Фагобиотик - комбинированное лекарственное средство на основе бактериофагов и пробиотиков Российский патент 2025 года по МПК A61K35/747 A61K35/76 C12N7/00 A61P31/04 C12R1/92 C12R1/225 

Область техники

Изобретение относится к области ветеринарии, медицины, биотехнологии, микробиологии и может быть использовано при производстве терапевтических и профилактических лекарственных средств ветеринарного и медицинского назначения, кормовых добавок для животных и биологически активных добавок для людей. Фагобиотик представляет собой смесь синбиотических компонентов, состоящих из про- и пребиотика, а также бактериофагов, обладающих антагонистической и антибактериальной активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов желудочно-кишечного тракта людей и сельскохозяйственных животных (в частности, свиней и птиц).

Уровень техники

Известен целый ряд зарегистрированных на территории РФ препаратов (лекарственных средств и кормовых добавок) на основе штаммов лактобацилл, в частности: Гипролам; Иммунобак; Велес 6.59; ЭМ-Вита; Лайфсейф; Олл-Лак™ ХCL 5X; Биосиб; "БИОСИЛ-НН"; Пиг Протектор; Лактоферм Лаг Про; Эмпробио; ЛАКТОБИФАДОЛ ФОРТЕ и т.д. Несмотря на кажущееся разнообразие подобного рода средств, существует необходимость в поиске и создании новых композиций, способных оказывать не только местное антагонистическое и антибактериальное действие в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, но и системное, тем самым повышая эффективность лекарственных средств и кормовых добавок данной категории. Как известно, пробиотические штаммы способны оказывать лишь местное действие (колонизацию эпителия кишечника, продуцирование антибактериальных метаболитов в кишечнике и т.д.), но не проникать в другие органы и ткани. Системное действие обуславливается именно содержанием в препаратах новой, предлагаемой группы - бактериофагов, которые, как известно, способны функционировать и обеспечивать профилактический и терапевтический эффект не только в кишечнике, но и в других локализациях.

Известна «Антибактериальная композиция на основе штаммов бактериофагов для профилактики или лечения сальмонеллеза и/или эшерихиоза сельскохозяйственных животных или птиц, или человека» [RU2705302], в которой использовали коктейль бактериофагов для профилактики и борьбы с коли-сальмонеллезной инфекцией в сельском хозяйстве, а также в медицине. Недостатком указанного изобретения является ограниченный спектр антибактериальной активности. Указанное изобретение возможно использовать исключительно для борьбы с колибактериозом и сальмонеллезом, так как бактериофаги видоспецифичны только для указанных микроорганизмов.

Из уровня техники известен пробиотический препарат ветеринарного назначения [RU2166324], в котором используются пробиотические штаммы Bifidobacterium globosum ВГНКИ БФ-4-ДЕП, штамм Streptococcus faecium ВГНКИ 27/11-В-ДЕП и комбинация вирулентных полирецепторных стафилококковых бактериофагов. Данное изобретение можно считать прототипом настоящего изобретения.

Раскрытие изобретения

Задачей настоящего изобретения является создание новой категории лечебно-профилактических средств на основе про- и пребиотического компонентов, а также бактериофагов, сочетанное действие которых нацелено на повышение эффективности проводимых оздоровительных мероприятий в медицинской и ветеринарной практике.

Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке композиции для профилактики и/или лечения инфекционного заболевания у человека или животного, основанной на комбинации пробиотических штаммов лактобацилл, обладающих широкой антагонистической активностью по отношению к микроорганизмам, которые способствуют возникновению заболеваний людей и животных (в том числе птиц), в частности вызывающие желудочно-кишечные и системные инфекции, а также обладают высокой колонизационной способностью в желудочно-кишечном тракте в сочетании с коктейлем вирулентных бактериофагов, а также с пребиотическим компонентом для питания пробиотиков. То есть композиция по изобретению основана на смеси синбиотических компонентов. Как уже отмечено, преимуществом предлагаемого изобретения является факт колонизации кишечника пробиотическим компонентом, после элиминации бактериофагами патогенов, что обеспечивает формирование нормофлоры. Иными словами, освобожденная микробиологическая ниша после применения бактериофагов, заселяется не патогенными изолятами бактерий, а сразу пробиотическими штаммами лактобацилл.

Изобретение обеспечивает эффективную совместимую комбинацию пробиотических штаммов лактобацилл, обладающих широкой антагонистической активностью по отношению к микроорганизмам, вызывающим заболевания людей и животных (в том числе птиц), и высокой колонизационной способностью в желудочно-кишечном тракте, в сочетании с коктейлем высоковирулентных специфических к сальмонеллам и эшерихиям бактериофагов и пребиотического компонента для питания пробиотиков. Таким образом, композиция по изобретению характеризуется широким спектром антибактериальной активности в отношении широко спектра патогенов за счет антибактериальной и антагонистической активности по отношению к ним.

Указанный технический результат достигается посредством композиции для профилактики и/или лечения инфекционного заболевания у человека или животного, включающей:

- эффективное количество смеси живых лиофилизированных бактериофагов штамма Escherichia coli BF-1351, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF-1351, штамма Salmonella enteritidis BF-1354, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF-1354, штамма Salmonella infantis BF-1355, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF-1355, и штамма Salmonella typhimurium BF-1356, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером BF-1356;

- эффективное количество смеси лиофилизированных пробиотических культур штамма Lactobacillus paracasei B-1037, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1037, штамма Lactobacillus fermentum B-1038, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1038, штамма Lactobacillus helveticus B-1039, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1039, штамма Lactobacillus rhamnosus B-1041, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1041, штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) под номером B-1042;

- по меньшей мере, одно вспомогательное вещество.

В частных вариантах воплощения изобретения вспомогательное вещество представляет собой фруктоолигосахарид.

В частных вариантах воплощения изобретения композиция включает:

- смесь живых лиофилизированных бактериофагов штамма Escherichia coli BF-1351, штамма Salmonella enteritidis BF-1354, штамма Salmonella infantis BF-1355 и штамма Salmonella typhimurium BF-1356 содержит по 1*10⁵-9*10⁷ БОЕ/г каждого бактериофага;

- общее количество смеси лиофилизированных пробиотических культур штамма Lactobacillus paracasei B-1037, штамма Lactobacillus fermentum B-1038, штамма Lactobacillus helveticus B-1039, штамма Lactobacillus rhamnosus B-1041, штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042 составляет 1*10⁸-9*10⁹ КОЕ/г;

- вспомогательное вещество - фруктоолигосахарид - до 1 кг общей массы композиции.

В частных вариантах воплощения изобретения композиция включает:

- бактериофаг штамма Escherichia coli BF-1351 в количестве 4.8*10⁶ БОЕ/г, бактериофаг штамма Salmonella enteritidis BF-1354 в количестве 7.7*10⁶ БОЕ/г, бактериофаг штамма Salmonella infantis BF-1355 в количестве 3.6*10⁷ БОЕ/г и бактериофаг штамма Salmonella typhimurium BF-1356 в количестве 5.7*10⁶ БОЕ/г;

- смесь лиофилизированных пробиотических культур штамма Lactobacillus paracasei B-1037, штамма Lactobacillus fermentum B-1038, штамма Lactobacillus helveticus B-1039, штамма Lactobacillus rhamnosus B-1041, штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042 в количестве 8.2*10⁹ КОЕ/г;

- вспомогательное вещество - фруктоолигосахарид - до 1 кг общей массы композиции.

В частных вариантах воплощения изобретения фруктоолигосахарид представляет собой чистый растворимый инулин.

Настоящее изобретение также включает применение композиции по изобретению для профилактики и/или лечения инфекционного заболевания у человека или животного.

В частных вариантах воплощения изобретения инфекционное заболевание вызвано бактериальной инфекцией. В частных вариантах воплощения изобретения заболевание вызвано патогенным или условно-патогенным микроорганизмом желудочно-кишечного тракта. Более конкретно заболевание вызвано бактерией Р. aeruginosa, C. albicans, E. coli, Kl. pneumonia, Pr. mirabilis, Pr. vulgaris, S. aureus, Salmonella spp., Sh. sonnei, Str. Pneumoniae. В частных вариантах воплощения изобретения заболевание представляет собой сальмонеллез, колибактериоз, стафилококкоз, псевдомоноз, кандидоз, протейную инфекцию, стрептококковую инфекцию, клебсиеллез, шигеллез.

В частных вариантах воплощения изобретения животное представляет собой млекопитающее или птицу.

В частных вариантах воплощения изобретения композиция дополнительно содержит штаммы любых известных бактериофагов, в частности способных лизировать такие виды микроорганизмов как: Acinetobacter, Actinobacillus, Aerococcus, Aeromonas, Aggregatibacter, Alcaligenes, Arcanobacterium, Avibacterium, Bacillus, Bibersteinia, Bordetella, Brochotrix, Burkholderia, Buttiauxella, Caenimicrobium, Campylobacter, Citrobacter, Clostridium, Corynebacterium, Edwardsiella, Enterobacillus, Enterobacter, Enterococcus, Erysipelothrix, Erwinia, Gallibacterium, Hafnia, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Kluyvera, Kocuria, Leminorella, Listeria, Macrococcus, Mannheimia, Moraxella, Morganella, Neisseria, Oligella, Paenibacillus, Pantoea, Pasteurella, Proteus, Providencia, Pseudomonas, Raoultella, Ralstonia, Riemerella, Rothia, Serratia, Shigella, Staphylococcus, Stenotrophomonas, Streptococcus, Vagococcus, Vibrio, Yersinia и т.д., а также штаммов пробиотических культур относящихся к различным родам, в частности: Bifidobacterium, Streptococcus, Bacillus, Escherichia, Leuconostoc, Pediococcus, Propionibacterium, Aerococcus, Enterococcus, Saccharomyces, Weissella и т.д.

Настоящее изобретение также включает применение композиции по изобретению в качестве пищевой добавки и/или включения в любую форму пищи (в качестве кормовой добавки) для животных.

В частных вариантах воплощения изобретения композиция представлена в составе функционального продукта и/или фармацевтического препарата, предназначенного для животных. В частных вариантах воплощения изобретения животное представляет собой млекопитающее или птицу.

Технический результат также достигается посредством осуществления способа профилактики и/или лечения бактериального заболевания у человека или животного, включающего введение композиции по изобретению в эффективном профилактическом или терапевтическом количестве.

В частных вариантах воплощения изобретения композиция вводится в качестве пищевой добавки и/или включения в любую форму пищи (в качестве кормовой добавки) для животных.

В частных вариантах воплощения изобретения композиция представлена в составе функционального продукта и/или фармацевтического препарата, предназначенного для животных.

Подробное раскрытие изобретения

Определения (термины)

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Термин «и/или» означает один, несколько или все перечисленные элементы.

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

Под «эффективным количеством» (терапевтически или профилактически) подразумевается такое количество композиции, вводимой или доставляемой субъекту (человеку или животному), при котором у субъекта с наибольшей вероятностью проявится желаемая реакция на лечение (профилактику). Точное требуемое количество может меняться от субъекта к субъекту в зависимости от возраста, массы тела и общего состояния субъекта, тяжести заболевания, методики введения композиции, комбинированного лечения с другими препаратами и т.п.

Термин «вспомогательное вещество» при использовании в настоящем описании относится к веществам, которые не нарушают биологической активности и свойств бактерий и являются приемлемыми для использования в медицине или ветеринарии (безопасность для применения в медицине или ветеринарии). Частные варианты вспомогательных веществ включают пребиотики, носители или разбавители (растворители), например, воду.

Термин «фагобиотик» (композиция по изобретению) в настоящем документе означает ряд средств и препаратов, в основе которого лежат бактериофаги, направленные на нормализацию микробиома в отдельной локализации (ротовая полость, желудочно-кишечный тракт, мочеполовая система и т.д.) [Сулаквелидзе А. Фагобиотики для здоровой жизни // Наука из первых рук. 4(70), 2016 г, 66-73 с.].

Осуществление изобретения

Приведенные ниже примеры являются иллюстративными и тем самым не ограничивают рамки настоящего изобретения.

Пример №1. Авторский штамм бактериофага BF-1351, лизирующий бактерии E. Coli.

