Метабиотическая композиция на основе метаболитов Bacillus subtilis Российский патент 2023 года по МПК A61K35/742 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящие изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к композициям для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта на основе метаболитов пробиотических микроорганизмов. Настоящее изобретение может быть использовано в пищевой промышленности, ветеринарии и медицине, в том числе для терапии постковидного синдрома.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0002] Желудочно-кишечный тракт (ЖКТ) млекопитающих, в том числе человека, является местом обитания триллионов микроорганизмов, таких как бактерии, археи, грибки, простейшие и вирусы, которые в совокупности называются микробиотой, или микрофлорой кишечника (Shah et al., 2021). Нарушения качественного и/или количественного состава микрофлоры кишечника связаны с развитием различных заболеваний, таких как острые инфекционные заболевания или хронические болезни, например, болезнь Крона или острый язвенный колит. Представляя экстракорпоральный орган, микрофлора организма выполняет или регулирует многообразные функции по поддержанию нормального гомеостаза (Шендеров, 1998). Микрофлора кишечника обеспечивает колонизационную резистентность, формирование иммунного ответа, переваривание пищи, регуляцию моторной функции кишечника, дезинтоксикацию. Отсутствие колонизационной резистентности приводит к значительному ослаблению противоинфекционной защиты организма, увеличению численности и спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а, следовательно, к повышению восприимчивости организма к возникновению инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы (Бондаренко с соавт, 2003; Петровская, 1982; Бухарин, 1999), развитию эндогенных инфекций, суперинфекций различных локализаций (Ленцнер, 1987; Юшков, 2002; Минушкин с соавт., 1999).

[0003] Нарушение микрофлоры кишечника может быть вызвано такими факторами, как стресс, физические и психоэмоциональные нагрузки, курение, несбалансированное питание, а также прием антибиотиков (Shah et al., 2021). В ряде случаев при изменении образа жизни возможно самопроизвольное восстановление состава микрофлоры кишечника (Шендеров, 1998; Бондаренко с соавт, 2003; Крамарь 2002). Однако после применения антибиотиков может развиться дисбактериоз, вызванный нарушением качественного и количественного состава микрофлоры кишечника. Лечение дисбактериоза в подобных случаях связано с применением различных иммунобиологических препаратов.

[0004] Наиболее популярными иммунобиологическими препаратами, используемыми для лечения и профилактики дисбактериоза, относятся пробиотики, включающие живые пробиотические микроорганизмы. Такие микроорганизмы проявляют антагонистическую активность в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Они способны синтезировать вещества, обладающие противомикробными свойствами, конкурировать с патогенными микроорганизмами за питательные вещества и участки микробной адгезии, модифицировать токсины или рецепторы токсинов (Воробейчиков с соавт., 2005).

[0005] В качестве пробиотических микроорганизмов часто используются молочнокислые бифидо- и лактобактерии, представляющие основу микрофлоры кишечника. Эти бактерии выделяют большое количество кислых продуктов. Создаваемая в результате кислая среда является неблагоприятной для развития патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Кроме того бифидо- и лактобактерии выделяют лизоцим, бактериоцины, спирты, интерфероны, которые ингибируют рост различных патогенов, препятствуя их проникновению в верхние отделы ЖКТ. При развитии дисбактериоза качественный и количественный состав анаэробных бифидо- и лактобактерий претерпевает нарушения в первую очередь.

[0006] Для лечения и профилактики дисбактериоза популярны препараты «Линекс» (фирма «Лек», Словения) и «Бифиформ» («Ферросан Интернейшнл А/С», Дания). «Линекс» включает живые лактобактерии Lactobacillus acidophilus, бифидобактерии Bifidobacterium infantis и энтерококки Enterococcus faecium. «Бифиформ» включает бифидобактерии Bifidobacterium longum (штамм АТСС 15707) и энтерококки Enterococcus faecium (штамм SF68). В составы указанных препаратов включены штаммы бактерий с достаточно высоким уровнем антибиотикорезистентности и зачастую рекомендуют их применение одновременно с антибиотиками. Однако опыт использования указанных препаратов в клинической практике с широким спектром антибиотиков при рекомендуемых схемах их назначения показал, что большая часть бактерий при таком сочетанном назначении гибнет, а активность попавших в кишечник в жизнеспособном состоянии чрезвычайно низка. Кроме того, препараты, включающие молочнокислые бактерии, отличаются отсутствием стабильности при длительном хранении, что ведет к снижению эффективности лечебно-профилактических процедур.

