УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ КОРМОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2023 года по МПК A23K20/189 A23K50/10 C12N15/82 

ЗАЯВЛЕНИЕ ОБ ЭЛЕКТРОННОЙ ПОДАЧЕ ПЕРЕЧНЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей в текстовом формате ASCII, предоставленный в соответствии с § 1.821 раздела 37 CFR под названием "81471-US-L-ORG-NAT-1", размером 15179 байт, созданный 8 октября 2018 г. и поданный с помощью EFS-WEB, предусмотрен вместо бумажной копии. Данный перечень последовательностей тем самым включен посредством ссылки в описание данного изобретения для его раскрытия.

ИНФОРМАЦИЯ КАСАТЕЛЬНО РОДСТВЕННОЙ ЗАЯВКИ

Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США с серийным №62/571378, поданной 12 октября 2017 г., раскрытие которой включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к кормовым композициям для животных и способам их применения для повышения продуктивности животных и/или эффективности использования кормов.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Корма для животных можно разделить на две группы: (1) концентраты или комбикорма и (2) грубые корма. Концентраты или комбикорма имеют высокую энергетическую ценность, включая жиры, злаковые зерна и побочные продукты их переработки (ячмень, кукуруза, овес, рожь, пшеница), молотые масличные жмыхи с высоким содержанием белка или шроты (сои, рапса, семян хлопчатника, арахиса и т.п.) и сопутствующие продукты переработки сахарной свеклы, сахарного тростника, сырья животного происхождения и рыбного сырья, которые могут быть получены в виде гранул или крошки. Концентраты или комбикорма могут быть полнорационными, поскольку они способны обеспечить все суточные потребности в пище, или они способны обеспечить часть рациона с дополнением чем-либо еще, что может обеспечить пищевой рацион. Грубый корм включает пастбищные травы, виды сена, силос, корнеплоды, солому и сухой корм для скота (стебли кукурузы).

Корм составляет наибольшие издержки при выращивании животных для производства продуктов питания. Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям и способам повышения продуктивности животных и/или эффективности использования кормов для животных, за счет чего снижаются издержки производства.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В одном аспекте настоящего изобретения предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая микробную α-амилазу. В некоторых аспектах микробная а-амилаза содержит полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ IDNO: 5.

В другом аспекте настоящего изобретения предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая растительный материал, где растительный материал содержит экспрессируемую гетерологичную α-амилазу. В некоторых конкретных вариантах осуществления экспрессируемая гетерологичная α-амилаза кодируется нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, или содержит полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.

В настоящем изобретении дополнительно предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая растительный материал из трансгенного растения или части растения, который содержит рекомбинантную α-амилазу, кодируемую нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, или содержащую полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.

В других аспектах в настоящем изобретении предусматривается рацион с кукурузой, предусматривающий растительный материал из трансгенного растения кукурузы или части растения, стабильно трансформированных рекомбинантной α-амилазой, кодируемой нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. В дополнительных аспектах настоящего изобретения предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая рацион с кукурузой по настоящему изобретению.

Настоящее изобретение также охватывает маисовый силос, предусматривающий растительный материал из трансгенного маиса, который содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантную α-амилазу (которая описана в данном документе).

В дополнительном аспекте в настоящем изобретении предусматривается способ увеличения среднесуточного привеса животного, включающий скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению, при этом необязательно среднесуточный привес животного увеличивается на величину от приблизительно 0,05 фунта/день до 10 фунтов/день. Необязательно, животное представляет собой животное, разводимое для мяса, например мясной скот. В вариантах осуществления мясной скот представляет собой животное на откормочной площадке. В вариантах осуществления животное представляет собой растущего теленка мясной породы (например, молодняк/животное на доращивании и откорме).

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предусматривается способ увеличения скорости роста (привеса) животного, включающий скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению, где необязательно скорость роста животного увеличивается на величину от приблизительно 0,05 фунта/день до 10 фунтов/день. Необязательно, животное представляет собой животное, разводимое для мяса, например мясной скот. В вариантах осуществления мясной скот представляет собой животное на откормочной площадке. В вариантах осуществления животное представляет собой растущего теленка мясной породы (например, молодняк/животное на доращивании и откорме).

В дополнительном аспекте настоящего изобретения предусматривается способ сокращения количества дней, необходимых для достижения требуемого веса у животного, включающий скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению, за счет чего сокращается количество дней, необходимых для достижения требуемого веса.

В других аспектах предусматривается способ повышения эффективности использования кормов у животных, при этом способ включает скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в количестве, эффективном для повышения эффективности использования кормов (например, для производства мяса, молока, яиц и/или шерсти) животным. Необязательно, животное представляет собой животное, разводимое для мяса, например мясной скот. В вариантах осуществления мясной скот представляет собой животное на откормочной площадке. В вариантах осуществления животное представляет собой растущего теленка мясной породы (например, молодняк/животное на доращивании и откорме). В вариантах осуществления животное представляет собой молочное животное.

В настоящем изобретении дополнительно предусматривается способ увеличения количества (например, определяемого по весу и/или объему) молока, вырабатываемого молочным животным, при этом способ включает скармливание молочному животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в количестве, эффективном для увеличения количества молока, вырабатываемого молочным животным. В вариантах осуществления молочное животное представляет собой молочную корову или молочную козу.

В дополнительных аспектах в настоящем изобретении предусматривается способ повышения эффективности использования кормов для молокообразования молочным животным, при этом способ включает скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в количестве, эффективном для повышения эффективности использования кормов у молочных животных.

Вышеуказанные и другие аспекты настоящего изобретения далее будут описаны более подробно, принимая во внимание другие варианты осуществления, описанные в данном документе. Следует понимать, что настоящее изобретение можно осуществлять в различных формах, и его не следует рассматривать как ограниченное вариантами осуществления, изложенными в данном документе. Наоборот, такие варианты осуществления представлены для того, чтобы данное раскрытие было подробным и полным и полностью передавало объем настоящего изобретения специалисту в данной области.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фигура 1 представляет собой гистограмму, на которой показаны характеристики силоса из кормовой Enogen® по сравнению с силосом из кукурузы, которая не содержит признака альфа-амилазы. Общий крахмал ("крахмал"), крахмала в виде мелких частиц (может диффундировать через поры размером 50 мкм) и перевариваемость крахмала in situ в рубце за 7 часов ("isSD7"; исчезновение крахмала в рубце в течение 7 часов) определяли способами аналитической химии.

Фигура 2 представляет собой гистограмму, на которой показаны характеристики Сахаров силоса из кормовой Enogen® по сравнению с силосом из кукурузы, которая не содержит признака альфа-амилазы. Растворимые в этаноле углеводы ("ESC-caxapa") представляют собой углеводы, которые можно растворить и экстрагировать в 80% этаноле. Водорастворимые углеводы ("WSC-caxapa") представляют собой углеводы, которые можно растворить и экстрагировать в воде. ESC-caxapa и WSC-caxapa определяли с помощью спектроскопии в ближней инфракрасной области (NIR). Общее содержание Сахаров измеряли с использованием способов аналитической химии, и оно отражает сумму общего содержания глюкозы, фруктозы, лактозы, сахарозы и маннита.

Фигура 3 представляет собой график, на котором показана перевариваемость нейтрально-детергентной клетчатки (NDFd) силоса из кормовой Enogen® по сравнению с силосом из кукурузы, которая не содержит признака альфа-амилазы. NDFd оценивали с помощью NIR в течение периода времени от 30 до 240 часов. Различия значимо отличались во все моменты времени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Если контекст не указывает иное, то, в частности, предполагается, что различные признаки настоящего изобретения, описанные в данном документе, можно применять в любой комбинации.

Более того, настоящим изобретением также предполагается, что в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения любой признак или комбинацию признаков, изложенных в данном документе, можно исключить или опустить. С целью иллюстрации, если в описании утверждается, что композиция содержит компоненты А, В и С, то это, в частности, предполагает, что любое из А, В или С или их комбинацию можно опустить и отклонить по отдельности или в любой комбинации.

Если не указано иное, все технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понятно специалисту в данной области, к которой относится настоящее изобретение. Терминология, применяемая в данном документе при описании настоящего изобретения, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения настоящего изобретения.

Как предполагается, применяемые в описании настоящего изобретения и прилагаемой формуле изобретения форма единственного числа также предусматривает форму множественного числа, если контекст явно не указывает иное.

Как применяется в данном документе, "и/или" относится к любой и всем возможным комбинациям одного или нескольких соответствующих перечисленных элементов и охватывает их, а также к отсутствию комбинаций при интерпретации в качестве альтернативы ("или").

Термин "приблизительно", применяемый в данном документе при упоминании измеряемой величины, такой как доза, количество или период времени и т.п., предназначен для охвата изменений определенного количества на ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или даже ±0,1% (например, количества привеса или предоставляемого корма).

Применяемые в данном документе фразы, такие как "от X до Y" и "от приблизительно X до Y", следует интерпретировать как включающие X и Y. Применяемые в данном документе фразы, такие как "от приблизительно X до Y", означают "от приблизительно X до приблизительно Y". Применяемые в данном документе фразы, такие как "приблизительно X-Y", означают "от приблизительно X до приблизительно Y."

Применяемые в данном документе термины "содержат", "содержит" и "содержащий" указывают на присутствие определенных признаков, целых чисел, стадий, действий, элементов и/или компонентов, но не исключают присутствие или добавление одного или нескольких других признаков, целых чисел, стадий, действий, элементов, компонентов и/или их групп.

Применяемая в данном документе переходная фраза "состоящий главным образом из" означает, что объем пункта формулы изобретения следует интерпретировать как охватывающий определенные вещества или стадии, перечисленные в пункте формулы изобретения, а также таковые, которые существенно не влияют на основную(-ые) и новую(-ые) характеристику(-и) заявляемого изобретения. Таким образом, термин "состоящий главным образом из", в случае если он применяется в пункте формулы настоящего изобретения, не предназначен для интерпретации как эквивалент термину "содержащий".

Настоящее изобретение относится к композициям и способам для улучшения продуктивности животных (например, повышения эффективности использования кормов для животных, увеличения привеса животных, выращиваемых на мясо, повышения молокообразования у молочных животных, увеличения производства яиц у домашней птицы и/или увеличения выработки шерсти или ворса у животных, выращиваемых ради их шерсти или ворса), за счет чего снижаются издержки производства. Авторы настоящего изобретения сделали удивительное открытие, что животные, которым скармливали кормовую композицию для животных, содержащую микробную α-амилазу, могут характеризоваться увеличением среднесуточного привеса или скорости роста, повышением молокообразования, повышением эффективности использования кормов, увеличением производства яиц, увеличением выработки шерсти или ворса и/или сокращением количества дней, необходимых для достижения требуемого веса, по сравнению с животными, которым не скармливали кормовую композицию для животных.

Соответственно, в одном аспекте настоящего изобретения предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая микробную α-амилазу. В дополнительных аспектах настоящего изобретения микробная α-амилаза содержит полипептид, характеризующийся по меньшей мере 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1, или полипептид, кодируемый нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления α-амилаза является жидкой. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кормовая композиция для животных по настоящему изобретению может представлять собой добавку, содержащую жидкую микробную α-амилазу, которую можно добавлять к корму, предоставляемому животному.

В другом аспекте в настоящем изобретении предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая растительный материал, где растительный материал содержит экспрессируемую гетерологичную α-амилазу. В некоторых конкретных вариантах осуществления экспрессируемая рекомбинантная α-амилаза кодируется нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, или содержит полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается кормовая композиция для животных, содержащая растительный материал из трансгенного растения или части растения, который содержит рекомбинантную α-амилазу, кодируемую нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, или содержащую полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1.

В конкретных вариантах осуществления трансгенное растение или часть растения могут составлять от приблизительно 1% до приблизительно 100% по весу растительного материала. Таким образом, например, трансгенное растение или часть растения могут составлять приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% по весу растительного материала и подобное значение или любой диапазон в указанных пределах. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления растительный материал может предусматривать один или несколько различных типов растений. Таким образом, например, растительный материал может происходить из растения, в котором экспрессируется рекомбинантная или гетерологичная (например, микробная) α-амилаза. В других вариантах осуществления растительный материал содержит, состоит главным образом из или состоит из материала из растения, в котором экспрессируется рекомбинантная или гетерологичная (например, микробная) α-амилаза, и материала из растения, в котором рекомбинантная или гетерологичная α-амилаза не экспрессируется (например, товарного растения). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления, если растительный материал содержит материал из растения, в котором экспрессируется рекомбинантная или гетерологичная (например, микробная) α-амилаза, и материал из растения, в котором рекомбинантная или гетерологичная α-амилаза не экспрессируется (например, товарного растения), то материал из растения, в котором экспрессируется рекомбинантная или гетерологичная (например, микробная) α-амилаза, может составлять от приблизительно 1% до приблизительно 99% по весу растительного материала, и материал из растения, в котором рекомбинантная или гетерологичная α-амилаза не экспрессируется, может составлять от приблизительно 99% до приблизительно 1% по весу растительного материала.

В дополнительных вариантах осуществления растительный материал может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100% по весу кормовой композиции для животных. Таким образом, например, растительный материал может составлять приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% по весу кормовой композиции для животных и подобное значение или любой диапазон в указанных пределах.

Корм для животных по настоящему изобретению может быть в любой форме, пригодной для настоящего изобретения. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления форма корма для животных может представлять собой без ограничения гранулы, в том числе один или несколько типов из смеси зерен (т.е. смешанное зерно), смеси зерна и гранул, силоса, ядер сухого плющения, хлопьев из ядер, полученных при воздействии пара, цельных ядер, грубодробленых ядер (например, грубодробленое ядро кукурузы), кукурузы с высокой степенью влажности и/или любой их комбинации. В некоторых вариантах осуществления корм для животных может содержать другие компоненты, в том числе без ограничения грубодробленые ядра, влажную зерновую барду, сухую зерновую барду, кукурузный силос, добавки/жидкие добавки, корм на основе кукурузной клейковины и/или измельченное сено.

Применяемый в данном документе термин "растительный материал" включает в себя любую часть растения, в том числе без ограничения эндосперм, эмбрионы (зародыш), перикарп (оболочка отрубей), ножку (корневой чехлик), пыльцу, яйцеклетки, семена (зерно), листья, цветки, ветки, стебли, плоды, ядра, колосья, початки, шелуху, цветоножки, корни, корневые кончики, пыльники, клетки растения, в том числе клетки растения, которые являются интактными в растениях и/или частях растений, протопласты растений, ткани растений, тканевые культуры из клеток растений, каллусы растений, скопления клеток растения и т.п. Кроме того, "клетка растения", как применяется в данном документе, относится к структурной и физиологической единице растения, которая содержит клеточную стенку, а также может относиться к протопласту. Клетка растения по настоящему изобретению может находиться в форме выделенной единичной клетки, или может представлять собой клетку из культуры, или может быть частью более высокоорганизованной единицы, такой как, например, ткань растения или орган растения. "Протопласт" представляет собой выделенную клетку растения без клеточной стенки или только с частями клеточной стенки. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения трансгенное растение или часть растения, которые содержат рекомбинантную α-амилазу, кодируемую нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, содержат клетку, которая содержит рекомбинантную α-амилазу, кодируемую нуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению, где клетка представляет собой клетку любого растения или части растения, в том числе без ограничения клетку корня, клетку листа, клетку тканевой культуры, клетку семени, клетку цветка, клетку плода, клетку пыльцы и т.п. В иллюстративных вариантах осуществления растительный материал может представлять собой семя или зерно.

Растительный материал может происходить из любого растения. В некоторых вариантах осуществления растительный материал происходит из растения, в котором может экспрессироваться рекомбинантная или гетерологичная (например, микробная) α-амилаза. Кроме того, как рассматривалось в данном документе, в других вариантах осуществления, растительный материал может представлять собой смесь растительного материала из растения, в котором экспрессируется рекомбинантная или гетерологичная (например, микробная) α-амилаза, и из растения, в котором рекомбинантная или гетерологичная α-амилаза не экспрессируется (например, товарного растения). Таким образом, в иллюстративных вариантах осуществления растительный материал может представлять собой смесь растительного материала из обычного "товарного" растения (например, товарной кукурузы) и растительного материала из трансгенного растения по настоящему изобретению, экспрессирующего рекомбинантную или гетерологичную α-амилазу.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления растительный материал может происходить из растения кукурузы, растения сорго, растения пшеницы, растения ячменя, растения ржи, растения овса, растения риса и/или растения проса. В иллюстративных вариантах осуществления растительный материал может происходить из растения кукурузы. В других вариантах осуществления растительный материал может представлять собой семя, ядро или зерно растения кукурузы. В вариантах осуществления растительный материал может происходить из растения кукурузы, экспрессирующего термостабильную альфа-амилазу, например альфа-амилазу 797GL3 или D45. Альфа-амилаза 797GL3 описана в публикации заявки на патент США № US2010/0240082 (под SEQ ID NO: 1) и в Richardson et al., (2002) J. Biol. Chem. 277: 26501-26507. Альфа-амилаза D45 описана в публикации заявки на патент США №US2010/0240082 (под SEQ ГО NO: 2) и у Atichokudomchai et al. (2006) Carbohydrate Polymers 64:582-588. В конкретных вариантах осуществления растительный материал может происходить из растения кукурузы, предусматривающего трансформант кукурузы 3272 (см. патент США №8093453). В вариантах осуществления альфа-амилаза не является термостабильной амилазой. В вариантах осуществления альфа-амилаза может переносить широкий диапазон рН (например, активна в широком диапазоне рН, включая кислый рН). В иллюстративных вариантах осуществления корм для животных представляет собой кукурузный силос, содержащий полинуклеотид, кодирующий альфа-амилазу, которая является термостабильной и/или активной в широком диапазоне значений рН, например альфа-амилазу 797GL3 и/или D45. Не желая быть связанными какой-либо конкретной теорией настоящего изобретения, процесс измельчения кукурузного растительного материала перед силосованием может активировать термостабильный фермент. Дополнительно, альфа-амилаза, которая активна в широком диапазоне рН (например, в том числе в кислом диапазоне), может быть полезной при производстве силоса, поскольку рН растительного материала будет уменьшаться в ходе ферментации.

Когда растительный материал представляет собой силос (например, кукурузный силос), силос необязательно может быть ферментирован в присутствии микробного инокулянта и/или химического стабилизатора. Из уровня техники известно, что инокулянт, такой как молочнокислые бактерии, и/или химический стабилизатор могут увеличивать аэробную устойчивость силоса и тем самым уменьшать порчу. Примеры подходящих инокулянтов включают без ограничения гомоферментативные и/или гетероферментативные молочнокислые бактерии, такие как: Lactobacillus spp. (например, L. buchneri, L. plantarum, L. casei, L. brevis и/или/,, acidophilus), Pediococcus spp.(например, P. pentosaceus и/или P. acidilactici), Lactococcus spp. Enterococcus spp. (например, E. faecium), Streptococcus spp. и/или Leuconostoc spp. Коммерчески доступный инокулянт, названный LB500, доступен от Lallemand Animal Nutrition. Химические стабилизаторы включают в себя без ограничения органические и/или минеральные кислоты (например, уксусную кислоту, муравьиную кислоту, масляную кислоту, молочную кислоту, пропионовую кислоту, летучие жирные кислоты, серную кислоту и/или хлористоводородную кислоту), хлорид натрия, бикарбонат натрия, сахарозу и/или мочевину и т.п. Таким образом, в вариантах осуществления силос содержит микробный инокулянт и/или химический стабилизатор. Кроме того, из уровня техники известно, что обработка ядра (например, дробленая кукуруза) перед силосованием повышает питательную ценность кукурузного силоса. Однако обработка ядра может замедлить скорость сбора урожая/силосования, и требует энергии, и, следовательно, может повлечь дополнительные расходы. В вариантах осуществления кукурузный силос по настоящему изобретению (например, полученный из трансгенного растения кукурузы, экспрессирующего альфа-амилазу) может достигать той же или лучшей питательной ценности, что и обычный кукурузный силос (без экзогенной альфа-амилазы), и/или может поддерживать такой же или лучший уровень продуктивности животных (например, молокообразование, производство мяса и т.п.) без обработки ядра или с уменьшенной обработкой ядра по сравнению с обычным кукурузным силосом. Таким образом, в вариантах осуществления кукурузный силос по настоящему изобретению получают из растений кукурузы без обработки или практически без обработки ядра или с уменьшенной обработкой ядра, чем традиционно применяется в промышленности. В вариантах осуществления ядра обрабатывают таким образом, чтобы они были больше, чем приблизительно 2 мм (например, по меньшей мере 3 мм или больше, 4 мм или больше, 5 мм или больше, 6 мм или больше, 7 мм или больше, 8 мм или больше, 9 мм или больше, 10 мм или больше и т.п.).

В некоторых вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривается "общий смешанный рацион", содержащий корм для животных. В вариантах осуществления общий смешанный рацион содержит корм для животных, содержащий растительный материал из трансгенного растения (например, трансгенного растения кукурузы) или части растения, стабильно трансформированных рекомбинантной α-амилазой, необязательно кодируемой нуклеотидной последовательностью, характеризующейся приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, и/или содержащей полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. Используемый в данном документе термин "общий смешанный рацион" относится к рациону, который объединяет все кормовые продукты (например, зерна, грубый корм/фураж, белки, минералы, витамины и/или кормовые добавки и т.п.) в полный рацион, составленный для конкретной концентрации питательных веществ в одной кормовой смеси, часто рассчитываемой на основе потребностей в питании для отдельного животного за 24 часа. В вариантах осуществления общий смешанный рацион включает в себя, например, кукурузное зерно (например, кукурузные ядра, грубодробленую кукурузу и т.п.), добавки и пищевые добавки (например, витамины и минералы) и/или "грубые корма" (например, пастбищные травы, виды сена, силос, корнеплоды, солому и сухой корм для скота (стебли кукурузы)). В вариантах осуществления компонент, представляющий собой зерно кукурузы (например, зерно кукурузы) и/или грубый корм (например, кукурузный силос), происходит из трансгенного растительного материала (например, материала трансгенного растения кукурузы) и содержит полинуклеотид, кодирующий альфа-амилазу.

В некоторых вариантах осуществления растительный материал из трансгенного растения кукурузы или части растения (например, зерно кукурузы и/или кукурузный силос) составляет от приблизительно 1% до приблизительно 100% по весу в расчете на сухое вещество общего смешанного рациона. Таким образом, например, трансгенное растение или часть растения могут составлять по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или даже 100% по весу в расчете на сухое вещество растительного материала и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах.

В других дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривается кукурузный рацион, содержащий растительный материал из трансгенного растения кукурузы или части растения, стабильно трансформированных рекомбинантной α-амилазой, необязательно кодируемой нуклеотидной последовательностью, характеризующейся приблизительно 80% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID N0:2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, и/или содержащей полипептид, характеризующийся по меньшей мере приблизительно 80% идентичностью с аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 1. Используемое в данном документе выражение "кукурузный рацион" означает норму кукурузы (например, норму кукурузы за 24 часа) для отдельного животного.

В некоторых вариантах осуществления растительный материал из трансгенного растения кукурузы или части растения составляет от приблизительно 1% до приблизительно 100% по весу в расчете на сухое вещество кукурузного рациона. Таким образом, например, трансгенное растение или часть растения могут составлять по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или даже 100% по весу в расчете на сухое вещество растительного материала и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах.

В других вариантах осуществления предусматривается кормовая композиция для животных, которая содержит кукурузный рацион по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления кукурузный рацион может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 100% по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных. Таким образом, например, кукурузный рацион может составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных и подобное значение или любой диапазон в указанных пределах. В иллюстративных вариантах осуществления кормовая композиция для животных содержит по меньшей мере приблизительно 50%.

В некоторых вариантах осуществления общий смешанный рацион может предусматривать влажный корм на основе кукурузной клейковины, содержание которого может составлять от приблизительно 10% до приблизительно 40% по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных. В дополнительных вариантах осуществления общий смешанный рацион может предусматривать влажный корм на основе кукурузной клейковины, содержание которого может составлять по меньшей мере приблизительно 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%), 37%), 38%), 39%), 40%), или более по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных.

В других вариантах осуществления общий смешанный рацион может предусматривать модифицированную зерновую барду с растворимыми веществами, содержание которой может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 25% по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных. В дополнительных вариантах осуществления общий смешанный рацион может предусматривать модифицированную зерновую барду с растворимыми веществами, содержание которой может составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных.

В дополнительных вариантах осуществления общий смешанный рацион может предусматривать влажную зерновую барду с растворимыми веществами, содержание которой может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 25% по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных. В дополнительных вариантах осуществления общий смешанный рацион может предусматривать влажную зерновую барду с растворимыми веществами, содержание которой может составлять по меньшей мере приблизительно 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, по весу в расчете на сухое вещество кормовой композиции для животных.

Кроме того, в случае материала трансгенного растения кукурузы, экспрессирующего альфа-амилазу, общий кукурузный зерновой рацион может весь или главным образом весь состоять из материала трансгенного растения кукурузы, экспрессирующего альфа-амилазу, или только часть кукурузного зернового рациона может происходить из трансгенного растения кукурузы, экспрессирующего альфа-амилазу, например, по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% по весу в расчете на сухое вещество кукурузного зернового рациона происходит из трансгенного растения кукурузы, содержащего полинуклеотид, кодирующий альфа-амилазу. Оставшаяся часть кукурузного зернового рациона может происходить из любого другого подходящего источника, включая без ограничения обычное кукурузное зерно, не экспрессирующее альфа-амилазу.

В вариантах осуществления грубый корм/фураж, скармливаемый животному, содержит кукурузный силос. Дневной рацион, представляющий собой грубый корм, животного может весь или главным образом весь состоять из силоса из материала трансгенного растения кукурузы, или только часть рациона, представляющего собой грубый корм, может быть силосом из трансгенного растения кукурузы, экспрессирующего альфа-амилазу, например, по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99% по весу в расчете на сухое вещество рациона, представляющего собой грубый корм, представляет собой силос из трансгенного растения кукурузы, содержащего полинуклеотид, кодирующий альфа-амилазу. Оставшаяся часть компонента, представляющего собой грубый корм, может происходить из любого подходящего источника, включая без ограничения стандартный кукурузный силос, не экспрессирующий альфа-амилазу, другие стандартные виды силоса (например, силос люцерны), пастбищную траву и т.п.