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: BF-1351.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: бактериофаг BF-1351, лизирующий бактерии E. coli B-1027.

4. Основание для депонирования: литическая активность по отношению к E. Coli.

5. Область применения: для производства средств профилактики, борьбы, лечения, фагодиагностики эшерихиоза птиц и животных.

6. Дата, источник и место выделения: 2015 г., проба сточных вод, Московская область.

7. Где идентифицирована культура: Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, лаборатория клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов.

8. Методы идентификации: культурально-морфологические, молекулярно-генетические.

9. Свойства и культуральные особенности: обладает литической активностью по отношению к E. coli. На чувствительном штамме образует прозрачные негативные колонии диаметром 1 мм, без ореола.

10. Условия культивирования: для наработки бактериофага BF-1351 используется штамм E. coli B-1027. В жидких питательных средах (LB-бульон, ГРМ-бульон) при температуре 37 °С в течение 4-6 ч., выход фага составляет 10⁹ БОЕ/мл.

11. Условия хранения: в лиофилизированном состоянии, сахарозо-желатиновая защитная среда, хранение при температуре (4 - 8) °С, срок хранения 5 лет.

Пример №2. Авторский штамм бактериофага BF-1354, лизирующий бактерии Salmonella enteritidis

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: BF-1354.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: бактериофаг BF-1354, лизирующий бактерии Salmonella enterica серотипа Enteritidis.

4. Основание для депонирования: литическая активность по отношению к Salmonella enterica серотипа Enteritidis.

5. Область применения: для производства средств профилактики, борьбы, лечения, фагодиагностики сальмонеллеза птиц и животных.

6. Дата, источник и место выделения: 2015г., проба фекалий кур, Белгородская область.

7. Где идентифицирована культура: Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, лаборатория клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов.

8. Методы идентификации: культурально-морфологические, молекулярно-генетические.

9. Свойства и культуральные особенности: обладает литической активностью по отношению к Salmonella Enteritidis. На чувствительном штамме образует прозрачные негативные колонии диаметром 2-3 мм. При культивировании в жидкой среде на чувствительном штамме концентрация составляет 10¹¹ БОЕ/мл.

10. Условия культивирования: для наработки фага BF-1354 используется штамм Salmonella enterica серовар Enteritidis B-1024.

11. Условия хранения: в лиофилизированном состоянии, сахарозо-желатиновая защитная среда, хранение при температуре (4 - 8) °С, срок хранения 5 лет.

Пример №3. Авторский штамм бактериофага BF-1355, лизирующий бактерии Salmonella infantis

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: BF-1355.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: бактериофаг BF-1355, лизирующий бактерии Salmonella enterica серотипа Infantis.

4. Основание для депонирования: литическая активность по отношению к Salmonella enterica серотипа Infantis.

5. Область применения: для производства средств профилактики, борьбы, лечения, фагодиагностики сальмонеллеза птиц и животных.

6. Дата, источник и место выделения: 2016г., проба фекалий кур, Челябинская область.

7. Где идентифицирована культура: Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, лаборатория клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов.

8. Методы идентификации: культурально-морфологические, молекулярно-генетические.

9. Свойства и культуральные особенности: обладает литической активностью по отношению к Salmonella enterica серотипа Infantis. На чувствительном штамме образует мутные негативные колонии диаметром 2 мм. При культивировании в жидкой среде на чувствительном штамме концентрация составляет 10¹⁰ БОЕ/мл.

10. Условия культивирования: для наработки фага BF-1355 используется штамм Salmonella infantis B-1026.

11. Условия хранения: в лиофилизированном состоянии, сахарозо-желатиновая защитная среда, хранение при температуре (4 - 8) °С, срок хранения 5 лет.

Пример №4. Авторский штамм бактериофага BF-1356, лизирующий бактерии Salmonella typhimurium

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: BF-1356.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: бактериофаг BF-1356, лизирующий бактерии Salmonella enterica серотипа Typhimurium.

4. Основание для депонирования: литическая активность по отношению к Salmonella enterica серотипа Typhimurium.

5. Область применения: для производства средств профилактики, борьбы, лечения, фагодиагностики сальмонеллеза птиц и животных.

6. Дата, источник и место выделения: 2016 г., проба фекалий кур, Ростовская область.

7. Где идентифицирована культура: Федеральное бюджетное учреждение науки Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского, лаборатория клинической микробиологии и биотехнологии бактериофагов.

8. Методы идентификации: культурально-морфологические, молекулярно-генетические.

9. Свойства и культуральные особенности: обладает литической активностью по отношению к Salmonella enterica серотипа Typhimurium. На чувствительном штамме образует прозрачные негативные колонии диаметром 2-3 мм. При культивировании в жидкой среде на чувствительном штамме концентрация составляет 10¹¹ БОЕ/мл.

10. Условия культивирования: для наработки фага BF-1356 используется штамм Salmonella Typhimurium B-1025.

11. Условия хранения: в лиофилизированном состоянии, сахарозо-желатиновая защитная среда, хранение при температуре (4 - 8) °С, срок хранения 5 лет.

Пример №5. Авторский штамм микроорганизма Lactobacillus paracasei B-1037

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1037.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: Lactobacillus paracasei.

4. Номер в других коллекциях (синонимы): отсутствует.

5. Основание для депонирования: штамм предназначен для производства пробиотических лекарственных средств для ветеринарного применения.

6. Родословная: нет.

7. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Lactobacillus paracasei не относятся ни к одной из четырёх групп патогенности.

8. Заключение о группе патогенности: не патогенный для белых мышей.

9. Дата, источник и место выделения: из кишечника здоровых суточных поросят, свиноводческого предприятия Тамбовской области в 2017 году.

10. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

11. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств, а также с помощью масспектрального анализа.

12. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными палочками, размером 0,6 – 0,9 х 1,5 – 6,0 мкм, в мазках расположены в виде отдельных клеток или цепочками. Клетки неподвижны, спор не образуют.

13. Культуральные особенности: на МРС агаре спустя 24-48 часов культивирования в СО₂-инкубаторе с концентрацией 10% СО₂ при температуре 37±0,5 °С образуются мелкие белые блестящие слизистые колонии S-формы, пигмент не образует. В МРС бульоне вызывает помутнение, образует осадок. Факультативный анаэроб, микроаэрофил.

14. Биохимические свойства: индол-, глюкоза+, мальтоза+, фруктоза+, галактоза+, лактоза+, мелецитоза+, уреаза-, нитраты-, сахароза+, салицин+, трегалоза+, маннитол+, рамноза+, N-Ацетил-β-D-глюкозаминидаза-, β-Глюкозидаза-, эскулин-, манноза+, раффиноза+, целлобиоза+, ксилоза+, арабиноза+, сорбитол+.

15. Серологические свойства: не определялось.

16. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

17. Вирулентность для лабораторных животных: не патогенен для мышей при внутримышечном, подкожном, внутрибрюшинном введении.

18. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к кларитромицину, дорипенему, цефалексину, хлортетрациклину; резистентен к нафциллину, азтреонаму, ампициллину, ванкомицину, канамицину, оксациллину, офлоксацину, пефлоксацину, полимиксину, сульфадиазину, сульфафуразолу, фосфомицину, цефепиму, ципрофлоксацину, цефпирому.

19. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось

20. Генетические характеристики: не определялось.

21. Условия культивирования: штамм растёт на МРС бульоне и агаре. Оптимальным значением pH при культивировании является диапазон 5,5-6,0. Оптимальная температура для культивирования 35-38 °С.

22. Условия хранения: штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах. Объём лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения +4…+8 °С. Срок хранения 5 лет.

Пример №6. Авторский штамм микроорганизма Lactobacillus fermentum B-1038

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1038.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: Lactobacillus fermentum.

4. Номер в других коллекциях (синонимы): отсутствует.

5. Основание для депонирования: штамм предназначен для производства пробиотических лекарственных средств для ветеринарного применения.

6. Родословная: нет.

7. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Lactobacillus fermentum не относятся ни к одной из четырёх групп патогенности.

8. Заключение о группе патогенности: не патогенный для белых мышей.

9. Дата, источник и место выделения: из кишечника здоровых цыплят, птицеводческого предприятия Белгородской области в 2017 году.

10. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

11. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств, а также с помощью масспектрального анализа.

12. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными палочками, размером 0,8 – 1,0 х 2,0 – 4,0 мкм, в мазках расположены в виде отдельных клеток или цепочками. Клетки неподвижны, спор не образуют.

13. Культуральные особенности: на МРС агаре спустя 24-48 часов культивирования в СО₂-инкубаторе с концентрацией 10% СО₂ при температуре 37±0,5 °С образуются белые блестящие колонии S-формы диаметром 0,5-1,0 мм, пигмент не образует. В МРС бульоне вызывает помутнение, образует осадок. Факультативный анаэроб, микроаэрофил.

14. Биохимические свойства: индол-, глюкоза+, мальтоза+, фруктоза+, галактоза+, лактоза+, мелецитоза+, уреаза-, нитраты-, сахароза+, салицин+, трегалоза+, маннитол+, рамноза+, N-Ацетил-β-D-глюкозаминидаза-, β-Глюкозидаза-, эскулин-, манноза+, раффиноза+, целлобиоза+, ксилоза+, арабиноза+, сорбитол+.

15. Серологические свойства: не определялось.

16. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

17. Вирулентность для лабораторных животных: не патогенен для мышей при внутримышечном, подкожном, внутрибрюшинном введении.

18. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к эритромицину, цефтриаксону, цефпирому, бацитрацину, кларитромицину, тетрациклину, тилозину, спирамицину, пристиномицину, линкомицину; резистентен к нафциллину, азтреонаму, бензилпенициллину, ванкомицину, норфлоксацину, оксациллину, пефлоксацину, полимиксину, фосфомицину, ципрофлоксацину.

19. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось.

20. Генетические характеристики: не определялось.

21. Условия культивирования: штамм растёт на МРС бульоне и агаре. Оптимальным значением pH при культивировании является диапазон 4,0-8,5. Оптимальная температура для культивирования 30-37 °С.

22. Условия хранения: штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах. Объём лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения +4…+8 °С. Срок хранения 5 лет

Пример №7. Авторский штамм микроорганизма Lactobacillus helveticus B-1039

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1039.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: Lactobacillus helveticus.

4. Номер в других коллекциях (синонимы): отсутствует.

5. Основание для депонирования: штамм предназначен для производства пробиотических лекарственных средств для ветеринарного применения.

6. Родословная: нет.

7. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Lactobacillus helveticus не относятся ни к одной из четырёх групп патогенности.

8. Заключение о группе патогенности: не патогенный для белых мышей.

9. Дата, источник и место выделения: из кишечника здоровых индюшат, птицеводческого предприятия Пензенской области в 2018 году.

10. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

11. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств, а также с помощью масспектрального анализа.

12. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными палочками, размером 0,6 – 0,9 х 1,5 – 6,0 мкм, в мазках расположены в виде отдельных клеток или короткими цепочками. Клетки неподвижны, спор не образуют.

13. Культуральные особенности: на МРС агаре спустя 24-48 часов культивирования в СО₂-инкубаторе с концентрацией 10% СО₂ при температуре 37±0,5 °С образуются белые блестящие слизистые колонии S-формы диаметром 0,5-1,5 мм, пигмент не образует. В МРС бульоне не вызывает помутнение, образует осадок. Факультативный анаэроб, микроаэрофил.

14. Биохимические свойства: индол-, глюкоза+, мальтоза+, фруктоза+, галактоза+, лактоза+, мелецитоза+, уреаза-, нитраты-, сахароза+, салицин+, трегалоза+, маннитол+, рамноза+, N-Ацетил-β-D-глюкозаминидаза-, β-Глюкозидаза-, эскулин-, манноза+, раффиноза+, целлобиоза+, ксилоза+, арабиноза+, сорбитол+.

15. Серологические свойства: не определялись.

16. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

17. Вирулентность для лабораторных животных: не патогенен для мышей при внутримышечном, подкожном, внутрибрюшинном введении.

18. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к цефтриаксону, цефазолину, хлортетрациклину, тетрациклину, стрептомицину, окситетрациклину, офлоксацину, бацитрацину; резистентен к ципрофлоксацину, сульфафуразолу, сульфадиазину, полимиксину, норфлоксацину, оксациллину, бензилпенициллину, азтреонаму, нафциллину.

19. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось

20. Генетические характеристики: не определялось.

21. Условия культивирования: штамм растёт на МРС и ГРМ бульоне и агаре. Оптимальным значением pH при культивировании является диапазон 5,5-6,0. Оптимальная температура для культивирования 35-38 °С.

22. Условия хранения: штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах. Объём лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения +2…+8 °С. Срок хранения 5 лет.

Пример №8. Авторский штамм микроорганизма Lactobacillus rhamnosus B-1041

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1041.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: Lactobacillus rhamnosus.

4. Номер в других коллекциях (синонимы): отсутствует.

5. Основание для депонирования: предназначен для производства пробиотических лекарственных средств для ветеринарного применения.

6. Родословная: нет.

7. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Lactobacillus rhamnosus не относятся ни к одной из четырёх групп патогенности.

8. Заключение о группе патогенности: не патогенный для белых мышей.

9. Дата, источник и место выделения: из кишечника здоровых цыплят, птицеводческого предприятия Новосибирской области в 2018 году.

10. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

11. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств, а также с помощью масспектрального анализа.

12. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными палочками, размером 0,7–1,1 х 2,0–4,0 мкм, в мазках расположены в виде отдельных клеток или цепочками. Клетки неподвижны, спор не образуют.

13. Культуральные особенности: на МРС агаре спустя 24-48 часов культивирования в СО₂-инкубаторе с концентрацией 10% СО₂ при температурном режиме 37±0,5 °С образуются блестящие слизистые колонии кремового цвета S-формы, диаметром 0,3-2,0 мм, пигмент не образует. В МРС бульоне вызывает помутнение, образует осадок. Факультативный анаэроб, микроаэрофил.

14. Биохимические свойства: индол-, глюкоза+, мальтоза+, фруктоза+, галактоза+, лактоза+, мелецитоза+, уреаза-, нитраты-, сахароза+, салицин+, трегалоза+, маннитол+, рамноза+, N-Ацетил-β-D-глюкозаминидаза-, β-Глюкозидаза-, эскулин+, манноза+, раффиноза+, целлобиоза+, ксилоза+, арабиноза+, сорбитол+.

15. Серологические свойства: не определялось.

16. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

17. Вирулентность для лабораторных животных: не патогенен при внутримышечном, подкожном, внутрибрюшинном введении.

18. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к кларитромицину, хлортетрациклину, амоксиклаву, эритромицину; резистентен к нафциллину, азтреонаму, бензилпенициллину, ванкомицину, гентамицину, дорипенему, канамицину, оксациллину, полимиксину, сульфадиазину, сульфафуразолу, фосфомицину, цефалексину, цефепиму, цефпирому, ципрофлоксацину.

19. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось.

20. Генетические характеристики: не определялось.

21. Условия культивирования: штамм растёт на МРС бульоне и агаре. Оптимальным значением pH при культивировании является диапазон 4,0-8,5. Оптимальная температура для культивирования 10-40 °С.

22. Условия хранения: штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах. Объём лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения +2…+8 °С. Срок хранения 5 лет.

Пример №9. Авторский штамм микроорганизма Lactobacillus delbrueckii B-1042

1. Номер штамма в «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных»: B-1042.

2. Дата депонирования: 18.01.2019.

3. Вид микроорганизма: Lactobacillus delbrueckii.

4. Номер в других коллекциях (синонимы): отсутствует.

5. Основание для депонирования: штамм предназначен для производства пробиотических лекарственных средств для ветеринарного применения.

6. Родословная: нет.

7. Патогенность: в соответствии с классификацией микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов биологического происхождения по группам патогенности санитарных правил 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней» бактериальные агенты вида Lactobacillus delbrueckii не относятся ни к одной из четырёх групп патогенности.

8. Заключение о группе патогенности: не патогенный для белых мышей.

9. Дата, источник и место выделения: из кишечника здоровой птицы, птицеводческого предприятия Ярославской области в 2018 году.

10. Где идентифицирована культура: лаборатория диагностики и контроля антибиотикорезистентности возбудителей наиболее клинически значимых инфекционных болезней животных ФГБНУ ФНЦ ВИЭВ РАН.

11. Методы идентификации: штамм был идентифицирован на основании изучения культуральных, морфологических, ферментативных свойств, а также с помощью масспектрального анализа.

12. Морфологические признаки: клетки микроорганизма при окрашивании по методу Грама являются грамположительными палочками, размером 0,5 – 0,8 х 2,0 – 9,0 мкм, в мазках расположены в виде отдельных клеток или цепочками. Клетки неподвижны, спор не образуют.

13. Культуральные особенности: на МРС агаре спустя 24-48 часов культивирования в СО₂-инкубаторе с концентрацией 10% СО₂ при температуре 37±0,5 °С образуются мелкие полупрозрачные блестящие колонии светло-серого цвета S-формы, пигмент не образует. В МРС бульоне вызывает помутнение, образует осадок. Факультативный анаэроб, микроаэрофил.

14. Биохимические свойства: индол-, глюкоза+, мальтоза-, фруктоза+, галактоза-, лактоза+, мелецитоза-, уреаза-, нитраты-, сахароза-, салицин-, трегалоза-, маннитол-, рамноза-, N-Ацетил-β-D-глюкозаминидаза-, β-Глюкозидаза-, эскулин-, манноза+, раффиноза-, целлобиоза-, ксилоза-, арабиноза-, сорбитол-.

15. Серологические свойства: не определялось.

16. Продукция антигенов, ферментов, токсинов: не определялось.

17. Вирулентность для лабораторных животных: не патогенен для мышей при внутримышечном, подкожном, внутрибрюшинном введении.

18. Устойчивость к антибактериальным препаратам: штамм чувствителен к цефтриаксону, цефпирому, цефалексину, цефепиму, цефазолину, норфлоксацину, ванкомицину, бацитрацину, бензилпенициллину; резистентен к левофлоксацину, пефлоксацину, пристиномицину, сульфадиазину, сульфафуразолу, тетрациклину, фосфомицину, цефотаксиму, ципрофлоксацину.

19. Отношение к гомо- и гетерологичным фагам (профаги): не определялось.

20. Генетические характеристики: не определялось.

21. Условия культивирования: штамм растёт на МРС бульоне и агаре. Оптимальным значением pH при культивировании является диапазон 5,5-6,2. Оптимальная температура для культивирования 32-50 °С.

22. Условия хранения: штамм хранят в лиофилизированном виде в ампулах. Объём лиофилизата составляет 1 см³. Температура хранения +2…+8 °С. Срок хранения 5 лет.

Пример №10. Определение антагонистической активности штаммов лактобацилл

Определение антагонистической активности штамма проводили с помощью метода отсроченного антагонизма, согласно МУ 2.3.2.2789-10 «Методические указания, по санитарно-эпидемиологической оценке, безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов» раздел 6.4.1.1. Исследование антагонистической активности Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., в отношении тест-культур патогенных и условно-патогенных микроорганизмов различных групп методом отсроченного антагонизма. Москва, 2011. В ходе испытания производили посев исследуемых культур бляшками размером не более 10 мм, но не более трех бляшек на чашку с оптимальной питательной средой, далее проводили культивирование при 37 °С, 24 - 48 ч. Лактобациллы выращивали как в аэробных, так и в анаэробных условиях; после чего проводилась ингибиция выращенных культур УФ-лучами 30 мин; в 0,7 % полужидкий мясопептонный агар (далее МПА) при температуре 50 °С вносили 1 мл суспензии тест-культуры, далее культура размешивалась и наслаивалась на исследуемые культуры; по истечении 15-20 минут чашки переворачивали и культивировали 18-24 ч при температуре 37 °С. Учет результатов проводили измеряя диаметр задержки роста тестовой культуры кронциркулем в мм. Наличие антагонистической активности принималось при размере зоны задержки роста от 20 мм.

В ходе проведения исследования по изучению антагонистической активности исследуемых штаммов, были получены результаты, представленные в таблице 1.

Согласно данным таблицы 1, исследуемые штаммы имели антагонистическую активность ко всем испытуемым патогенным микроорганизмам. Наибольшую антагонистическую активность проявил штамм Lactobacillus rhamnosus B-1041.

Пример №11. Определение токсигенности штаммов лактобацилл

Определение токсигенности испытуемых пробиотических штаммов с использованием лабораторных животных (мышей) проводили согласно МУК 4.2.2602-10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» Москва, 2010.

Токсигенность испытуемых штаммов изучали на половозрелых самках и самцах инбредных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1), массой от 10 до 14 г. За животными проводили ежедневное наблюдение, отмечая в протоколе исследования количество живых и павших животных. Для определения токсигенности культуры испытуемых штаммов, их сеяли на жидкую питательную среду, выдерживали в термостате при 37 °С в течение 10 суток для накопления в ней токсина, если такой продуцируется штаммом. Далее проводили фильтрование через бактериальный фильтр. Полученный фильтрат вводили внутрибрюшинно неразведенным в различных объемах: 0,1 мл, 0,5 мл, 1,0 мл.

Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе отражен в таблице 2.

Таблица 2 – Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе при изучении токсигенных свойств лактобацилл у мышей C57BL/6 и ICR (CD-1).

№ группы Штамм Объем, мл Кол-во животных (и номера животных) Самцы Самки 1 2 3 4 5 1 Плацебо 0,1 Подгруппа 1 (1-5) Подгруппа 2 (106-110) 2 0,5 Подгруппа 3 (6-10) Подгруппа 4 (111-115) 3 1 Подгруппа 5 (11-15) Подгруппа 6 (116-120) 4 Lactobacillus paracasei B-1037 0,1 Подгруппа 7 (16-20) Подгруппа 8 (121-125) 5 0,5 Подгруппа 9 (21-25) Подгруппа 10 (126-130) 6 1 Подгруппа 11 (26-30) Подгруппа 12 (131-135) 7 Lactobacillus fermentum B-1038 0,1 Подгруппа 13 (31-35) Подгруппа 14 (136-140) 8 0,5 Подгруппа 15 (36-40) Подгруппа 16 (141-145) 9 1 Подгруппа 17 (41-45) Подгруппа 18 (146-150) 10 Lactobacillus helveticus B-1039 0,1 Подгруппа 19 (46-50) Подгруппа 20 (151-155) 11 0,5 Подгруппа 21 (51-55) Подгруппа 22 (156-160) 12 1 Подгруппа 23 (56-60) Подгруппа 24 (161-165) 13 Lactobacillus rhamnosus B-1041 0,1 Подгруппа 31 (76-80) Подгруппа 32 (181-185) 14 0,5 Подгруппа 33 (81-85) Подгруппа 34 (186-190) 15 1 Подгруппа 35 (86-90) Подгруппа 36 (191-195) 16 Lactobacillus delbrueckii B-1042 0,1 Подгруппа 37 (91-95) Подгруппа 38 (196-200) 17 0,5 Подгруппа 39 (96-100) Подгруппа 40 (201-205) 18 1 Подгруппа 41 (101-105) Подгруппа 42 (206-210)

На основании полученных данных, в ходе изучения токсигенности штаммов лактобацилл можно сделать заключение о том, что исследуемые штаммы не обладают токсигенностью в исследовании на самках и самцах лабораторных мышей двух разных линий.

При проведении клинического осмотра животных, используемых при оценке токсигенности вышеобозначенных штаммов, оценивали следующие показатели: положение тела животного, состояние глаз (слезотечение, выделение секрета), носа, характер стула, аппетит, характер дыхания, состояние шерстного покрова (пилоэрекция, выпадение шерсти, изменение цвета шерстного покрова). Особое внимание уделяли поведенческим реакциям животных, как основному показателю, отражающему состояние нервной системы. Оценивали степень возбудимости животных по уровню двигательной активности и агрессивности, рефлексы «позы», «походки» и другие нарушения.