[0007] Более стабильными при хранении являются пробиотики, включающие спорообразующие бактерии. Популярными для создания пробиотиков являются спорообразующие пробиотические штаммы Bacillus subtilis (В. subtilis). Например, известна пищевая добавка, включающая пробиотический штамм В. subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-67989 (DE111). Добавка может включать один или несколько сухих носителей, например, олигофруктозу (US 20210315945 A1; опубл. 14.10.2021; МПК: A61K 35/742, A61K 9/00, А61Р 3/04). Известна композиция, включающая штамм В. subtilis QST713. Композиция также может включать пребиотики, например, инулин и/или олигофруктозу (ЕР 2348880 В1; опубл. 22.10.2014; МПК: A61K 23/00, A61K 23/18). Описано использование штамма В. subtilis АТСС РТА-6737 для профилактики и лечения диареи и воспалительного кишечного заболевания. При этом В. subtilis АТСС РТА-6737 может применяться в комбинации с пребиотиком инулином (RU 2412241; опубл. 20.02.2011; МПК: A61K 35/742, A61K 38/16, А61Р 1/00, C12N 1/21, A61K 35/74, C12N 1/20, C12R 1/07). Однако использование в составе указанных композиций живых микроорганизмов затрудняет или исключает использование в комплексной терапии со многими антибиотиками.

[0008] Одним из перспективных направлений лечения и профилактики дисбактериоза, особенно вызванного антибиотиками, является применение метабиотиков - препаратов, которые содержат не живые пробиотические микроорганизмы, а их метаболиты (Шендеров, 2019). Например, известен препарат «Бактистатин», включающий стерилизованную культуральную жидкость, содержащую метаболиты Bacillus subtilis (RU 2287335 C1, опубл. 20.11.2006; МПК: А61К 35/74; А61Р 1/00). Также известна композиция, включающая стерилизованные высушенные культуральные жидкости, содержащие метаболиты пробиотических штаммов Bacillus subtilis ВКПМ №В-2335, Enterococcus faecium L-3, Lactobacillus delbrueckii TS1-06, бактерий Lactobacillus fermentum TS3-06 (RU 2589818 C1, опубл. 10.07.2016; МПК: A61K 35/02; A61K 35/74; A61K 36/899; A61K 47/48; A61K 9/48). Указанные препарат и композиция нормализуют количественный и качественный состав микрофлоры кишечника за счет селективного стимулирования роста и размножения бифидо- и лактобактерий, а также специфической антагонистической активности в отношении широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Однако помимо полезных метаболитов пробиотических микроорганизмов культуральные жидкости могут включать вещества, вредные или, как минимум, бесполезные для симбиотической микрофлоры. Это может снижать эффективность метабиотических препаратов на основе культуральных жидкостей.

[0009] В связи с вышесказанным представляется полезным создание эффективной метабиотической композиции для нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника, особенно в условиях применения антибиотиков.

ТЕРМИНЫ И СОКРАЩЕНИЯ

[0010] Дисбактериоз это качественное и/или количественное изменение бактериальной микрофлоры в организме, перемещение различных ее представителей в несвойственные им места обитания, сопровождающееся метаболическими и иммунными нарушениями. Причем указанные нарушения не исчезают после устранения неблагоприятного фактора, вызвавшего дисбактериоз. Чаще всего под дисбактериозом подразумевают нарушение микрофлоры кишечника (Хурса с соавт., 2017; Жучкова, 2015).

[0011] Культуральная жидкость - жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая остаточные питательные вещества и продукты метаболизма этих клеток (Тарантула, 2005).

[0012] Культуральная суспензия жидкая среда, получаемая при культивировании различных про- и эукариотических клеток in vitro и содержащая культивируемые клетки и/или споры.

[0013] Метабиотики - вещества, являющиеся структурными компонентами пробиотических микроорганизмов и/или их метаболитов, которые способны оптимизировать физиологические функции, метаболические, эпигенетические, информационные, регуляторные, транспортные, иммунные, нейрогормональные, и/или поведенческие реакции, связанные с деятельностью симбиотической (индигенной) микрофлоры организма-хозяина (Шендеров с соавт., 2018).

[0014] Микрофлора (микробиота) - совокупность различных видов микроорганизмов, населяющих определенную среду обитания. Постоянно живущие в симбиозе с хозяином микроорганизмы называются нормальной, или симбиотической, микрофлорой (Фирсов, 2006 г.). В данном тексте термин «микрофлора» относится к микрофлоре кишечника.

[0015] Пермеат - фаза, прошедшая через мембрану в процессе мембранного разделения, основанного на преимущественной проницаемости одного или нескольких компонентов жидкой либо газовой смеси, а также коллоидной системы, через разделительную перегородку-мембрану. При этом задержанная фаза называется концентратом (Химическая энциклопедия, 1988).

[0016] Пребиотики - физиологически функциональные пищевые ингредиенты, обеспечивающие благоприятное воздействие на организм человека в результате избирательной стимуляции роста и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005, Gibson et al., 2017).

[0017] Пробиотики - функциональный пищевой ингредиент в виде полезных для человека непатогенных и нетоксикогенных живых микроорганизмов, обеспечивающий при систематическом употреблении в пищу в виде препаратов или в составе пищевых продуктов благоприятное воздействие на организм человека в результате нормализации состава и/или повышения биологической активности нормальной микрофлоры кишечника (ГОСТ Р 52349-2005).

[0018] Тангенциальная ультрафильтрация - ультрафильтрация, в процессе которой фильтруемая жидкость движется параллельно мембране.

[0019] Ультрафильтрация - процесс мембранного разделения, а также фракционирования и концентрирования веществ, осуществляемый путем фильтрования жидкости под действием разности давлений до и после мембраны. При этом размер выделяемых частиц (т.е. частицы какого размера не проходят через фильтр, а остаются в концентрате) составляет приблизительно 0,001-0,05 мкм (5-500 кДа).

[0020] БГКП бактерии группы кишечной палочки

[0021] ГХЦГ - гексахлоран C₆H₆Cl₆, смесь восьми стереоизомеров 1,2,3,4,5,6-гексахлорциклогексана

[0022] ДДТ - 1,1,1-трихлор-2,2-бис(4-хлорфенилэтан), или трихлорметилди(п-хлорфенил)метан)

[0023] ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

[0024] кДа - килодальтон

[0025] КМАФАнМ - количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

[0026] КОЕ - колониеобразующая единица

[0027] В. subtilis - Bacillus subtilis

[0028] Е. coli - Escherichia coli

[0029] GSRS - Gastrointestinal Symptom Rating Scale

[0030] CD64 - мембранный белок Fc-гамма-рецептор 1, моноцитарный маркер, также провоспалительный маркер макрофагов

[0031] IL1b - интерлейкин 1 бета, провоспалительный цитокин

[0032] IL6 интерлейкин 6, про- и противовоспалительный цитокин, фактор регенерации, фактор активации макрофагов, фактор стимуляции лимфоцитов

[0033] IL10 - интерлейкин 10, противовоспалительный цитокин

[0034] TNFa - фактор некроза опухолей альфа, фактор активации макрофагов.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0035] Задачей настоящего изобретения является создание композиции для лечения и профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта, вызванных дисбактериозом кишечника.

[0036] Данная задача решается заявляемым изобретением за счет достижения такого технического результата как создание композиции, обладающей широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также иммуномодулирующим потенциалом.

[0037] Заявленный технический результат достигается за счет того, что заявленная композиция включает метаболиты В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа, а также наполнитель. При этом соотношение компонентов в мас. %:

метаболиты Bacillus subtilis - 0,6-5

наполнитель - 95-99,4

[0038] Метаболиты представляют собой вещества с молекулярным весом 5-100 кДа, полученные из культуральной жидкости пробиотического штамма В. subtilis. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм В. subtilis представляет собой В. subtilis ВКМ B-3536D. Метаболиты В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа способны селективно подавлять рост широкого ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов. Благодаря отсутствию живых микроорганизмов, заявленная композиция не теряет эффективности при сочетанном приеме с антибиотиками, что позволяет использовать ее для лечения и профилактики дисбактериоза для широкого круга пациентов.

[0039] Наполнитель представляет собой одно или несколько веществ, которые могут способствовать сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности указанных метаболитов и/или могут оказывать полезный физиологический эффект, усиливая полезное действие композиции.

[0040] В предпочтительном варианте реализации заявленная композиция в качестве наполнителя включает один или несколько пребиотиков, которые могут представлять собой ди-, олиго- и полисахариды. В еще более предпочтительном варианте реализации один или несколько пребиотиков могут иметь растительное происхождение. Например, пребиотики могут быть представлены такими полифруктозанами, как, инулин, олигофруктоза или их смесь. Пребиотики стимулируют рост симбиотической микрофлоры кишечника, оказывают иммуномодулирующее и гепатопротекторное действие.

[0041] Технический результат также достигается за счет разработки доступного способа получения метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа, для их последующего применения в заявленной композиции. Способ включает следующие этапы:

а) выращивание В. subtilis в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации проводят глубинное выращивание в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70% при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации. При этом выращивание заканчивают, когда рН культуральной суспензии достигает 8,5-8,9. Такой рН соответствует максимальной концентрации метаболитов В. subtilis в культуральной суспензии. Указанный способ выращивания позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения метаболитов В. subtilis;

б) путем центрифугирования культуральной суспензии на проточной центрифуге отделяют клетки от культуральной жидкости;

в) путем ультрафильтрации полученной культуральной жидкости с порогом отсечения 100 кДа получают пермеат, включающий метаболиты с молекулярным весом 0-100 кДа. В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию. При этом ультрафильтрацию завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. Указанное снижение скорости фильтрации соответствует моменту получения пермеата с оптимальным содержанием метаболитов. Возможность сориентироваться по скорости фильтрации упрощает процесс получения целевых метаболитов;

г) путем ультрафильтрации полученного пермеата с порогом отсечения 5 кДа с получением целевых метаболитов. В предпочтительном варианте реализации также применяют тангенциальную ультрафильтрацию, которую завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза.

[0042] Заявленный способ обеспечивает получение метаболитов в количествах, необходимых для производства заявленной композиции в промышленных масштабах.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0043] На Фиг. 1 представлены результаты исследования иммуномодулирующих свойств метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100кДа.

[0044] На Фиг. 2 представлены результаты исследования воздействия заявленной композиции на выраженность гастроэнтерологических симптомов у пациентов с постковидным синдромом.

[0045] На Фиг. 3 представлены результаты исследования воздействия заявленной композиции на выраженность абдоминальной боли, диарейного синдрома и диспепсического синдрома у пациентов с постковидным синдромом.

[0046] На Фиг. 4 представлены результаты исследования воздействия заявленной композиции на уровень астении у пациентов с постковидным синдромом.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0047] В приведенном ниже подробном описании реализации изобретения приведены многочисленные детали реализации, призванные обеспечить отчетливое понимание настоящего изобретения. Однако, квалифицированному в предметной области специалисту, очевидно, каким образом можно использовать настоящее изобретение, как с данными деталями реализации, так и без них. В других случаях хорошо известные методы, процедуры и компоненты не описаны подробно, чтобы не затруднять излишне понимание особенностей настоящего изобретения.

[0048] Кроме того, из приведенного изложения ясно, что изобретение не ограничивается приведенной реализацией. Многочисленные возможные модификации, изменения, вариации и замены, сохраняющие суть и форму настоящего изобретения, очевидны для квалифицированных в предметной области специалистов.

[0049] Заявленная композиция нормализует количественный и качественный состав микрофлоры кишечнике, селективно ингибируя рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и создавая условия для роста симбиотической микрофлоры.

[0050] Заявленная композиция включает метаболиты В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа в количестве от приблизительно 0,6% мае. до приблизительно 5% мас.

[0051] Метаболиты В. subtilis представлены веществами, полученными из культуральной жидкости пробиотического штамма В. subtilis. Использование указанной фракции метаболитов увеличивает избирательность действия и эффективность заявленной композиции. Так, экспериментальные данные показывают, что указанные метаболиты способны подавлять рост широкого ряда патогенных и условно патогенных микроорганизмов, например: Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecium, Enterococcus faecalis, Streptococcuss salivarius, Streptococcus mitis. При этом метаболиты указанной фракции не оказывают ингибирующего воздействия на Escherichia coli (Е. coli) - представителя симбиотической микрофлоры кишечника (Пример 2).

[0052] Избирательность ингибирующего действия метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа может быть связана с тем, что данная фракция не включает некоторые вещества с известным антибактериальным эффектом. Например, такие биологически активные липопептиды, как итурины, сурфактины и фенгицины имеют размер 1-1,5 кДа (Onega et al., 2007), и, соответственно, не попадают в указанную фракцию. При этом способность указанных метаболитов подавлять рост патогенных и условно-патогенных микроорганизмов может быть связана с действием лизоцима и бактериоцинов (Тагиева и Гахраманова, 2020).

[0053] Кроме того, В. subtilis вырабатывают различные ферменты и коферменты, полипептиды, пребиотические компоненты, способствующие росту симбиотической микрофлоры, влияющие на обменные процессы и оказывающие иммуномодулирующее действие.

[0054] Использование метаболитов В. subtilis в концентрации менее 0,6% мае. приводит к существенному снижению эффективности композиции. Увеличение содержания метаболитов более 5% мае. нерационально, так как увеличивает стоимость производства и при этом не оказывает значительного влияния на эффективность композиции.

[0055] В качестве пробиотического штамма В. subtilis могут быть использованы штаммы В. subtilis ВКПМ №В-2335 (3), В. subtilis 534, В. subtilis ТПИ 13 - 07.06.21 - ДЕП/ВГНКИ, В. subtilis ВКПМ №В4759 (3), В. subtilis р ВМВ105, В. subtilis ТПИ 9; В. subtilis рВМВ 105. В предпочтительном варианте реализации пробиотический штамм В. subtilis представляет собой В. subtilis ВКМ B-3536D.

[0056] Остальную часть композиции - 95-99,4% мае. - составляет наполнитель, представляющий собой одно или несколько веществ, которые могут способствовать сохранению целостности композиции, сохранению биологической активности указанных метаболитов и/или могут оказывать полезный физиологический эффект, усиливая полезное действие композиции. В качестве наполнителя могут быть использованы, например, но не ограничиваясь этим: мальтодекстрин, пищевые волокна, производные крахмала, пектины, целлюлоза, микрокристаллическая целлюлоза и другие производные целлюлозы, а также другие технологически приемлемые наполнители (например, выбранные из списка, представленного на сайте https://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/).

[0057] В предпочтительном варианте реализации заявленная композиция в качестве наполнителя включает один или несколько пребиотиков, которые могут представлять собой ди-, олиго- и полисахариды. Причем такие ди-, олиго- и полисахариды устойчивы к гидролизу пищеварительными ферментами человека и не абсорбируются в верхних отделах пищеварительного тракта. Например, это могут быть пищевые волокна злаковых, овощей, фруктов, трав, или синтетические полисахариды, такие как лактулоза, или их сочетания. В еще более предпочтительном варианте реализации один или несколько пребиотиков могут иметь растительное происхождение. Например, в качестве пребиотиков могут быть использованы полифруктозаны (фруктаны), такие, как инулин и/или олигофруктоза. При этом полифруктозаны могут быть получены, например, из цикория, топинамбура, георгина, артишока, свеклы и др. растений.

[0058] Инулин это полисахарид, который состоит из 27-35 остатков D-фруктозы в фуранозной форме и одного остатка глюкозы. Молекула инулина устойчива к воздействию слюнных и кишечных ферментов. Не подвергаясь расщеплению, инулин достигает просвета толстой кишки, где происходит его бактериальная ферментация благодаря наличию бифидобактерий. Инулин, в свою очередь, стимулирует рост бифидобактерий, практически не влияя на других представителей кишечной микрофлоры (Gibson et al., 2017).

[0059] В результате ферментации инулина кишечными микроорганизмами в толстой кишке увеличивается бактериальная биомасса, снижается внутрикишечный уровень рН, образуется большое количество продуктов ферментации, в частности, короткоцепочечные жирные кислоты. Снижение рН приводит к повышению количества воды в просвете толстой кишки за счет осмотического эффекта. Это увеличивает объем каловых масс и усиливает перистальтику кишечника. В результате устраняется запор, снижается всасывание и ускоряется выведение жиров, токсичных метаболитов, канцерогенов. Таким образом, инулин содействует нормальному функционированию ЖКТ. Кроме того, инулин противодействует возникновению онкологических заболеваний, оказывает иммуномодулирующее и гепатопротекторное действие (Лузина, 2013).

[0060] Олигофруктоза является продуктом частичного ферментативного гидролиза инулина. Она представляет собой смесь олигосахаридов, состоящих из линейных цепочек фруктозных звеньев, соединенных между собой р-2,1-связями. Семейство олигофруктозы отличается от инулина длиной цепи, которая может колебаться от 2 до 8 мономеров, в то время как степень полимеризации инулина может достигать 60 (Архипов, 2014).

[0061] Олигофруктоза и инулин способствуют дезинтоксикации организма, так как обладают способностью сорбировать токсины, тяжелые металлы из ЖКТ. Кроме того, короткоцепочечные жирные кислоты, образующиеся при гидролизе инулина, стимулируют детоксицирующую активность печени. Также употребление инулина и олигофруктозы ассоциировано со снижением массы тела, в частности, снижением жировой массы, улучшением контроля глюкозы, уменьшением воспаления (Gibson et al., 2017).

[0062] Заявленная композиция может применяться для лечения и профилактики дисбактериоза кишечника различного генеза: при хронических заболеваниях пищеварительного тракта, после перенесенных острых кишечных инфекций, на фоне и после приема антибиотиков, после проведения химиотерапии, на фоне длительной гормональной терапии, в условиях хронических стрессовых состояний, при нерациональной диете. Кроме того, экспериментальные данные показывают, что заявленная композиция может применяться для облегчения таких сложных дисфункциональных состояний, как постковидный синдром (Пример 6).

[0063] Благодаря отсутствию в составе живых микроорганизмов композиция не теряет своей эффективности при сочетании с антибиотиками.

[0064] Заявленная композиция может быть использована для изготовления пищевой добавки или фармацевтического препарата в виде порошка, эмульсии, таблетки или капсулы. Последняя форма является наиболее удобной для применения. При этом оболочка капсулы может быть выполнена из желатина.

[0065] При получении заявленной композиции используют метаболиты В. subtilis размером 5-100 кДа, полученные следующим способом. На этапе а) проводят глубинное выращивание пробиотического штамма В. subtilis в жидкой питательной среде, имеющей исходный рН 7,0±0,2. В предпочтительном варианте реализации глубинное выращивание проводят в ферментере. При этом коэффициент заполнения ферментера может составлять от приблизительно 60% до приблизительно 70%. Указанный коэффициент заполнения, с одной стороны, позволяет избежать нежелательного пенообразования, и с другой стороны, позволяет максимально эффективно использовать оборудование для получения культуральной суспензии, насыщенной метаболитами пробиотического штамма В. subtilis. Глубинное выращивание проводят при температуре 36-38°С при постоянном перемешивании и аэрации до тех пор, когда рН культуральной суспензии достигнет 8,5-8,9 и/или до достижения созревания более 90%.

[0066] На этапе б) проводят центрифугирование культуральной суспензии на проточной центрифуге до получения прозрачного супернатанта, представляющего собой культуральную жидкость. При этом происходит отделение основного количества биомассы В. subtilis от культуральной жидкости, включающей метаболиты В. subtilis.

[0067] На этапе в) проводят ультрафильтрацию культуральной жидкости, полученной на этапе б). В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию со степенью концентрирования в 10-15 раз. Процесс ультрафильтрации завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. Для ультрафильтрации могут использовать любые подходящие фильтрующие мембраны с порогом отсечения 100 кДа. В результате получают пермеат, включающий метаболиты с молекулярным весом менее 100 кДа.

[0068] На этапе г) проводят ультрафильтрацию пермеата, полученного на этапе в). В предпочтительном варианте реализации применяют тангенциальную ультрафильтрацию со степенью концентрирования в 10-15 раз. Процесс ультрафильтрации завершают при снижении скорости фильтрации в 2-3 раза. При этом могут использовать любые подходящие фильтрующие мембраны с порогом отсечения 5 кДа. В результате получают концентрат, включающий целевые метаболиты с молекулярным весом 5-100 кДа.

[0069] Полученные метаболиты могут быть смешаны с пребиотиками и другими компонентами для получения фармацевтического препарата в форме эмульсии.

[0070] Также полученные метаболиты могут быть лиофилизированы стандартными методами, известными в данной области техники. Лиофилизированные метаболиты могут быть использованы для получения заявленной композиции в сухом виде. Лиофилизация продлевает срок хранения как самих метаболитов, так и заявленной композиции в сухом виде.

Описание реализации изобретения

[0071] Пример 1. Получение метаболитов В. subtilis.

[0072] В данном примере получали метаболиты штамма В. subtilis ВКМ B-3536D. Процесс глубинного культивирования вели в ферментере Р1000 фирмы Bioengineering (Швейцария) объемом 1000 дм³ с коэффициентом заполнения 0,6. В процессе культивирования поддерживали температуру 37±1°С. Скорость перемешивания составляля 250 об/мин. Начальная скорость аэрации составляла 0,2 об/об/мин, через 16 часов роста скорость изменяли до значения 0,5 об/об/мин. Процесс глубинного культивирования вели в течение 32 часов.

[0073] Культуральную суспензию В. subtilis ВКМ B-3536D подвергали центрифугированию на проточной суперцентрифуге Sharpless AS-26. Полученную культуральную жидкость подвергали ультрафильтрации на установке тангенциальной ультрафильтрации в две стадии. На первой стадии использовали фильтрующую мембрану АР-3-100. При этом получали концентрат №1 с порогом отсечения 100 кДа, включающий высокомолекулярную фракцию метаболитов весом более 100 кДа. Пермеат, полученный после первой стадии ультрафильтрации, вновь подвергали тангенциальной ультрафильтрации с использованием фильтрующей мембраны АР-3-5. В результате получали концентрат №2 с порогом отсечения 5 кДа. Полученный концентрат №2 составлял около 10% от исходного объема культуральной жидкости. Полученный концентрат №2 включал в себя метаболиты В. subtilis ВКМ B-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа.

[0074] Пример 2. Изучение воздействия метаболитов В. subtilis на ингибирование роста патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

[0075] В данном примере изучали способность метаболитов штамма В. subtilis ВКМ В-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа подавлять рост индикаторных культур. Исследование проводили с использованием адаптированного метода стандартных дисков для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам. Использованные в данном примере индикаторные культуры представлены патогенными и условно-патогенными для человека микроорганизмами. Для реализации метода индикаторные культуры помещали на поверхность агаризованной питательной среды Луриа-Бертани в чашке Петри в количестве 107 КОЕ. После застывания чашки Петри подсушивали в течение 15 минут при 37°С. Затем на поверхность питательной среды с индикаторными культурами в виде капель диаметром 5±1 мм наносили по 10 мкл концентратов №1 и №2, полученных в Примере 1. Затем чашки Петри оставляли при комнатной температуре до полного впитывания капель и затем инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Детекцию результатов проводили путем измерения зоны задержки роста индикаторных культур вокруг области нанесения концентратов, включающих метаболиты В. subtilis ВКМ B-3536D. Появление зон, свободных от индикаторных культур, вокруг области нанесения концентратов указывает на антагонистическое действие метаболитов В. subtilis ВКМ В-3536 в отношении указанных в Таблице 1 индикаторных культур. Величина зон, свободных от индикаторных культур, указывает на эффективность антагонистического действия метаболитов В. subtilis ВКМ В-3536.

[0076] Таблица 1. Задержка роста индикаторных культур при воздействии метаболитов В. subtils.

[0077] Из Таблицы 1 видно, что способностью к подавлению роста обладают как высокомолекулярные метаболиты весом более 100 кДа (концентрат №1), так и метаболиты весом 5-100кДа (концентрат №2). При этом в воздействии этих двух вариантов метаболитов есть существенная разница: высокомолекулярные метаболиты вызывают задержку роста Е. coli, а целевые метаболиты весом 5-100 кДа не вызывают. При том, что Е. coli является представителем нормальной микрофлоры кишечника, отсутствие подавляющего воздействия концентрата 2 на данную культуру, говорит об избирательности действия метаболитов весом 5-100кДа.

[0078] Стоит отметить, что культуральная суспензия штамма В. subtilis ВКМ B-3536D, включающая все метаболиты, также вызывала значительную задержку роста Е. coli. Такие данные были получены в исследовании антагонистической активности штамма В. subtilis ВКМ B-3536D методом перпендикулярных штрихов.

[0079] В результате исследования установлена выраженная избирательная способность метаболитов штамма В. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа к подавлению роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

[0080] Пример 3. Санитарно-химический анализ заявленной композиции.

[0081] Санитарно-химический анализ проводили с целью определения содержания пестицидов и тяжелых металлов в образцах композиции, включающей пребиотики растительного происхождения. Содержание хлорорганических пестицидов (токсикантов) определяли методом хроматографии в тонком слое согласно методическим указаниям по определению хлорорганических пестицидов в воде, продуктах питания, кормах и табачных изделиях (№2142-80).

[0082] Содержание тяжелых металлов исследовали с помощью атомно-абсорбционного спектрометра МГА-1000. Содержание свинца и кадмия определяли в соответствии с МУК 4.1.986-00 «Методикой выполнения измерений массовой доли свинца и кадмия в пищевых продуктах и продовольственном сырье методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии». Содержание мышьяка определяли в соответствии с ГОСТ Р 51766-2001 «Атомно-абсорбционным методом определения мышьяка». Содержание ртути определяли в соответствии с «Методикой выполнения измерений массовой доли ртути в пробах пищевого сырья и пищевых продуктов методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии» (Аттестат ВНИИМС Л 301/174-98). Результаты проведенных измерений представлены в Таблице 2.

[0083] Таблица 2. Содержание в заявленной композиции хлорорганических пестицидов и тяжелых металлов.

[0084] Результаты измерений свидетельствуют о том, что в заявляемой метабиотической композиции содержание токсичных и опасных для здоровья хлорорганических пестицидов ГХЦТ и ДЛТ) тяжелых металлов (свинец, кадмий, ртуть, мышьяк) не превышает допустимые уровни, установленные Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложение 3, раздел 10). Такие пестициды как алдрин и гептахлор в заявляемой метабиотической композиции не обнаружены.

[0085] Пример 4. Микробиологический анализ заявленной композиции. [0086] Микробиологические исследования проводили в соответствии с ГОСТ 10444.15-94 «Методы определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов», с ГОСТ 31747-2012 «Методы выявления и определения количества бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)», с ГОСТ 31659-2012 «Метод выявления бактерий рода Salmonella», с ГОСТ 31708-2012 «Метод обнаружения и определения количества презумптивных бактерий Escherichia coli», с ГОСТ 10444.12-2013 «Методы выявления и подсчета количества дрожжей и плесневых грибов». Результаты исследований представлены в Таблице 3.

[0087] Таблица 3. Микробиологические показатели безопасности заявленной композиции.

[0088] Результаты исследования показывают, что по микробиологическим показателям безопасности заявленная композиция соответствует требованиям, установленным Техническим регламентом Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» (приложения 1 и 2, раздел 1.9). Кроме того, заявленная композиция, действительно, является метабиотической, т.е. не содержит живых пробиотических бактерий В. subtilis.

[0089] Пример 5. Исследование цитотоксичности метаболитов В. subtilis в отношении клеток млекопитающих.

[0090] В данном примере исследовали потенциальную цитотоксичность метаболитов штамма В. subtilis ВКМ B-3536D. Цитотоксичность оценивали согласно рекомендациям Европейского Агентства по безопасности пищевых продуктов (EFSA) для характеризации микроорганизмов используемых в качестве кормовых добавок или штаммов-продуцентов (Rychen et al., 2018). Штамм В. subtilis ВКМ B-3536D выращивали в сердечно-мозговом бульоне при 30°С в течение 6 ч. Клетки отделяли от культуральной жидкости центрифугированием.

[0091] Анализ цитотоксичности на клетках Vero (клеточная линия почечного эпителия зеленой мартышки) проводили по методу (Roberts et al., 2001) с модификациями. Клетки Vero инкубировали с культуральной жидкостью. Степень поврежденности клеток Vero оценивали по выделению клетками фермента лактат-дегидрогеназы. Цитотоксичность выражали в процентах от токсичности детергента Triton-X100, вызывающего выход из клеток лактат-дегидрогеназы за счет перфорации клеточных мембран. В качестве контрольных штаммов использовали цитотоксичный и нецитотоксичный штаммы рода Bacillus. В Таблице 4 представлены средние значения 3 (штамм ВКМ B-3536D) или 2 (контрольные штаммы) экспериментов. Каждый эксперимент проводился в двух повторах.

[0092] Таблица 4. Цитотоксичность метаболитов В. subtilis в отношении клеток Vero.

[0093] Из представленных результатов видно, что цитотоксичность культуральной жидкости штамма В. subtilis ВКМ B-3536D не превышает границы в 20%. Таким образом, метаболиты штамма В. subtilis ВКМ B-3536D, содержащиеся в исследованной культуральной жидкости, не являются токсичными в отношении клеток Vero, и могут считаться безопасными для клеток млекопитающих.

[0094] Пример 6. Оценка иммуномодулирующих свойств лиофилизированных метаболитов В. subtilis с молекулярным весом 5-100кДа.

[0095] В данном примере исследовали иммуномодулирующие свойства метаболитов с молекулярным весом 5-100кДа пробиотического штамма В. subtilis ВКМ B-3536D. Для этого лиофилизированные метаболиты 5-100 кДа с добавлением мальтодекстрина в качестве носителя добавляли в культуру клеток моноцитов человека ТНР-1. Сравнивали эффект добавления метаболитов по отношению к контролю без метаболитов 1) на стадии дифференцировки моноцитов в макрофаги с помощью форбол-миристат-ацетата и 2) на стадии поляризации ранее дифференцированных моноцитов. Эффект оценивали методом обратной транскрипции (RT-PCR), по экспрессии мРНК маркерных генов, кодирующих интерлейкины и другие факторы: IL1b, IL6, IL10, TNFa и CD64.

[0096] На Фиг. 1 показаны значения экспрессии указанных маркерных генов при добавлении метаболитов, нормализованные к контролю без добавления метаболитов. Указаны средние значения двух экспериментов, по три повтора в каждом эксперименте. Статистически значимые (р<0,05) количественные изменения (не менее чем в два раза по сравнению с контролем) в обоих экспериментах отмечены звездочкой (*). Светло-серые столбцы отражают уровень экспрессии соответствующего гена на стадии дифференцировки, темно-серые столбцы отражают уровень экспрессии на стадии поляризации.

[0097] Видно, что на стадии дифференцировки исследованные метаболиты значительно усиливали экспрессию гена TNFa, и в то же время значительно снижали экспрессию гена CD64. Это указывает на усиление процесса дифференцировки моноцитов в макрофаги. Также значительно снижалась экспрессия цитокина IL1b, что указывает на противовоспалительный эффект. На стадии поляризации исследуемые метаболиты значительно повышали экспрессию цитокинов IL6 и IL10. IL10 классический противовоспалительный цитокин, и повышение его экспрессии свидетельствует об активации противовоспалительной поляризации макрофагов. IL6 - важный цитокин, высокие концентрации которого также ассоциированы с противовоспалительным эффектом.

[0098] Полученные данные указывают на то, что исследованные метаболиты обладают иммуно модулирующими свойствами. Они могут способствовать дифференцировке моноцитов в макрофаги, а также способствовать противовоспалительной поляризации макрофагов, которая необходима для окончания воспаления и регенерации тканей.

[0099] Пример 7. Оценка эффективности применения заявленной композиции в терапии у пациентов с постковидным синдромом.

[00100] В данном примере проводили рандомизированное одноцентровое открытое проспективное исследование эффективности и безопасности заявленной композиции с участием пациентов с постковидным синдромом. Использованная в примере композиция включала метаболиты штамма В. subtilis ВКМ B-3536D с молекулярным весом 5-100 кДа, в качестве наполнителя включала смесь инулина и олигофруктозы. В исследование было включено 40 пациентов обоих полов в возрасте от 18 до 60 лет включительно с диагнозом постковидный синдром. Все пациенты были поровну разбиты на экспериментальную группу 1 и контрольную группу 2. