрольной точке оценивали конфлюентность и производили подсчет клеток. Процент образования монослоя при разной посевной концентрации и времени инкубирования представлен в таблице 3.

Таблица 3 Посевная концентрация клеток А431, тыс/мл Время инкубирования 24 часа 48 часа 72 часа 96 часа 2000 10% 30% 45% 50% 5000 20% 60% 100% 100% 10000 80% 100% 100% 100% 15000 90% 100% 100% 100% 20000 100% 100% 100% 100% 30000 100% 100% 100% 100%

Далее проводили МТТ тест с концентрациями клеток 5, 10, 20 тысяч клеток на лунку. Для начала делали анализ с концентрациями препарата от 1000 мкг/мл до 1,91 нг/мл с шагом 2 и концентрациями клеток 20 и 30 тысяч клеток на лунку. Делали разведения препарата в среде без FBS и инкубировали с клетками в течение 96 часов.

Через 96 часов к препарату добавляли 10 мкл МТТ с концентрацией 5 мг/мл, инкубировали 4 часа при температуре 37°С, по окончании времени инкубации, вносили в планшет раствор ДМСО. Доза зависимый эффект был обнаружен в диапазоне концентраций от 31,25 мкг/мл до 30,5 нг/мл. Далее был проведен аналогичный анализ с концентрациями клеток 5 и 10 тысяч на лунку, с концентрациями препарата от 31,25 мкг/мл до 30,5 нг/мл.

Пример 5 Методика определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток

Клеточную линию А431 (10000 клеток) инкубировали с цетуксимабом (7812,5 нг/мл - 30,5 нг/мл) в 96-луночном планшете в трех повторностях. После инкубации в течение 96 часов при 37°C, добавляли 10 мкл MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид, 5 мг/мл, Sigma, St. Louis, MO) добавляли в каждую лунку и проводили инкубацию в течение 4 ч.

Затем растворяли кристаллы формазана в лизирующем буфере (натрия ацетат, натрия лаурилсульфат, диметилформамид, вода очищенная, pH 4,7), нагретом до 37°С. Планшеты оставляли на шейкере (скорость 450 об/мин, температура 37°С) на 3 часа. Колориметрическая оценка была протестирована с использованием планшетного спектрофотометра при 570 нм. Коэфициент детерминации для стандартных и испытуемых образцов должен быть ≥0,98. Ингибирование пролиферации показано как процент роста клеток, индуцированных цетуксимабом, по сравнению с ростом, индуцированным контрольным mAb.

На Фиг 8 представлены результаты инкубирования клеток А431 с образцом для первой повторности. Коэффициент детерминации стандартного образца равен 0,9885, испытуемого образца - 0,9962.

На Фиг 9 представлены результаты инкубирования клеток А431 с образцом для второй повторности. Коэффициент детерминации стандартного образца равен 0,9895, испытуемого образца - 0,9935.

На Фиг 10 представлены результаты инкубирования клеток А431 с образцом для третьей повторности. Коэффициент детерминации стандартного образца равен 0,9946, испытуемого образца - 0,9937.

В результате исследований разработан способ определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток.

Изобретение относится к области иммуноонкологии, а именно к способу определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток. Проводят засев клеточной линии А431 в количестве 10000 клеток в 96-луночный планшет и вносят серийные разведения цетуксимаба в диапазоне 7812,5 нг/мл - 30,5 нг/мл в трех повторностях в планшет с клетками через 4 часа после засева клеток. Проводят инкубирование клеточной линии А431 с серийными разведениями цетуксимаба в 96-луночном планшете в течение 96 часов при 37°C в трех повторениях. Затем вносят 10 мкл MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) с концентрацией 5 мг/мл в каждую лунку и инкубируют в течение 4 часов. Растворяют кристаллы формазана в предварительно нагретом до 37°С лизирующем буфере с pH 4,7, состоящем из натрия ацетата, натрия лаурилсульфата, диметилформамида и воды очищенной. Смешивают с помощью шейкера в течение 3 часов при поддержании скорости на уровне 450 об/мин и температуры 37°С. Проводят колориметрическую оценку с использованием планшетного спектрофотометра при длине волны 570 нм. Изобретение позволяет оценить специфическую активность препарата, которая характеризует фармакологическое действие препарата, и может быть использовано для более эффективной терапии онкологических заболеваний при адаптировании лечения к конкретному пациенту. 10 ил., 1 табл., 5 пр.

Способ определения специфической активности препарата цетуксимаб биологическим методом на культуре клеток, включающий все перечисленные ниже этапы:

a) засев клеточной линии А431 в количестве 10000 клеток в 96-луночный планшет;

b) внесение серийных разведений цетуксимаба в диапазоне 7812,5 нг/мл – 30,5 нг/мл в трех повторностях, в планшет с клетками, через 4 часа после засева клеток;

c) инкубирование клеточной линии А431 в количестве 10000 клеток с серийным разведением цетуксимаба в диапазоне 7812,5 нг/мл – 30,5 нг/мл в 96-луночном планшете в течение 96 часов при 37°C в трех повторениях;

d) внесение 10 мкл MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид) с концентрацией 5 мг/мл в каждую лунку с последующим инкубированием в течение 4 часов;

e) растворение кристаллов формазана в 100 мкл предварительно нагретого до 37°С лизирующего буфера с pH 4,7, состоящего из 100 мл ацетатного буферного раствора, включающего 2,05 г натрия ацетата безводного и 450 мл воды очищенной, 40 г натрия лаурилсульфата, 100 мл диметилформамида;

f) смешивание с помощью шейкера в течение 3 часов при поддержании скорости на уровне 450 об/мин и температуры 37°С;

g) проведение колориметрической оценки с использованием планшетного спектрофотометра при длине волны 570 нм.