На протяжении всего эксперимента у данных животных сохранялись нормальный внешний вид, шерстный покров, характер выделений, поведенческие реакции не отличались от подобных показателей у животных контрольных подгрупп. Отсутствовали различия в реакции на взятие в руки животных контрольных подгрупп, и подгрупп, получавших плацебо. Вокализация у мышей на взятие в руки и/или перемещение из клетки у животных отсутствовала, но у отдельных особей фиксировались кратковременные писки во время извлечения их из клетки и нахождения в руках. Отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Нос розовый. Уши бледно-розовые, нормальной температуры у всех животных контрольных и экспериментальных подгрупп. Нагноений, воспалений, загрязнений в ушах не обнаружено. Зубы сохранены. Нарушения слюноотделения не наблюдали.

Дыхание было нормальным у животных контрольных подгрупп и у животных, получивших испытуемые штаммы. Шерсть у всех особей блестящая, без очагов облысения. Тонус мускулатуры был умеренным у всех животных. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Деформации или отека конечностей нет. Кожа без признаков раздражения или воспаления.

Во время обследования мышей при формировании опытных и контрольных подгрупп, признаков острой боли выявлено не было.

Достоверная разница между массой животных контрольных и опытных подгрупп, а также между опытными подгруппами, отсутствовала, что свидетельствует об отсутствии токсигенных свойств у исследуемых штаммов и подтверждает их безопасность.

Пример №12. Определение токсичности штаммов лактобацилл

Определение токсигенности испытуемых пробиотических штаммов с использованием лабораторных животных (мышей) проводили согласно МУК 4.2.2602-10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» Москва, 2010.

Токсичность испытуемых штаммов изучали на половозрелых самках и самцах инбредных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1), массой от 14 до 16 г. За животными проводили ежедневное наблюдение, отмечая в протоколе исследования количество живых и павших животных. Для определения токсичности культуры испытуемых штаммов, сеяли на жидкую питательную среду, для накопления максимальной концентрации бактериальных клеток при культивировании в термостате при 37 °С. Далее испытуемые штаммы прогревали при 100 °С в течение 30 мин (в максимальной концентрации микробных клеток). Прогретая культура вводилась в нативном виде внутрибрюшинно по 0,5 мл. При отсутствии гибели животных, наличии или отсутствии признаков нарушения здоровья и потери массы тела, к концу срока наблюдения (14 дней) при введении максимально переносимой дозы делалось соответствующее заключение.

Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе отражен в таблице 3.

Таблица 3 – Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе при изучении токсичности лактобацилл у мышей C57BL/6 и ICR (CD-1).

№ группы Штамм Объем, мл Кол-во животных (и номера животных) Самцы Самки 1 2 3 4 5 1 Плацебо 0,5 Подгруппа 1 (1-5) Подгруппа 2 (36-40) 2 Lactobacillus paracasei B-1037 0,5 Подгруппа 3 (6-10) Подгруппа 4 (41-45) 3 Lactobacillus fermentum B-1038 0,5 Подгруппа 5 (11-15) Подгруппа 6 (46-50) 4 Lactobacillus helveticus B-1039 0,5 Подгруппа 7 (16-20) Подгруппа 8 (51-55) 5 Lactobacillus rhamnosus B-1041 0,5 Подгруппа 11 (26-30) Подгруппа 12 (61-65) 6 Lactobacillus delbrueckii B-1042 0,5 Подгруппа 13 (31-35) Подгруппа 14 (66-70)

На основании полученных данных, в ходе оценки токсичности штаммов, можно сделать заключение о том, что штаммы испытуемых лактобацилл не обладают токсичностью для самок и самцов лабораторных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1).

При проведении клинического осмотра животных, используемых при оценке токсичности вышеобозначенных штаммов, оценивали следующие показатели: положение тела животного, состояние глаз (слезотечение, выделение секрета), носа, характер стула, аппетит, характер дыхания, состояние шерстного покрова (пилоэрекция, выпадение шерсти, изменение цвета шерстного покрова). Особое внимание уделяли поведенческим реакциям животных, как основному показателю, отражающему состояние нервной системы. Оценивали степень возбудимости животных по уровню двигательной активности и агрессивности, рефлексы «позы», «походки» и другие нарушения.

На протяжении всего эксперимента у данных животных сохранялись нормальный внешний вид, шерстный покров, характер выделений, поведенческие реакции не отличались от подобных показателей у животных контрольных подгрупп. Отсутствовали различия в реакции на взятие в руки животных контрольных подгрупп, и подгрупп, получавших плацебо. Вокализация у мышей на взятие в руки и/или перемещение из клетки у животных отсутствовала, но у отдельных особей фиксировались кратковременные писки во время извлечения их из клетки и нахождения в руках. Отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Нос розовый. Уши бледно-розовые, нормальной температуры у всех животных контрольных и экспериментальных подгрупп. Нагноений, воспалений, загрязнений в ушах не обнаружено. Зубы сохранены. Нарушения слюноотделения не наблюдали.

Дыхание было нормальным у животных контрольных подгрупп и у животных, получивших испытуемые штаммы. Шерсть у всех особей блестящая, без очагов облысения. Тонус мускулатуры был умеренным у всех животных. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Деформации или отека конечностей нет. Кожа без признаков раздражения или воспаления.

Во время обследования мышей при формировании опытных и контрольных подгрупп, признаков острой боли выявлено не было.

Двигательная активность у всех особей была в норме. Отклонений в походке не наблюдалось ни в одной подгруппе животных. Аномалий поведения не отмечено. Все выделения были в норме. Проявление вокализации у некоторых животных при перемещении и во время взятия в руки нами интерпретируется как индивидуальные особенности этих особей. Таким образом можно считать, что испытуемые штаммы не влияют на организм лабораторных животных. Все манипуляции животные перенесли хорошо. Местных и/или системных реакций от применения испытуемых штаммов в различных концентрациях выявлено не было, что в свою очередь говорит об их безопасности. Отличий в поведенческих реакциях у животных контрольных и опытных подгрупп выявлено не было.

Достоверная разница между массой животных контрольных и опытных подгрупп, а также между опытными подгруппами, отсутствовала, что свидетельствует об отсутствии токсичности у исследуемых штаммов и подтверждает их безопасность.

Пример №13. Определение безвредности штаммов лактобацилл

Определение безвредности испытуемых пробиотических штаммов с использованием лабораторных животных (черных мышей) согласно МУК 4.2.2602-10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» Москва, 2010.

Безвредность испытуемых штаммов изучали на половозрелых самках и самцах инбредных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1), массой от 10 до 14 г. За животными проводили ежедневное наблюдение, отмечая в протоколе исследования количество живых и павших животных. Для определения безвредности использовали взвесь испытуемых штаммов 2-го или 3-го пассажа в концентрации 10⁸, 10⁹, 10¹⁰ микробных клеток в объеме 0,5 мл. Наблюдение за мышами осуществлялось в течение 5 суток.

Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе отражен в таблице 4.

Таблица 4 – Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе при изучении безвредности лактобацилл у мышей C57BL/6 и ICR (CD-1).

№ Группы Штамм Объем, мл Кол-во животных (и номера животных) Самцы Самки 1 2 3 4 5 1 Плацебо 0,5 мл Подгруппа 1 (1-5) Подгруппа 2 (96-100) 2 Lactobacillus paracasei B-1037 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 3 (6-10) Подгруппа 4 (101-105) 3 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 5 (11-15) Подгруппа 6 (106-110) 4 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 7 (16-20) Подгруппа 8 (111-115) 5 Lactobacillus fermentum B-1038 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 9 (21-25) Подгруппа 10 (116-120) 6 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 11 (26-30) Подгруппа 12 (121-125) 7 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 13 (31-35) Подгруппа 14 (126-130) 8 Lactobacillus helveticus B-1039 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 15 (36-40) Подгруппа 16 (131-135) 9 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 17 (41-45) Подгруппа 18 (136-140) 10 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 19 (46-50) Подгруппа 20 (141-145) 11 Lactobacillus rhamnosus B-1041 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 27 (66-70) Подгруппа 28 (161-165) 12 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 29 (71-75) Подгруппа 30 (166-170) 13. 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 31 (76-80) Подгруппа 32 (171-175) 14. Lactobacillus delbrueckii B-1042 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 33 (81-85) Подгруппа 34 (176-180) 15 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 35 (86-90) Подгруппа 36 (181-185) 16 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 37 (91-95) Подгруппа 38 (186-190)

На основании полученных данных, полученных в ходе изучения безвредности испытуемых штаммов, можно сделать заключение о том, что штаммы испытуемых лактобацилл безвредны для самок и самцов лабораторных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1).

При проведении клинического осмотра животных, используемых при оценке безвредности вышеобозначенных штаммов, оценивали следующие показатели: положение тела животного, состояние глаз (слезотечение, выделение секрета), носа, характер стула, аппетит, характер дыхания, состояние шерстного покрова (пилоэрекция, выпадение шерсти, изменение цвета шерстного покрова). Особое внимание уделяли поведенческим реакциям животных, как основному показателю, отражающему состояние нервной системы. Оценивали степень возбудимости животных по уровню двигательной активности и агрессивности, рефлексы «позы», «походки» и другие нарушения.

На протяжении всего эксперимента у данных животных сохранялись нормальный внешний вид, шерстный покров, характер выделений, поведенческие реакции не отличались от подобных показателей у животных контрольных подгрупп. Отсутствовали различия в реакции на взятие в руки животных контрольных подгрупп, и подгрупп, получавших плацебо. Вокализация у мышей на взятие в руки и/или перемещение из клетки у животных отсутствовала, но у отдельных особей фиксировались кратковременные писки во время извлечения их из клетки и нахождения в руках. Отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Нос розовый. Уши бледно-розовые, нормальной температуры у всех животных контрольных и экспериментальных групп. Нагноений, воспалений, загрязнений в ушах не обнаружено. Зубы сохранены. Нарушения слюноотделения не наблюдали.

Дыхание было нормальным у животных контрольных подгрупп и у животных, получивших испытуемые штаммы. Шерсть у всех особей блестящая, без очагов облысения. Тонус мускулатуры был умеренным у всех животных. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Деформации или отека конечностей нет. Кожа без признаков раздражения или воспаления.

Во время обследования мышей при формировании опытных и контрольных подгрупп, признаков острой боли выявлено не было.

Согласно данным, полученным в ходе изучения безвредности испытуемых штаммов лактобацилл, достоверная разница между массой животных контрольных и опытных подгрупп, а также между опытными подгруппами, отсутствует, что свидетельствует о безвредности исследуемых штаммов, что подтверждает их безопасность.

Пример №14. Определение вирулентности штаммов лактобацилл

Определение вирулентности испытуемых пробиотических штаммов с использованием лабораторных животных (черных мышей) согласно МУК 4.2.2602-10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» Москва, 2010.

Вирулентность испытуемых штаммов изучали на половозрелых самках и самцах инбредных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1), массой от 10 до 14 г. Культуру второго пассажа, выращенную на плотной питательной среде, смывали 0,9%-м раствором натрия хлорида. Из полученной суспензии делали ряд десятикратных разведений (10¹⁰, 10⁹, 10⁸), которые вводили различными способами (внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно, перорально) по 0,5 мл. На каждое разведение использовали по 10 мышей (5 самок и 5 самцов). За животными проводили ежедневное наблюдение, отмечая в протоколе исследования количество живых и павших животных. По истечении срока наблюдения (14 дней) рассчитывали LD₅₀ (МУК 4.2.2602-10).

Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе отражен в таблице 5.