В вариантах осуществления по меньшей мере приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, или 99%, или даже 100% по весу в расчете на сухое вещество кукурузного силоса, скармливаемого животному, происходит из трансгенного растения маиса, содержащего полинуклеотид, кодирующий альфа-амилазу.

Различные нуклеиновые кислоты или белки, характеризующиеся гомологией, в данном документе называются "гомологами". Термин "гомолог" включает гомологичные последовательности от одного и того же вида и другого вида, а также ортологичные последовательности от одного и того же вида и другого вида. Выражение "гомология" относится к уровню сходства между двумя или более последовательностями нуклеиновых кислот и/или аминокислотными последовательностями, выраженному в виде процента идентичности по положениям (т.е. сходства или идентичности последовательностей). Гомология также относится к представлению о сходных функциональных свойствах различных нуклеиновых кислот или белков. Таким образом, композиции и способы по настоящему изобретению дополнительно включают гомологи нуклеотидных последовательностей и полипептидных последовательностей по настоящему изобретению (например, SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5). Как применяется в данном документе, "ортологичный" относится к гомологичным нуклеотидным последовательностям и/или аминокислотным последовательностям у различных видов, которые возникли от общего предкового гена в процессе видообразования. Гомолог по настоящему изобретению характеризуется значительной идентичностью последовательности (например, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, и/или 100%) с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQIDNO: 4miH SEQ ID NO: 5.

Гомолог SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5 может использоваться с любыми кормовой композицией или способом по настоящему изобретению, отдельно или в комбинации друг с другом, и/или с SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5.

Как применяется в данном документе, "идентичность последовательностей" относится к степени инвариантности двух оптимально выровненных последовательностей полинуклеотидов или пептидов по всему окну выравнивания компонентов, например нуклеотидов или аминокислот."Идентичность" можно легко вычислить с помощью известных способов, включая без ограничения те, что описаны в Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); и Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. and Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991).

Применяемые в данном документе термины "процентная идентичность последовательностей" или "процентная идентичность" относятся к процентной доле идентичных нуклеотидов в линейной полинуклеотидной последовательности в эталонной ("запрашиваемой") молекуле полинуклеотида (или ее комплементарной нити) по сравнению с тестируемой ("испытуемой") молекулой полинуклеотида (или ее комплементарной нитью), в случае если две последовательности оптимально выровнены. В некоторых вариантах осуществления "процентная идентичность" может относиться к процентной доле идентичных аминокислот в аминокислотной последовательности.

Фраза "в значительной степени идентичные", применительно к двум молекулам нуклеиновой кислоты, нуклеотидным последовательностям или белковым последовательностям, относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, которые по меньшей мере на приблизительно 70%, по меньшей мере на приблизительно 75%, по меньшей мере на приблизительно 80%, по меньшей мере на приблизительно 81%, по меньшей мере на приблизительно 82%, по меньшей мере на приблизительно 83%, по меньшей мере на приблизительно 84%, по меньшей мере на приблизительно 85%, по меньшей мере на приблизительно 86%, по меньшей мере на приблизительно 87%, по меньшей мере на приблизительно 88%, по меньшей мере на приблизительно 89%, по меньшей мере на приблизительно 90%, по меньшей мере на приблизительно 95%, по меньшей мере на приблизительно 96%, по меньшей мере на приблизительно 97%, по меньшей мере на приблизительно 98% или по меньшей мере на приблизительно 99% идентичны нуклеотидам или аминокислотным остаткам при сравнении и выравнивании на максимальное соответствие, которое измеряют с помощью одного из следующих алгоритмов сравнения последовательностей, описанных в данном документе и известных из уровня техники, или с помощью визуального просмотра. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения значительная идентичность существует в пределах области последовательностей, длина которой составляет по меньшей мере от приблизительно 50 остатков до приблизительно 200 остатков, от приблизительно 50 остатков до приблизительно 150 остатков и т.п. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления по настоящему изобретению значительная идентичность существует в пределах области последовательностей, длина которой составляет по меньшей мере приблизительно 50, приблизительно 60, приблизительно 70, приблизительно 80, приблизительно 90, приблизительно 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200 остатков или больше. В дополнительном варианте осуществления последовательности в значительной степени идентичны по всей длине кодирующих областей. Кроме того, в иллюстративных вариантах осуществления в значительной степени идентичные нуклеотидные или белковые последовательности выполняют, по сути, ту же функцию (например, α-амилазная активность). Таким образом, в некоторых конкретных вариантах осуществления последовательности являются в значительной степени идентичными в пределах по меньшей мере приблизительно 150 остатков и обладают α-амилазной активностью.

При сравнении последовательностей одна последовательность обычно выступает в качестве эталонной последовательности, с которой сравнивают тестируемые последовательности. При применении алгоритма сравнения последовательностей тестируемые и эталонные последовательности вводят в компьютер, при необходимости задают координаты подпоследовательности и задают программные параметры алгоритма сравнения последовательностей. Затем с помощью алгоритма сравнения последовательностей на основе заданных программных параметров вычисляют процентную идентичность последовательностей для тестируемой(-ых) последовательности(-ей) относительно эталонной последовательности.

Оптимальное выравнивание последовательностей для выравнивания в окне сравнения хорошо известно специалистам в данной области и может быть выполнено с помощью инструментов, таких как алгоритм поиска локальной гомологии Смита-Уотермана, алгоритм выравнивания областей гомологии Нидлмана-Вунша, способ поиска сходства по Пирсону-Липману и необязательно с помощью компьютеризированных путей реализации данных алгоритмов, таких как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA, доступных как часть GCG® Wisconsin Package® (Accelrys Inc., Сан-Диего, штат Калифорния, США). "Доля идентичности" для выровненных сегментов тестируемой последовательности и эталонной последовательности представляет собой число идентичных компонентов, которые являются общими для двух выровненных последовательностей, разделенное на общее число компонентов в сегменте эталонной последовательности, т.е. всей эталонной последовательности или меньшей определенной части эталонной последовательности. Процентная идентичность последовательностей представлена как доля идентичности, умноженная на 100. Сравнение одной или нескольких полинуклеотидных последовательностей может проводиться с полноразмерной полинуклеотидной последовательностью или ее частью либо с более длинной полинуклеотидной последовательностью. Для целей настоящего изобретения "процентная идентичность" может быть также определена с применением BLASTX версии 2.0 для транслируемых нуклеотидных последовательностей и BLASTN версии 2.0 для полинуклеотидных последовательностей.

Программное обеспечение для проведения анализов BLAST общедоступно благодаря Национальному центру биотехнологической информации. Данный алгоритм предусматривает изначальную идентификацию пар последовательностей с наибольшим сходством (HSP) путем идентификации коротких "слов" длиной W в запрашиваемой последовательности, которые либо совпадают, либо удовлетворяют некоторому положительному пороговому баллу Т при выравнивании со "словом" такой же длины в последовательности из базы данных. Т называется пороговым показателем соседнего "слова" (Altschul et al., 1990). Эти исходные совпадения соседних "слов" выступают в качестве затравки для начала поисков с целью обнаружения более длинных HSP, содержащих их. Затем совпадения "слов" продлеваются в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока может увеличиваться совокупный показатель выравнивания. Совокупные показатели рассчитывают с применением, в случае нуклеотидных последовательностей, параметров М (балл-вознаграждение, начисляемый за пару совпадающих остатков; всегда >0) и N (штрафной балл, начисляемый за несовпадающие остатки; всегда <0). В случае аминокислотных последовательностей, для расчета совокупного показателя применяют матрицу замен. Продление совпадений "слов" в каждом направлении прекращается, когда совокупный показатель выравнивания снижается на величину X от его максимального достигнутого значения, при этом совокупный показатель падает до нуля или ниже вследствие накопления одного или нескольких выравниваний остатков с отрицательными показателями, либо в случае достижения конца одной из последовательностей. Параметры W, Т и X алгоритма BLAST определяют чувствительность и скорость выравнивания. В программе BLASTN (для нуклеотидных последовательностей) по умолчанию используется длина "слова" (W), равная 11, ожидаемое значение (Е), равное 10, пороговое значение, равное 100, М=5, N=-4 и сравнение обеих нитей. Для аминокислотных последовательностей в программе BLASTP по умолчанию используется длина "слова" (W), равная 3, ожидаемое значение (Е), равное 10, а также матрица замен BLOSUM62 (см. Henikoff & Henikoff, Proc Natl Acad. Sci USA 89: 10915 (1989)).

В дополнение к расчету процентной идентичности последовательностей алгоритм BLAST также выполняет статистический анализ сходства между двумя последовательностями (см., например, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Одной мерой сходства, предоставляемой алгоритмом BLAST, является наименьшая суммарная вероятность (P(N)), являющаяся показателем вероятности, согласно которому совпадения между двумя нуклеотидными или аминокислотными последовательностями будут наблюдаться случайным образом. Например, тестируемая последовательность нуклеиновой кислоты считается подобной эталонной последовательности, если наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с эталонной нуклеотидной последовательностью составляет от менее приблизительно 0,1 до менее приблизительно 0,001. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения наименьшая суммарная вероятность при сравнении тестируемой нуклеотидной последовательности с эталонной нуклеотидной последовательностью составляет менее приблизительно 0,001.

Две нуклеотидные последовательности также могут считаться в значительной степени идентичными, если две последовательности гибридизируются друг с другом при жестких условиях. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления две нуклеотидные последовательности, которые считаются в значительной степени идентичными, гибридизируются друг с другом при очень жестких условиях.

"Жесткие условия гибридизации" и "жесткие условия отмывки при гибридизации" в контексте экспериментов по гибридизации нуклеиновых кислот, таких как Саузерн- и Нозерн-гибридизация, зависят от последовательности и отличаются при разных параметрах окружающей среды. Расширенное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот можно найти в Tijssen Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, New York (1993). Как правило, условия гибридизации и отмывки высокой жесткости выбирают так, чтобы температура была на приблизительно 5°С ниже точки плавления (T_m) для конкретной последовательности при определенных ионной силе и значении рН.

Значение T_m представляет собой температуру (при определенных ионной силе и значении рН), при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с точно совпадающим зондом. Для очень жестких условий выбирают температуру, равную T_m для конкретного зонда. Примером жестких условий гибридизации для гибридизации комплементарных последовательностей нуклеотидов, которые имеют более 100 комплементарных остатков на фильтре при Саузерн- или Нозерн-блоттинге, является 50% формамид с 1 мг гепарина при 42°С, при этом гибридизацию проводят в течение ночи. Примером условий отмывки высокой жесткости является 0,15 М NaCl при 72°С в течение приблизительно 15 минут. Примером жестких условий отмывки является отмывка с помощью 0,2х SSC при 65°С в течение 15 минут (описание буфера SSC см. в Sambrook ниже). Часто с целью избавления от фонового сигнала зонда отмывке в условиях высокой жесткости предшествует отмывка в условиях низкой жесткости. Примером условий отмывки средней жесткости для дуплекса, например с более чем 100 нуклеотидами, является lx SSC при 45°С в течение 15 минут. Примером условий отмывки низкой жесткости для дуплекса, например с более чем 100 нуклеотидами, является 4-6х SSC при 40°С в течение 15 минут. Для коротких зондов (например, длиной от приблизительно 10 до 50 нуклеотидов) жесткие условия обычно предусматривают концентрации солей, составляющие менее чем приблизительно 1,0 М ионов Na, как правило концентрации, составляющие приблизительно 0,01-1,0 М ионов Na (или других солей) при рН 7,0-8,3, а также температуру, как правило равную по меньшей мере приблизительно 30°С. Жесткие условия также могут быть достигнуты с добавлением дестабилизирующих средств, таких как формамид. В целом, соотношение сигнал-шум, в 2 (или более) раза превышающее наблюдаемое для несвязанного зонда при конкретном гибридизационном анализе, указывает на выявление специфической гибридизации. Нуклеотидные последовательности, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще являются в значительной степени идентичными, если белки, которые они кодируют, в значительной степени идентичны. Это может происходить, например, если копия нуклеотидной последовательности создана с применением максимальной вырожденности кодонов, допускаемой генетическим кодом.

Ниже приведены примеры наборов условий гибридизации/отмывки, которые можно применять для клонирования гомологичных нуклеотидных последовательностей, являющихся в значительной степени идентичными эталонным нуклеотидным последовательностям (например, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5). В одном варианте осуществления эталонная нуклеотидная последовательность гибридизируется с "тестируемой" нуклеотидной последовательностью в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaP₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 2Х SSC, 0,1% SDS при 50°С. В другом варианте осуществления эталонная нуклеотидная последовательность гибридизируется с "тестируемой" нуклеотидной последовательностью в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 1X SSC, 0,1% SDS при 50°С или в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄ 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,5Х SSC, 0,1% SDS при 50°С. В еще одних вариантах осуществления эталонная нуклеотидная последовательность гибридизируется с "тестируемой" нуклеотидной последовательностью в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,1X SSC, 0,1% SDS при 50°С или в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0,5 М NaPO₄, 1 мМ EDTA при 50°С с отмывкой в 0,1X SSC, 0,1% SDS при 65°С.

В конкретных вариантах осуществления дополнительным свидетельством того, что две нуклеотидные последовательности или две полипептидные последовательности в значительной степени идентичны, может быть то, что белок, кодируемый первой нуклеиновой кислотой, характеризуется иммунологической перекрестной реактивностью с белком, кодируемым второй нуклеиновой кислотой, или специфически с ним связывается. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления полипептид может быть в значительной степени идентичным второму полипептиду, например, если два полипептида отличаются только консервативными заменами.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваются нуклеотидные последовательности, характеризующиеся значительной идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. Выражения "значительная идентичность последовательности" или "значительное сходство последовательности" означают идентичность или сходство с другой нуклеотидной последовательностью по меньшей мере на приблизительно 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%), 97%), 98%), 99%), и/или 100%. Таким образом, в дополнительных вариантах осуществления "значительная идентичность последовательности" или "значительное сходство последовательности" означают идентичность или сходство с другой нуклеотидной последовательностью в диапазоне от приблизительно 70% до приблизительно 100%, от приблизительно 75% до приблизительно 100%, от приблизительно 80% до приблизительно 100%, от приблизительно 81% до приблизительно 100%, от приблизительно 82% до приблизительно 100%, от приблизительно 83% до приблизительно 100%, от приблизительно 84% до приблизительно 100%, от приблизительно 85% до приблизительно 100%, от приблизительно 86% до приблизительно 100%, от приблизительно 87% до приблизительно 100%, от приблизительно 88% до приблизительно 100%, от приблизительно 89% до приблизительно 100%, от приблизительно 90% до приблизительно 100%, от приблизительно 91% до приблизительно 100%, от приблизительно 92% до приблизительно 100%, от приблизительно 93% до приблизительно 100%, от приблизительно 94% до приблизительно 100%, от приблизительно 95% до приблизительно 100%, от приблизительно 96% до приблизительно 100%, от приблизительно 97% до приблизительно 100%, от приблизительно 98% до приблизительно 100% и/или от приблизительно 99% до приблизительно 100%. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению представляет собой нуклеотидную последовательность, которая характеризуется значительной идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 и кодирует полипептид, обладающий α-амилазной активностью. В некоторых вариантах осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению представляет собой нуклеотидную последовательность, которая характеризуется 80%-100% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 и кодирует полипептид, обладающий α-амилазной активностью. В иллюстративных вариантах осуществления нуклеотидная последовательность по настоящему изобретению представляет собой нуклеотидную последовательность, которая характеризуется 95% идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 5 и кодирует полипептид, обладающий α-амилазной активностью.

В некоторых вариантах осуществления полипептид по настоящему изобретению содержит, состоит главным образом из или состоит из аминокислотной последовательности, которая по меньшей мере на 70% идентична, например по меньшей мере на 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, и/или 100% идентична аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 1 и обладает α-амилазной активностью.

В некоторых вариантах осуществления полипептидная или нуклеотидная последовательность могут представлять собой вариант с консервативной модификацией. Как применяется в данном документе, "вариант с консервативной модификацией" относится к полипептидным и нуклеотидным последовательностям, содержащим отдельные замены, делеции или добавления, за счет которых изменяется, добавляется или удаляется одна аминокислота или нуклеотид или небольшая процентная доля аминокислот или нуклеотидов в последовательности, при этом изменение приводит в результате к замене аминокислоты на химически сходную аминокислоту. Таблицы консервативных замен, обеспечивающих функционально сходные аминокислоты, являются хорошо известными из уровня техники.

Как применяется в данном документе, вариант полипептида с консервативной модификацией является биологически активным, и следовательно обладает требуемой активностью эталонного полипептида (например, α-амилазной активностью), как описано в данном документе. Вариант может возникать в результате, например, генетического полиморфизма или действий человека. Биологически активный вариант эталонного полипептида может характеризоваться по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или большей идентичностью или сходством последовательности (например, от приблизительно 40% до приблизительно 99% или большей идентичностью или сходством последовательности и любым диапазоном в указанных пределах) с аминокислотной последовательностью эталонного полипептида, как определено с помощью программ для выравнивания последовательностей и параметров, описанных в других местах в данном документе. Активный вариант может отличаться от последовательности эталонного полипептида всего лишь 1-15 аминокислотными остатками, всего лишь 1-10, например 6-10, всего лишь 5, всего лишь 4, 3, 2 или даже 1 аминокислотным остатком.

В популяции могут существовать встречающиеся в природе варианты. Эти варианты можно идентифицировать с помощью хорошо известных методик молекулярной биологии, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и гибридизация, как описано ниже. Нуклеотидные последовательности, полученные синтетическим путем, например последовательности, полученные с помощью сайт-направленного мутагенеза или ПЦР-опосредованного мутагенеза, которые кодируют полипептид по настоящему изобретению, также включены в качестве вариантов. Замены, добавления или делеции одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот можно вводить в нуклеотидную или аминокислотную последовательность, раскрытые в данном документе, таким образом, что замены, добавления или делеции вводятся в кодируемый белок. Добавления (вставки) или делеции (усечения) можно осуществлять в N-концевой или С-концевой областях нативного белка или в одном или нескольких участках нативного белка. Аналогично, замену одного или нескольких нуклеотидов или аминокислот можно осуществлять в одном или нескольких участках нативного белка.

Например, консервативные аминокислотные замены можно осуществлять по одному или нескольким предсказанным остаткам предпочтительно несущественных аминокислот. Остаток "несущественной" аминокислоты представляет собой остаток, который можно изменить в последовательности белка дикого типа без изменения биологической активности, тогда как "существенная" аминокислота является необходимой для биологической активности. "Консервативная аминокислотная замена" является такой, при которой аминокислотный остаток замещают аминокислотным остатком со сходной боковой цепью. Семейства аминокислот, остатки которых имеют сходные боковые цепи, известны из уровня техники. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), кислотными боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серии, треонин, тирозин, цистеин), неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), разветвленными в бета-положении боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Такие замены не могут быть осуществлены в отношении консервативных аминокислотных остатков или в отношении аминокислотных остатков, которые находятся в консервативном мотиве, при этом такие остатки являются существенными для активности белка.

Например, варианты аминокислотной последовательности эталонного полипептида можно получить посредством мутации нуклеотидной последовательности, кодирующей фермент. Можно осуществлять рекомбинантную экспрессию полученных в результате мутантов у растений и проводить скрининг в отношении тех, у которых сохраняется биологическая активность, с помощью анализа α-амилазной активности с применением способов, хорошо известных из уровня техники. Способы мутагенеза и изменений нуклеотидной последовательности хорошо известны из уровня техники. См., например, Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-492; Kunkel et al. (1987) Methods in Enzymol. 154: 367-382; и Techniques in Molecular Biology (Walker & Gaastra eds., MacMillan Publishing Co. 1983) и ссылки, процитированные там; а также патент США №4873192. Ясно, что мутации, осуществленные в ДНК, кодирующей вариант, не должны приводить к нарушению рамки считывания, и в результате них предпочтительно не будут формироваться комплементарные области, которые могут образовать вторичную структуру mRNA. См. публикацию европейской патентной заявки №75444. Рекомендации относительно соответствующих аминокислотных замен, которые не влияют на биологическую активность белка, представляющего интерес, можно найти в модели Dayhoff et al. (1978). Atlas of Protein Sequence and Structure (Национальный фонд биомедицинских исследований, Вашингтон, округ Колумбия, США), включенной в данный документе с помощью ссылки.

Делеции, вставки и замены в полипептидах, описанных в данном документе, как предполагается, не будут приводить к радикальным изменениям в отношении характеристик полипептида (например, активности полипептида). Однако, если сложно предсказать точный эффект замены, делеции или вставки до ее осуществления, то специалист в данной области поймет, что эффект можно оценивать с помощью обычных скрининговых анализов, которыми можно осуществлять скрининг в отношении определенных активностей полипептида, представляющих интерес (например, α-амилазной активности).

В некоторых вариантах осуществления композиции по настоящему изобретению могут содержать активные фрагменты полипептида. Как применяется в данном документе, "фрагмент" означает часть эталонного полипептида, которая сохраняет полипептидную активность α-амилазы. Фрагмент также означает часть молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей эталонный полипептид. Активный фрагмент полипептида можно получить, например, путем выделения части молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, которая экспрессирует кодируемый фрагмент полипептида (например, с помощью рекомбинантной экспрессии in vitro), и оценки активности фрагмента. Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей такие фрагменты, могут состоять из по меньшей мере приблизительно 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, или 2200 смежных нуклеотидов, или любого диапазона в указанных пределах, или вплоть до числа нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Как таковые, полипептидные фрагменты могут состоять из по меньшей мере приблизительно 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 525, 550, 600, 625, 650, 675, или 700 смежных аминокислотных остатков, или любого диапазона в указанных пределах, или вплоть до общего числа аминокислотных остатков, присутствующих в полноразмерном полипептиде. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривается полипептид, содержащий, состоящий главным образом из или состоящий из по меньшей мере приблизительно 150 смежных аминокислотных остатков полипептида по настоящему изобретению (например, SEQ ID NO: 1) и обладающий α-амилазной активностью.

Термины "экспрессируют", "экспрессирует", "экспрессируемый" или "экспрессия" и т.п., применяемые в данном документе в отношении молекулы нуклеиновой кислоты и/или нуклеотидной последовательности (например, РНК или ДНК), указывают на то, что молекула нуклеиновой кислоты и/или нуклеотидная последовательность транскрибируется и необязательно транслируется. Таким образом, молекула нуклеиновой кислоты и/или нуклеотидная последовательность могут экспрессировать или продуцировать полипептид, представляющий интерес, или функциональную нетранслируемую РНК.

"Гетерологичная" или "рекомбинантная" нуклеотидная последовательность представляет собой нуклеотидную последовательность, в природных условиях не связанную с клеткой-хозяином, в которую ее вводят, в том числе не встречающиеся в природе множественные копии нуклеотидной последовательности, встречающейся в природе.

"Нативная" или "дикого типа" нуклеиновая кислота, нуклеотидная последовательность, полипептид или аминокислотная последовательность относятся к встречающейся в природе или эндогенной нуклеиновой кислоте, нуклеотидной последовательности, полипептиду или аминокислотной последовательности. Таким образом, например, "mRNA дикого типа" представляет собой mRNA, которая встречается в природе в организме или является эндогенной по отношению к нему. "Гомологичная" последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нуклеотидную последовательность, в природных условиях связанную с клеткой-хозяином, в которую ее вводят.

Также применяемые в данном документе термины "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "нуклеотидная последовательность" и "полинуклеотид" могут применяться взаимозаменяемо и охватывают как РНК, так и ДНК, в том числе cDNA, геномную ДНК, mRNA, синтетическую (например, химически синтезированную) ДНК или РНК и химерные ДНК и РНК. Термины "полинуклеотид", "нуклеотидная последовательность" или "нуклеиновая кислота" относятся к цепи нуклеотидов без учета длины цепи. Нуклеиновая кислота может быть двухнитевой или однонитевой. Если нуклеиновая кислота однонитевая, то она может представлять собой смысловую нить или антисмысловую нить. Нуклеиновую кислоту можно синтезировать с применением аналогов или производных олигонуклеотидов (например, инозина или фосфотиоатных нуклеотидов). Такие олигонуклеотиды можно применять, например, для получения нуклеиновых кислот с измененными свойствами спаривания оснований или повышенной устойчивостью к нуклеазам. В настоящем изобретении дополнительно предусматривается нуклеиновая кислота, которая является комплементарной (что может означать как полную комплементарность, так и частичную комплементарность) нуклеиновой кислоте, нуклеотидной последовательности или полинуклеотиду по настоящему изобретению. Молекулы нуклеиновых кислот и/или нуклеотидные последовательности, предусмотренные в данном документе, приводятся в данном документе в направлении от 5'- к 3'- концу, слева направо, и обозначаются с применением стандартного кода для обозначения символов нуклеотидов, как установлено правилами США для изложения последовательностей, §§1.821-1.825 раздела 37 CFR и стандартом ST.25 Всемирной организации интеллектуальной собственности (WIPO).

В некоторых вариантах осуществления рекомбинантные молекулы нуклеиновых кислот, нуклеотидные последовательности и полипептиды по настоящему изобретению являются "выделенными". "Выделенная" молекула нуклеиновой кислоты, "выделенная" нуклеотидная последовательность или "выделенный" полипептид представляют собой молекулу нуклеиновой кислоты, нуклеотидную последовательность или полипептид, которые посредством вмешательства человека существует отдельно от своей естественной среды, а следовательно не являются природными продуктами. Выделенные молекула нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность или полипептид могут находиться в очищенной форме, т.е. быть по меньшей мере частично отделенными от по меньшей мере некоторых других компонентов встречающегося в природе организма или вируса, например структурных компонентов клетки или вируса или других полипептидов или нуклеиновых кислот, обычно обнаруживаемых связанными с полинуклеотидом. В иллюстративных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты, выделенная нуклеотидная последовательность и/или выделенный полипептид являются чистыми на по меньшей мере приблизительно 1%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, или более.

В других вариантах осуществления выделенные молекула нуклеиновой кислоты, нуклеотидная последовательность или полипептид могут существовать в среде, не являющейся естественной, например, такой как рекомбинантная клетка-хозяин. Таким образом, например, в отношении нуклеотидных последовательностей, термин "выделенная" означает то, что она отделена от хромосомы и/или клетки, в которой она встречается в природе. Полинуклеотид также является выделенным, если он отделен от хромосомы и/или клетки, в которой он встречается в природе, и затем встроен в генетическое окружение, хромосому и/или клетку, в которых он в природе не встречается (например, другую клетку-хозяина, другие регуляторные последовательности и/или другое положение в геноме по сравнению с таковыми обнаруживаемыми в природе). Соответственно, рекомбинантные молекулы нуклеиновой кислоты, нуклеотидные последовательности и кодируемые ими полипептиды являются "выделенными", поскольку они посредством вмешательства человека существуют отдельно от их естественной среды и, следовательно, не являются природными продуктами, однако в некоторых вариантах осуществления они могут быть введены в рекомбинантную клетку-хозяина и существовать в ней.

В некоторых вариантах осуществления нуклеотидные последовательности и/или молекулы нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению могут быть функционально связаны с различными промоторами для экспрессии в клетках-хозяевах (например, клетках растения). Как применяется в данном документе, "функционально связанный с", при упоминании первой последовательности нуклеиновой кислоты, которая функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, означает ситуацию, в которой первая последовательность нуклеиновой кислоты находится в функциональной взаимосвязи со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности.

"Промотор" ДНК является нетранслируемой последовательностью ДНК, расположенной выше кодирующей области, которая содержит сайт связывания для РНК-полимеразы и инициирует транскрипцию ДНК. "Промоторная область" может также включать другие элементы, которые действуют в качестве регуляторов экспрессии генов. Промоторы могут включать, например, конститутивные, индуцируемые, регулируемые во времени, регулируемые в процессе развития, регулируемые химическими веществами, тканепредпочтительные и тканеспецифичные промоторы для применения при получении рекомбинантных молекул нуклеиновой кислоты, т.е. химерных генов. В определенных аспектах "промотор", пригодный в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой промотор, способный инициировать транскрипцию нуклеотидной последовательности в клетке растения.

"Химерный ген" представляет собой рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, в которой промотор или другая регуляторная нуклеотидная последовательность функционально связаны с нуклеотидной последовательностью, которая кодирует mRNA или которая экспрессируется в виде белка, таким образом, что регуляторная нуклеотидная последовательность способна регулировать транскрипцию или экспрессию ассоциированной нуклеотидной последовательности. Регуляторная нуклеотидная последовательность химерного гена обычно не является функционально связанной с ассоциированной нуклеотидной последовательностью, встречающейся в природе.

Выбор промотора будет меняться в зависимости от временных и пространственных требований для экспрессии, а также в зависимости от клетки-хозяина, подлежащей трансформации. Таким образом, например, экспрессия нуклеотидной последовательности может иметь место в любом растении и/или части растения (например, в листьях, в цветоножках или стеблях, в колосьях, в соцветиях (например, колосках, метелках, початках и т.п.), в корнях, семенах и/или проростках и т.п.). Несмотря на то, что многие промоторы из двудольных растений, как было показано, функционируют у однодольных и наоборот, в идеальном случае для экспрессии у двудольных растений выбирают промоторы двудольных, а промоторы однодольных выбирают для экспрессии у однодольных. Однако не существует каких-либо ограничений в отношении происхождения выбранных промоторов; при этом достаточно, чтобы они являлись функциональными в отношении управления экспрессией нуклеотидных последовательностей в требуемой клетке.

Промоторы, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, включают без ограничений промоторы, которые управляют экспрессией нуклеотидной последовательности конститутивно, промоторы, которые управляют экспрессией при индукции, и промоторы, которые управляют экспрессией тканеспецифически или специфически в отношении стадии развития. Эти различные типы промоторов хорошо известны из уровня техники.

Примеры конститутивных промоторов включают без ограничений промотор вируса цеструма (стр) (патент США №7166770), промотор гена актина-1 риса (Wang et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12: 3399-3406; а также патент США №5641876), промотор гена 35S CaMV (Odell et al. (1985) Nature 313: 810-812), промотор гена 19S CaMV (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324), промотор гена nos (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:5745-5749), промотор гена Adh (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6624-6629), промотор гена сахарозосинтазы (Yang & Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:4144-4148) и промотор гена убиквитина. Конститутивный промотор, полученный из гена убиквитина, накапливается во многих типах клеток. Промоторы гена убиквитина были клонированы из нескольких видов растений для применения у трансгенных растений, например, у подсолнечника (Binet et al., 1991. Plant Science 79: 87-94), маиса (Christensen et al., 1989. Plant Molec. Biol. 12: 619-632) и Arabidopsis (Norris et al. 1993. Plant Molec. Biol. 21:895-906). Промотор гена убиквитина маиса (UbiP) был разработан в трансгенных системах однодольных, и его последовательность и векторы, сконструированные для трансформации однодольных растений, раскрыты в патентной публикации ЕР 0342926. Дополнительно, кассеты экспрессии с промотором, описанные в McElroy et al. (Mol. Gen. Genet. 231: 150-160 (1991)), можно легко модифицировать для экспрессии нуклеотидных последовательностей, и они являются особенно подходящими для применения у однодольных хозяев.

В некоторых вариантах осуществления можно применять тканеспецифичные/тканепредпочтительные промоторы. Паттерны тканеспецифичной или тканепредпочтительной экспрессии включают без ограничения паттерны экспрессии, специфичной или предпочтительной в отношении зеленых тканей, специфичной или предпочтительной в отношении корня, специфичной или предпочтительной в отношении стебля, специфичной или предпочтительной в отношении семени и специфичной или предпочтительной в отношении цветка. Промоторы, подходящие для экспрессии в зеленой ткани, включают множество промоторов, которые осуществляют регуляцию генов, участвующих в фотосинтезе, и многие из них были клонированы как из однодольных, так и из двудольных. В одном варианте осуществления промотор, пригодный в соответствии с настоящим изобретением, представляет собой промотор РЕРС маиса из гена фосфоенолкарбоксилазы (Hudspeth & Grula, PlantMolec. Biol. 12:579-589 (1989)). Неограничивающие примеры тканеспецифичных промоторов включают промоторы, связанные с генами, кодирующими запасные белки семян (такие как β-конглицинин, круциферин, напин и фазеолин), зеин (например, гамма-зеин), или белки масляных телец (такие как олеозин), или белки, вовлеченные в биосинтез жирных кислот (в том числе ацилпереносящий белок, стеароил-АСР-десатуразу и десатуразы жирных кислот (fad 2-1)), и другими нуклеиновыми кислотами, экспрессируемыми в ходе эмбрионального развития (такими как Все 4, см., например, Kridl et al. (1991) Seed Sci. Res. 1: 209-219; а также патент ЕР №255378). Тканеспецифичные или тканепредпочтительные промоторы, пригодные для экспрессии нуклеотидных последовательностей у растений, в частности маиса, включают без ограничения промоторы, которые управляют экспрессией в корне, сердцевине стебля, листе или пыльце. Такие промоторы раскрыты, например, в публикации согласно РСТ WO 93/07278, которая включена в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте. Другие неограничивающие примеры тканеспецифичных или тканепредпочтительных промоторов включают промотор гена rubisco хлопчатника, раскрытый в патенте США №6040504; промотор гена сахаросинтазы риса, раскрытый в патенте США №5604121; промотор, специфичный в отношении корня, описанный de Framond (FEBS 290:103-106 (1991); ЕР 0452269, выданный Ciba-Geigy); промотор, специфичный в отношении стебля, описанный в патенте США №5625136 (выданный Ciba-Geigy), и который управляет экспрессией гена trpA маиса; и промотор вируса цеструма, вызывающего желтую курчавость листьев, раскрытый в публикации согласно РСТ WO 01/73087, все из которых включены в данный документ с помощью ссылки.

Дополнительные примеры тканеспецифичных/тканепредпочтительных промоторов включают без ограничения промоторы, специфичные в отношении корня, RCc3 (Jeong et al. Plant Physiol. 153:185-197 (2010)) и RB7 (патент США №5459252), промотор гена лектина (Lindstrom et al. (1990) Der. Genet. 11:160-167; и Vodkin (1983) Prog. Clin. Biol. Res. 138:87-98), промотор гена алкогольдегидрогеназы 1 кукурузы (Dermises al. (1984) Nucleic Acids Res. 12:3983-4000), гена S-аденозил-L-метионинсинтетазы (SAMS) (Vander Mijnsbrugge et al. (1996) Plant and Cell Physiology, 37(8): 1108-1115), промотор генов светособирающего комплекса кукурузы (Bansal et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3654-3658), промотор гена белка теплового шока кукурузы (O'Dell et al. (1985) EMBO J. 5:451-458; и Rochester et al. (1986) EMBO J. 5:451-458), промотор гена малой субъединицы RuBP-карбоксилазы гороха (Cashmore, "Nuclear genes encoding the small subunit of ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase" pp. 29-39 в: Genetic Engineering of Plants (Hollaender ed., Plenum Press 1983; и Poulsen et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 205: 193-200), промотор гена маннопинсинтазы Ti-плазмиды (Langridge et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3219-3223), промотор гена нопалинсинтазы Ti-плазмиды (Langridge et al. (1989), выше), промотор гена халконизомеразы петунии (van Tunen et al. (1988) EMBO J. 7: 1257-1263), промотор гена богатого глицином белка 1 фасоли (Keller et al. (1989) Genes Dev. 3: 1639-1646), промотор гена усеченной 35S CaMV (O'Dell et al. (1985) Nature 313: 810-812), промотор гена пататина картофеля (Wenzler et al. (1989) Plant Mol. Biol. 13:347-354), промотор из клеток корней (Yamamoto et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18:7449), промотор геназеина маиса (Kriz et al. (1987) Mol. Gen. Genet. 207: 90-98; Langridge et al. (1983) Cell 34: 1015-1022; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 6425; Reina et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 7449; и Wandelt et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2354), промотор гена глобулина-1 (Belanger et al. (1991) Genetics 129:863-872), промотор гена α-тубулина cab (Sullivan et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 215: 431-440), промотор гена РЕРСазы (Hudspeth & Grula (1989) Plant Mol. Biol. 12:579-589), промоторы, связанные с комплексами R-генов (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1: 1175-1183), и промоторы гена хальконсинтазы (Franken et al. (1991) EMBO J. 10:2605-2612).

Особенно пригодными для экспрессии, специфичной в отношении семян, является промотор гена вицилина гороха (Czako et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 235: 33-40; а также специфичные в отношении семян промоторы, раскрытые в патенте США №5625136. В некоторых вариантах осуществления промотор может представлять собой промотор, специфичный в отношении эндосперма, в том числе без ограничения промотор гена гамма-зеина маиса или промотор гена ADP-gpp маиса.

Промоторы, применимые для экспрессии в зрелых листьях, представляют собой промоторы, которые включаются при наступлении старения, такие как промотор SAG из Arabidopsis (Gan et al. (1995) Science 270: 1986-1988).

Кроме того, можно применять промоторы, являющиеся функциональными в пластидах. Неограничивающие примеры таких промоторов включают промотор 5'-UTR гена 9 бактериофага Т3 и другие промоторы, раскрытые в патенте США №7579516. Другие промоторы, пригодные в соответствии с настоящим изобретением, включают без ограничения промотор малой субъединицы S-E9 RuBP-карбоксилазы и промотор гена ингибитора трипсина Кунитца (Kti3).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения можно применять индуцируемые промоторы. Таким образом, например, промоторы, регулируемые химическими веществами, можно применять для модуляции экспрессии гена в растении посредством применения экзогенного химического регулятора. Регуляция экспрессии нуклеотидных последовательностей посредством промоторов, регулируемых химическими веществами, обеспечивает синтез полипептидов по настоящему изобретению только тогда, когда культурные растения обрабатывают индуцирующими химическими веществами. В зависимости от цели промотор может представлять собой промотор, индуцируемый химическим веществом, при этом применение химического вещества индуцирует экспрессию гена, или промотор, подавляемый химическим веществом, при этом применение химического вещества подавляет экспрессию гена.

Промоторы, индуцируемые химическими веществами, известны из уровня техники и включают без ограничения промотор In2-2 маиса, который активируется антидотами бензолсульфонамидных гербицидов, промотор GST маиса, который активируется гидрофобными электрофильными соединениями, применяемыми в качестве предвсходовых гербицидов, и промотор гена PR-1a табака, который активируется салициловой кислотой (например, системы PR 1а), стероидзависимые промоторы (см., например, промотор, индуцируемый глюкокортикоидами, в Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10421-10425 и McNellis et al. (1998) Plant J. 14, 247-257) и промоторы, индуцируемые тетрациклинами и подавляемые тетрациклинами (см., например, Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227, 229-237 и патенты США №№5814618 и 5789156), промоторы системы Lac-penpeccopa, промоторы системы, индуцируемой медью, промоторы системы, индуцируемой салицилатом (например, системы PR1a), промоторы, индуцируемые глюкокортикоидами (Aoyama et al. (1997) Plant J. 11:605-612), и промоторы системы, индуцируемой экдизоном.

Другие неограничивающие примеры индуцируемых промоторов включают промоторы, индуцируемые ABA и тургорным давлением, промотор гена белка, связывающего ауксин (Schwob et al. (1993) Plant J. 4: 423-432), промотор генаУДФ-глюкозофлавоноидгликозилтрансферазы (Ralston et al. (1988) Genetics 119:185-197), промотор гена ингибитора протеиназы MPI (Cordero et al. (1994) Plant J. 6:141-150) и промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Kohler et al. (1995) PlantMol. Biol. 29: 1293-1298; Martinez et al. (1989) J. Mol. Biol. 208:551-565; и Quigley e tal. (1989) J. Mol. Evol. 29: 412-421). Также включены системы, индуцируемые бензолсульфонамидом (патент США №5364780) и индуцируемые спиртами (публикации международных патентных заявок №№ WO 97/06269 и WO 97/06268), и промоторы гена глутатион-S-трансферазы. Аналогично можно применять любой из индуцируемых промоторов, описанных в Gatz (1996) Current Opinion Biotechnol. 7: 168-172 и Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108. Другие индуцируемые химическими веществами промоторы, пригодные для управления экспрессией нуклеотидных последовательностей по настоящему изобретению у растений, раскрыты в патенте США №5614395, включенном в данный документ с помощью ссылки во всей своей полноте. Химическое индуцирование экспрессии генов также подробно изложено в опубликованной заявке ЕР 0332104 (выданной Ciba-Geigy) и патенте США №5614395. В некоторых вариантах осуществления промотор для химического индуцирования может представлять собой промотор гена PR-1а табака.

Полипептид по настоящему изобретению может нацеливаться или не нацеливаться на компартмент внутри растения посредством применения сигнальной последовательности. Известно, что многочисленные сигнальные последовательности влияют на экспрессию или нацеливание полинуклеотида на конкретные компартмент/ткань или за пределами конкретных компартмента/ткани. Подходящие сигнальные последовательности и нацеливающие промоторы известны из уровня техники и включают без ограничения те, которые приведены в данном документе (см. например патент США №7919681). Примеры мишеней включают без ограничения вакуоль, эндоплазматический ретикулум (ER), хлоропласт, амилопласт, крахмальную гранулу, клеточную стенку, семя или конкретную ткань, например эндосперм. Таким образом, нуклеотидная последовательность, кодирующая полипептид по настоящему изобретению (например, SEQ ID NO: 1), может быть функционально связана с сигнальной последовательностью для нацеливания и/или сохранения полипептида в компартменте внутри растения. В некоторых вариантах осуществления сигнальная последовательность может представлять собой N-концевую сигнальную последовательность из гена waxy, N-концевую сигнальную последовательность из гена гамма-зеина, крахмалсвязывающий домен или С-концевой крахмалсвязывающий домен. В дополнительных вариантах осуществления сигнальная последовательность может представлять собой сигнальную последовательность ER, последовательность удерживания ER, сигнальную последовательность ER и дополнительную последовательность удерживания ER. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды α-амилазы могут быть слиты с одной или несколькими сигнальными последовательностями (и/или нуклеотидные последовательности, кодирующие полипептиды, могут быть функционально связаны с нуклеотидными последовательностями, кодирующими сигнальные последовательности).

Выражение "кассета экспрессии", используемое в данном документе, означает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, представляющую интерес (например, нуклеотидную последовательность с SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5), где нуклеотидная последовательность функционально связана с по меньшей мере регуляторной последовательностью (например, промотором). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваются кассеты экспрессии, сконструированные для экспрессии нуклеотидной последовательности под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5. Таким образом, например, один или несколько промоторов растений, функционально связанных с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5 или нуклеотидной последовательностью, характеризующейся значительной идентичностью с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и/или SEQ ID NO: 5, могут быть предоставлены в кассете экспрессии с целью экспрессии в организме или его клетке (например, растении, части растения и/или клетке растения).

Кассета экспрессии, содержащая нуклеотидную последовательность, представляющую интерес, может быть химерной, что означает, что по меньшей мере один из ее компонентов является гетерологичным по отношению к по меньшей мере одному из ее остальных компонентов. Кассета экспрессии также может представлять собой таковую, которая встречается в природе, но которая была получена в рекомбинантной форме, пригодной для гетерологичной экспрессии. Однако обычно кассета экспрессии является гетерологичной по отношению к хозяину, т.е. конкретная последовательность нуклеиновой кислоты в кассете экспрессии не встречается в клетке-хозяине в природных условиях, а должна быть введена в клетку-хозяина или предка клетки-хозяина с помощью трансформации.

В дополнение к промоторам, функционально связанным с нуклеотидной последовательностью, подлежащей экспрессии, кассета экспрессии может также включать другие регуляторные последовательности. Как применяется в данном документе, "регуляторная последовательность" означает нуклеотидную последовательность, расположенную выше (5'-некодирующие последовательности), в пределах и/или ниже (3'-некодирующие последовательности) кодирующей последовательности, и/или которая влияет на транскрипцию, процессинг или стабильность РНК или трансляцию связанной кодирующей последовательности. Регуляторные последовательности включают без ограничения промоторы, энхансеры, интроны, лидерные последовательности, регулирующие трансляцию, сигналы терминации и сигнальные последовательности полиаденилирования. В некоторых вариантах осуществления кассета экспрессии также может включать в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие сигнальные последовательности, функционально связанные с полинуклеотидной последовательностью по настоящему изобретению.

Для целей настоящего изобретения регуляторные последовательности или области могут являться нативными/аналогичными в отношении растения, части растения и/или клетки растения, и/или регуляторные последовательности могут являться нативными/аналогичными в отношении других регуляторных последовательностей. В качестве альтернативы, регуляторные последовательности могут являться гетерологичными в отношении растения (и/или части растения, и/или клетки растения) и/или друг друга (т.е. регуляторных последовательностей). Таким образом, например, промотор может являться гетерологичным, если он функционально связан с полинуклеотидом от вида, отличного от вида, от которого получили полинуклеотид. В качестве альтернативы, промотор может также являться гетерологичным в отношении выбранной нуклеотидной последовательности, если промотор происходит от одного и того же/аналогичного вида, от которого получен полинуклеотид, но один или оба (т.е. промотор и/или полинуклеотид) в значительной степени модифицированы по сравнению со своей исходной формой и/или геномным локусом, и/или промотор не является нативным промотором в отношении функционально связанного полинуклеотида.

Как известно, ряд нетранслируемых лидерных последовательностей, полученных из вирусов, усиливают экспрессию генов. В частности, было показано, что лидерные последовательности вируса табачной мозаики (TMV, "ω-последовательность"), вируса хлоротической пятнистости маиса (MCMV) и вируса мозаики люцерны (AMV) являются эффективными в усилении экспрессии (Gallie et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:8693-8711; и Skuzeski et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:65-79). Другие лидерные последовательности, известные из уровня техники, включают без ограничения лидерные последовательности пикорнавирусов, такие как лидерная последовательность 5'-некодирующей области вируса энцефаломиокардита (EMCV) (Elroy-Stein et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6126-6130); лидерные последовательности потивирусов, такие как лидерная последовательность вируса гравировки табака (TEV) (Allison et al. (1986) Virology 154: 9-20); лидерная последовательность вируса карликовой мозаики маиса (MDMV) (Allison et al. (1986), выше); лидерная последовательность белка, связывающего тяжелую цепь иммуноглобулинов человека (BiP) (Macejak & Samow (1991) Nature 353: 90-94); нетранслируемая лидерная последовательность mRNA белка оболочки AMV (РНК 4 AMV; Jobling & Gehrke (1987) Nature 325: 622-625); лидерная последовательность вируса табачной мозаики TMV (Gallie et al. (1989) Molecular Biology of RNA 237-256) и лидерная последовательность MCMV (Lommel et al. (1991) Virology 81: 382-385). См. также Della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965-968.

Кассета экспрессии также необязательно может содержать участок терминации транскрипции и/или трансляции (т.е. участок терминации), который является функциональным у растений. Разнообразные терминаторы транскрипции доступны для применения в кассетах экспрессии, и они отвечают за терминацию транскрипции за пределами представляющей интерес гетерологичной нуклеотидной последовательности и правильное полиаденилирование mRNA. Участок терминации может быть нативным в отношении участка инициации транскрипции, может быть нативным в отношении функционально связанной нуклеотидной последовательности, представляющей интерес, может быть нативным в отношении растения-хозяина или может быть получен из другого источника (например, быть чужеродным или гетерологичным в отношении промотора, представляющей интерес нуклеотидной последовательности, растения-хозяина или любой их комбинации). Надлежащие терминаторы транскрипции включают без ограничения терминатор гена 35S CaMV, терминатор гена tml, терминатор гена нопалинсинтазы и/или терминатор гена rbcs-E9 гороха. Их можно применять как у однодольных, так и у двудольных растений. В дополнение, можно применять терминатор транскрипции, нативный в отношении кодирующей последовательности.

Кассета экспрессии по настоящему изобретению также может включать нуклеотидную последовательность селектируемого маркера, который можно применять для отбора трансформированного растения, части растения или клетки растения. Как применяется в данном документе, "селектируемый маркер" означает нуклеотидную последовательность, которая при экспрессии придает отличительный фенотип растению, части растения и/или клетке растения, экспрессирующим данный маркер, и, таким образом, позволяет отличать такие трансформированные растения, части растений и/или клетки растений от тех, которые не имеют маркера. Такая нуклеотидная последовательность может кодировать либо селектируемый, либо подвергаемый скринингу маркер в зависимости от того, придает ли маркер признак, по которому можно провести отбор с помощью химических средств, например путем применения селективного средства (например, антибиотика, гербицида и т.п.), или от того, является ли маркер просто признаком, который можно идентифицировать посредством наблюдения или тестирования, например путем скрининга (например, признаком, определяемым в R-локусе). Разумеется, много примеров подходящих селектируемых маркеров известны из уровня техники и могут применяться в кассетах экспрессии, описанных в данном документе.

Примеры селектируемых маркеров включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую neo или nptII, которые придают устойчивость к канамицину, G418 и т.п. (Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199: 183-188); нуклеотидную последовательность, кодирующую bar, который придает устойчивость к фосфинотрицину; нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу (EPSP), которая придает устойчивость к глифосату (Hinchee et al. (1988) Biotech. 6:915-922); нуклеотидную последовательность, кодирующую нитрилазу, такую как bxn из Klebsiella ozaenae, которая придает устойчивость к бромоксинилу (Stalker et al. (1988) Science 242:419-423); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную ацетолактатсинтазу (ALS), которая придает устойчивость к имидазолинону, сульфонилмочевине или другим ALS-ингибирующим химическим веществам (европейская патентная заявка №154204); нуклеотидную последовательность, кодирующую устойчивую к метотрексату дигидрофолатредуктазу (DHFR) (Thillet et al. (1988) J. Biol. Chem. 263:12500-12508); нуклеотидную последовательность, кодирующую далапондегалогеназу, которая придает устойчивость к далапону; нуклеотидную последовательность, кодирующую маннозо-6-фосфатизомеразу (также называемую фосфоманнозоизомеразой (PMI)), которая придает способность к метаболизму маннозы (патенты США №№5767378 и 5994629); нуклеотидную последовательность, кодирующую измененную антранилатсинтазу, которая придает устойчивость к 5-метилтриптофану; и/или нуклеотидную последовательность, кодирующую hph, который придает устойчивость к гигромицину. Специалист в данной области способен выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.

Дополнительные селектируемые маркеры включают без ограничения нуклеотидную последовательность, кодирующую β-глюкуронидазу или uidA (GUS), который кодирует фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты; нуклеотидную последовательность R-локуса, которая кодирует продукт, регулирующий продуцирование антоцианиновых пигментов (красного цвета) в тканях растений (Dellaporta et al., "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon-tagging with Ac," pp. 263-282, в: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium (Gustafson & Appels eds., Plenum Press 1988)); нуклеотидную последовательность, кодирующую β-лактамазу, фермент, для которого известны различные хромогенные субстраты (например, PAD АС, хромогенный цефалоспорин) (Sutcliffe (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:3737-3741); нуклеотидную последовательность, кодирующую xylE, который кодирует катехолдиоксигеназу (Zukowsky et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101-1105); нуклеотидную последовательность, кодирующую тирозиназу, фермент, способный окислять тирозин до DOPA и допахинона, который, в свою очередь, конденсируется с образованием меланина (Katz et al. (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-2714); нуклеотидную последовательность, кодирующую β-галактозидазу, фермент, для которого существуют хромогенные субстраты; нуклеотидную последовательность, кодирующую люциферазу (lux), которая обеспечивает выявление с помощью биолюминесценции (Ow et al. (1986) Science 234:856-859); нуклеотидную последовательность, кодирующую экворин, который может быть использован в обнаружении чувствительной к кальцию биолюминесценции (Prasher et al. (1985) Biochem. Biophys. Res. Comm. 126:1259-1268); или нуклеотидную последовательность, кодирующую зеленый флуоресцентный белок (Niedz et al. (1995) Plant Cell Reports 14:403-406). Специалист в данной области способен выбрать подходящий селектируемый маркер для применения в кассете экспрессии по настоящему изобретению.

В других аспектах в настоящем изобретении предусматривается способ увеличения скорости роста (привеса) или среднесуточного привеса животного (например, животного, выращиваемого для производства мяса), при этом способ включает скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению. В вариантах осуществления скорость роста животного или среднесуточный привес животного увеличивается на от приблизительно 0,05 фунта/день до приблизительно 10 фунтов/день по сравнению со скоростью роста контрольного животного, которому не предоставлена кормовая композиция для животных по настоящему изобретению. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления увеличение скорости роста или среднесуточного привеса может составлять по меньшей мере приблизительно 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09, 0,1, 0,1, 0,125, 0,15, 0,175, 0,2, 0,225, 0,25, 0,275, 0,3, 0,325, 0,35, 0,375, 0,4, 0,425, 0,45, 0,475, 0,5, 0,525, 0,55, 0,575, 0,6, 0,625, 0,65, 0,675, 0,7, 0,725, 0,75, 0,775, 0,8, 0,825, 0,85, 0,875, 0,9, 0,925, 0,95, 0,975, 1, 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,1, 4,2, 4,21, 4,22, 4,23, 4,24, 4,25, 4,26, 4,27, 4,28, 4,29, 4,3, 4,31, 4,32, 4,33, 4,34, 4,35, 4,36, 4,37, 4,38, 4,39, 4,4, 4,41, 4,42, 4,43, 4,44, 4,45, 4,46, 4,47, 4,48, 4,49, 4,5, 4,75, 5, 5,25, 5,5, 5,75, 6, 6,25, 6,5, 6,75, 7, 7,25, 7,5, 7,75, 8, 8,25, 8,5, 8,75, 9, 9,25, 9,5, 9,75, 10 фунтов/день и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах. В некоторых конкретных вариантах осуществления увеличение скорости роста или среднесуточного привеса может составлять от приблизительно 0,05 фунта/день до приблизительно 0,5 фунта/день. В дополнительных вариантах осуществления увеличение скорости роста или среднесуточного привеса может составлять приблизительно 0,1 фунта/день по сравнению с ростом контрольного животного, которому не предоставлена данная кормовая композиция для животных.

В дополнительных аспектах настоящего изобретения предусматривается способ сокращения количества дней, необходимых для достижения требуемого веса у животного, при этом способ включает скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению, за счет чего сокращается количество дней, необходимых для достижения требуемого веса, по сравнению с количеством дней, необходимых для достижения такого же требуемого веса у контрольного животного, которому не скармливали данную кормовую композицию для животных.

Как применяется в данном документе, "требуемый вес" или "требуемый предубойный вес" могут означать живой вес или вес парной туши. Таким образом, например, для крупного рогатого скота требуемый живой вес может составлять от приблизительно 950 до приблизительно 1600 фунтов, и требуемый вес парной туши может составлять от приблизительно 700 до приблизительно 1000 фунтов.

Традиционно, после отъема и перед поступлением на откормочную площадку "молодняк" мясного скота (также известный как крупный рогатый скот "на доращивании и откорме") проводит большую часть своей жизни, пасясь на пастбище или пастбищном угодье, и затем их транспортируют на откормочную площадку для завершающего откорма скота, где их кормят зерном и другими кормовыми концентратами. Однако в соответствии с настоящим изобретением способы по настоящему изобретению могут применяться к молодняку мясного скота, например растущему теленку мясной породы (самцу и/или самке) после отъема, необязательно выращиваемому для перевода на откормочную площадку для завершающего откорма скота.

Как правило, крупный рогатый скот поступает на откормочную площадку с весом, составляющим от приблизительно 600 до приблизительно 750 фунтов. В зависимости от веса при помещении, условий питания и требуемого предубойного веса, период пребывания на откормочной площадке может находиться в диапазоне от приблизительно 90 дней до приблизительно 300 дней. Средний прирост может составлять от приблизительно 2,5 до приблизительно 5 фунтов в день.

Соответственно, в другом аспекте настоящего изобретения количество дней, необходимых для достижения требуемого веса у животного, которому скармливали кормовые композиции для животных по настоящему изобретению, можно сократить на от приблизительно 1 дня до приблизительно 30 дней по сравнению с контрольным животным, которому не скармливали данную кормовую композицию для животных. В некоторых вариантах осуществления количество дней, необходимых для достижения требуемого веса у животного, которому скармливали кормовые композиции для животных по настоящему изобретению, можно сократить на от приблизительно 1 дня до приблизительно 25 дней, от приблизительно 1 дня до приблизительно 20 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 20 дней, от приблизительно 5 дней до приблизительно 15 дней и т.п., по сравнению с контрольным животным, которому не скармливали кормовую композицию для животных. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления количество дней, необходимых для достижения требуемого веса у животного, которому не скармливали кормовую композицию для животных по настоящему изобретению, можно сократить на приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 дней и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах.

В других аспектах настоящего изобретения предусматривается способ повышения эффективности использования кормов животным (например, для производства мяса, молока, яиц и/или шерсти), при этом способ включает скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в количестве, эффективном для повышения эффективности использования кормов животным по сравнению с контрольным животным, которому не скармливали данную кормовую композицию для животных.

Эффективность использования кормов можно рассчитать как потребление сухого вещества, деленное на прирост веса тела животного. В некоторых вариантах осуществления вес тела представляет собой предубойный вес тела перед убоем. В дополнительных вариантах осуществления предусмотренный корм представляет собой количество корма, которое предоставляется в течение периода от приблизительно 15, 30, 45, 60 или 90 дней до приблизительно 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 или 300 дней, и любой диапазон в указанных пределах, при условии, что значение нижнего диапазона меньше значения верхнего диапазона. В некоторых вариантах осуществления предусмотренный корм представляет собой количество корма, которое предоставляется в течение периода от приблизительно 100 дней до приблизительно 275 дней, от приблизительно 125 дней до приблизительно 250 дней, от приблизительно 150 дней до приблизительно 225 дней, от приблизительно 180 дней до приблизительно 200 дней и т.п.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления период времени (количество дней), в течение которого измеряют привес, составляет 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, ПО, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 дней и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах.

В дополнительных аспектах настоящего изобретения кормовая ценность кукурузы для животного повышена на от приблизительно 1% до приблизительно 25% по сравнению с контрольным животным, которому не скармливали данную кормовую композицию для животных. Кормовая ценность кукурузы равна разнице кормовой эффективности кормовой композиции по настоящему изобретению и кормовой эффективности для контрольного животного, которому не скармливали данную кормовую композицию, деленной на кормовую эффективность для контрольного животного, которому не скармливали данную кормовую композицию, все из которых разделены на процентное включение кукурузы в кормовую композицию. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления повышение кормовой ценности кукурузы может составлять приблизительно 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25% и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах. В конкретных вариантах осуществления повышение кормовой ценности кукурузы составляет от приблизительно 1% до приблизительно 10% по сравнению с контролем. В иллюстративном варианте осуществления повышение пищевой ценности составляет приблизительно 5% по сравнению с контролем.

В дополнительных аспектах настоящего изобретения соотношение корм/прирост для животного снижается, необязательно, на приблизительно 0,005-0,1 по сравнению с контрольным животным, которому не скармливали данную кормовую композицию для животных. Эффективность использования кормов, также известная как "F:G", представляет собой потребление сухого вещества в день, деленное на среднесуточный прирост животного. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления снижение соотношения корм/прирост может составлять по меньшей мере приблизительно 0,005, 0,006, 0,007, 0,008, 0,009,0,01, 0,011, 0,012, 0,013, 0,014, 0,015, 0,016, 0,017, 0,018, 0,019, 0,02, 0,021, 0,022, 0,023, 0,024, 0,025, 0,026, 0,027, 0,028, 0,029, 0,03, 0,035, 0,04, 0,045, 0,05 и подобное значение или любой диапазон в указанных пределах. В конкретных вариантах осуществления снижение соотношения корм/прирост составляет от приблизительно 0,005, 0,01, или 0,015 до приблизительно 0,01, 0,015, 0,02, 0,025, 0,03, 0,035. 0,040, 0,045, 0,05, 0,055, 0,06, 0,065, 0,07, или 0,075, включая любую комбинацию нижнего и верхнего значений, при условии, что нижнее значение меньше верхнего значения, по сравнению с контролем.

В дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ повышения эффективности использования кормов для молокообразования молочным животным, при этом способ включает скармливание животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в количестве, эффективном для повышения эффективности использования кормов молочным животным. Эффективность использования кормов можно рассчитать как количество (фунтов) молока, полученного с головы в день, деленное на количество корма, потребляемого в расчете на сухое вещество. В вариантах осуществления эффективность молокообразования увеличивается на по меньшей мере приблизительно 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 или 0,1. В дополнительных вариантах осуществления эффективность молокообразования увеличивается на от приблизительно 0,01 до приблизительно 0,01, 0,125, 0,015 или 0,2; от приблизительно 0,02 до приблизительно 0,01, 0,0125, 0,015 или 0,2; от приблизительно 0,03 до приблизительно 0,01, 0,0125, 0,015 или 0,2; от приблизительно 0,04 до приблизительно 0,01, 0,0125, 0,015 или 0,2; или от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,01, 0,0125, 0,015 или 0,2.

В некоторых вариантах осуществления животному скармливают от приблизительно 1 фунта до приблизительно 30 фунтов кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в пересчете на одно животное в день. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления животному скармливают приблизительно 1 фунт, 2 фунта, 3 фунта, 4 фунта, 5 фунтов, 6 фунтов, 7 фунтов, 8 фунтов, 9 фунтов, 10 фунтов, 11 фунтов, 12 фунтов, 13 фунтов, 14 фунтов, 15 фунтов, 16 фунтов, 17 фунтов, 18 фунтов, 19 фунтов, 20 фунтов, 21 фунт, 22 фунта, 23 фунта, 24 фунта, 25 фунтов, 26 фунтов, 27 фунтов, 28 фунтов, 29 фунтов, 30 фунтов кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в пересчете на одно животное в день и подобное значение и/или любой диапазон в указанных пределах. В некоторых вариантах осуществления животному скармливают от приблизительно 9 фунтов до приблизительно 21 фунта кормовой композиции для животных по настоящему изобретению в пересчете на одно животное в день. В некоторых вариантах осуществления животному можно скармливать кормовую композицию для животных по настоящему изобретению ad libitum, или от приблизительно одного раза до приблизительно трех раз в день (например, 1, 2, 3), или в любой их комбинации.

Кормовую композицию для животных по настоящему изобретению можно скармливать любому животному, например сельскохозяйственному животному, зоопарковому животному, лабораторному животному и/или домашнему животному. В вариантах осуществления животное является жвачным животным. В некоторых вариантах осуществления животное может представлять собой без ограничения крупный рогатый скот (например, домашний крупный рогатый скот, в том числе Bos taurus и/или В. indicus, [например, молочный и/или мясной скот], бизон, буйвол), лошадиных (например, лошадь, осел, зебра и т.п.), птичьих (например, курица, куропатка, индейка, утка и т.п.; например, домашняя птица), овцу, козу, антилопу, свиньих (например, свинья), собачьих, кошачьих, грызунов (например, мышь, крыса, морская свинка); кролика, рыбу и т.п. Домашний крупный рогатый скот включает телят, бычков, телок и/или коров. В вариантах осуществления домашний крупный рогатый скот, выращиваемый на мясо, представляет собой кастрированного бычка и/или телку (например, на откормочной площадке). В вариантах осуществления домашний крупный рогатый скот, выращиваемый на мясо, представляет собой растущего теленка после отъема (например, молодняк или теленка мясной породы на доращивании и откорме), необязательно выращиваемого для перевода на откормочную площадку для завершающего откорма скота. Домашние молочные животные включают коров и/или коз. В некоторых вариантах осуществления животное может представлять собой домашнюю птицу. В других вариантах осуществления животное может представлять собой курицу. В дополнительных вариантах осуществления животное может представлять собой домашнюю свинью. В еще одних вариантах осуществления животное может представлять собой свинью.

В соответствии со способами по настоящему изобретению для увеличения привеса и/или эффективности использования кормов животного, выращиваемого для производства мяса, животному можно скармливать кормовую композицию для животных по настоящему изобретению в течение любого подходящего времени для достижения необходимого результата. В вариантах осуществления животному скармливают композицию по настоящему изобретению в течение по меньшей мере от приблизительно 15, 30, 45, 60 или 90 дней до приблизительно 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 или 300 дней и любого диапазона в указанных пределах, при условии, что нижнее значение меньше верхнего значения. В некоторых вариантах осуществления животному скармливают корм для животных по настоящему изобретению в течение периода от приблизительно 30 дней до приблизительно 275 дней, от приблизительно 45 дней до приблизительно 250 дней, от приблизительно 60 дней до приблизительно 225 дней, от приблизительно 75 дней до приблизительно 200 дней, от приблизительно 100 дней до приблизительно 275 дней, от приблизительно 125 дней до приблизительно 250 дней, от приблизительно 150 дней до приблизительно 225 дней, от приблизительно 180 дней до приблизительно 200 дней и т.п.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления животному скармливают кормовую композицию для животных по настоящему изобретению в течение по меньшей мере приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, ПО, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 или более дней и подобного значения и/или любого диапазона в указанных пределах.

В случае мясного скота животному можно скармливать кормовую композицию для животных на стадии выращивания молодняка и/или завершающего откорма скота (на откормочной площадке).

В дополнительных вариантах осуществления в настоящем изобретении предусматривается способ увеличения количества (например, измеряемого как объем или вес) молока, вырабатываемого молочным животным (например, коровой, козой и т.п.), включающий скармливание молочному животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению. В вариантах осуществления количество молока, вырабатываемого молочным животным, увеличивается на от приблизительно 1, 2, 3, 4 или 5% до приблизительно 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150 или 200% (включая диапазоны, охватываемые любой комбинацией нижнего значения и верхнего значения) по сравнению с количеством молока, вырабатываемого контрольным животным, которому не предоставлена кормовая композиция для животных по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления количество молока, вырабатываемого животным, увеличивается на от приблизительно 1% до приблизительно 50%, от приблизительно 2% до приблизительно 50%, от приблизительно 1% до приблизительно 25%, от приблизительно 2% до приблизительно 25%, от приблизительно 1% до приблизительно 15%, от приблизительно 2% до приблизительно 15%, от приблизительно 1% до приблизительно 10%, от приблизительно 2% до приблизительно 10% и т.п. В дополнительных вариантах осуществления количество молока, вырабатываемого животным, увеличивается на по меньшей мере приблизительно 1%, 2% 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 100%, 105%, 110%, 115%, 120%, 125%, 130%, 135%, 140%, 145%, 150%, 155%, 160%, 165%, 170%, 175%, 180%, 185%, 190%, 195% и/или 200% по сравнению с контрольным животным, которому не скармливали кормовую композицию для животных по настоящему изобретению. Увеличение молокообразования можно измерить за любой подходящий период времени, например на ежедневной основе (например 24 часа), приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа, еженедельно, ежемесячно или даже общее молокообразование в течение всего цикла лактации.

В соответствии со способами по настоящему изобретению для увеличения молокообразования и/или эффективности использования кормов молочного животного, животному можно скармливать кормовую композицию для животных по настоящему изобретению в течение любого подходящего времени для достижения необходимого результата. В вариантах осуществления животному скармливают композицию по настоящему изобретению в течение по меньшей мере от приблизительно 15, 30, 45, 60 или 90 дней до приблизительно 30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 или 300 дней и любого диапазона в указанных пределах, при условии, что нижнее значение меньше верхнего значения. В некоторых вариантах осуществления животному скармливают корм для животных по настоящему изобретению в течение периода от приблизительно 30 дней до приблизительно 275 дней, от приблизительно 45 дней до приблизительно 250 дней, от приблизительно 60 дней до приблизительно 225 дней, от приблизительно 75 дней до приблизительно 200 дней и т.п.

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления молочному животному скармливают кормовую композицию для животных по настоящему изобретению в течение по меньшей мере приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, ПО, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300 или более дней и подобного значения и/или любого диапазона в указанных пределах.

Кроме того, молочным животным можно скармливать кормовую композицию для животных в течение сухостойного периода (например, во время беременности, необязательно, по меньшей мере в последние 2, 3, 4, 6 или 8 недель беременности) и/или в течение периода лактации.

В настоящем изобретении также предусматриваются способы лечения, предупреждения и/или снижения возникновения, продолжительности и/или тяжести микробной или грибковой инфекции у животного. В вариантах осуществления животное представляет собой жвачное животное (например, особь крупного рогатого скота, которая описана выше, включая мясной скот и молочных коров). В вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию, вызванную бактерий организмом, организмом дрожжей и/или простейших. В вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию кишечника (например, задней кишки). В вариантах осуществления инфекция представляет собой инфекцию, вызванную видами Clostridium, например С. perfringens, необязательно С. perfringens типа А. Не ограничиваясь какой-либо теорией настоящего изобретения, из уровня техники известно, что непереваренный крахмал в кишечнике, в частности в задней кишке, может привести к микробной инфекции. Следовательно, улучшенная перевариваемость крахмала в кормах для животных по настоящему изобретению может быть выгодной для лечения, предупреждения и/или снижения вероятности возникновения, продолжительности и/или тяжести микробных инфекций.

Термины "увеличивать", "увеличивающий", "увеличенный", "усилить", "усиленный", "усиливающий" и "усиление" (и их грамматические вариации), используемые в данном документе, описывают увеличение указанного параметра при скармливании животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению, где указанный параметр повышен по сравнению с животным, которому не скармливают кормовую композицию для животных по настоящему изобретению (т.е. контроль), например, скармливают стандартный корм, который не содержит экзогенную альфа-амилазу.

Используемые в данном документе термины "уменьшать", "уменьшенный", "уменьшающий", "уменьшение", "сокращать", "подавлять" и "снижать" (и их грамматические вариации) описывают, например, уменьшение или снижение указанного параметра при скармливании животному кормовой композиции для животных по настоящему изобретению, где указанный параметр ниже по сравнению с подходящим контрольным животным (например, контрольным животным, которому не скармливают кормовую композицию для животных, содержащую экзогенную альфа-амилазу).

Настоящее изобретение более конкретно описано в следующих примерах, которые предназначены только для иллюстрации, поскольку для специалистов в данной области будут очевидны их многочисленные модификации и вариации.

ПРИМЕР 1

Исследования завершающего откорма мясного скота

Эксперимент 1

Триста кроссбредных быков (исходный BW=658±36 фунтов) использовали в испытании на откормочной площадке для завершающего откорма на откормочной площадке в сельскохозяйственном научно-исследовательском центре (ARDC) UNL возле Мида, штат Небраска, США. Крупному рогатому скоту скармливали пищевой рацион в ограниченном количестве, составляющем 2% от BW, который состоял из 32% влажной кукурузной барды с растворимыми веществами, 32% люцернового сена, 32% кукурузы сухого плющения и 4% добавки (исходя из DM), в течение пяти дней перед началом эксперимента. В 0 и 1 дни регистрировали значения исходного веса в пределах двух дней, которые усредняли и использовали в качестве исходного BW. Быков разделяли на блоки по BW в блоки с легким, средним и тяжелым BW (n=3, 2 и 1 повторности на загон, соответственно), стратифицировали по BW, и распределяли случайным образом в один из 30 загонов, при этом к загонам случайным образом распределяли одну из пяти диетологических обработок. Насчитывалось 10 голов/загон и 6 повторностей/обработка. Диетологические обработки предусматривали 1) коммерческий источник кукурузы (CON), 2) тестируемую кукурузу Enogen® (SYN), 3) смесь 50:50 CON и SYN, 4) CON с влажным кормом на основе кукурузной клейковины (CON-SB) и 5) SYN с влажным кормом на основе кукурузной клейковины (SYN-SB) в схеме рандомизированных блоков (таблица 1). Быков адаптировали к пищевым рационам завершающего откорма в течение 21-дневного периода, при этом кукурузой замещали люцерновое сено, тогда как включение кукурузного силоса, влажной кукурузной барды с растворимыми веществами (WDGS) и добавки оставалось таким же во всех пищевых рационах. В пищевых рационах, содержащих влажный корм на основе кукурузной клейковины (Sweet Bran® (Cargill); SB), концентрация оставалась такой же во всех зерновых пищевых рационах для адаптации. Пищевые рационы составляли с удовлетворением или превосхождением требований NRC в отношении белка и минералов. Конечные пищевые рационы завершающего откорма обеспечивали ежедневно 360 мг/бык Rumensin® (30 г/тонна DM) и ежедневно 90 мг/бык Tylan® (9 г/тонна DM). Быкам имплантировали в 1-й день Revalor®-XS.

Всех быков собирали в коммерческой скотобойне (Greater Omaha Pack, Омаха, штат Небраска, США) на 173 день. Значения конечного живого BW собирали в день убоя и применяли 4% поправку на потерю веса для расчета убойного выхода. Корм, обеспечиваемый на 173 день, составлял 50% DMI предыдущего дня, и проводили взвешивание в 4:00 после полудня. Быков затем перевозили и содержали до убоя на следующий день. Вес парной туши и показатели печени регистрировали в день убоя. Толщину жира, область LM и степень мраморности согласно оценке USDA регистрировали через 48 ч. после охлаждения. Конечный BW, ADG и F:G рассчитывали с применением HCW, скорректированного к общему убойному выходу 63%.

Эксперимент 2

Двести сорок кроссбредных быков (исходный BW=634±34 фунта) использовали в испытании на откормочной площадке для завершающего откорма на откормочной площадке в Центре исследований и внедрения в Панхандле (PHREC) UNL возле Скотсблаффа, штат Небраска, США. Протоколы ограниченного кормления крупного рогатого скота и определения исходного BW являлись такими же как в эксп.1. Быков разделяли на блоки по BW в блоки с легким, средним и тяжелым BW, стратифицировали по BW, и распределяли случайным образом в один из 24 загонов, при этом к загонам случайным образом распределяли одну из четырех диетологические обработок. Насчитывалось 10 голов на загон и 6 повторностей на обработку. Диетологические обработки предусматривали: 1) CON, 2) SYN, 3) смесь и 4) CON с ферментом (Amaize; Alltech, Inc.), добавленным ежедневно к пищевому рациону при норме 5 г/бык (NZ; таблица 2). Процедуры ограниченного кормления, взвешивания, разделения на блоки, имлантирования и адаптации к зерну являлись такими же как в эксп.1. Быков в блоках с тяжелым, средним и легким BW собирали на коммерческой скотобойне (Cargill Meat Solutions, Форт Морган, штат Колорадо, США) на 148, 169 и 181 дни (соответственно). В последний день быков удерживали от корма и взвешивали в 8:00 до полудня перед перевозкой и убоем в тот же день. Данные анализировали по схеме рандомизированных блоков с блоком исходного BW в качестве фиксированного результата и загоном в качестве экспериментальной единицы.

ЭКСПЕРИМЕНТ 3

Испытание в отношении завершающего откорма длительностью 173 дня проводили с использованием некоторого количества кроссбредных быков (исходный BW (вес тела)=685±46 фунтов) по схеме рандомизированных блоков. Быкам скармливали пищевой рацион в ограниченном количестве, составляющем 2% от BW, который состоял из 47,5% люцернового сена, 47,5% влажного корма на основе кукурузной клейковины и 5% добавки (исходя из DM (сухое вещество)), в течение пяти дней перед началом эксперимента. На 0 и 1 дни регистрировали значения исходного веса в пределах двух дней и усредняли для определения исходного BW. Наряду с измерением исходного BW в 1 день, быкам имплантировали Revalor®-XS. Быков разделяли на блоки по BW в блоки с легким и тяжелым BW, стратифицировали по BW и распределяли случайным образом в загон. В загоны затем случайным образом распределяли диетологические обработки с количеством 8 голов/загон и 6 повторностей/обработка.

Диетологические обработки (таблица 6) согласовывали с факторами, в том числе тестируемой кукурузой или контролем (Enogen® или отличная от Enogen®) и типом сопутствующего продукта (MDGS (разновидности модифицированной зерновой барды с растворимыми веществами) или Sweet Bran). Сопутствующие продукты, используемые в этом испытании, обеспечивали либо в качестве источника белка (18% MDGS), либо в качестве средств контроля ацидоза (35% SB (Sweet Bran® (Cargill))). Быков адаптировали к пищевым рационам завершающего откорма в течение 21-дневного периода, при этом кукурузой замещали люцерновое сено, тогда как включение соргового силоса, Sweet Bran или MDGS и добавки оставалось таким же во всех пищевых рационах. Пищевые рационы составляли с удовлетворением или превосхождением требований NRC в отношении белка и минералов. Конечный пищевой рацион завершающего откорма обеспечивал ежедневно 330 мг/бык Rumensin® (30 г/тонна DM) и ежедневно 90 мг/бык Tylan® (8,18 г/тонна DM).

Всех быков собирали на 174 день на коммерческой скотобойне (Greater Omaha Pack, Омаха, штат Небраска, США). Корм, обеспечиваемый на 173 день, составлял 50% DMI предыдущего дня, и проводили взвешивание в 4:00 после полудня. Быков затем перевозили в коммерческую скотобойню и содержали до убоя на следующий день. Значения веса парной туши и показатели печени регистрировали в день убоя, при этом характеристики туши, такие как толщина жира на 12-ом ребре, область LM и степень мраморности согласно оценке USD А, регистрировали через 48 ч. после охлаждения. Оценку выхода рассчитывали с применением уравнения для YG согласно USDA [YG=2,5+2,5 (толщина жира, дюйм) - 0,32 (область LM, дюйм²)+0,2 (жир КРН, %)+0,0038 (HCW, фунт)]. Конечный BW, ADG (среднесуточный прирост) и G:F (соотношение прироста к корму) рассчитывали с применением HCW (вес парной туши), скорректированного к общему убойному выходу 63%.

ПРИМЕР 2

Дополнительные исследования завершающего откорма с применением кормовой кукурузы Enogen®

Два эксперимента по завершающему откорму проводили для оценки кормовой кукурузы Enogen® (EFC), содержащей признак фермента альфа-амилазы, по сравнению с контрольной кукурузой ближайшей отрицательной изолинии в двух локациях по показателям продуктивности и физиологического состояния крупного рогатого скота и характеристикам туши.

Условия эксперимента

Триста кроссбредных быков (исходный вес [BW] = 703±43 фунта) использовали в испытании завершающего откорма на откормочной площадке в Центре по исследованиям и распространению в Восточной Небраске (ENREC) в университете Небраски в Линкольн (UNL) возле Мида, штат Небраска, США. Всю кукурузу (семена EFC и исходной контрольной кукурузы ближайшей отрицательной изолинии [NEG] от Syngenta Seeds, LLC) выращивали в течение лета в ENREC, собирали в ноябре и перерабатывали в виде кукурузы сухого плющения (DRC) во время скармливания. Крупному рогатому скоту скармливали пищевой рацион в ограниченном количестве, составляющем 2% от BW в течение 5 дней перед началом эксперимента. На 0 и 1 дни регистрировали значения исходного веса в пределах двух дней, которые усредняли и использовали в качестве исходного BW. Быков разделяли на блоки по BW в два блока с легким и тяжелым весом (n=10 и 5 повторностей на загон, соответственно) на основании BW 0 дня, стратифицировали по BW в блок и распределяли случайным образом в 1 из 30 загонов. Загону случайным образом присваивали обработку. Насчитывалось 10 быков/загон и 15 повторностей/обработка.

Диетологические обработки предусматривали 1) EFC и 2) исходный контроль ближайшей отрицательной изолинии (NEG; таблица 9). Быков адаптировали к пищевым рационам завершающего откорма в течение 21-дневного периода, при этом кукурузой замещали люцерновое сено, тогда как включение кукурузного силоса, модифицированной зерновой барды с растворимыми веществами (MDGS) и добавки оставалось таким же во всех пищевых рационах. Пищевые рационы составляли с удовлетворением или превосхождением требований NRC в отношении белка и минералов. Конечный пищевой рацион завершающего откорма обеспечивал ежедневно 330 мг/бык Rumensin® (30 г/тонна сухого вещества [DM]; Elanco Animal Health, Гринфилд, штат Индиана, США) и ежедневно 90 мг/бык Tylan® (8,2 г/тонна DM; Elanco Animal Health, Гринфилд, штат Индиана, США). Быкам имплантировали Component® IS (Elanco Animal Health, Гринфилд, штат Индиана, США) на 22 день и Component® S (Elanco Animal Health, Гринфилд, штат Индиана, США) на 92 день.

На 169 день обеспечиваемый корм составлял 50% от потребления сухого вещества (DMI) в предыдущий день, и быков взвешивали в 15:00 для определения конечного живого BW. К конечному живому BW применяли 4% поправку на потерю веса для расчета убойного выхода. Всех быков собирали на 170 день на коммерческой скотобойне (Greater Omaha Pack, Омаха, штат Небраска, США) и значения веса мяса парной туши (HCW) и показатели печени регистрировали в день убоя. Толщину жира, область длиннейшей мышцы (LM) и степень мраморности согласно оценке USDA регистрировали через 48 ч. после охлаждения. Оценку выхода (YG) рассчитывали с применением уравнения USDA для YG [YG = 2,5+2,5 (толщина жира, дюйм) - 0,32 (область LM, дюйм²) + 0,2 (околопочечный, тазовый и околосердечный [КРН] жир, %) + 0,0038 (HCW, фунт)]. Конечный BW, среднесуточный прирост (ADG) и соотношение корм: прирост (F:G) рассчитывали с применением HCW, скорректированного к общему убойному выходу 63%.

Во втором исследовании триста кроссбредных быков (исходный BW=624±34 фунта) использовали в испытании завершающего откорма на откормочной площадке в Центре исследований и внедрения в Панхандле (PREC) UNL возле Скотсблаффа, штат Небраска, США. Всю использованную кукурузу выращивали в ENREC и отправляли в PREC во время испытания. Протоколы определения исходного BW, разделения на блоки по BW, назначенная обработка, количество быков на загон и повторностей на обработку были такими же, как описано выше в ENREC. Быков адаптировали к пищевым рационам завершающего откорма в течение 21-дневного периода, при этом кукурузой замещали люцерновое сено, тогда как включение кукурузного силоса, влажной зерновой барды с растворимыми веществами (WDGS) и добавки оставалось таким же во всех пищевых рационах. Диетологические обработки были такими же, как в ENREC, за исключением WDGS вместо MDGS и включения добавки в количестве 6% вместо 4% от DM пищевого рациона. Быкам имплантировали Component® IS (Elanco Animal Health, Гринфилд, штат Индиана, США) на 1 день и Component® S (Elanco Animal Health, Гринфилд, штат Индиана, США) на 91 день. Быков собирали на коммерческой скотобойне (Cargill Meat Solutions, Форт Морган, штат Колорадо, США) на 181 день. Процедуры сбора данных о туше и расчеты были такими же, как описано выше.

В целом, в двух локациях использовали 600 быков, чтобы обеспечить в общей сложности 30 повторностей на обработку. Данные по показателям продуктивности и физиологического состояния и характеристикам туши анализировали с использованием процедуры MIXED из SAS (Кэри, штат Северная Каролина, США) по схеме обобщенных рандомизированных блоков с загоном в качестве экспериментальной единицы. Данные о частоте абсцесса печени проанализировали с использованием процедуры GLPMMIX из SAS (Кэри, штат Северная Каролина, США) с числом животных, пораженных абсцессами печени, деленным на общее число животных в загоне в качестве биномиальных переменных. Все типы влияния локации, обработки и локации х обработки включали в модель с блоком на основе BW в качестве независимой переменной. Если взаимосвязь локация × обработка не была значимой (Р≥0,05), обсуждали основные типы влияния и элемент взаимосвязи удаляли из модели.

Результаты

Не наблюдали никаких взаимосвязей обработки и локации (Р>0,30) для исходного BW, конечного BW, DMI, ADG, F:G и процентного содержания абсцессов в печени (данные не показаны). Не наблюдали значимых различий в конечном BW, DMI, ADG, F:G или процентном содержании абсцессов в печени для быков, которым скармливали EFC, по сравнению с NEG (Р≥0,17; таблица 10). Небольшое (на 2% из-за зерна) численное снижение (Р=0,17) F:G наблюдалось для быков, которым скармливали EFC, по сравнению с NEG. Влияние локации (Р≤0,03) наблюдали для конечного BW, DMI, ADG и F:G, при этом у быков, которым скармливали корм в PREC, имел место больший конечный BW, DMI, ADG и сниженное F:G по сравнению с ENREC (данные не показаны). Предыдущее исследование показало положительные результаты по продуктивности и физиологическому состоянию крупного рогатого скота у быков, которым скармливали EFC, переработанную в виде DRC. В целом, более высокий ADG и улучшение F:G отмечены у быков, которым скармливали EFC, по сравнению с коммерческой кукурузой или NEG (2016 Nebraska Beef Report pp. 135; 2016 Nebraska Beef Report 143).

Толщина шпика и рассчитанный YG были больше (Р<0,01 и Р=0,02, соответственно) для быков, которым скармливали EFC, по сравнению с NEG; однако область LM была немного больше (Р=0,02) для NEG. В предыдущем исследовании отмечено как увеличение толщины шпика (Р≤0,03) и рассчитанного YG (Р≤0,03; 2016 Nebraska Beef Report pp. 135), так и отсутствие различий (Р≤0,22 и Р≤0,17, соответственно; 2016 Nebraska Beef Report pp. 135; 2016 Nebraska Beef Report pp. 143) при скармливании быкам EFC. Никаких существенных различий при обработке не наблюдали в отношении HCW или степени мраморности (Р≥0,33). В предыдущем исследовании отмечены смешанные результаты в отношении степени мраморности у быков, которым скармливали SYT-EFC, по сравнению с коммерческой кукурузой или NEG, при этом наблюдалось либо увеличение (2016 Nebraska Beef Report pp. 135), либо отсутствие различий (2016 Nebraska Beef Report pp. 143).

Различия в ответе крупного рогатого скота между предыдущими и нынешними испытаниями могут быть связаны с условиями выращивания кукурузы, что приводит к эффекту года.

В заключение, в предыдущих испытаниях для завершающего откорма наблюдали снижение F:G, когда EFC скармливали в качестве основного источника кукурузного зерна в пищевом рационе. Однако результаты этого испытания позволяют предположить, что при скармливании гибрида кормовой кукурузы Enogen от Syngenta, содержащего признак фермента альфа-амилазы, значимых изменений в F:G нет, поскольку ответ был слишком мал, чтобы его можно было выявить. Изменение F:G составило лишь 1% благодаря пищевому рациону, который, как предполагается, составляет только 1,6% из-за кукурузного зерна (65% пищевого рациона, среднее между ENREC и PREC).

ПРИМЕР 3

Исследование завершающего откорма мясного скота с применением кормовой кукурузы Enogen® с высокой влажностью и сухого плющения

Исходная информация о крупном рогатом скоте

Все быки получены в виде отнятых телят в Центре по исследованиям и распространению в Восточной Небраске при университете Небраски возле Мида, штат Небраска, США. Телят получают за 3-4 недели и выпасают на кукурузных остатках, а перед экспериментом проводят фоновый осмотр, чтобы убедиться, что все телята здоровы. Обращение с животными и территория для этого эксперимента соответствуют Руководству по уходу и использованию сельскохозяйственных животных в сельскохозяйственных исследованиях и обучении (FASS, первое пересмотренное издание, январь 1999 г.). Все процедуры, изложенные в рамках данного исследования, соответствуют протоколам по уходу за животными Университета Небраски.

Схема и распределение

Быкам скармливают в ограниченном количестве из расчета 2% от веса тела (BW) пищевой рацион из 50% люцерны, 50% влажного корма на основе кукурузной клейковины (WCGF) в течение 5 дней перед взвешиванием. Показатели веса собирают у особей два дня подряд, чтобы свести к минимуму влияние наполнения кишечника и получить точный исходный вес тела.

В данном исследовании используют 336 быков (8 быков/загон). Быков случайным образом распределяют по загонам на основании веса в первый день. Критерии распределения на блоки можно использовать в зависимости от диапазона веса тела. Загонам случайным образом присваивают одну из 7 обработок, описанных ниже. Это исследование разработано как полностью рандомизированная схема (или схема рандомизированных блоков, если требуются критерии распределения на блоки) с 7 видами обработки, организованными в виде структуры факторного эксперимента по обработке 2x3+1. Загон является экспериментальной единицей, и имеют место 6 повторностей на обработку с простым воздействием, или в целом 42 загона с 7 видами обработки.

Пищевые рационы и скармливание

Состав пищевых рационов для обработки описан в таблице 11. Структура обработки организована как факторный эксперимент 2 х 3 с 1 дополнительной сравнительной обработкой. В структуре факторного эксперимента факторы включают в себя зерно с признаком экспрессии альфа-амилазы или без него и скармливание в виде соотношения кукурузы с высокой влажностью к кукурузе сухого плющения. Дополнительная обработка позволяет оценивать кормовую кукурузу Enogen® (EFC), скармливаемую в виде кукурузы сухого плющения (DRC), с контрольной кукурузой с высокой влажностью (НМС).

Все пищевые рационы содержат 20% разновидностей зерновой барды для обеспечения в пищевом рационе достаточного количества неразлагаемого в рубце белка (RUP) для удовлетворения потребностей в белке и соответствия типичному включению сопутствующего продукта в отрасли кормовой промышленности. Скармливают 5% сухой пищевой добавки с основными компонентами, такими как кальций, мочевина для разлагаемого в рубце белка, готовая смесь микроэлементов, готовая смесь витаминов ADE и Rumensin®/Tylan® на целевых уровнях. Носителем для пищевой добавки является тонко измельченная кукуруза. Пищевые рационы составлены таким образом, чтобы обеспечить сопоставимые значения Са и оптимальные соотношения Са:Р. Конечные пищевые рационы обеспечивают 30 г/тонна Monensin и 8,8 г/тонна Tylan® (исходя из сухого вещества [DM]). Быков кормят раз в день и пищевые рационы смешивают с использованием кормораздаточных грузовых автомобилей Roto-mix.

Данные о состоянии здоровья

Любой крупный рогатый скот, у которого наблюдаются симптомы общих заболеваний или расстройств, получает лечение в соответствии со стандартными операционными процедурами, установленными для Университета Небраски. С ветеринаром-консультантом консультируются в отношении наблюдаемых состояний, которые не подпадают под стандартные операционные процедуры по охране здоровья животных. Наблюдения за здоровьем животных подытожены в итоговом отчете.

Измерения

Крупный рогатый скот взвешивают два дня подряд в начале испытания, чтобы установить исходный вес тела. Быкам имплантировали с использованием стандартной программы имплантирования в зависимости от их размера и продолжительность кормления. Быков кормят примерно 145-160 дней.

Характерные признаки продуктивности и физиологического состояния включают потребление сухого вещества, среднесуточный прирост (с использованием исходного веса при ограниченном кормлении и скорректированного на тушу конечного веса), измерения веса тела, включая конечный живой вес, и характерные признаки туши. Характерными признаками туши, которые важны для сбора в день убоя, являются вес парной туши, оценка печени в отношении абсцессов и порядок забоя. После 48 часов охлаждения измеряют толщину шпика, область длиннейшей мышцы (LM), степень мраморности и рассчитанную оценку выхода. Меру рассчитанной оценки выхода определяют, исходя из 2% околопочечного, тазового и сердечного (КРН) жира.

ПРИМЕР 4

Характеристики продуктивности и физиологического состояния, а также туши крупного рогатого скота, которому скармливали пищевые рационы завершающего откорма, содержащие кормовую Enogen® в виде кукурузного зерна и/или кукурузного силоса

Исследование проводится в Центре исследований мясного скота Университета штата Канзас со приведенными ниже целями.

1. Оценить показатели роста (суточный прирост, потребление сухого вещества и кормовую эффективность) крупного рогатого скота при завершающем откорме, которому скрамливали пищевые рационы, содержащие комбинации силосного кормового материала и зерна, плющенного в хлопья, полученных из гибридов кукурузы с высокой экспрессией амилазы или без нее.

2. Оценить характеристики туши и частоту абсцесса печени крупного рогатого скота, которому скармливали пищевые рационы, содержащие комбинации силосного кормового материала и зерна, плющенного в хлопья, полученных из гибридов кукурузы с высокой экспрессией амилазы или без нее.

Схема эксперимента

Схема рандомизированных полных блоков с 4 видами обработки и 12 повторностями в виде структуры факторного эксперимента 2x2, а именно:

фактор 1: кукурузное зерно, полученное в виде хлопьев при воздействии пара из гибридов с высокой экспрессией амилазы или без нее;

фактор 2: кукурузный силос, полученный из гибридов кукурузы, при этом кукуруза характеризуется высокой активностью амилазы или нет.

Загон является экспериментальной единицей.

Методология исследования

Тестируемые животные: кроссбредный мясной скот со средним начальным весом тела от 750 до 900 фунтов. Группу из 960 исследуемых животных отбирали из популяции в примерно 1000 голов крупного рогатого скота.

Процедуры обработки до испытания. Используемые процедуры обработки до исследования являются типичными для проведения на месте исследования и обычно состоят из определения веса тела, идентификации с помощью ушных бирок с уникальными номерами, введения вакцин и бактеринов, введения паразитицидов для борьбы с внутренними и внешними паразитами и введения стероидного имплантата. Профилактика инъекционным антибиотиком может применяться по усмотрению клинического исследователя.

Кормление и поение. Животные номинально имеют доступ ad libitum к корму и кормятся один раз в день в течение всего исследования. Кормушки контролируют ежедневно для облегчения управления откормом, так что крупный рогатый скот номинально имеет доступ ad libitum к пищевому рациону, но при этом на следующий день в кормушках остается минимум непотребленного корма. Водопроводная вода доступна в течение всего исследования в автоматических поилках в загоне, которые распределяются между смежными загонами.

Состав пищевого рациона. Основные пищевые рационы перед испытанием состоят из смеси сена, кукурузного силоса, кукурузных хлопьев, полученных при воздействии пара, и добавки для обеспечения примерно равных пропорций концентрата и грубых кормов. Кукурузный силос состоит из материала, представляющего собой фураж, отличного от кормовой кукурузы Enogen® (EFC).

Во время фазы испытания компонент, представляющий собой фураж, пищевого рациона полностью состоит из кукурузного силоса. Начиная с 1 дня эксперимента, крупному рогатому скоту скармливают пищевые рационы с 50% концентрата и 50% грубых кормов (стадия 1), который скармливают в течение 5-дневного периода. Долю концентрата увеличивают поэтапно, так что каждый из последовательных пищевых рационов скармливают в течение 5 дней (стадии 2, 3 и 4). Конечный пищевой рацион завершающего откорма состоит из 10% кукурузного силоса в качестве источника грубых кормов, примерно 6-8% добавки и остатка в виде кукурузных хлопьев, и его скармливают на 21 день и до окончания испытания после 120-150 дней на откорме. Пищевые рационы составлены с содержанием 33 грамм/тонна моненсина, и в течение последних 28-42 дней откорм содержит 25 г/тонна рактопамина. Кукурузные хлопья, полученные при воздействии пара, обрабатывают ежедневно. Пищевые рационы готовят свежими ежедневно и доставляют каждое утро в кормушки. Зерно (товарное и EFC) и фураж (стандартный коммерческий гибрид или EFC) ежедневно включают непосредственно в общие смешанные рационы и тщательно перемешивают.

Способы сбора данных и переменные

Вес тела. Значения полного веса тела отдельных животных перед обработкой определяют на 1 день. Значения промежуточного веса тела (примерно на 28, 56, 84 и 112 дни) и конечный вес тела фиксируют для загонов животных.

Потребление корма. Экспериментальные пищевые рационы скармливают, начиная с 1 дня исследования, и продолжают до окончания исследования. Количество корма, доставляемого в каждый загон, регистрируют ежедневно. Избыток оставшегося корма удаляют в дни взвешивания и по мере необходимости для поддержания свежего корма в кормушках. Количество фуража, доставляемого в каждый загон, взвешивают.

Вес непотребленного корма, оставшегося в кормушках, измеряют по мере необходимости, но минимально в дни промежуточного взвешивания и в последний день исследования. Остатки корма также можно измерять в другое время на усмотрение клинического исследователя (например, загрязнение фекалиями, порча и т.д.). Процедуры определение содержания сухого вещества производят на составных образцах непотребленного корма через определенные промежутки времени. Подсчитывают общие значения количества корма, доставляемого (из расчета на готовый продукт) в каждый загон в течение определенного интервала времени.

Показатели роста. Среднесуточный прирост рассчитывают для каждого загона крупного рогатого скота. Регистрируют общее потребление сухого вещества для каждого загона, а эффективность прироста рассчитывают как ADG, деленное на суточное потребление животным сухого вещества корма. Значения потребления сухого вещества, значения интенсивности прироста и значения кормовой эффективности для каждого загона рассчитывают примерно с 28-дневными интервалами и на протяжении всего исследования.

Характеристики туши. В день сбора животных удаляют из загонов по группам, взвешивают с использованием групповых весов и загружают в грузовики для перевозки на коммерческую скотобойню. Туши идентифицируют по порядку сбора в скотобойне. Вес парной туши, частоту и тяжесть абсцессов печени регистрируют в день сбора. Через 24-48 часов замораживания регистрируют степень мраморности, область длиннейшей мышцы, толщину подкожного жира (12^е ребро), встречаемость говяжьей туши с темной окраской мяса на разрезе, оценку выхода по USDA и класс качества по USDA для каждой туши.

ПРИМЕР 5

Место и степень усвоения пищевых рационов, содержащих кукурузное зерно или кукурузу, полученную из гибрида кормовой кукурузы Enogen®

Цели

1) Сравнить место и степень усвоения сухого вещества, органического вещества, крахмала, нейтрально-детергентной клетчатки (NDF), кислотно-детергентной клетчатки (ADF), азота и липидов в пищевых рационах завершающего откорма, состоящих из кукурузы и кукурузного силоса; и

2) измерить степень разбавления жидкостью и синтез микробного белка в пищевых рационах для скармливания крупному рогатому скоту, состоящих из комбинаций кукурузного зерна и кукурузного силоса.

Способы исследования

Исследуемые животные. В исследовании используют 12 быков с несколькими канюлированиями (рубца, двенадцатиперстной кишки и подвздошной кишки) со средним весом тела примерно 500 фунтов. Быки снабжены канюлями рубца, двенадцатиперстной кишки (двойная L; 6 см позади сфинктера привратника) и подвздошной кишки (двойная L; 10 см перед подвздошно-слепокишечным соединением). Быков размещают в денниках, оборудованных индивидуальными кормушками и поилками.

Схема исследования. Эксперимент состоит из повторяющейся схемы латинского квадрата 4×4 со структурой факторного эксперимента по обработке 2×2. Факторы заключаются в 1) источнике зерна (отруби или кормовая кукуруза Enogen® (EFC)) и 2) источнике фуража (коммерческий гибрид, традиционно используемый для производства кукурузного силоса или гибрид EFC для силоса). Эксперимент состоит из четырех 15-дневных периодов, каждый из которых включает 10-дневный период адаптации и 5-дневный период сбора данных.

Экспериментальные пищевые рационы. Пищевые рационы смешивают ежедневно и предлагают быкам ad libitum примерно в 8:00 до полудня. Пищевые рационы содержат (исходя из сухого вещества) примерно 10% кукурузного силоса, 84% кукурузы и 6% добавки.

Сбор, обработка и анализ пищевого рациона, объедков, содержимого кишечника и фекалий.

Оксид хрома (10 г) ежедневно смешивают с отдельными пищевыми рационами с 4 по 13 день в качестве маркера для определения перевариваемости пищевого рациона. На 15 день 200 мл раствора, содержащего 3 г Co-EDTA, импульсно подают через канюлю в рубце в 8:00 утра для оценки скорости прохождения жидкости. С 11 по 14 день фиксированную долю ежедневных объедков дополнительно отбирают и компонуют по периодам. Образцы пищевых рационов собирают после смешивания с 10 по 13 день и компонуют по периодам из расчета равного веса. 15-й день каждого периода используют для сбора рубцовой жидкости для измерения рН, летучих жирных кислот (VFA) и скорости прохождения корма. Произвольно взятые образцы химуса двенадцатиперстной кишки (~ 300 мл) и подвздошной кишки (~ 200 мл) и фекалий (~ 300 г во влажном состоянии) собирают три раза в день с 11 по 14 день. Образцы собирают с 8-часовыми интервалами, при этом время сбора сдвигается на 2 часа каждый день, чтобы получить профиль, представляющий 24-часовой цикл после кормления. Образцы из двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и фекалий сразу замораживают при 4°С. Образцы содержимого кишечника и фекалий компонуют для каждого быка в конце каждого периода сбора. Образцы пищевого рациона, объедков и фекалий сушат в течение 4 дней при 55°С, выдерживают на воздухе и затем измельчают с использованием 1 мм сита (мельница Wiley №2, Arthur Н. Thomas Co., Филадельфия, штат Пенсильвания, США). Образцы содержимого кишечника лиофилизируют (Virtis Genesis, модель 35EL) перед измельчением через 1 мм сито в мельнице Wiley. Пищевой рацион, объедки, содержимое кишечника и фекалии анализируют на содержание сухого вещества (24 часа при 105°С), органического вещества (600°С в течение 2 часов), азота (анализатор азота LECO FP-2000; Сент-Джозеф, штат Мичиган, США), крахмала, свободной глюкозы (с использованием автоматического анализатора Technicon Autoanalyzer III) и хрома. Примерно 500 мл жидкости из рубца собирают один раз в день с 11 по 14 дни для оценки синтеза микробного белка в рубце. Образцы смешивают для удаления бактерий, связанных с частицами, и процеживают через 8 слоев марли перед тем, как заморозить при 4°С. Время сбора сдвигается на 6 часов каждый день, чтобы получить образец через каждые 6 часов в 24-часовом цикле. Микробные клетки рубца выделяют из содержимого рубца дифференциальным центрифугированием, лиофилизируют и анализируют на содержание сухого вещества, органического вещества и азота. Измеряют концентрацию цитозина в микробных клетках и образцах из двенадцатиперстной кишки. Долю содержимого двенадцатиперстной кишки микробного происхождения определяют путем деления количества проходящего цитозина двенадцатиперстной кишки на соотношение микробный цитозин : азот. Количество проходящего азота в корме рассчитывают путем вычитания общего количества проходящего азота из количества проходящего микробного азота, включая, таким образом, вклад эндогенного азота. Истинное органическое вещество, ферментированное в рубце, рассчитывают как потребление органического вещества минус общее количество органического вещества, достигающего двенадцатиперстной кишки, с поправкой на количество микробного органического вещества, достигающего двенадцатиперстной кишки. Образцы жидкости из рубца собирают в 08:00 на 15 день и затем через 2, 4, 6, 8, 12, 18 и 24 ч. после кормления. Жидкость из рубца пропускают через четыре слоя марли и анализируют на рН во время сбора образцов с использованием портативного рН-метра. Жидкость из рубца (8 мл) добавляют к 2 мл 25% (вес/объем) метафосфорной кислоты и замораживают для последующего анализа VFA и аммиака. Примерно 20 мл профильтрованной жидкости из рубца помещают в сцинтилляционные флаконы и замораживают для последующего анализа кобальта. Кобальт измеряют в жидкости из рубца после оттаивания и центрифугирования при 30000 × g в течение 20 минут с использованием атомно-адсорбционной спектрофотометрии. Образцы подкисленной жидкости из рубца оттаивают, центрифугируют при 30000 × g в течение 20 минут и анализируют на VFA с помощью газовой хроматографии (газовый хроматограф Agilent 7890а, оборудованный 15-метровой колонкой Nukol) и на NH₃ с использованием автоматического анализатора Technicon Autoanalyzer III (Bran and Luebbe, Эльмсфорд, штат Нью-Йорк, США).

Статистические анализы.

Данные о потреблении, количестве проходящих веществ и пищеварении анализируют, используя отдельное животное в качестве экспериментальной единицы, с помощью PROC MIXED из SAS. Модель включает эффекты источника зерна, плющенного в хлопья, источника силоса и взаимосвязь между источником зерна и источником силоса. Случайные эффекты включают быка и период. Данные по летучим жирным кислотам, NH₃ и рН анализируют как повторные измерения с использованием ковариационной структуры составной симметрии в PROC MIXED из SAS. Утверждение модели включает в себя эффекты источника зерна, плющенного в хлопья, источника силоса, часа и всех взаимосвязей. Случайное утверждение включает в себя эффекты быка и периода, а также бык × период × источник зерна × источник силоса. Повторное измерение определяется как час в пределах период × бык × источник зерна × источник силоса. Для определения скорости прохождения жидкости концентрации кобальта в 0, 2, 4, 6, 8, 12, 18 и 24 ч. преобразуют в натуральные логарифмы и регрессируют на время для отдельных быков с использованием процедуры REG из SAS. Угловые коэффициенты (оценки скоростей прохождения) анализируют с использованием процедуры MIXED из SAS, как описано ранее.

ПРИМЕР 6

Исследование молодняка мясного скота с использованием кормовой кукурузы Enogen®

Молодняк крупного рогатого скота (иногда называемый крупным рогатым скотом на доращивании и откорме) представляет собой животных, находящихся на промежуточной стадии между отъемом (обычно имеющим место при весе от 400 до 550 фунтов) и завершающим откормом на откормочной площадке. Этим животным традиционно скармливают пищевой рацион с высоким содержанием фуража, такой как пастбищный, хотя иногда также используют добавки.

Цель

Определить ответ растущего теленка на кормовую кукурузу Enogen®, содержащую признак фермента альфа-амилазы, при скармливании в виде цельнозерновой кукурузы (WC) или кукурузы сухого плющения (DRC).

Процедцры эксперимента

Четыреста двадцать шесть кроссбредных быков (средний вес 538 фунтов) перевозили из Лазбудди, штат Техас, США, в Подразделение по доращиванию и откорму крупного рогатого скота при Университете штата Канзас (KSU). Схему факторного эксперимента 2×2 использовали с двумя типами кукурузы (Enogen® против Yellow corn №2) и двумя уровнями обработки кукурузы (WC против DRC). Быкам скармливали общий смешанный рацион (TMR) раз в день в течение 76 дней с последующим 14-дневным периодом наполнения кишечника (всего 90 дней).

Четыре пищевые рациона для обработки составляли таким образом, чтобы обеспечить 51 Мкал NEg (чистая энергия для прироста)/100 фунтов. Элементы TMR приведены ниже в таблице 12.

Результаты

У быков оценивали исходный вес тела (BW), конечный BW, среднесуточный прирост (ADG), потребление сухого вещества (DMI) и соотношение корм : прирост (F:G). Результаты показаны в таблице 13 ниже.

Краткое описание

1. Конечный вес тела и ADG имели тенденцию к увеличению (р<0,10) у телят, которым скармливали кормовую кукурузу Enogen®.

2. DMI имело тенденцию к снижению (р<0,09) у телят, которым скармливали кормовую кукурузу Enogen®.

3. Кормовая эффективность (F:G) у телят, получавших кормовую кукурузу Enogen®, была улучшена на 5,5% (р<0,01).

ПРИМЕР 7

Комбинированный пищевой рацион из зерна кормовой кукурузы Enogen® и кормового силоса Enogen® у молодняка мясного скота

Целью данного исследования является сравнение кормовой кукурузы Enogen®, содержащей признак фермента альфа-амилазы (EFC), с исходной кукурузой изолинии без признака фермента альфа-амилазы (отрицательная изолиния) при скармливании кукурузного силоса и зерна кукурузы в отношении здоровья и продуктивности растущего молодняка мясного скота.

Относительная ценность EFC как источника энергии в виде силоса и/или зерна для вновь прибывшего и растущего мясного скота неизвестна. Пищевые рационы для выращивания мясного скота, как правило, состоят из большего количества грубых кормов и сопутствующих продуктов зерноперерабатывающей промышленности, при этом примерно одна треть потребления DM состоит из кукурузы или других зерновых в качестве источника энергии.

Схема эксперимента - методология исследования

Испытание начато в Подразделении по доращиванию и откорму крупного рогатого скота при Университете штата Канзас (KSU) (KSBSU) и включает 32 загона (8 для каждой обработки), содержащих каждый по 12-14 животных, и длится приблизительно 76 дней в дополнение к 14-дневному периоду выравнивания наполнения кишечника (всего 90 дней). Четыре пищевые рациона для обработки составляют таким образом, чтобы обеспечить 50 Мкал NEg/100 фунтов. Пищевые рационы построены сходным образом, следуя структуре факторного эксперимента по обработке 2×2 с факторами кукурузный силос +альфа-амилаза/ -альфа-амилаза и кукурузное зерно +альфа-амилаза/ -альфа-амилаза; таблица 14). Особей стратифицируют по весу в пределах их блока (каждая нагрузка) и случайным образом распределяют по загонам. Затем обработки случайным образом распределяют по загонам.

1) Описание животных

Примерно 400 кроссбредных самок мясного скота весом примерно 500 фунтов получают и транспортируют на коммерческом грузовике в Подразделение по доращиванию и откорму крупного рогатого скота KSU. По прибытии все животные подвергаются визуальному осмотру для оценки состояния здоровья, включая дыхательную, двигательную и пищеварительную системы. Любые животные, испытывающие проблемы со здоровьем, немедленно удаляются из исследования. Всех животных проверяют на статус относительно BVDV-PI. При положительном результате животное удаляют из исследования.

Профилактические медицинские требования

Приблизительно через 24 часа после прибытия крупный рогатый скот обрабатывают в соответствии со стандартными медицинскими протоколами, которые включают модифицированную живую вирусную вакцину (инфекционный ринотрахеит, вирус вирусной диареи крупного рогатого скота, парагрипп-3, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота), 7-направленную противоклостридийную вакцину и противопаразитарный препарат.

3) Идентификация животных

По прибытии всем исследуемым животным вводят уникальную подвесную ушную бирку с кнопочной биркой RFID.

4) Вода

Крупный рогатый скот всегда имеет свободный доступ к питьевой воде.

5) Рационы

Пищевые рационы составлены таким образом, чтобы соответствовать или превышать рекомендации для этого класса животных в соответствии с рекомендациями Национального научно-исследовательского совета по нормам питания для мясного скота (NRC, 7^е издание, 1996 г.). Пищевые рационы корректируют по мере необходимости для удовлетворения меняющихся потребностей в питательных веществах в течение 76-дневного периода исследования. Регистрируют состав пищевых рационов и все изменения в пищевых рационах.

6) Сбор образцов корма при подаче и из кормушек

Образцы корма при подаче и из кормушек собирают еженедельно и компонуют для анализа.

7) Адаптация и скармливание пищевого рациона

Телятам скармливают их соответствующие пищевые рационы для обработки один раз в день и регистрируют количество корма, доставленного при каждом кормлении в каждый загон.

8) Лечебные процедуры

Обученные сотрудники KSBSU отвечают за выявление клинически больных животных, перемещение их в зону лечения и проведение соответствующих видов лечения. Каждый загон осматривают по меньшей мере два раза в день для выявления клинически больных животных. Каждое животное, которое идентифицировано как больное, перемещают в зону лечения. Животных с клинической оценкой заболевания, большей 1, и ректальной температурой, более чем или равной 104°F, и более чем через 72 часа после прибытия лечат. Виды лечения проводят на основании протокола обычного лечения KSBSU, показанного ниже (таблица 15). После лечения животных возвращают в их исходный загон, и любое животное, получившее лечение три раза в отношении BRDC, определяется как "хроническое" и исключается из исследования.

9) Сбор данных по продуктивности и состоянию здоровья

Взвешивание крупного рогатого скота индивидуально по прибытии (день -1), начальной обработке (0 день), ревакцинации (14 день), на 48 день (произвольно взятый образец фекального крахмала) и в последний день испытания (90 день). Значения вес в загоне регистрируют еженедельно, если не запланировано индивидуальное взвешивание. Среднесуточный прирост и конверсию корма рассчитывают для каждого загона за пять периодов времени: от прибытия до 14 дня, до 21 дня, до 34 дня, до 48 дня, до 62 дня и до 76 дня. Кормушки ежедневно изучаются сотрудниками KSBSU и количество размещаемого корма основывается на оценке кормушек за тот день, отражая потребление корма с момента предыдущего кормления. Общее количество корма, выгруженного в каждый загон, регистрируют при каждом кормлении.

При необходимости рассчитывают заболеваемость, смертность, летальность заболевания, дату первого извлечения и частоту успеха первого противомикробного лечения. Заболеваемость рассчитывают как количество животных на обработку, получающих первое лечение BRDC, деленное на количество животных, включенных в обработку. Смертность рассчитывают как количество животных, умерших от BRDC на обработку, деленное на общее количество животных, включенных в обработку. Летальность заболевания рассчитывают для каждой обработки как количество смертей в результате BRDC, деленное на количество животных, получавших лечение BRDC по меньшей мере один раз. Дату первого извлечения рассчитывают с использованием даты извлечения животного по отношению к 0 дню испытания. Частоту успеха первого противомикробного лечения определяют путем деления количества животных, которых лечили от заболевания только один раз, на общее количество животных, которых лечили от заболевания на начальном этапе.

10) Физические измерения окружающей среды

Данные о погоде, включая осадки, скорость и направление ветра, относительную влажность и температуру, собираются метеостанцией (метеостанция с пятью параметрами Storm3 Waterlogger, Stevens Water Monitoring Systems, Inc.) в течение 56-дневного исследовательского периода.

11) Анализ данных

Данные анализируют для оценки различий в показателях продуктивности и состояния здоровья между четырьмя диетологическими обработками. Соотношение уровней заболеваемости, смертности и летальности заболевания при обработке анализируют с использованием моделей логистической регрессии.

Схема эксперимента - Исследование потребления и перевариваемости

Испытание проводят в Подразделении по доращиванию и откорму крупного рогатого скота при Университете штата Канзас (KSBSU) одновременно с исследованием продуктивности, описанным выше. Четыре кроссбредных быка мясной породы весом 450-500 фунтов используют для проведения исследования потребления и перевариваемости (Wang et al., 2016. J. Anim. Sci. 94-1159-1169). Быков индивидуально размещали на открытом воздухе. Используя аналогичные перечисленным выше пищевые рационы для обработки, по одному быку из в общей сложности 4 быков случайным образом распределяют на каждую обработку.

1) Схема латинского квадрата

Четыре кроссбредных быка мясной породы используют для определения перевариваемости тестируемых пищевых рационов in vivo. Исследование длится 60 дней с четырьмя 15-дневными периодами для выполнения схемы латинского квадрата. Каждый период состоит из 10-дневного периода адаптации, 4 дней сбора образцов фекалий и 1 дня сбора образцов содержимого рубца.

2) Образцы содержимого рубца

Образцы содержимого рубца отбирают в конце каждого периода для определения перевариваемости пищевых рационов для обработки. Образцы также анализируют на долю маркера для определения степени разбавления жидкостью. Концентрации ацетата, пропионата, бутирата и лактата анализируют и рассчитывают.

3) Образцы фекалий

Установленные во времени произвольно взятые образцы фекалий анализируют для определения концентрации присутствующего маркера.

4) Анализы in vitro

Ферментацию in vitro используют для определения перевариваемости сухого вещества in vitro (IVDMD), перевариваемости органического вещества in vitro (IVOMD) и выработки газа, связанных с четырьмя пищевыми рационами для обработки.

ПРИМЕР 8

Влияние силоса или зерна кормовой кукурузы Enogen® на продуктивность и перевариваемость у растущего мясного скота

Цель. Оценить зерно кормовой кукурузы Enogen® (EFC) в пищевых рационах для молодняка, содержащих 40% кукурузного зерна, и оценить кукурузный силос EFC (с эквивалентным зерном при условии, что силос содержит 50% зерна в расчете на сухое вещество [DM]).

Процедуры эксперимента

Силос. Орошаемую кукурузу, выращенную в Центре по исследованиям и распространению в Восточной Небраске при университете Небраски, используют для сбора силоса и сухого зерна. Сбор силоса проводили при 37-38% DM или примерно 3/4 молочной линии. Каждую загрузку силоса взвешивали при доставке и отбирали образцы для определния исходного содержания DM. В ходе получения силос еженедельно отбирают по месту выработки для анализа содержания DM. Образцы сохраняют каждую неделю для последующего определения содержания питательных веществ, рН и органических кислот в месячных композитах. Весь материал, извлеченный для кормления, взвешивают как есть, и еженедельные процентные доли DM используют для расчета скармливаемого количества DM. Зерно производили согласно протоколам для контроля происхождения и хранили в виде цельного зерна в отдельных резервуарах. При необходимости зерно доставляют и перерабатывают в виде кукурузы сухого плющения с контролем происхождения.

Исследование по выращиванию

Исходная информация о крупном рогатом скоте. Все быки получены в виде отнятых телят в Центре по исследованиям и распространению в Восточной Небраске при университете Небраски возле Мида, штат Небраска, США. Телят получают за 3-4 недели до эксперимента, чтобы убедиться, что все телята здоровы. Телят можно выращивать в течение зимы до эксперимента, чтобы обеспечить здоровье и готовность. Обращение с животными и территория для этого эксперимента соответствуют Руководству по уходу и использованию сельскохозяйственных животных в сельскохозяйственных исследованиях и обучении (FASS, первое пересмотренное издание, январь 1999 г.). Все процедуры, изложенные в рамках данного исследования, согласуются с Комитетом по уходу за животными Университета Небраски.

Схема и распределение

Быкам скармливают в ограниченном количестве из расчета 2% от веса тела (BW) пищевой рацион из 50% люцерны, 50% влажного корма на основе кукурузной клейковины (WCGF) в течение 5 дней перед взвешиванием. Показатели веса собирают у особей два дня подряд, чтобы свести к минимуму влияние наполнения кишечника и получить точный исходный вес тела.

В данном исследовании используют 576 быков (12 быков/загон). Быков случайным образом распределяют по загонам на основании веса в первый день. Критерии распределения на блоки можно использовать в зависимости от диапазона веса тела. Загонам случайным образом присваивают одну из 6 обработок, описанных ниже. Это исследование разработано как полностью рандомизированная схема (или схема рандомизированных блоков, если требуются критерии распределения на блоки) с 6 видами обработки, организованными в виде структуры факторного эксперимента по обработке 2×2+2. Загон является экспериментальной единицей, и имеют место 8 повторностей на обработку с простым воздействием, или в целом 48 загона с 6 видами обработки.

Пищевые рационы и скармливание

Состав пищевых рационов для обработки описан в таблице 16. Структура обработки организована как факторный эксперимент 2×2 с 2 дополнительными сравнительными обработками. В структуре факторного эксперимента факторы включают силос с признаком экспрессии альфа-амилазы Enogen® (EFC) или без него и с обработанным ядром (2 мм) или нет.Дополнительные 2 обработки позволяют оценить кукурузное зерно, используемое в пищевых рационах для молодняка с фуражом. Включение 40% зерна идентично включению 40% зерна, когда скармливают 80% кукурузного силоса, при условии, что в кукурузном силосе 50% кукурузного зерна и 50%) фуража.

Все пищевые рационы содержат 15% разновидностей зерновой барды для обеспечения в пищевом рационе достаточного количества неразлагаемого в рубце белка (RUP) для удовлетворения потребностей в белке и 5% сухой пищевой добавки. Основными компонентами в пищевой добавке являются кальций, мочевина для разлагаемого в рубце белка, готовая смесь микроэлементов, готовая смесь витаминов ADE и Rumensin® на целевых уровнях. Носителем для пищевой добавки является тонко измельченная кукуруза. Пищевые рационы составлены таким образом, чтобы обеспечить сопоставимые значения Са и оптимальные соотношения Са:Р. Конечные пищевые рационы обеспечивают 200 мг/бык в день Monensin. Быков кормят раз в день и пищевые рационы смешивают с использованием кормораздаточных грузовых автомобилей Roto-mix.

Измерения

Крупный рогатый скот взвешивают два дня подряд в начале испытания и два дня подряд примерно на 84 день для определения конечного живого BW. Быкам скармливают в ограниченном количестве из расчета 2% от веса тела одинаковые пищевые рационы для сбора исходного и конечного значений веса тела для выравнивания наполнения кишечника по крупному рогатому скоту и видам обработки.

Показатели продуктивности включают потребление сухого вещества, среднесуточный прирост (с использованием исходного веса при вскармливании в ограниченном количестве и конечного веса тела) и кормовую эффективность.

ПРИМЕР 9

Исследование качества силоса кормовой Enogen®

Провели исследования по оценке ряда параметров качества силоса относительно силоса кормовой Enogen® по сравнению со стандартным кукурузным силосом, не содержащим признака альфа-амилазы. Силос, полученный из кукурузы Enogen® от Syngenta, содержащей признак альфа-амилазы, обладает рядом улучшенных свойств по сравнению с контрольным силосом, полученным из гибридов Golden Harvest (GH)/NK (аналогичный генетический фон) или конкурентных гибридов кукурузы. Дискриминантный анализ показал, что пищевые характеристики силоса кормовой Enogen® можно отличить от контролей, исходя из наличия признака альфа-амилазы, а не по генетическому фону (данные не показаны).

Силос получали из целых растений кукурузы, срезанных приблизительно на 6 дюймов над землей; затем материал измельчали и образцы малого размера собирали в мешки и герметично закрывали. Образцы оставляли для ферментации в течение 60-75 дней до анализа. Некоторые образцы исключили из-за того, что они были слишком сухими при сборе, или из-за неспособности к эффективной ферментации. Итоговое количество образцов, включенных в анализ, составило: 165 образцов силоса кормовой Enogen®, 160 образцов GH/NK, отличных от Enogen®, и 105 образцов конкурентных гибридов без признака альфа-амилазы.

Спектроскопию в ближней инфракрасной области (NIR) использовали для оценки ряда пищевых характеристик силоса. Характеристики крахмала и Сахаров также оценивали с использованием химического анализа и перевариваемость крахмала in situ в рубце определяли путем измерения исчезновения крахмала из образцов силоса при инкубировании в пористом пакете в рубце в течение 7 часов.

По данным NIR не было значимых различий в концентрациях белка, жира, лигнина, золы, молочной кислоты или уксусной кислоты или в рН силоса, полученного из кормовой кукурузы Enogen®, по сравнению с силосом из GH/NK, отличной от Enogen®, или конкурентных гибридов кукурузы, у которых отсутствует признак альфа-амилазы (данные не показаны).

Значимые различия выявили в характеристиках крахмала и Сахаров в силосе кормовой Enogen® по сравнению с кукурузным силосом, не содержащим признака альфа-амилазы. Двумя важными факторами, влияющими на доступность крахмала для животного, являются размер частиц и перевариваемость. Как показано на фигуре 1, при химическом анализе уровни общего крахмала в силосе кормовой Enogen® и силосе, отличном от Enogen®, были одинаковыми. Однако силос кормовой Enogen® характеризовался более высоким уровнем (увеличение на 199,5%) крахмала в виде мелких частиц (определяемым по диффузии через поры 50 мкм), который может быстрее стать доступным в рубце и, следовательно, может оперативнее обеспечить доступную энергию. Кроме того, наблюдали увеличение на 14% переваривания крахмала в рубце через 7 часов in situ (isSD7), что свидетельствует о лучшей перевариваемости доступного крахмала из силоса кормовой Enogen®.

Сахар является еще одним источником быстро доступной энергии для животного. Силос имеет тенденцию к относительно низким естественным концентрациям сахара, но, как показано на фигуре 2, силос кормовой Enogen® характеризовался значительно более высоким уровнем (201%) общих Сахаров, определяемых способами аналитической химии, по сравнению с традиционным кукурузным силосом без признака альфа-амилазы, с потенциалом более доступной энергии для животного и микробов рубца. Уровни растворимых в этаноле углеводов (ESC) и водорастворимых углеводов (WSC), определенные с помощью NIR, были значительно выше в силосе кормовой Enogen® по сравнению с силосом GH/NK или силосом из конкурентного гибрида, не имеющего признака альфа-амилазы. Кроме того, общие сахара (глюкоза, фруктоза, сахароза, лактоза и маннит), измеренные с помощью химического анализа, показали ту же картину.

Характеристики клетчатки силоса также определяли с помощью NIR. Перевариваемость клетчатки положительно коррелирует с потреблением сухого вещества, поскольку более перевариваемая клетчатка меньше наполняет животное в результате более быстрого прохождения через рубец. Животное тогда имеет возможность потреблять больше фуража, что может положительно влиять на продуктивность, такую как ADG или молокообразование. Перевариваемость нейтрально-детергентной клетчатки (NDFd) является мерой перевариваемости клетчатки, взятой в различные промежутки времени, и часто используется для сравнения кормовой ценности разновидностей фуража. Силос с высоким содержанием NDFd обеспечивает больший потенциал потребления сухого вещества и, следовательно, возможность скармливать животному большее количество силоса.

В этом исследовании качества силоса с помощью NIR спрогнозировано, что силос кормовой Enogen® будет иметь более высокий уровень NDFd, важный показатель перевариваемости клетчатки, чем стандартный кукурузный силос.Как показано на фигуре 3, силос кормовой Enogen® характеризовался увеличенными значениями NDFd, определенными в нескольких временных точках, по сравнению с кукурузным силосом, отличными от Enogen®, не содержащим признака альфа-амилазы: увеличение на 8,2% (30 часов), увеличение на 12,6% (120 часов) и увеличение на 6,2% (240 часов). Величины значимо отличались во все моменты времени. С другой стороны, для силоса кормовой Enogen® с помощью NIR спрогнозировано снижение количества неперевариваемой нейтральной клетчатки (uNDF) на 18,5% (120 часов) и на 17,4% (240 часов) по сравнению со стандартным кукурузным силосом (данные не показаны).

Более того, для силоса кормовой Enogen® с помощью NIR спрогнозировано увеличение общей перевариваемости нейтрально-детергентной клетчатки в желудочно-кишечном тракте (TTNDFd) на 6,4% по сравнению со стандартным кукурузным силосом (данные не показаны). TTDNFd предлагает целостное представление о перевариваемости клетчатки путем оценки скорости переваривания клетчатки, скорости прохождения клетчатки и содержания неперевариваемой клетчатки. Более высокое значение TTNDFd предполагает лучшую перевариваемость клетчатки и потребление сухого вещества, что может способствовать повышению продуктивности животных.

Таким образом, это исследование указывает на то, что силос кормовой Enogen® характеризуется повышенной концентрацией крахмала в виде мелких частиц, что приводит к улучшению перевариваемости крахмала. Эта характеристика крахмала наряду с более высоким уровнем Сахаров обеспечивает более легкодоступные источники энергии для животного и микробов рубца, что может привести к улучшению продуктивности животных. Кроме того, улучшенная перевариваемость клетчатки в силосе кормовой Enogen® может привести к большему потреблению сухого вещества, что опять-таки способствует повышению продуктивности животных, что в случае этого исследования по прогнозам составит приблизительно от 2 до 5 фунтов/голова/день увеличения молокообразования, исходя из анализа с помощью коммерческого пакета программного обеспечения (NDS Professional, доступного для загрузки в World Wide Web по адресу rumen.it/en/ndspro), обычно используемого профессиональными специалистами по кормлению животных.

ПРИМЕР 10 Оценка ферментации, пищевой ценности и аэробной устойчивости силоса кормовой кукурузы Enogen®, хранящегося при различных значениях температуры или обработанного различными инокулянтами/химическими стабилизаторами

Цели

Оценить ферментацию, перевариваемость крахмала в рубце и аэробную устойчивость силоса кормовой кукурузы Enogen® (EFC) в сравнении с контрольным силосом под влиянием продолжительности хранения при 1) различных температурных режимах хранения или 2) различной обработке перед хранением с использованием инокулянта или химического стабилизатора.

Материалы и способы

Гибриды кукурузы поставляются Syngenta и высаживаются и контролируются в соответствии с порядками нормальной агрономической практики на ферме Университета Делавэра. Участки примерно от 8 до 12 рядов и 400-600 футов в длину. Сухое вещество целого растения (DM) собирали с использованием прицепного комбайна (John Deere 3975, Молин, штат Иллинойс, США), оборудованного механическим обрабатывающим устройством (установка межвалкового зазора 1,40 мм). Растения кукурузы нарезали для получения 34-36% DM и теоретической длины среза 19 мм и упаковывали в лабораторные силосные хранилища объемом 7,5 л при плотности приблизительно 230 кг DM/м³ (приблизительно 44 фунта сырого веса или 15 фунтов DM/фут³).

Эксперимент 1. Влияние температуры

Пять отдельно полученных повторностей следующих обработок упаковали для хранения в течение различных отрезков времени и при различных значениях температуры (6 видов обработки × 5 повторностей × 3 момента времени = 90 образцов силоса):

1) контрольный гибрид, хранящийся при 22°С (72°F);

2) кормовая кукуруза Enogen®, хранящаяся при 22°С;

3) кормовая кукуруза Enogen®, обработанная LB500*, хранящаяся при 22°С;

4) контрольный гибрид, хранящийся при 40°С (104°F);

5) кормовая кукуруза Enogen®, хранящаяся при 40°С;

6) кормовая кукуруза Enogen®, обработанная LB500*, хранящаяся при 40°С; *LB500=конечная норма внесения 400000 КОЕ Lactobacillus buchneri 40788+100000 КОЕ Pediococcus pentosaceus 12455 (Lallemand Animal Nutrition).

Силос из обработок 1-3 хранят при температуре лабораторной комнаты, при приблизительно 21-22°С, в течение 30, 120 и 240 дней. Силос из обработок 4-6 хранят при повышенной температуре, при приблизительно 40°С, в течение 0-120 дней, а затем хранят при более низкой (но все еще повышенной) температуре, при приблизительно 32°С, до открытия на 240 день.

Эксперимент 2. Влияние инокулянта/стабилизатора

Пять отдельно полученных повторностей следующих обработок упаковали для хранения в течение различных отрезков времени после обработки инокулянтом или химическим стабилизатором, все при 22°C/72°F (6 видов обработки × 5 повторностей × 3 момента времени = 90 образцов силоса):

1) контрольный гибрид, необработанный;

2) контрольный гибрид с химическим стабилизатором*;

3) контрольный гибрид + LB500**;

4) гибрид Enogen®, необработанный;

5) гибрид Enogen® с химическим стабилизатором;

6) гибрид Enogen® + LB500**;

**LB500 = конечная норма внесения 400000 КОЕ Lactobacillus buchneri 40788+100000 КОЕ Pediococcus pentosaceus 12455 (Lallemand Animal Nutrition).

Сбор образцов и анализ

При каждом открытии (30, 120 и 240 дней) для каждого эксперимента определяют значение веса силосного хранилища и используют с содержанием DM в силосах для определения извлечения DM. Исходя из предыдущего опыта, длительное хранение образцов силоса в лабораторных силосных хранилищах часто приводит к отсутствию жизнеспособных дрожжей, поскольку силосные хранилища очень воздухонепроницаемы (в большей степени, чем коммерческие силосные хранилища). Таким образом, во время хранения силосные хранилища, в которых хранится силос до открытия через 120 и 240 дней, подвергают контролируемому воздействию воздуха по 4 часа в неделю в течение последних 6 недель хранения. При всех открытиях силосного хранилища определяют аэробную устойчивость кукурузных силосов. Приблизительно 3±0,01 кг иллюстративного кукурузного силоса из каждого силосного хранилища возвращают в то же очищенное силосное хранилище. Провод термопары помещают в геометрический центр каждой массы образца и температуру регистрируют каждые 30 минут с использованием регистратора данных (DataTaker DT85, Thermo Fisher Scientific Australia, Pty). Температуру окружающей среды регистрируют с провода термопары в пустой емкости. Емкости накрывают двумя слоями марли и оставляют в условиях воздуха в лаборатории (22±1°С). Аэробную устойчивость рассчитывают как количество часов до того, как температура силосной массы поднимается на 3°С выше исходной температуры.

Содержание DM во всех образцах определяют путем сушки в сушильном шкафу с принудительной подачей воздуха при 60°С в течение 48 часов. Часть каждого высушенного образца измельчают с использованием мельницы для образцов Udy Cyclone (Udy Corp., Форт Коллинз, штат Колорадо, США) для пропускания через 1 мм сито и анализируют на наличие нейтрально-детергентной клетчатки (NDF). Содержание кислотно-детергентной клетчатки (ADF) количественно определяют на высушенных измельченных образцах в соответствии с известными процедурами с той модификацией, что этот остаток клетчатки из ADF извлекают на удерживающем частицы 1,5 мкм фильтре Ватмана 7 см в калифорнийской воронке Бюхнера (934-АН Whatman Inc., Клифтон, штат Нью-Джерси, США) вместо тигля Гуча, чтобы обеспечить лучшую фильтрацию. Общее количество N определяют при сжигании образца (анализатор LECO CNS 2000, LECO Corporation, Сент-Джозеф, штат Мичиган, США), а сырой белок (CP) рассчитывают путем умножения итогового общего содержания N на 6,25. Определяют растворимый белок (% CP). Отдельную порцию высушенных образцов измельчают, чтобы пропустить через 3 мм сито, и анализируют на крахмал и перевариваемость крахмала в рубце в течение 7 часов in vitro. Концентрации золы, ADF, NDF, CP, растворимого N, крахмала и перевариваемого крахмала анализируют в химико-аналитической службе Cumberland Valley, Хэджерстаун, штат Мэриленд, США.

Иллюстративные образцы разновидностей влажного фуража и силоса смешивают со стерильным в четверть концентрации раствором Рингера (Oxoid BR0052G, Oxoid, Unipath, Ltd., Бейзингсток, Великобритания) и гомогенизируют в течение 1 мин. в блендере Proctor-Silex 57171 (Hamilton BeachProctor-Silex Inc., Вашингтон, штат Северная Каролина, США). Значение рН определяют в экстрактах свежей водой. Количества общих молочно-кислых бактерий определяют путем посева заливкой 10-кратных серийных разведений на агаре де Мана-Рогоза-Шарпа (СМ3651, Oxoid, Unipath, Бейзингсток, Великобритания). Планшеты инкубируют анаэробно при 32°С в течение 48-72 часов. Общее количество дрожжей и плесневых грибов определяют путем посева заливкой 10-кратных серийных разведений на агаре с солодовым экстрактом (СМ0059, Oxoid, Unipath, Бейзингсток, Великобритания). Эти планшеты инкубируют в аэробных условиях при 32°С в течение 48-72 ч. перед подсчетом. Порции водных экстрактов перед анализом замораживают.Молочную и уксусную кислоты, 1-2 пропандиол (1,2 PD) и этанол определяют в водных экстрактах с помощью HPLC. N аммиака определяют в водных экстрактах фенол-гипохлоритным способом. Водорастворимые углеводы (WSC) количественно определяют колориметрическим способом.

Анализ по растительным материалам и срокам (таблица 17)

Статистические данные

Данные из каждого открытия силосного хранилища анализируют отдельно как полностью рандомизированную схему. Модель включает в себя фиксированный эффект обработки. Данные анализируют с использованием процедуры glm программного обеспечения SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Кэри, штат Северная Каролина, США) и различия сообщают как значимые при Р≤0,05. Если общее значение Р является значимым, средние значения разделяют с помощью критерия Тьюки (Р≤0,05).

ПРИМЕР 11

Исследование молочных коров с использованием силоса кормовой Enogen®

Проведено исследование для оценки влияния скармливания молочным коровам силоса кормовой Enogen® на молокообразование, качество молока и оценку упитанности в баллах (BCS).

Условия эксперимента

Молочных коров содержали в загонах в зависимости от стадии лактации/продуктивности и скармливали в загоне общий смешанный рацион (TMR), адаптированный к пищевым потребностям коров в этом загоне. Животным не вводили бычий соматотропин.

Силос получали на ферме из кормовой кукурузы Enogen® или стандартной кукурузы, не содержащей признака альфа-амилазы. Силос ферментировали в течение 3 месяцев до применения. Данные собирали от животных, которым скармливали TMR, содержащий стандартный кукурузный силос без признака альфа-амилазы, в течение 30 дней (период ИСКЛЮЧЕНИЯ силоса кормовой Enogen®). После этого животных переводили со стандартного силоса на силос кормовой Enogen® путем скармливания двух видов силоса в соотношении 50:50 в течение 12 дней. Затем животных переключали на 100% силос кормовой Enogen® в качестве силосного компонента TMR в течение 85 дней (период ВКЛЮЧЕНИЯ силоса кормовой Enogen®).

Надой молока измеряли ежедневно для каждой коровы с помощью электронной системы доильного зала. Потребление сухого вещества (DMI) в загоне измеряли ежедневно с помощью системы учета TMR.

Оценку упитанности в баллах определяли ежемесячно в ходе исследования у 10% коров, выбранных случайным образом из всех загонов. Оценку выполняли по шкале от 1 до 5, при этом 1 балл - слишком худой, 5 баллов - слишком тяжелый, а 3 балла - идеальный.

Коров разделяли на загоны следующим образом: ранняя лактация (1 загон), поздняя лактация (2 загона) и высокая продуктивность (2 загона). Рационы для каждого загона составлял профессиональный диетолог для животных.

Для рационов высокопроизводительных коров состав фуража TMR был таким, как представлен ниже.

Рационы для коров ранней и поздней лактации обычно имеют более низкое содержание энергии по сравнению с рационом для высокопродуктивных коров, что отражается в более высоком проценте рациона в форме фуража (силоса) по сравнению с рационами, показанными в таблице 18. Содержание и состав фуража для коров в периоды ИСКЛЮЧЕНИЯ и ВКЛЮЧЕНИЯ рассчитывали так, чтоб они были одинаковыми для коров ранней и поздней лактации.

Продуктивность лактации оценивали в периоды ИСКЛЮЧЕНИЯ и ВКЛЮЧЕНИЯ как средние значения по всем загонам (ранняя лактация, поздняя лактация и высокая продуктивность). Как видно из таблицы 19 ниже, молочные коровы, которым скармливали силос кормовой Enogen®, производили больше молока в день, чем в период ИСКЛЮЧЕНИЯ со стандартным кукурузным силосом в рационе. В то же время DMI (потребление сухого вещества) было снижено, что привело к улучшению кормовой эффективности (FE). Общее количество коров и период раздоя для стада существенно не отличались между периодами ИСКЛЮЧЕНИЯ и ВКЛЮЧЕНИЯ, и поэтому не ожидалось, что это приведет к значимым различиям в продуктивности, потреблении или кормовой эффективности между двумя периодами.

В дополнение к количеству произведенного молока важны также качество молока и упитанность животных. Одной из проблем высокопродуктивных молочных коров является то, что упитанность будет ухудшаться, что может привести к долгосрочной потере продуктивности. Аналогичным образом, увеличение молокообразования имеет ограниченную ценность, если качество молока значимо снижается. В этом исследовании качество молока и оценку упитанности в баллах сохраняли даже в условиях более высокого молокообразования. Не было никаких существенных различий в составе жира, белка и азота мочевины молока (MUN) в молоке, произведенном в периоды ИСКЛЮЧЕНИЯ и ВКЛЮЧЕНИЯ (данные не показаны). Кроме того, не было никаких изменений в BCS со средними оценками примерно 3 у случайно отобранных животных как в период ИСКЛЮЧЕНИЯ, так и в период ВКЛЮЧЕНИЯ (при этом 1 балл - слишком худой, 5 баллов - слишком тяжелый, а 3 балла - идеальный).

В целом, в этом исследовании молочные коровы, которым скармливали силос кормовой Enogen®, как часть TMR, имели улучшенное молокообразование, сохраняя при этом качество молока и упитанность.

ПРИМЕР 12 Влияние добавки кормовой кукурузы Enogen® на продуктивность и потребление кормов у высокопродуктивных молочных коров

Цель

Определить влияние скармливания кукурузного силоса, полученного из гибрида, который экспрессирует признак альфа-амилазы ("кормовая кукуруза Enogen®" или "EFC"), по сравнению со стандартным кукурузным силосом на потребление кормов и молокообразование у переходных высокопродуктивных молочных коров.

Посадка, сбор и хранение

Syngenta предоставила семена гибридной кукурузы EFC (семена EFC) и семена гибридной кукурузы ближайшей изолинии (контрольные семена) для исследования в достаточном количестве, чтобы засадить примерно по 22 акра на гибрид при целевой норме высева 33000 семян/акр. Семена высаживали с помощью 24-рядной сеялки на одном 45-акровом поле. Силос EFC и контрольный силос собирали при 62-65% влажности целых растений и хранили в отдельных мешках с воздушным зазором, инокулированных коммерческим инокулянтом для молочного скота LB 500.

Животные и обработки

Двадцать четыре (24) сухостойные коровы голштинской породы, вступающие во вторую или большую лактацию, разделяли на блоки для обработок на основании ожидаемой даты отела, лактации, оценки упитанности в баллах (BCS) и предшествующего молокообразования (ME 305). Случайным образом распределяли на две диетологические обработки: 1) контрольный кукурузный силос и 2) силос EFC. Сухостойных коров содержали в индивидуальных кормовых станциях Biocontrol, начиная с ~ 3-4 недель до ожидаемого отела, и рацион включал силос распределенной обработки (контроль против EFC) в течение этого предродового периода. После отела животных распределяли для одной из двух обработок с кукурузным силосом в рационе для высокопродуктивных коров. Животные остаются в загоне Biocontrol до 90 дней периода раздоя (DEVI). См. таблицу 20 для распределения обработок. Весь эксперимент повторяли со второй группой из двадцати четырех (24) коров как можно скорее после того, как ворота Biocontrol снова стали доступны, когда первая группа прошла 90 DIM.

Рацион и доставка корма

Коровам, содержавшимся в коммерческом коровнике или общих загонах, скармливали общий смешанный рацион (TMR) два раза в день, тогда как животным, содержащимся в воротах Biocontrol, скармливали TMR один раз в день. Базовый рацион без кукурузного силоса готовили для всех загонов в одной загрузке, используя барабанный смеситель Roto-Mix. После того, как базовый рацион смешивали, этот рацион выгружали и половину добавляли в смеситель вместе с контрольным силосом. Рацион дополнительно перемешивали и доставляли в контрольные загоны или в ворота Biocontrol. Смеситель очищали и оставшуюся половину базового рациона, который был выгружен, загружали обратно в смеситель вместе с кукурузным силосом EFC. После смешивания рацион с кукурузным силосом EFC-обработки доставляли в соответствующие загоны или ворота Biocontrol.

Кормушки изучали до ежедневного кормления и соответствующим образом корректировали кормовые запросы на основе остаточного корма, оставшегося в кормушке. Коров кормили до небольшого остатка корма, 1 балл по шкале от 0 до 4; где 0 - не осталось корма, а 1 - 1-5% оставшегося корма. Смешанный рецепт, доставленный корм и остаточный корм, оставшийся в кормушке, регистрировали в электронном виде с использованием TMR Tracker (Digi-Star, Форт Аткинсон, штат Висконсин, США). Для поддержания постоянной питательности состав ингредиентов рациона корректировали с регулярными интервалами, чтобы учесть изменения содержания сухого вещества в кукурузном силосе и люцерновом силосе с течением времени.

Измеряемые параметры

Потребление сухого вещества (DMI) сухостойными коровами регистрировали ежедневно на индивидуальном уровне один раз в воротах Biocontrol. После отела коров доили 3 раза в день, а индивидуальный надой молока регистрировали и хранили. Образцы молока отбирали у каждой коровы один раз в неделю до 90 DIM при 3 последовательных доениях и анализировали на процентное содержание жира, белка и лактозы, количество соматических клеток (SCC) и азот мочевины молока (MUN) в AgSource Laboratories (Меномони, штат Висконсин, США). Ежедневное индивидуальное DMI регистрировали с 0 по 90 DFM. Значения индивидуального веса тела коров брали еженедельно в ходе испытания. События у коров, такие как состояние здоровья, размножение и т.д. регистрировали в DairyCOMP 305 (DC305; Valley Agricole Software, Туларе, штат Калифорния, США). Потребление сухого вещества на загон рассчитывали по ежедневной доставке корма за вычетом остатков. Измерения BCS проводили до испытания, при отелах, в 45 DFM и в последний день испытания. Оценки способности к передвижению регистрировали, когда каждую корову помещали в ворота Biocontrol (~30 дней до отела) и в 0, 45 и 90 DFM. TMR и остатки собирали один раз в неделю и замораживали до анализа. ВО, 14, 28 и 42 дни образцы фекалий собирали и анализировали на фекальный крахмал. За последние 45 дней образцы фекалий собирали один раз в месяц до максимального уровня молока. Температуру на поверхности (12'') и на глубине 36'' в каждом силосном мешке регистрировали 3 раза в неделю, исследуя 5 точек по всей поверхности силосного мешка для каждой глубины. Лабораторные исследования устойчивости силоса проводили в течение четырех недель подряд.

Результаты

Из результатов видно увеличение молокообразования и кормовой эффективности в отношении молока (фунт молока, произведенный на фунт потребленного корма) следующим образом (таблица 21).

• Контроль до отела/контроль после отела (обработка 1) характеризовался примерно 103,5 фунта молока/голова/день по сравнению с EFC до отела /EFC после отела (обработка 4) при 111,4 фунта/голова/день

• Разница в 7,9 фунта/голова/день в среднем за 90 дней лактации, когда EFC скармливали как до, так и после отела

• Другие 2 обработки (EFC в период до отела или после отела; обработки 2 и 3) дали промежуточные результаты

• Кормовая эффективность для обработки 1 (контроль до отела/контроль после отела) составила 1,656 против 1,792 для обработки 4 (EFC до отела/ EFC после отела).

ПРИМЕР 13

Исследование продуктивности молочного скота: скармливание комбинации зерна и силоса кормовой Enogen®

Исследование молочной продуктивности проводится в Арлингтонском центре сельскохозяйственных исследований Университета Висконсин-Мэдисон. В исследовании в загонах используют многотельных коров голштинской породы в середине лактации. Есть 16 загонов с 8 коровами в каждом загоне, всего 128 коров.

Эксперимент начинается с 2-х недельного ковариатного периода, когда всем коровам скармливают одинаковый пищевой рацион. В течение следующих 10 недель загоны случайным образом распределяют для одного из четырех пищевых рационов, содержащих различные уровни кукурузного силоса кормовой Enogen® или зерна кормовой кукурузы Enogen®.

Четыре экспериментальных диетологических обработки представляют собой:

1) 40% стандартного кукурузного силоса и 15% стандартного кукурузного зерна (отрицательный контроль);

2) 40% силоса кормовой кукурузы Enogen® и 15% стандартного кукурузного зерна (влияние кукурузного силоса);

3) 40% стандартного кукурузного силоса и 15% зерна кормовой кукурузы Enogen® (влияние кукурузного зерна);

4) 40% силоса кормовой кукурузы Enogen® и 15% зерна кормовой кукурузы Enogen® (положительный контроль).

Образцы/переменные ответа для измерения

Потребление сухого вещества. Коровам скармливают общий смешанный рацион (TMR) один раз в день ad libitum, корректируя предложенное количество для получения 5-10% остатков в каждом загоне. Фураж сушат до 60°С в течение 48 часов, чтобы скорректировать смеси ингредиентов TMR под изменение содержания сухого вещества (DM) каждую неделю.

Кормовой ингредиент. Образцы отдельных кормовых ингредиентов, TMR, смеси комбикормов и объедков отбирают раз в неделю и хранят в замороженном виде для последующего анализа. Образцы каждого кормового ингредиента объединяют каждые две недели, сушат и измельчают с пропусканием через 1,0 мм сито в мельнице Wiley. В образцах проводят анализ на сырой белок (CP), нейтрально-детергентную клетчатку (NDF), кислотно-детергентную клетчатку (ADF), крахмал, лигнин, эфирный экстракт (жир) и золу. Кроме того, определяют перевариваемость NDF в рубце in vitro через 30 часов (NDFD30h), перевариваемость крахмала в рубце in vitro через 7 часов для составных образцов фуража, смесей комбикормов (включая стандартные кукурузный силос и кукурузное зерно и силос и зерно кормовой кукурузы Enogen®).

Молокообразование и состав молока. Надой молока измеряют ежедневно для каждой отдельной коровы в ходе эксперимента. Коров доят два раза в день до полудня и после полудня. Образцы молока для определения состава молока отбирают в течение двух последовательных дней (4 доения) каждые две недели. В образцах молока проводят анализ концентраций жира, белка, лактозы, соматических клеток и азота мочевины молока (MUN).

Образец разовой порции мочи. Образцы мочи для каждой коровы собирают в 4 момента времени с 6-часовым интервалом, чтобы охватить 24-часовой период. Образцы мочи анализируют на производное пурина и концентрацию креатинина, чтобы оценить синтез микробного белка и объем мочи.

Образец крови. Образцы крови от каждой коровы собирают и анализируют в отношении аминокислотного профиля один раз в конце испытания.

Вес тела (BW) и оценка упитанности в баллах (BCS). BW и BCS коров измеряют в течение 2 последовательных дней в начале испытания, в течение 5-й недели экспериментального пищевого рациона и на последней неделе эксперимента.

ПРИМЕР 14 Исследование отходов молочного производства: скармливание комбинации зерна и силоса кормовой Enogen®

Исследование продуктивности молочного скота, выделения кишечного метана, метаболизма рубца, утилизации азота и перевариваемости питательных веществ проводят в Университете Висконсина с использованием лактирующих молочных коров, которым скармливают стандартный кукурузный силос или силос кормовой кукурузы Enogen®, а также зерно кормовой кукурузы Enogen®.

Материалы и способы

Экспериментальная схема представляет собой латинский квадрат 4×4 (4 коровы на квадрат, 4 периода) с повторностями, с четырьмя 28-дневными периодами (14 дней для адаптации и 14 дней для сбора данных) для 16-недельного испытания. Двадцать многотельных лактирующих коров в середине лактации содержат в коровнике со стойлом с привязью. В дополнение к четырем квадратам не канюлированных коров, четыре коровы с канюлированием рубца (RC) находятся на двойной перекрестной схеме. Коров кормят один раз в день и доят два раза в день. Ниже перечислены четыре диетологические обработки не канюлированных коров, содержащие на различном уровне силос кормовой кукурузы Enogen® или зерно кормовой кукурузы Enogen®. Коров случайным образом распределяют в квадратах для 4 последовательностей диетологических обработок.

Четыре экспериментальных диетологических обработки не канюлированных коров представляют собой:

1) 40% стандартного кукурузного силоса и 15% стандартного кукурузного зерна (отрицательный контроль);

2) 40% силоса кормовой кукурузы Enogen® и 15% стандартного кукурузного зерна (влияние кукурузного силоса);

3) 40% стандартного кукурузного силоса и 15% зерна кормовой кукурузы Enogen® (влияние кукурузного зерна);

4) 40% силоса кормовой кукурузы Enogen® и 15% зерна кормовой кукурузы Enogen® (положительный контроль).

Пищевые рационы для коров с RC представляют собой пищевой рацион 1) (отрицательный контроль) и 4) (положительный контроль) (например, последовательность пищевых рационов 1) → 4) → 1) → 4) для двойного перекрестного исследования).

Образцы/переменные ответа для измерения

Потребление сухого вещества. Коровам скармливают общий смешанный пищевой рацион (TMR) один раз в день ad libitum, за исключением коров с RC в период отбора образцов, когда пищевой рацион предлагают два раза в день в 8:00 до полудня и 8:00 после полудня, корректируя предложенное количество, чтобы иметь 5-10% остатков для каждой коровы. Фураж сушат до 60°С в течение 48 часов, чтобы скорректировать смеси ингредиентов TMR под изменение содержания сухого вещества (DM) каждую неделю.

Кормовой ингредиент. Образцы отдельных кормовых ингредиентов, TMR, смеси комбикормов и объедков отбирают раз в неделю и хранят в замороженном виде для последующего анализа. Образцы каждого кормового ингредиента объединяют в последние две недели каждого периода, сушат и измельчают с пропусканием через 1,0 мм сито в мельнице Wiley. Образцы анализируют на валовую энергию, сырой белок (CP), нейтрально-детергентную клетчатку (NDF), неперевариваемую нейтрально детергентную клетчатку (uNDF), кислотно-детергентную клетчатку (ADF), крахмал, водорастворимые углеводы, лигнин, эфирный экстракт и золу. Образцы объедков анализируют на содержание крахмала, золы, CP, NDF и uNDF. Кроме того, определяют перевариваемость NDF в рубце in vitro через 30 часов (NDFD30h), перевариваемость крахмала в рубце in vitro через 7 часов для составных образцов фуража, смесей комбикормов (включая стандартные кукурузный силос и кукурузное зерно и силос и зерно кормовой кукурузы Enogen®).

Молокообразование и состав молока. Надой молока измеряют ежедневно для каждой отдельной коровы в ходе эксперимента. Коров доят два раза в день до полудня и после полудня. Образцы молока для определения состава молока отбирают в течение двух последовательных дней (4 доения) в последние две недели каждого периода. В образцах молока проводят анализ концентраций жира, белка, лактозы, соматических клеток и MUN.

Вес тела (BW) и оценка упитанности в баллах (BCS). BW и BCS коров измеряют в течение 2 последовательных дней в начале испытания и в течение четвертой недели каждого периода.

Выделение кишечного метана (СН4). СН4 измеряют для каждой коровы в течение третьей недели каждого периода. Измерение метана проводят несколько раз в день с максимальной частотой каждые четыре часа с помощью системы GreenFeed (C-Lock Inc., Рапид-Сити, штат Южная Дакота, США). Прежде чем коров распределяют для различных диетологических обработок, проводят две недели адаптации и отбора в отношении системы GreenFeed у 20 неканюлированных коров, получающих одинаковый пищевой рацион для стада. В течение двух недель систему GreenFeed несколько раз ставят перед коровами, чтобы обучить коров привыкнуть к оборудованию для измерения СН4. В конце недели отбора коров, которые не адаптируются к GreenFeed, и любых дополнительных коров из протокола возвращают в молочное стадо, только 16 коров (в дополнение к 4 коровам с RC) используют для оценки влияния диетологических обработок.

Отбор образцов жидкости из рубца. Образцы жидкости из рубца отбирают у 4 коров с RC один раз через 2 и 4 часа после кормления каждый период для анализа профилей VFA, аммиака и рН.

Размер слоя содержимого рубца и питательные вещества в содержимом рубца.

Содержимое рубца извлекают вручную через канюлю рубца в 12 часов ночи (через 4 часа после кормления) и 7 часов утра (за 1 час до кормления) на 21-й день (на 3 неделе периода) у каждой из 4 коров в каждом периоде. Определяют массу и объем общего содержимого рубца и часть образца содержимого рубца массой 1 кг собирают для анализа органического вещества (ОМ), нейтрально-детергентной клетчатки (NDF), неперевариваемой нейтрально-детергентной клетчатки (uNDF) и крахмала, а извлеченное содержимое помещают обратно в рубец. Размеры слоя содержимого рубца для ОМ, NDF, uNDF и крахмала определяют путем умножения концентрации каждого компонента на DM содержимого рубца.

Отбор образцов содержимого книжки. В течение последней недели каждого периода прохождение вещества содержимого из рубца в книжку коров с RC определяют количественно с помощью способа отбора образцов из книжки, разработанного Huhtanen et al. (1997. JAnim Sci.75:1380-1392) и модифицированного Ahvenjarvi et al. (2000, Br. J. Nutr. 83: 67-77) и Lopes et al., (2015 J. Dairy Sci. 98:574-585). Неперевариваемую NDF, CoEDTA ("Co") и лантан ("La") используют в качестве маркеров прохождения вещества содержимого для фазы крупных частиц, жидкой фазы и фазы мелких частиц соответственно. Желатиновые капсулы, содержащие 1 г La и 0,75 г Со, вводят через канюлю рубца в 06:00, 12:00, 18:00 и 00:00 ч. (всего 4 г La и 3 г Со в день) в течение 7 дней, начиная с 20 дня каждого периода с 3 -кратным введением в 20 день. С 23 по 25 день отбирают образцы из книжки 4 раза в день с интервалом в 2 часа, чтобы отобразить 24 часа. Составные образцы из книжки разделяют на 3 фазы книжки и анализируют на концентрацию маркеров. В результате восстанавливают видимое содержимое книжки, вытекающее из рубца. Определяют концентрации ОМ, NDF, крахмала, не аммиачного N и микробного N в содержимом книжки. Также определяют переваримость питательных веществ в рубце и скорость потока.

Перевариваемость NDF in vitro. Стандартный кукурузный силос и кукурузное зерно и силос и зерно кормовой кукурузы Enogen® высушивают и измельчают. Образцы в трех экземплярах помещают в пакеты ANKOM и инкубируют в забуференной жидкости рубца на водяной бане при 39°С в течение 0, 24, 30, 48 ч (4 источника образца × 4 момента времени × три экземпляра = 48 пакетов ANKOM для образцов). Затем пакеты анализируют на NDF с помощью анализатора клетчатки ANKOM200 (Ankom Technology, Фэрпорт, штат Нью-Йорк, США) с α-амилазой и сульфидом натрия для определения остатка NDF. Затем можно рассчитать кинетику переваривания клетчатки кукурузных продуктов.

Разовый образец мочи. Разовые образцы мочи собирают в четыре момента времени в течение четвертой недели каждого периода, чтобы охватить 24 ч. Образцы мочи подкисляют 0,072 М серной кислоты в соотношении 4:1 кислоты к моче по объему. Образцы мочи замораживают при -20°С до анализа. Образцы мочи объединяют в один образец на одну корову за период и анализируют на общий N, креатинин мочи и мочевину мочи. Суточный объем мочи для каждой коровы оценивают по креатинину в моче в качестве внутреннего маркера. Кроме того, образцы мочи, объединенные по пищевым рационам, анализируют на валовую энергию каждый период.

Произвольно взятый образец фекалий. Образцы кала берут из прямой кишки каждой коровы в одно время с разовой пробой мочи (4 раза с 6-часовыми интервалами, чтобы охватить 24 ч.). Образцы фекалий от каждой коровы усредняют по весу и высушивают, измельчают и анализируют на содержание uNDF, NDF, органического вещества, общего азота и крахмала на общую перевариваемость питательных веществ в желудочно-кишечном тракте. Суточный вывод DM с фекалиями оценивают по uNDF в качестве внутреннего маркера. Кроме того, образцы фекалий, объединенные по пищевым рационам, анализируют на валовую энергию каждый период. С помощью валовой энергии при поглощении и из фекалий и мочи можно определить энергетический баланс, в том числе перевариваемую энергию и метаболизируемую энергию пищевых рационов.

Образец крови. Сбор крови проводят из хвостовой вены до трех раз один раз за период для определения азота мочевины крови.

ПРИМЕР 15

Исследование молочного скота с использованием кормовой кукурузы Enogen® в виде зерна

Многочисленные исследования на фермерских хозяйствах указывают на пользу от включения зерна кормовой кукурузы Enogen® в рационы, скармливаемые лактирующим молочным коровам. В начальном исследовании на фермерском хозяйстве было показано, что использование 6,5 фунта/голова/день зерна кормовой кукурузы Enogen® для непосредственной замены того же количества стандартного кукурузного зерна №2 yellow, которое является частью сбалансированного рациона, защищает молокообразование от обычно ожидаемого связанного с перегревом летнего снижения производства. Стандартную кукурузу и кормовую кукурузу Enogen® измельчали до размера частиц 450 мкм и никаких других изменений в составе рациона не производили. В то время как молочные хозяйства обычно испытывали снижение молокообразования на 3-5 фунтов/голова/день в предыдущие годы в более теплую поздневесеннюю и летнюю погоду, никакого снижения количества или качества молокообразования не наблюдалось, когда зерно кормовой кукурузы Enogen® включали в рационы, начиная с поздней весны (период ВКЛЮЧЕНИЯ кормовой кукурузы Enogen®), по сравнению с предыдущими тридцатью днями (период ИСКЛЮЧЕНИЯ кормовой кукурузы Enogen®) (таблица 22). Анализ образцов фекалий за период ВКЛЮЧЕНИЯ показал снижение фекального крахмала на 43% по сравнению с периодом ИСКЛЮЧЕНИЯ и улучшение общей видимой перевариваемости крахмала в желудочно-кишечном тракте (ATTSD) с 95,42% до 98,07% DM.

Во втором молочном хозяйстве замена стандартного кукурузного зерна (6,5 фунта/голова/день, размер частиц 450 мкм) таким же количеством зерна кормовой кукурузы Enogen® в рационах лактирующих коров была оценена обслуживающим специалистом по кормлению как полезная для взятия под контроль сложной эпидемии Clostridium perfringens типа А. Этот организм, являясь нормальной частью микрофлоры кишечника у молочных коров, может при определенных условиях, включая стресс, нарушение питания или ацидоз рубца, вызывать серьезное или смертельное заболевание. Эпидемия продолжалась в течение 6 месяцев с ограниченным успехом стандартного лечения антибиотиками и антитоксинами. После того, как стадо перевели на рационы, содержащие зерно кормовой кукурузы Enogen®, успех лечения улучшился и эпидемия была быстро прекращена. Хотя механизм, с помощью которого это произошло, до конца не изучен, снижение ацидоза в рубце и снижение избытка крахмала в кишечнике за счет повышенной перевариваемости крахмала могут быть важными факторами.

В третьем исследовании десять молочных хозяйств, представляющих примерно двенадцать тысяч лактирующих коров, которые пользовались консультациями одного специалиста по кормлению и которые получали кукурузное зерно, включенное в рационы их стад, от одного комбикормового завода, приняли участие в исследовании непосредственной замены, заменив стандартную кукурузу в смешанных рационах на кормовую кукурузу Enogen® (6,5 фунта/голова/день, размер частиц 450 мкм) в течение 60-90 дней. Никаких других изменений в рационах за этот период не было. С этим уровнем включения было предотвращено ранее описанное летнее снижение молокообразования. Для подгруппы этих молочных хозяйств, которые постепенно увеличивали включение зерна кормовой кукурузы Enogen® в рационы до 13,5 фунта/голова/день, наблюдалось увеличение молокообразования от 2 до 2,5 фунта/голова/день без снижения показателей качества молока.

Вышеизложенное является иллюстрацией настоящего изобретения и не подразумевает его ограничение. Настоящее изобретение определяется следующей формулой изобретения, при этом в нее включены также и эквиваленты пунктов формулы изобретения.

Все публикации, заявки на патенты, патенты и другие ссылки, цитируемые в данном документе, включены с помощью ссылки во всей своей полноте для объяснения идей, относящихся к предложению и/или абзацу, в котором приведена данная ссылка.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЗИНГЕНТА ПАРТИСИПЕЙШНС АГ

<120> УСОВЕРШЕНСТВОВАННЫЕ КОРМОВЫЕ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И СПОСОБЫ

ИХ ПРИМЕНЕНИЯ

<130> 81471-US-L-ORG-NAT-1

<160> 5

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 436

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетический

<400> 1

Met Ala Lys Tyr Leu Glu Leu Glu Glu Gly Gly Val Ile Met Gln Ala

1 5 10 15

Phe Tyr Trp Asp Val Pro Ser Gly Gly Ile Trp Trp Asp Thr Ile Arg

20 25 30

Gln Lys Ile Pro Glu Trp Tyr Asp Ala Gly Ile Ser Ala Ile Trp Ile

35 40 45

Pro Pro Ala Ser Lys Gly Met Ser Gly Gly Tyr Ser Met Gly Tyr Asp

50 55 60

Pro Tyr Asp Tyr Phe Asp Leu Gly Glu Tyr Tyr Gln Lys Gly Thr Val

65 70 75 80

Glu Thr Arg Phe Gly Ser Lys Gln Glu Leu Ile Asn Met Ile Asn Thr

85 90 95

Ala His Ala Tyr Gly Ile Lys Val Ile Ala Asp Ile Val Ile Asn His

100 105 110

Arg Ala Gly Gly Asp Leu Glu Trp Asn Pro Phe Val Gly Asp Tyr Thr

115 120 125

Trp Thr Asp Phe Ser Lys Val Ala Ser Gly Lys Tyr Thr Ala Asn Tyr

130 135 140

Leu Asp Phe His Pro Asn Glu Leu His Ala Gly Asp Ser Gly Thr Phe

145 150 155 160

Gly Gly Tyr Pro Asp Ile Cys His Asp Lys Ser Trp Asp Gln Tyr Trp

165 170 175

Leu Trp Ala Ser Gln Glu Ser Tyr Ala Ala Tyr Leu Arg Ser Ile Gly

180 185 190

Ile Asp Ala Trp Arg Phe Asp Tyr Val Lys Gly Tyr Gly Ala Trp Val

195 200 205

Val Lys Asp Trp Leu Asn Trp Trp Gly Gly Trp Ala Val Gly Glu Tyr

210 215 220

Trp Asp Thr Asn Val Asp Ala Leu Leu Asn Trp Ala Tyr Ser Ser Gly

225 230 235 240

Ala Lys Val Phe Asp Phe Pro Leu Tyr Tyr Lys Met Asp Ala Ala Phe

245 250 255

Asp Asn Lys Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Ala Leu Lys Asn Gly Gly

260 265 270

Thr Val Val Ser Arg Asp Pro Phe Lys Ala Val Thr Phe Val Ala Asn

275 280 285

His Asp Thr Asp Ile Ile Trp Asn Lys Tyr Pro Ala Tyr Ala Phe Ile

290 295 300

Leu Thr Tyr Glu Gly Gln Pro Thr Ile Phe Tyr Arg Asp Tyr Glu Glu

305 310 315 320

Trp Leu Asn Lys Asp Lys Leu Lys Asn Leu Ile Trp Ile His Asp Asn

325 330 335

Leu Ala Gly Gly Ser Thr Ser Ile Val Tyr Tyr Asp Ser Asp Glu Met

340 345 350

Ile Phe Val Arg Asn Gly Tyr Gly Ser Lys Pro Gly Leu Ile Thr Tyr

355 360 365

Ile Asn Leu Gly Ser Ser Lys Val Gly Arg Trp Val Tyr Val Pro Lys

370 375 380

Phe Ala Gly Ala Cys Ile His Glu Tyr Thr Gly Asn Leu Gly Gly Trp

385 390 395 400

Val Asp Lys Tyr Val Tyr Ser Ser Gly Trp Val Tyr Leu Glu Ala Pro

405 410 415

Ala Tyr Asp Pro Ala Asn Gly Gln Tyr Gly Tyr Ser Val Trp Ser Tyr

420 425 430

Cys Gly Val Gly

435

<210> 2

<211> 1308

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетический

<400> 2

atggccaagt acctggagct ggaggagggc ggcgtgatca tgcaggcgtt ctactgggac 60

gtcccgagcg gaggcatctg gtgggacacc atccgccaga agatccccga gtggtacgac 120

gccggcatct ccgcgatctg gataccgcca gcttccaagg gcatgtccgg gggctactcg 180

atgggctacg acccgtacga ctacttcgac ctcggcgagt actaccagaa gggcacggtg 240

gagacgcgct tcgggtccaa gcaggagctc atcaacatga tcaacacggc gcacgcctac 300

ggcatcaagg tcatcgcgga catcgtgatc aaccacaggg ccggcggcga cctggagtgg 360

aacccgttcg tcggcgacta cacctggacg gacttctcca aggtcgcctc cggcaagtac 420

accgccaact acctcgactt ccaccccaac gagctgcacg cgggcgactc cggcacgttc 480

ggcggctacc cggacatctg ccacgacaag tcctgggacc agtactggct ctgggcctcg 540

caggagtcct acgcggccta cctgcgctcc atcggcatcg acgcgtggcg cttcgactac 600

gtcaagggct acggggcctg ggtggtcaag gactggctca actggtgggg cggctgggcg 660

gtgggcgagt actgggacac caacgtcgac gcgctgctca actgggccta ctcctccggc 720

gccaaggtgt tcgacttccc cctgtactac aagatggacg cggccttcga caacaagaac 780

atcccggcgc tcgtcgaggc cctgaagaac ggcggcacgg tggtctcccg cgacccgttc 840

aaggccgtga ccttcgtcgc caaccacgac acggacatca tctggaacaa gtacccggcg 900

tacgccttca tcctcaccta cgagggccag cccacgatct tctaccgcga ctacgaggag 960

tggctgaaca aggacaagct caagaacctg atctggattc acgacaacct cgcgggcggc

1020

tccactagta tcgtgtacta cgactccgac gagatgatct tcgtccgcaa cggctacggc

1080

tccaagcccg gcctgatcac gtacatcaac ctgggctcct ccaaggtggg ccgctgggtg

1140

tacgtcccga agttcgccgg cgcgtgcatc cacgagtaca ccggcaacct cggcggctgg

1200

gtggacaagt acgtgtactc ctccggctgg gtctacctgg aggccccggc ctacgacccc

1260

gccaacggcc agtacggcta ctccgtgtgg tcctactgcg gcgtcggc 1308

<210> 3

<211> 2223

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетический

<400> 3

atggccaagt acctggagct ggaggagggc ggcgtgatca tgcaggcgtt ctactgggac 60

gtcccgagcg gaggcatctg gtgggacacc atccgccaga agatccccga gtggtacgac 120

gccggcatct ccgcgatctg gataccgcca gcttccaagg gcatgtccgg gggctactcg 180

atgggctacg acccgtacga ctacttcgac ctcggcgagt actaccagaa gggcacggtg 240

gagacgcgct tcgggtccaa gcaggagctc atcaacatga tcaacacggc gcacgcctac 300

ggcatcaagg tcatcgcgga catcgtgatc aaccacaggg ccggcggcga cctggagtgg 360

aacccgttcg tcggcgacta cacctggacg gacttctcca aggtcgcctc cggcaagtac 420

accgccaact acctcgactt ccaccccaac gagctgcacg cgggcgactc cggcacgttc 480

ggcggctacc cggacatctg ccacgacaag tcctgggacc agtactggct ctgggcctcg 540

caggagtcct acgcggccta cctgcgctcc atcggcatcg acgcgtggcg cttcgactac 600

gtcaagggct acggggcctg ggtggtcaag gactggctca actggtgggg cggctgggcg 660

gtgggcgagt actgggacac caacgtcgac gcgctgctca actgggccta ctcctccggc 720

gccaaggtgt tcgacttccc cctgtactac aagatggacg cggccttcga caacaagaac 780

atcccggcgc tcgtcgaggc cctgaagaac ggcggcacgg tggtctcccg cgacccgttc 840

aaggccgtga ccttcgtcgc caaccacgac acggacatca tctggaacaa gtacccggcg 900

tacgccttca tcctcaccta cgagggccag cccacgatct tctaccgcga ctacgaggag 960

tggctgaaca aggacaagct caagaacctg atctggattc acgacaacct cgcgggcggc

1020

tccactagta tcgtgtacta cgactccgac gagatgatct tcgtccgcaa cggctacggc

1080

tccaagcccg gcctgatcac gtacatcaac ctgggctcct ccaaggtggg ccgctgggtg

1140

tacgtcccga agttcgccgg cgcgtgcatc cacgagtaca ccggcaacct cggcggctgg

1200

gtggacaagt acgtgtactc ctccggctgg gtctacctgg aggccccggc ctacgacccc

1260

gccaacggcc agtacggcta ctccgtgtgg tcctactgcg gcgtcggcac atcgattgct

1320

ggcatcctcg aggccgacag ggtcctcacc gtcagcccct actacgccga ggagctcatc

1380

tccggcatcg ccaggggctg cgagctcgac aacatcatgc gcctcaccgg catcaccggc

1440

atcgtcaacg gcatggacgt cagcgagtgg gaccccagca gggacaagta catcgccgtg

1500

aagtacgacg tgtcgacggc cgtggaggcc aaggcgctga acaaggaggc gctgcaggcg

1560

gaggtcgggc tcccggtgga ccggaacatc ccgctggtgg cgttcatcgg caggctggaa

1620

gagcagaagg gccccgacgt catggcggcc gccatcccgc agctcatgga gatggtggag

1680

gacgtgcaga tcgttctgct gggcacgggc aagaagaagt tcgagcgcat gctcatgagc

1740

gccgaggaga agttcccagg caaggtgcgc gccgtggtca agttcaacgc ggcgctggcg

1800

caccacatca tggccggcgc cgacgtgctc gccgtcacca gccgcttcga gccctgcggc

1860

ctcatccagc tgcaggggat gcgatacgga acgccctgcg cctgcgcgtc caccggtgga

1920

ctcgtcgaca ccatcatcga aggcaagacc gggttccaca tgggccgcct cagcgtcgac

1980

tgcaacgtcg tggagccggc ggacgtcaag aaggtggcca ccaccttgca gcgcgccatc

2040

aaggtggtcg gcacgccggc gtacgaggag atggtgagga actgcatgat ccaggatctc

2100

tcctggaagg gccctgccaa gaactgggag aacgtgctgc tcagcctcgg ggtcgccggc

2160

ggcgagccag gggttgaagg cgaggagatc gcgccgctcg ccaaggagaa cgtggccgcg

2220

ccc 2223

<210> 4

<211> 3285

<212> ДНК

<213> Aspergillus shirousami

<400> 4

gccaccccgg ccgactggcg ctcccagtcc atctacttcc tcctcaccga ccgcttcgcc 60

cgcaccgacg gctccaccac cgccacctgc aacaccgccg accagaagta ctgcggcggc 120

acctggcagg gcatcatcga caagctcgac tacatccagg gcatgggctt caccgccatc 180

tggatcaccc cggtgaccgc ccagctcccg cagaccaccg cctacggcga cgcctaccac 240

ggctactggc agcaggacat ctactccctc aacgagaact acggcaccgc cgacgacctc 300

aaggccctct cctccgccct ccacgagcgc ggcatgtacc tcatggtgga cgtggtggcc 360

aaccacatgg gctacgacgg cgccggctcc tccgtggact actccgtgtt caagccgttc 420

tcctcccagg actacttcca cccgttctgc ttcatccaga actacgagga ccagacccag 480

gtggaggact gctggctcgg cgacaacacc gtgtccctcc cggacctcga caccaccaag 540

gacgtggtga agaacgagtg gtacgactgg gtgggctccc tcgtgtccaa ctactccatc 600

gacggcctcc gcatcgacac cgtgaagcac gtgcagaagg acttctggcc gggctacaac 660

aaggccgccg gcgtgtactg catcggcgag gtgctcgacg tggacccggc ctacacctgc 720

ccgtaccaga acgtgatgga cggcgtgctc aactacccga tctactaccc gctcctcaac 780

gccttcaagt ccacctccgg ctcgatggac gacctctaca acatgatcaa caccgtgaag 840

tccgactgcc cggactccac cctcctcggc accttcgtgg agaaccacga caacccgcgc 900

ttcgcctcct acaccaacga catcgccctc gccaagaacg tggccgcctt catcatcctc 960

aacgacggca tcccgatcat ctacgccggc caggagcagc actacgccgg cggcaacgac

1020

ccggccaacc gcgaggccac ctggctctcc ggctacccga ccgactccga gctgtacaag

1080

ctcatcgcct ccgccaacgc catccgcaac tacgccatct ccaaggacac cggcttcgtg

1140

acctacaaga actggccgat ctacaaggac gacaccacca tcgccatgcg caagggcacc

1200

gacggctccc agatcgtgac catcctctcc aacaagggcg cctccggcga ctcctacacc

1260

ctctccctct ccggcgccgg ctacaccgcc ggccagcagc tcaccgaggt gatcggctgc

1320

accaccgtga ccgtgggctc cgacggcaac gtgccggtgc cgatggccgg cggcctcccg

1380

cgcgtgctct acccgaccga gaagctcgcc ggctccaaga tatgctcctc ctccaagccg

1440

gccaccctcg actcctggct ctccaacgag gccaccgtgg cccgcaccgc catcctcaac

1500

aacatcggcg ccgacggcgc ctgggtgtcc ggcgccgact ccggcatcgt ggtggcctcc

1560

ccgtccaccg acaacccgga ctacttctac acctggaccc gcgactccgg catcgtgctc

1620

aagaccctcg tggacctctt ccgcaacggc gacaccgacc tcctctccac catcgagcac

1680

tacatctcct cccaggccat catccagggc gtgtccaacc cgtccggcga cctctcctcc

1740

ggcggcctcg gcgagccgaa gttcaacgtg gacgagaccg cctacgccgg ctcctggggc

1800

cgcccgcagc gcgacggccc ggccctccgc gccaccgcca tgatcggctt cggccagtgg

1860

ctcctcgaca acggctacac ctccgccgcc accgagatcg tgtggccgct cgtgcgcaac

1920

gacctctcct acgtggccca gtactggaac cagaccggct acgacctctg ggaggaggtg

1980

aacggctcct ccttcttcac catcgccgtg cagcaccgcg ccctcgtgga gggctccgcc

2040

ttcgccaccg ccgtgggctc ctcctgctcc tggtgcgact cccaggcccc gcagatcctc

2100

tgctacctcc agtccttctg gaccggctcc tacatcctcg ccaacttcga ctcctcccgc

2160

tccggcaagg acaccaacac cctcctcggc tccatccaca ccttcgaccc ggaggccggc

2220

tgcgacgact ccaccttcca gccgtgctcc ccgcgcgccc tcgccaacca caaggaggtg

2280

gtggactcct tccgctccat ctacaccctc aacgacggcc tctccgactc cgaggccgtg

2340

gccgtgggcc gctacccgga ggactcctac tacaacggca acccgtggtt cctctgcacc

2400

ctcgccgccg ccgagcagct ctacgacgcc ctctaccagt gggacaagca gggctccctg

2460

gagatcaccg acgtgtccct cgacttcttc aaggccctct actccggcgc cgccaccggc

2520

acctactcct cctcctcctc cacctactcc tccatcgtgt ccgccgtgaa gaccttcgcc

2580

gacggcttcg tgtccatcgt ggagacccac gccgcctcca acggctccct ctccgagcag

2640

ttcgacaagt ccgacggcga cgagctgtcc gcccgcgacc tcacctggtc ctacgccgcc

2700

ctcctcaccg ccaacaaccg ccgcaactcc gtggtgccgc cgtcctgggg cgagacctcc

2760

gcctcctccg tgccgggcac ctgcgccgcc acctccgcct ccggcaccta ctcctccgtg

2820

accgtgacct cctggccgtc catcgtggcc accggcggca ccaccaccac cgccaccacc

2880

accggctccg gcggcgtgac ctccacctcc aagaccacca ccaccgcctc caagacctcc

2940

accaccacct cctccacctc ctgcaccacc ccgaccgccg tggccgtgac cttcgacctc

3000

accgccacca ccacctacgg cgagaacatc tacctcgtgg gctccatctc ccagctcggc

3060

gactgggaga cctccgacgg catcgccctc tccgccgaca agtacacctc ctccaacccg

3120

ccgtggtacg tgaccgtgac cctcccggcc ggcgagtcct tcgagtacaa gttcatccgc

3180

gtggagtccg acgactccgt ggagtgggag tccgacccga accgcgagta caccgtgccg

3240

caggcctgcg gcgagtccac cgccaccgtg accgacacct ggcgc 3285

<210> 5

<211> 1320

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> синтетический

<400> 5

atggcgaagc acttggctgc catgtgctgg tgcagcctcc tagtgcttgt actgctctgc 60

ttgggctccc agctggccca atcccaggtc ctcttccagg ggttcaactg ggagtcgtgg 120

aagaagcaag gtgggtggta caactacctc ctggggcggg tggacgacat cgccgcgacg 180

ggggccacgc acgtctggct cccgcagccg tcgcactcgg tggcgccgca ggggtacatg 240

cccggccggc tctacgacct ggacgcgtcc aagtacggca cccacgcgga gctcaagtcg 300

ctcaccgcgg cgttccacgc caagggcgtc cagtgcgtcg ccgacgtcgt gatcaaccac 360

cgctgcgccg actacaagga cggccgcggc atctactgcg tcttcgaggg cggcacgccc 420

gacagccgcc tcgactgggg ccccgacatg atctgcagcg acgacacgca gtactccaac 480

gggcgcgggc accgcgacac gggggccgac ttcgccgccg cgcccgacat cgaccacctc 540

aacccgcgcg tgcagcagga gctctcggac tggctcaact ggctcaagtc cgacctcggc 600

ttcgacggct ggcgcctcga cttcgccaag ggctactccg ccgccgtcgc caaggtgtac 660

gtcgacagca ccgcccccac cttcgtcgtc gccgagatat ggagctccct ccactacgac 720

ggcaacggcg agccgtccag caaccaggac gccgacaggc aggagctggt caactgggcg 780

caggcggtgg gcggccccgc cgcggcgttc gacttcacca ccaagggcgt gctgcaggcg 840

gccgtccagg gcgagctgtg gcgcatgaag gacggcaacg gcaaggcgcc cgggatgatc 900

ggctggctgc cggagaaggc cgtcacgttc gtcgacaacc acgacaccgg ctccacgcag 960

aactcgtggc cattcccctc cgacaaggtc atgcagggct acgcctatat cctcacgcac

1020

ccaggaactc catgcatctt ctacgaccac gttttcgact ggaacctgaa gcaggagatc

1080

agcgcgctgt ctgcggtgag gtcaagaaac gggatccacc cggggagcga gctgaacatc

1140

ctcgccgccg acggggatct ctacgtcgcc aagattgacg acaaggtcat cgtgaagatc

1200

gggtcacggt acgacgtcgg gaacctgatc ccctcagact tccacgccgt tgcccctggc

1260

aacaactact gcgtttggga gaagcacggt ctgagagttc cagcggggcg gcaccactag

1320

<---

Изобретение относится к биотехнологии и сельскому хозяйству и представляет собой способ повышения эффективности использования кормов для молокообразования молочным животным, при этом способ включает скармливание животному в количестве, эффективном для повышения эффективности использования кормов молочным животным, корма для животных, содержащего растительный материал из трансгенного маиса, где растительный материал из трансгенного маиса содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантную α-амилазу, где рекомбинантная α-амилаза характеризуется по меньшей мере приблизительно 80%-ной идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью с SEQ ID NO: 1. Изобретение позволяет повысить эффективность использования кормов. 14 з.п. ф-лы, 3 ил., 22 табл., 15 пр.

1. Способ повышения эффективности использования кормов для молокообразования молочным животным, при этом способ включает скармливание животному в количестве, эффективном для повышения эффективности использования кормов молочным животным, корма для животных, содержащего растительный материал из трансгенного маиса, где растительный материал из трансгенного маиса содержит полинуклеотид, кодирующий рекомбинантную α-амилазу, где

рекомбинантная α-амилаза характеризуется по меньшей мере приблизительно 80%-ной идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью с SEQ ID

NO: 1.

2. Способ по п. 1, где эффективность использования кормов для молокообразования увеличивается на по меньшей мере приблизительно 0,02.

3. Способ по п. 1 или 2, где молочное животное представляет собой корову.

4. Способ по п. 1 или 2, где молочное животное представляет собой козу.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где полинуклеотид содержит нуклеотидную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%-ной идентичностью последовательности с нуклеотидной последовательностью под SEQ ID NO: 2 и/или SEQ ID NO: 3.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где альфа-амилаза представляет собой термостабильную альфа-амилазу.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где рекомбинантная α-амилаза представляет собой α-амилазу 797GL3 или D45.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где растительный материал из маиса содержит трансформант 3272 маиса.

9. Способ по любому из пп. 1-8, где рекомбинантная α-амилаза нацелена в сторону, противоположную ее субстрату.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где рекомбинантная α-амилаза нацелена на хлоропласт, вакуоль, цитоплазму, апопласт или эндоплазматический ретикулум.

11. Способ по любому из пп. 1-10, где рекомбинантная α-амилаза нацелена на эндоплазматический ретикулум.

12. Способ по любому из пп. 1-11, где полинуклеотид, кодирующий рекомбинантную α-амилазу, экспрессируется в ядре.

13. Способ по любому из пп. 1-12, где корм для животных включает гранулы, зерно, силос, ядра сухого плющения, хлопья из ядер, полученные при воздействии пара, цельные ядра, грубодробленые ядра, кукурузу с высокой степенью влажности или любую их комбинацию, содержащие растительный материал из трансгенного маиса.

14. Способ по любому из пп. 1-13, где корм для животных содержит по меньшей мере приблизительно 10% по весу в расчете на сухое вещество растительного материала из трансгенного маиса.

15. Способ по любому из пп. 1-14, где корм для животных представляет собой общий смешанный рацион, содержащий растительный материал из трансгенного маиса.