Таблица 5 – Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе при изучении вирулентности лактобацилл у мышей C57BL/6 и ICR (CD-1) при внутрибрюшинном, внутримышечном, подкожном и пероральном введениях

№ Группы Штамм Объем, мл Кол-во животных (и номера животных) Самцы Самки 1 2 3 4 5 1 Плацебо 0,5 мл Подгруппа 1 (1-5) Подгруппа 2 (96-100) 2 Lactobacillus paracasei B-1037 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 3 (6-10) Подгруппа 4 (101-105) 3 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 5 (11-15) Подгруппа 6 (106-110) 4 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 7 (16-20) Подгруппа 8 (111-115) 5 Lactobacillus fermentum B-1038 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 9 (21-25) Подгруппа 10 (116-120) 6 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 11 (26-30) Подгруппа 12 (121-125) 7 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 13 (31-35) Подгруппа 14 (126-130) 8 Lactobacillus helveticus B-1039 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 15 (36-40) Подгруппа 16 (131-135) 9 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 17 (41-45) Подгруппа 18 (136-140) 10 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 19 (46-50) Подгруппа 20 (141-145) 11 Lactobacillus rhamnosus B-1041 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 27 (66-70) Подгруппа 28 (161-165) 12 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 29 (71-75) Подгруппа 30 (166-170) 13 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 31 (76-80) Подгруппа 32 (171-175) 14 Lactobacillus delbrueckii B-1042 0,5 мл - 10⁸ Подгруппа 33 (81-85) Подгруппа 34 (176-180) 15 0,5 мл - 10⁹ Подгруппа 35 (86-90) Подгруппа 36 (181-185) 16 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 37 (91-95) Подгруппа 38 (186-190) 17 0,5 мл – 10¹⁰ Подгруппа 37 (91-95) Подгруппа 38 (186-190)

По истечении 14-ти суток наблюдения за лабораторными животными, после введения испытуемых взвесей штаммов лактобацилл четырьмя различными способами, у мышей отсутствовали признаки нарушения здоровья, потери массы тела, гибель к концу исследования. На основании этого можно сделать заключение, что испытуемые штаммы не обладают вирулентностью для самок и самцов лабораторных мышей линии C57BL/6 и ICR (CD-1).

При проведении клинического осмотра животных, используемых при оценке вирулентности при внутрибрюшинном введении вышеобозначенных штаммов, оценивали следующие показатели: положение тела животного, состояние глаз (слезотечение, выделение секрета), носа, характер стула, аппетит, характер дыхания, состояние шерстного покрова (пилоэрекция, выпадение шерсти, изменение цвета шерстного покрова). Особое внимание уделяли поведенческим реакциям животных, как основному показателю, отражающему состояние нервной системы. Оценивали степень возбудимости животных по уровню двигательной активности и агрессивности, рефлексы «позы», «походки» и другие нарушения.

На протяжении всего эксперимента у данных животных сохранялись нормальный внешний вид, шерстный покров, характер выделений, поведенческие реакции не отличались от подобных показателей у животных контрольных подгрупп. Отсутствовали различия в реакции на взятие в руки животных контрольных подгрупп, и подгрупп, получавших плацебо. Вокализация у мышей на взятие в руки и/или перемещение из клетки у животных отсутствовала, но у отдельных особей фиксировались кратковременные писки во время извлечения их из клетки и нахождения в руках. Отечности или гиперемии слизистых глаз не отмечалось. Нос розовый. Уши бледно-розовые, нормальной температуры у всех животных контрольных и экспериментальных подгрупп. Нагноений, воспалений, загрязнений в ушах не обнаружено. Зубы сохранены. Нарушения слюноотделения не наблюдали.

Дыхание было нормальным у животных контрольных подгрупп и у животных, получивших испытуемые штаммы. Шерсть у всех особей блестящая, без очагов облысения. Тонус мускулатуры был умеренным у всех животных. Видимые слизистые оболочки бледной окраски, блестящие. Молочные железы самок без уплотнений на ощупь, выделения из сосков отсутствовали. Деформации или отека конечностей нет. Кожа без признаков раздражения или воспаления.

Во время обследования мышей при формировании опытных и контрольных подгрупп, признаков острой боли выявлено не было.

Согласно данным, полученным в ходе проведения исследования, достоверная разница между массой животных контрольных и опытных подгрупп, а также между опытными подгруппами, отсутствует, что свидетельствует об отсутствии вирулентности у исследуемых штаммов и подтверждает их безопасность.

Пример №15. Определение дермонекротических свойств штаммов лактобацилл

Определение дермонекротические свойства испытуемых пробиотических штаммов с использованием лабораторных животных (морских свинок и кроликов породы «Советская шиншилла») проводили согласно МУК 4.2.2602-10 «Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков» Москва, 2010.

Дермонекротические свойства испытуемых штаммов изучали на половозрелых самках и самцах морских свинок массой 250-300 г, а также на половозрелых самках и самцах кроликов породы Советская шиншилла массой 1,0 - 1,5 кг.

Разные концентрации микробной взвеси (10¹⁰ и 10⁹) в объеме 0,2 мл вводили внутрикожно в область спины. На каждый штамм использовали не менее 1 самца и 1 самки морских свинок, и 1 самца и 1 самки кролика (из расчета на 1 концентрацию). При этом использовали тонкие (№ 18—20) острые иглы с небольшим скосом. Кожу в месте введения взвеси предварительно освобождали от шерсти, обрабатывали 70° спиртом. В месте введения кожу растягивали пальцами левой руки, правой рукой вводили иглу под острым углом. Конец иглы был виден через эпидермис: при введении материала эпидермис приподнимался в виде четко ограниченного бугорка, кожа над ним становилась прозрачной и пористой. Результат учитывали ежедневно в течение 5 суток. Отмечали появление припухлости, красноты, наличие некроза. При испытании каждому животному вводили взвесь штамма бактерий, обладающего дермонекротической активностью (контроль чувствительности животных).

Принцип формирования подгрупп и количество животных в подгруппе отражен в таблице 6.

Таблица 6 – Принцип формирования подгрупп и количество животных (морских свинок и кроликов) в подгруппе при изучении дермонекротических свойств испытуемых штаммов лактобацилл.

№ группы Штамм Объем, мл Кол-во животных (и номера животных) Самцы Самки 1 2 3 4 5 1 Плацебо 0,2 мл Подгруппа 1 (1) Подгруппа 2 (14) 2 Lactobacillus paracasei B-1037 0,2 мл - 10⁹ Подгруппа 3 (2) Подгруппа 4 (15) 3 0,2 мл – 10¹⁰ Подгруппа 5 (3) Подгруппа 6 (16) 4 Lactobacillus fermentum B-1038 0,2 мл - 10⁹ Подгруппа 7 (4) Подгруппа 8 (17) 5 0,2 мл – 10¹⁰ Подгруппа 9 (5) Подгруппа 10 (18) 6 Lactobacillus helveticus B-1039 0,2 мл - 10⁹ Подгруппа 11 (6) Подгруппа 12 (19) 7 0,2 мл – 10¹⁰ Подгруппа 13 (7) Подгруппа 14 (20) 8 Lactobacillus rhamnosus B-1041 0,2 мл - 10⁹ Подгруппа 19 (10) Подгруппа 20 (23) 9 0,2 мл – 10¹⁰ Подгруппа 21 (11) Подгруппа 22 (24) 10 Lactobacillus delbrueckii B-1042 0,2 мл - 10⁹ Подгруппа 23 (12) Подгруппа 24 (25) 11 0,2 мл – 10¹⁰ Подгруппа 25 (13) Подгруппа 26 (26)

При введении взвеси штамма Lactobacillus casei B-13206, который обладает дермонекротической активностью, у всех животных возникали признаки некроза (припухлость, краснота, отек).

По окончанию исследования признаки некроза, ухудшения состояния здоровья, гибель животных в период 5 суток наблюдения после введения испытуемых штаммов лактобацилл, отсутствовали, что свидетельствует об отсутствии дерматонекротических свойств для морских свинок и кроликов.

Пример №16. Определение кислотообразования штаммов лактобацилл

Микроорганизмы, относящиеся к представителям молочнокислых бактерий, продуцируют разные кислоты, изменяющие рН окружающей среды (питательных сред in vitro или в кишечнике in vivo). Антагонизм молочнокислых бактерий в отношении микроорганизмов обусловлен образованием молочной кислоты, продукцией других антимикробных и антибиотик подобных субстанций.

Изучаемую культуру смывали 0,9 % раствором натрия хлорида и по 2,5 мл полученной взвеси вносили в 25 мл среды Блаурокка. Засев проводили в 2 пробирки. Содержимое тщательно перемешивали и инкубировали в течение 72 ч при температуре 38±1 °С. После инкубации проводили определение кислотности в каждой пробирке (по 2 параллельные пробы). Каждую пробу в объеме 10 мл титровали раствором натрия гидроксида в концентрации 0,1 моль/л в присутствии индикатора фенолфталеина (2 - 3 капли) до появления стойкого слабо розового окрашивания. Показатель pH контролировали потенциометрически: он составлял 8,5 ± 0,1. Кислотность выражают в градусах Тернера (°Т) и вычисляют по формуле:

°Т - А х К * 10, где

А - количество миллилитров раствора натрия гидроксида, в концентрации 0,1 моль/л, пошедшее на титрование;

К - поправка к титру раствора натрия гидроксида в концентрации 0,1 моль/л;

°Т - условная величина, выраженная в миллилитрах щелочи, пошедшей на титрование 10 мл исследуемой суспензии.

Вычисляли средний показатель из двух пробирок (2 параллельные пробы из каждой пробирки).

Результаты определения активности кислотообразования испытуемых штаммов представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Активность кислотообразования испытуемых штаммов

№ п/п Штамм Кислотообразование, °T 1 Lactobacillus paracasei B-1037 230±1,2 2 Lactobacillus fermentum B-1038 160±0,7 3 Lactobacillus helveticus B-1039 150±0,6 4 Lactobacillus rhamnosus B-1041 220±1,3 5 Lactobacillus delbrueckii B-1042 250±1,5

Согласно данным таблицы 7, наибольшая активность кислотообразования отмечается у штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042, схожей активностью обладают штаммы Lactobacillus paracasei B-1037 и Lactobacillus rhamnosus B-1041. Наименьшей активностью обладают штаммы Lactobacillus fermentum B-1038, Lactobacillus helveticus B-1039.

Активность кислотообразования является одним из важнейших биологических параметров производственных штаммов пробиотических культур. Продуцируемые пробиотиками кислоты играют важную роль в формировании и функционировании микробиома ЖКТ. Высокий уровень кислотообразования пробиотиков имеет прямое влияние на антагонистические свойства в отношении патогенов.

Пример №17. Спектр литической активности штаммов бактериофагов входящих в состав композиции по изобретению

В документе RU2705302 приведены результаты изучения спектра литической активности бактериофагов, входящих в состав композиции по изобретению.

Пример №18. Результаты изучения интерференции компонентов фагобиотика (композиции по изобретению)

Интерференцию между компонентами фагобиотика изучали путем оценки динамики персистенции лактобацилл и бактериофагов, входящих в состав препарата, на модели беспородных мышей после однократного внутрижелудочного введения 0,1 г средства, растворенного в 0,9 мл воды (суммарно 1 мл). Обозначенный объем был обусловлен растворимостью препарата, а также максимально допустимым объемом внутрижелудочного введения мышам. На каждый вариант препарата (комплексного и монопрепаратов) было использовано по 6 животных.

Цель исследования заключалась в определении количества специфических фаговых частиц и лактобацилл в фекалиях животных в различные промежутки времени после введения препарата. Необходимо было установить или опровергнуть, что комбинированный препарат, содержащий 4 различных бактериофага, а также ассоциацию лактобацилл, обладает такими же свойствами, что и монопрепараты из них изготовленные. В случае если готовая лекарственная форма продемонстрировала бы худший результат по параметру персистенции фагов и лактобацилл в кишечнике, чем монопрепараты, препарат бы признался неэффективным в данном составе, что привело бы к необходимости корректировки его рецептуры. Каждая мышь содержалась в отдельной клетке. Количество фаговых частиц, а также концентрацию лактобацилл в фекалиях животных определяли до, а также через 3, 6, 9, 12, 24 и 48 часов после введения по методу Грациа (для бактериофагов) и методом бактериологического посева для детекции штаммов лактобацилл. Результаты определения динамики персистенции фагов и лактобацилл для монопрепаратов и комбинированной терапии приведены ниже.

Краткая характеристика лактобацилл и бактериофагов, входящих в состав фагобиотика (композиции по изобретению), приведена в таблице 8.

Таблица 8 – Состав фагобиотика (композиции по изобретению)

№ п/п Компонент препарат Титр в препарате 1 Escherichia coli BF-1351 4,8*10⁶ БОЕ/гр 2 Salmonella enteritidis BF-1354 7,7*10⁶ БОЕ/гр 3 Salmonella infantis BF-1355 3,6*10⁷ БОЕ/гр 4 Salmonella typhimurium BF-1356 5,7*10⁶ БОЕ/гр 5 Смесь лактобацилл 8,2*10⁹ КОЕ/гр Монопрепарат 1 Escherichia coli BF-1351 6,6*10⁶ БОЕ/гр Монопрепарат 2 Salmonella enteritidis BF-1354 7,2*10⁶ БОЕ/гр Монопрепарат 3 Salmonella infantis BF-1355 9,6*10⁶ БОЕ/гр Монопрепарат 4 Salmonella typhimurium BF-1356 6,2*10⁶ БОЕ/гр Монопрепарат 5 Смесь лактобацилл 7,5*10⁹ КОЕ/гр

Динамика персистенции фагов и лактобацилл в кишечнике мышей после однократного внутрижелудочного введения фагобиотика представлена в таблице 9.

Таблица 9 - Динамика персистенции фагов и лактобацилл в кишечнике мышей после однократного внутрижелудочного введения лекарственного средства (БОЕ/г).

Компонент препарата Время после введения препарата, час С_max, БОЕ/г T_max, час Т₀, час 0 3 6 9 12 24 48 BF-1351 0 2,3*10² ±1,2*10² 7,3*10² ±5,0*10² 1,3*10³ ±2,9*10² 8,2*10² ±4,1*10² 8,7*10² ±3,8*10² 5,2*10² ±1,1*10² 1,3*10³±2,9*10² 9 > 48 BF-1354 0 2,4*10² ±9,9*10¹ 7,4*10² ±5,1*10² 1,1*10³ ±4,4*10² 8,1*10² ±2,8*10² 5,2*10² ±1,9*10² 5,8*10² ±1,3*10² 1,1*10³±4,4*10² 9 > 48 BF-1355 0 3,7*10² ±1,4*10² 6,8*10² ±2,8*10² 9,6*10² ±6,5*10² 9,0*10² ±2,3*10² 8,3*10² ±2,5*10² 4,1*10² ±8,2*10¹ 9,0*10²±2,3*10² 12 > 48 BF-1356 0 4,5*10² ±1,1*10² 7,2*10² ±2,7*10² 1,5*10³ ±2,9*10² 8,4*10² ±2,5*10² 5,0*10² ±2,1*10² 4,5*10² ±1,0*10² 1,5*10³±2,9*10² 9 > 48 Смесь лактобацилл 0 2,2*10³ ±9,6*10² 5,0*10⁵ ±3,7*10⁵ 4,6*10⁵ ±3,0*10⁵ 1,3*10⁵ ±6,7*10⁴ 1,6*10⁵ ±7,0*10⁴ 1,1*10⁵ ±3,7*10⁴ 5,0*10⁵±3,7*10⁵ 6 > 48 Монопрепарат BF-1351 0 3,3*10² ±1,2*10² 7,8*10² ±4,2*10² 1,1*10³ ±1,5*10² 9,0*10² ±5,0*10² 8,7*10² ±3,2*10² 6,3*10² ±9,4*10¹ 1,1*10³1,5*10² 9 > 48 Монопрепарат BF-1354 0 3,7*10² ±9,6*10¹ 9,4*10² ±1,9*10² 1,2*10³ ±4,8*10² 7,2*10² ±3,2*10² 6,9*10² ±2,1*10² 5,8*10² ±1,5*10² 1,2*10³±4,8*10² 9 > 48 Монопрепарат BF-1355 0 3,2*10² ±1,9*10¹ 5,0*10² ±1,7*10² 1,0*10³ ±6,2*10² 8,4*10² ±3,1*10² 8,3*10² ±1,6*10² 3,9*10² ±1,0*10² 1,0*10³±6,2*10² 9 > 48 Монопрепарат BF-1356 0 2,4*10² ±9,9*10¹ 8,1*10² ±3,1*10² 1,3*10³ ±4,6*10² 8,2*10² ±2,2*10² 7,2*10² ±2,0*10² 4,1*10² ±1,3*10² 1,3*10³±4,6*10² 9 > 48 Монопрепарат Смесь лактобацилл 0 1,3*10³ ±8,7*10² 7,6*10⁵ ±2,5*10⁵ 3,9*10⁵ ±3,2*10⁵ 1,7*10⁵ ±6,7*10⁴ 1,9*10⁵ ±5,1*10⁴ 8,0*10⁴ ±3,8*10⁴ 7,6*10⁵±2,5*10⁵ 6 > 48 Примечание:
С_max – максимальная концентрация фага и штаммов лактобацилл;
T_max – время достижения максимальной концентрации в кишечнике животного;
Т₀ – время полного выведения фага и лактобацилл из кишечника животного.

В результате проведенного эксперимента было установлено, что после выпойки животным фагобиотика, состоящего из 4 бактериофагов и лактобацилл, а также выпойки животным монопрепаратов из бактериофагов и лактобацилл, достоверной разницы в динамике персистенции фагов и пробиотических культур выявлено не было. При использовании комбинированного лекарственного средства, так и при использовании монопрепаратов, время достижения максимальной концентрации в кишечнике животных составляло 9 часов для бактериофагов и 6 часов для лактобацилл. При этом стоит отметить, что время полного выведения бактериофагов и лактобацилл в рамках проведенного исследования установлено не было, что в свою очередь говорит о том, что они персистируют в кишечнике животных более 48 часов.

Таким образом, можно сделать вывод о совместимости компонентов композиции по изобретению.

Пример №19. Способ получения фагобиотика

Промышленное производство предлагаемого изобретения подразумевает выполнение целого ряда последовательных действий, основные из которых отражены ниже:

1. Подготовка производства: подготовка вентиляционного воздуха; подготовка воды (очищенной или инъекционной); подготовка дезинфицирующих и моющих растворов; подготовка помещений (уборка, мойка, дезинфекция); подготовка технологической одежды; подготовку посуды; подготовка оборудования, инструментов и вспомогательных материалов; приготовление питательных сред и растворов. Каждый обозначенный этап производится в соответствии с технологическим регламентом, внедренным на каждой производственной площадке, и в полной мере зависит от используемой технологической линии.

2. Подготовка сырья и материалов: подготовка упаковочных материалов; подготовка вспомогательных веществ (пребиотика).

3. Изготовление препарата (подразумевает выполнение следующих этапов):

3.1. Получение полуфабрикатов производственных штаммов лактобацилл с использованием общеизвестных и методов культивирования и лиофилизирования [например, RU2058681, RU2233322, RU2475535].

3.2. Получение полуфабрикатов производственных штаммов бактериофагов (RU2705302) и лиофилизация полуфабрикатов.

3.3. Сведение серии продукта согласно рецептуре: препарат содержит смесь живых лиофилизированных бактериофагов Escherichia coli BF-1351, Salmonella enteritidis BF-1354, Salmonella infantis BF-1355 и Salmonella typhimurium BF-1356 по 1*10⁵-9*10⁷ БОЕ/г каждого, а также пробиотических культур Lactobacillus paracasei B-1037, Lactobacillus fermentum B-1038, Lactobacillus helveticus B-1039, Lactobacillus rhamnosus B-1041, Lactobacillus delbrueckii B-1042 (общее количество молочнокислых бактерий – 1*10⁸-9*10⁹ КОЕ/г), вспомогательное вещество: фруктоолигосахариды (чистый растворимый инулин) – до 1 кг.

3.4. Упаковка и маркировка готовой продукции.

4. Выходной контроль продукта.

Пример №20. Изучение терапевтической эффективности фагобиотика на цыплятах при проведении острого опыта (инфицировании цыплят пуллорозом)

В опыте использованы 3-ех дневные цыплята в количестве 60 голов:

1) Опытная группа №1 состояла из 20 цыплят, которым в первый день жизни (однократно) с профилактической целью был назначен испытуемый препарат (из расчета 10 гр на 1000 голов);

2) Опытная группа №2 состояла из 20 цыплят, которым с момента начала проявления клинических проявлений пуллороза назначался препарат с лечебной целью (один раз в день, курсом 5 дней подряд) из расчета 40 гр на 1000 голов;

3) Контрольная группа №1 состояла из 20 цыплят, которым препарат не назначался.

Инфицирование 3-ех дневных птенцов, первой и второй опытной группы, проводили пероральным заражением культурой Salmonella gallinarum-pullorum штамм 1062-ВИЭВ. Объем инфицирующей суспензии составил 1 мл, на голову с концентрацией 3 млрд. мк. кл. см³. Инфицирование проводилось индивидуально, с использованием шприца с катетером.

Все группы были сформированы по принципу аналогов, т.е. имели одинаковую массу, одинаковый возраст и т.д.

За инфицированными цыплятами опытных групп было установлено наблюдение до момента начала развития первых клинических проявлений сальмонеллезной инфекции, а за контрольной группой до момента их гибели.

В результате проведенного опыта были получены результаты, отраженные в таблице 10.

Таблица 10 - Результаты оценки терапевтической эффективности фагобиотика на цыплятах при проведении острого опыта (инфицировании цыплят пуллорозом).

Показатель Опытная группа №1 Опытная группа №2 Контрольная группа №1 Количество голов цыплят в начале опыта 20 20 20 Возраст цыплят при первой выпойке фагобиотика, дней 1 4 - Курс выпоек, раз 1 5 - Возраст инфицирования сальмонеллой, дней 3 3 3 Начало развития клинических проявлений инфекции, часов после инфицирования 24-26 Сохранность цыплят на 4 день жизни, гол/% 20/100 20/100 20/100 Сохранность цыплят на 5 день жизни, гол/% 20/100 20/100 20/100 Сохранность цыплят на 6 день жизни, гол/% 18/90 20/100 17/85 Сохранность цыплят на 7 день жизни, гол/% 18/90 19/95 14/70 Сохранность цыплят на 8 день жизни, гол/% 16/80 19/95 14/70 Сохранность цыплят на 9 день жизни, гол/% 15/75 19/95 12/60 Сохранность цыплят на 10 день жизни, гол/% 15/75 18/90 12/60 Сохранность цыплят на 11 день жизни, гол/% 15/75 18/90 10/50 Сохранность цыплят на 12 день жизни, гол/% 14/70 17/85 9/45 Сохранность цыплят на 13 день жизни, гол/% 14/70 17/85 9/45 Сохранность цыплят на 14 день жизни, гол/% 13/65 17/85 8/40

Как видно из данных, отраженных в таблице 10, смертность цыплят в контрольной группе, после заражения их пуллорозом, составила 60%, в то время как значение данного показателя на группе птиц, которой с профилактической целью назначался фагобиотик, составил 35%. Смертность среди цыплят опытной группы №2, которой лекарственный препарат назначался курсом в течение 5 дней с лечебной целью, была наименьшей, и составила 15%.

Ввиду полученных результатов, можно сделать заключение, что лекарственное средство для ветеринарного применения (фагобиотик) обладает высоким лечебно-профилактическим эффектом в борьбе с пуллорозом цыплят.

Пример №21. Изучение безопасности и терапевтической эффективности фагобиотика на поросятах при проведении острого опыта (инфицировании животных патогенными сальмонеллами и эшерихиями)

Для воспроизведения инфекционного генеза проводили инфицирование пост отъёмных поросят (23-дневного возраста) парентеральным (подкожным) и одновременно пероральным введением культур Salmonella choleraesuis №370 (LD₅₀ для морских свинок 1,2 млрд м.к. при подкожном инфицировании. Гибель животных наступает в течение 5-14 суток) и Escherichia coli АЛК, обладающий b-гемолитическими свойствами (LD₅₀ для мышей 9,8*10⁸ м.к. при подкожном инфицировании. Гибель животных наступает в течение 2-3 суток) в дозе 5LD₅₀. Таким образом, заражающая доза была - Salmonella choleraesuis №370 6*10⁹ м.к., Escherichia coli АЛК – 4,9*10⁹ м.к. Для подкожной инъекции данная концентрация вводилась поросятам в объеме 4 см³, для перорального - в объеме 20 см³. Такой подход изначально был нацелен на формирование у животных острого течения ассоциированного заболевания.

Основным критерием, подтверждающим корректность используемой инфекционной модели, было развитие соответствующих клинико-морфологических проявлений сочетанной коли-сальмонеллезной инфекции, смертность поросят, а также подтвержденное выделение с фекалиями ранее введенных инфицирующих культур.

Эшерихии используемые в опыте, обладают гемолитическими свойствами, что упрощает проведение диагностических исследований. Значение показателя LD₅₀ указано в соответствии с паспортными данными на эти культуры.

В опыте использованы суточные поросята одного помета (поросята, полученные от одной свиноматки). Всего было использовано 23 поросенка, полученных от двух свиноматок.

1) Контрольная группа №1 – 11 поросят, подвергнутые инфицированию, без применения фагобиотика;

2) Опытная группа №1 – 12 поросят, подвергнутые инфицированию смесью патогенных эшерихий и сальмонелл с последующим курсовым применением испытуемого фагобиотика.

Все группы были сформированы по принципу аналогов, т.е. имели одинаковую массу, одинаковый возраст и т.д.

Результаты определения веса поросят в суточном возрасте отражены в таблице 11.

Таблица 11 – Вес суточных поросят в начале проведения эксперимента

Группа Поросенок Ср. знач. Ст. откл. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 К 1135 982 1042 1204 1308 1029 1074 903 1091 909 1181 - 1078,00 124,47 О 1248 873 1276 1193 1219 1211 944 1276 1158 1147 1106 992 1136,92 133,41

Как видно из данных, отраженных в таблице 11, масса суточных поросят, используемых в эксперименте, колебалась в диапазоне от 873 до 1308 г, каких-либо статистически достоверных различий в массе поросят различных групп выявлено не было. Таким образом можно утверждать, что группы были сформированы по принципу аналогов.

Перед началом проведения эксперимента от всех контрольных и опытных групп животных были отобраны образцы фекалий с целью выявления в них эшерихий (гемолитических изолятов) и сальмонелл. Исследование на сальмонеллез проводили согласно МУ 4.2.2723-10 «Лабораторная диагностика сальмонеллезов, обнаружение сальмонелл в пищевых продуктах и объектах окружающей среды». Исследование на сальмонеллез проводили согласно МУ по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных от 27.07.2000 г.

В ходе реализации обозначенной задачи было установлено, что в фекалиях подопытных животных (всех контрольных и опытных групп) отсутствовали бактерий рода Salmonella, а также Escherichia, обладающие гемолитическими свойствами. Таким образом было подтверждено, что изначально все животные были интактными и не являлись носителями E. coli и Salmonella spp.

С целью подтверждения того, что в кишечнике подопытных животных изначально отсутствуют вирулентные бактериофаги, было проведено исследование их фекалий с целью детекции в них бактериофагов последовательно микробиологическими методами – spot-тестом и методом Грациа. Для реализации поставленной цели кал растирали с 10-15 мл физиологического раствора, добавляли хлороформ в соотношении 1:10 и взбалтывали в течение 15 минут, после чего центрифугировали в течение 30 минут при 5000 оборотах, отбирали для исследования верхний слой жидкости.

Spot-тест- метод нанесения фага на газон бактериальной культуры. В чашки Петри разливали 1,5 % МПА. После застывания и подсушивания агара на чашки Петри наносили по 0,1 мл 16-18 часовой бульонной культуры микроорганизмов, чувствительных к бактериофагам, находящимся в исследуемом фильтрате, растирали шпателем по всей поверхности чашки, чтобы получить равномерный сплошной рост культуры. После того, как культура впиталась и чашки подсохли, на них каплями (spot-тест) наносили исследуемый фильтрат. После подсушивания, чашки переворачивали вверх дном и ставили в термостат при 37°С на 18-24 часа. На следующие сутки производили учет результатов – наличие или отсутствие «пятна лизиса».

Метод Грациа (метод агаровых слоев) основан на внесении различных разведений титруемого бактериофага в соответствующую культуру бактерий и посеве на плотную питательную среду с целью получения негативных колоний бактериофага. Накануне опыта готовили питательные среды: 1,5 % МПА, стерильно разлитый на чашках Петри по 25 мл, стерильно разлитые пробирки МПБ по 4,5 мл в каждой, 0,7 % МПА в пробирках по 2,5 мл. В день постановки опыта из жидкости, содержащей титруемый бактериофаг, готовили в пробирках ряд последовательных разведений. Затем в пробирку с 0,7% МПА, расплавленным и остуженным до 50-52°С, вносили 1 мл соответствующего разведения исследуемого бактериофага, слегка перемешивали, добавляли 0,1-0,2 мл 1-миллиардной взвеси культуры, чувствительной к бактериофагу, опять слегка перемешивали и содержимое пробирки выливали в чашку с МПА (вторым слоем). После остывания среды чашки инкубировали в термостате при 37°С в течение 18-20 ч. Титр фага определяли путем подсчета количества негативных колоний на параллельных чашках и умножением среднего арифметического на показатель разведения.

В ходе данной работы установлено, что в кишечнике животных опытной и контрольной групп бактериофагов, активных в отношении заражающих культур, выявлено не было. Данный факт позволяет нам в последующем оценить персистирование фаговых частиц в кишечнике подопытных животных.

Инфицирование поросят опытной и контрольной групп:

Поросят в возрасте 23 дней (непосредственно после отъема) подвергали комбинированному заражению (подкожно и перорально), в ранее обозначенных дозах. За поросятами обоих групп было установлено наблюдение до момента начала развития первых клинических проявлений сальмонеллезной инфекции. Ввиду того, что инфицирование поросят проводили одновременно как патогенным серотипом сальмонелл, так и патогенным штаммом эшерихий, то тяжесть заболевания усиливалась, что в свою очередь благоприятно влияло на воспроизводимость самого опыта.

После инфицирования животных за ними было установлено наблюдение до наступления первых клинико-морфологических проявлений патологии. Во время данного периода от животных ежедневно отбирались образцы фекалий с целью проведения лабораторно-диагностического исследования на сальмонеллез и колибактериоз. Иными словами, для того, чтобы подтвердить, что перорально и парентерально введенные культуры сальмонелл и эшерихий способны вызвать заболевание у животных, а также колонизировали кишечник у них, образцы фекалий подвергались исследованию с целью выделения этих культур бактериологическими методами. Поскольку в кишечнике сельскохозяйственных и любых других видов животных, бактерии рода Escherichia могут являться представителями нормофлоры, то дифференциация не патогенных эшерихий (представителей нормофлоры) от патогенных (заражающего штамма) проводилась на основании выделения именно гемолитических культур эшерихий (данным свойством обладает заражающий штамм).

В результате данной работы было установлено, что уже на 2 день после перорального заражения, у 100% подопытных животных в фекалиях обнаруживалась Salmonella choleraesuis. Детекция в фекалиях гемолитической эшерихии (заражающей культуры) началась с 3 дня, при том, что развитие первых клинических признаков инфекционного заболевания (повышение температуры тела) у части животных началось уже начиная с 2 дня.

Проводили общее клиническое исследование: определение габитуса, исследование видимых слизистых оболочек, кожи, лимфатических узлов, измерение температуры тела, а также посистемные исследования органов дыхательного аппарата, сердечно-сосудистой системы, пищеварительного тракта, мочеполового аппарата и нервной системы.

Сроки развития первых клинических признаков коли-сальмонеллезной инфекции отражены в таблице 12.

Таблица 12 – Сроки развития клинико-морфологических проявлений коли-сальмонеллезной инфекции у поросят после их заражения вирулентными штаммами Salmonella choleraesuis и Escherichia coli

Порядковый номер поросенка* День проявления клиники после заражения Отказ от корма Повышение температуры Рвота Синюшность ушей, хвоста, живота Диарея со слизью и кровью Кашицеобразный кал Судороги Специфический запах экскрементов Угнетенное состояние Серый цвет кожи 1К 2 - + - - - - + + + - 2К 3 + + + + + + - + + - 3К 1 + + - - + + - - + + 4К 2 - + - - + - - + + - 5К 3 + - + + - - + - + - 6К 2 + + - + + + + - + - 7К 2 - + - - + + - + + - 8К 1 + + + - - - - - + + 9К 3 - - - + + + - - + - 10К 2 + + + - + - + - + + 11К 2 + + + - - - - + + - % встреч. 63,64 81,82 45,45 36,36 63,64 45,45 36,36 45,45 100,00 27,27 1О 2 - + - - - - - - + - 2О 2 + + + - + - - - + - 3О 1 + + - - - + + + + + 4О 2 - - - + - - + + + - 5О 1 - - + - + - - - + - 6О 2 + + + - - - - + + - 7О 2 + - - + + + + + + - 8О 1 - - + - - - - - + - 9О 3 + + - - + + - + + + 10О 2 + + + + + + - + + - 11О 2 + + + + + - - - + + 12О 2 - + + - - + + + + - % встреч. 58,33 66,67 58,33 33,33 50,00 41,67 33,33 58,33 100,00 25,00

* к – контрольной группы; о – опытной группы.

Как видно из данных таблицы 12, основными клиническими проявлениями развития заболевания у подопытных животных было: угнетенное состояние у 100% животных обоих групп; отказ от корма у 63,64% контрольных животных и 58,33% у опытных соответственно; повышение температуры тела у 81,82% контрольных и 66,67 опытных животных; рвота у 45,45% контрольных и 58,33% опытных животных; синюшность ушей, хвоста и/или живота у 36,36% контрольных и 33,33% опытных животных; диарея со слизью и кровью у 63,64% контрольных и 50% опытных животных; кашицеобразный кал у 45,45% контрольных и 41,67% опытных животных; судороги у 36,36% контрольных и 33,33% опытных животных; специфический запах кала у 45,45% контрольных и 58,33% опытных животных; серый цвет кожи у 27,27% контрольных и 25% опытных животных соответственно. Все перечисленные клинические признаки свойственны для сальмонеллезной и колибактериозной инфекции поросят. Стоит отметить, что все зафиксированные признаки были подтверждены в течение 1-3 суток после перорального и подкожного заражения поросят. Согласно литературным данным, заражение поросят исключительно пероральным способом в лабораторных условиях зачастую не демонстрирует необходимую 80-100%-ную воспроизводимость. Ввиду чего, на наш взгляд, подкожное заражение после отъёмных поросят, сыграло важную роль в обеспечении необходимой 100% воспроизводимости. Пероральное же заражение было необходимо для того, чтобы оценить приживляемость и колонизирующую способность заражающего штамма сальмонеллы и эшерихии к эпителию кишечника животных.

Спустя 3 дня после заражения поросят, на фоне развития у них клинико-морфологических проявлений коли-сальмонеллезной инфекции, животным опытной группы начали выпаивать испытуемый лекарственный препарат в рекомендованной дозе (из расчета 30 г на тонну не хлорированной воды для поения). Выпаивание производилось в течение 6 часов. Длительность применения испытуемого лекарственного средства составило 7 дней, в обозначенной дозе. Каких-либо лечебных препаратов животным контрольной группы не давалось, как и дополнительных средств поросятам опытной группы. На фоне развития патологического процесса часть животных контрольной и опытной группы пали в ходе реализации острого эксперимента, что в свою очередь отражено в таблице 13.

Таблица 13 – Смертность среди поросят опытной и контрольной групп в остром эксперименте

Группа Поросенок % смертности 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 К Пал на 5 день Пал на 7 день Пал на 9 день Жив Пал на 5 день Пал на 5 день Пал на 5 день Пал на 6 день Жив Пал на 7 день Пал на 6 день - 81,82% О Жив Жив Жив Пал на 12 день Жив Жив Жив Жив Пал на 11 день Жив Жив Жив 16,67%

Как видно из данных, отраженных в таблице 13, на фоне применения испытуемого средства сохранность животных опытной группы оказалась в 4,9 раза выше, чем в контрольной. Таким образом можно утверждать, что пероральное применение фагобиотика продемонстрировало высокий уровень терапевтического эффекта, отразившийся на сохранности инфицированных животных.

Дополнительными критериями оценки эффективности фагобиотика при пероральной выпойке пост отъемным поросятам в остром опыте была детекция патологоморфологических отклонений зафиксированных на вскрытии всех павших животных.

Макроскопическое исследование органов и тканей проводили согласно «Методическим указаниям по патоморфологической диагностике болезней животных, птиц и рыб в ветеринарных лабораториях». Вскрытие трупов павших и вынужденно убитых животных осуществляли методом полной эвисцерации.

Непосредственное проведение вскрытия трупов проводили по схеме:

- наружный осмотр;

- внутренний осмотр;

- оценка полученных результатов.

Подопытных животных вскрывали в спинном положении. Оценку полученных результатов проводили в соответствии с методологией, описанной Жаровым А.В.

Результаты данной работы отражены в таблице 14.

Таблица 14 – Морфологические отклонения у павших в остром опыте животных

Животное Срок гибели после заражения/ дней Катаральный энтерит (энтероколит) Увеличенные региональные л/узлы Геморрагическое воспаление лимфатических узлов Мелкопятнистые кровоизлияния под капсулой печени Отечные легкие Лобулярная интерстициальная пневмония Лобарная фибринозная пневмония Фибринозно-геморрагический перикардит Серо-желтые очаги некроза в паренхиме печени Фибринозно-геморрагический колит Полиартрит К1 5 - + - - + - - + + + - К2 7 - + - - - + + - - - + К3 9 - + + + + - - - - - - К5 5 - + - - - + + - - - + К6 5 + + - + - - - - + - - К7 5 + + + + + + + - - - - К8 6 - + - + + - - + - + - К10 7 + + - - - - - - + - - К11 6 - + - + + - + + + - - О4 12 + + + - + + - + - + + О9 11 - + - + + + - - - - + % встречаемости 36,36 100,00 27,27 54,55 63,64 45,45 36,36 36,36 36,36 27,27 36,36

Согласно отраженным в таблице 14, у 100% павших животных было зафиксировано увеличение региональных лимфатических узлов, у 54,55% поросят отмечено мелкопятнистые кровоизлияния под капсулой печени, у 63,64% животных отек легких, у 36,36% серо-желтые очаги некроза в паренхиме печени, катаральный энтерит (энтероколит), лобарная фибринозная пневмония, фибринозно-геморрагический перикардит, полиартрит, у 27,27% животных фибринозно-геморрагический колит, геморрагическое воспаление лимфатических узлов, у 45,45% животных была зафиксирована лобулярная интерстициальная пневмония. Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что подобранная схема воспроизведения острого опыта является корректной.

Стоит отметить, что переболевшие поросята остались живы после заражения в течение 2 месяцев наблюдения. Гибель поросят в опытной группе, несмотря на применение фаготерапии, на наш взгляд, связана с генерализацией инфекционного процесса, именно поэтому эффективность использования испытуемого фагобиотика в большей степени зависит от того, насколько быстро будет назначен препарат, так как это позволит элиминировать возбудителя в желудочно-кишечном тракте, до проникновения его в другие органы и кровеносное русло.

В ходе проведения настоящих испытаний было установлено следующее:

1) Инфекционная модель сочетанной коли-сальмонеллезной инфекции на пост отъёмных поросятах является корректной и воспроизводимой схемой для оценки специфической активности и терапевтической эффективности фагобиотика;

2) Гибель поросят контрольной группы, подвергнувшихся пероральному и подкожному инфицированию, без назначения лечебного курса средством по изобретению ведет к 81,82% смертности в течение 5-9 суток после заражения;

3) У инфицированных патогенными эшерихиями и сальмонеллами поросят подтверждено угнетенное состояние у 100% животных обоих групп; отказ от корма у 63,64% контрольных животных и 58,33% у опытных соответственно; повышение температуры тела у 81,82% контрольных и 66,67 опытных животных; рвота у 45,45% контрольных и 58,33% опытных животных; синюшность ушей, хвоста и/или живота у 36,36% контрольных и 33,33% опытных животных; диарея со слизью и кровью у 63,64% контрольных и 50% опытных животных; кашицеобразный кал у 45,45% контрольных и 41,67% опытных животных; судороги у 36,36% контрольных и 33,33% опытных животных; специфический запах кала у 45,45% контрольных и 58,33% опытных животных; серый цвет кожи у 27,27% контрольных и 25% опытных животных соответственно;

4) Использование фагобиотика целесообразно начинать с проявлением первых клинико-морфологических признаков желудочно-кишечных заболеваний (в частности колибактериоза и/или сальмонеллеза), что позволяет снизить, или полностью предотвратить отход среди поросят;

5) Своевременное применение фагобиотика на опытных группах поросят, позволило обеспечить 83,33% сохранности опытной группы животных и минимизировать последствия патологического процесса в организме опытных животных;

6) Развитие генерализованной формы заболевания осложняет проведение терапии поэтому, эффективность использования фагобиотика в большей степени зависит от того насколько быстро будет назначен препарат, так как это позволит элиминировать возбудителя в желудочно-кишечном тракте, до проникновения его в другие органы и кровеносное русло.

Проведенные исследования продемонстрировали положительный эффект от использования фагобиотика на поросятах одновременно инфицированными вирулентными штаммами эшерихий и сальмонелл, в виварных условиях, что говорит о перспективности использования разрабатываемого продукта в условиях промышленных свиноводческих предприятий.

Пример №22. Принципы применения и режимы дозирования

Композицию по изобретению, в частности, применяют свиньям и птице перорально, индивидуально или групповым методом с водой, молоком, заменителем цельного молока.

Маточный раствор готовится непосредственно перед применением путем предварительного растворения необходимого объема лекарственного средства в соответствующем объеме питьевой воды из соотношения 100 мл воды на каждые 20 г препарата. Раствор перед применением подлежит тщательному шутелированию (встряхиванию). Полученный маточный раствор добавляется в воду для поения, либо выпаивается посредством дозаторов/медикаторов. Маточный раствор необходимо использовать в течение 6 часов после приготовления.

Режим дозирования:

- С профилактической целью назначают на протяжении всего периода выращивания птице из расчета 5-10 г на 1000 голов в день, а также свиньям в течение всего периода выращивания из расчета 10-20 г на тонну воды.

- С лечебной целью назначают птице из расчета 20-40 г на 1000 голов в сутки в течение 5-7 дней в зависимости от тяжести инфекционного процесса, свиньям в течение всего периода выращивания курсом 5-7 дней по 30-60 г на тонну воды.

Особенности применения препарата у супоросных свиней, у свиней в период лактации, а также кур несушек, уток, индюшек и др. птиц товарного, родительского и племенного назначения не установлены.

Препарат применяют свиньям и сельскохозяйственной птице для:

- уменьшения негативных последствий воздействия стресс-факторов:

а) средовых (отклонения от оптимальных температур);

б) кормовых (отравления, микотоксины, окисленные жиры, низкое качество воды, применение антибиотиков, антигельминтиков, кокцидиостатиков и других химиотерапевтических препаратов);

в) внутренних (желудочно-кишечных заболеваний различного инфекционного генеза, протекающих с диарейным синдромом);

- профилактики нарушений обмена веществ и повышения естественной резистентности организма свиней и сельскохозяйственной птицы;

- повышения сохранности молодняка и увеличения привесов.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретения относятся к области ветеринарии, медицины, биотехнологии, микробиологии. Предложена композиция и ее применение для профилактики или лечения инфекционного заболевания у человека или животного, вызванного вызвано бактерией Р. aeruginosa, E. coli, Kl. pneumonia, Pr. mirabilis, Pr. vulgaris, S. aureus, Salmonella spp., Sh. sonnei, Str. pneumoniae или грибом C. albicans. Композиция включает эффективное количество смеси живых лиофилизированных штаммов бактериофагов BF-1351, BF-1354, BF-1355, BF-1356, эффективное количество смеси лиофилизированных пробиотических культур штаммов Lactobacillus paracasei B-1037, Lactobacillus fermentum B-1038, Lactobacillus helveticus B-1039, Lactobacillus rhamnosus B-1041, Lactobacillus delbrueckii B-1042 и по меньшей мере одно вспомогательное вещество. Предложенный фагобиотик может быть использован при производстве терапевтических и профилактических лекарственных средств ветеринарного и медицинского назначения, кормовых добавок для животных и биологически активных добавок для людей. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 14 табл., 22 пр.

1. Композиция для профилактики или лечения инфекционного заболевания у человека или животного, включающая:

- эффективное количество смеси живых лиофилизированных бактериофагов: штамма BF-1351, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) и лизирующего бактерии Escherichia coli, штамма BF-1354, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) и лизирующего бактерии Salmonella enteritidis, штамма BF-1355, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) и лизирующего бактерии Salmonella infantis, и штамма BF-1356, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук) и лизирующего Salmonella typhimurium;

- эффективное количество смеси лиофилизированных пробиотических культур: штамма Lactobacillus paracasei B-1037, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук), штамма Lactobacillus fermentum B-1038, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук), штамма Lactobacillus helveticus B-1039, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук), штамма Lactobacillus rhamnosus B-1041, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук), штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042, депонированного во «Всероссийской государственной коллекции патогенных и вакцинных штаммов микроорганизмов-возбудителей инфекционных болезней животных» (Федеральный Научный Центр - Всероссийский Научно-Исследовательский Институт Экспериментальной Ветеринарии им. К.И. Скрябина и Я.Р. Коваленко Российской Академии Наук);

- по меньшей мере одно вспомогательное вещество;

причем заболевание вызвано бактерией Р. aeruginosa, E. coli, Kl. pneumonia, Pr. mirabilis, Pr. vulgaris, S. aureus, Salmonella spp., Sh. sonnei, Str. pneumoniae или грибом C. albicans.

2. Композиция по п. 1, в которой вспомогательное вещество представляет собой фруктоолигосахарид.

3. Композиция по п. 1, в которой:

- смесь живых лиофилизированных штаммов бактериофагов Escherichia coli BF-1351, Salmonella enteritidis BF-1354, Salmonella infantis BF-1355 и Salmonella typhimurium BF-1356 содержит по 1×10⁵ - 9×10⁷ БОЕ/г каждого штамма бактериофага;

- общее количество смеси лиофилизированных пробиотических культур штамма Lactobacillus paracasei B-1037, штамма Lactobacillus fermentum B-1038, штамма Lactobacillus helveticus B-1039, штамма Lactobacillus rhamnosus B-1041, штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042 составляет 1×10⁸ - 9×10⁹ КОЕ/г;

- вспомогательное вещество - фруктоолигосахарид - до 1 кг общей массы композиции.

4. Композиция по п. 3, в которой:

- штамм бактериофага Escherichia coli BF-1351 в количестве 4,8×10⁶ БОЕ/г, штамм бактериофага Salmonella enteritidis BF-1354 в количестве 7,7×10⁶ БОЕ/г, штамм бактериофага Salmonella infantis BF-1355 в количестве 3,6×10⁷ БОЕ/г и штамм бактериофага Salmonella typhimurium BF-1356 в количестве 5,7×10⁶ БОЕ/г;

- смесь лиофилизированных пробиотических культур штамма Lactobacillus paracasei B-1037, штамма Lactobacillus fermentum B-1038, штамма Lactobacillus helveticus B-1039, штамма Lactobacillus rhamnosus B-1041, штамма Lactobacillus delbrueckii B-1042 в количестве 8,2×10⁹ КОЕ/г;

- вспомогательное вещество - фруктоолигосахарид - до 1 кг общей массы композиции.

5. Композиция по п. 2, в которой фруктоолигосахарид представляет собой чистый растворимый инулин.

6. Применение композиции по п. 1 для профилактики или лечения инфекционного заболевания у человека или животного, причем заболевание вызвано бактерией Р. aeruginosa, E. coli, Kl. pneumonia, Pr. mirabilis, Pr. vulgaris, S. aureus, Salmonella spp., Sh. sonnei, Str. pneumoniae или грибом C. albicans.

7. Применение по п. 6, в котором заболевание представляет собой сальмонеллез, колибактериоз, стафилококкоз, псевдомоноз, кандидоз, протейную инфекцию, стрептококковую инфекцию, клебсиеллез, шигеллез.

8. Применение по п. 6, в котором животное представляет собой млекопитающее или птицу.

9. Применение по п. 6, в котором применение композиции осуществляется в качестве пищевой добавки или посредством включения в любую форму пищи для животных.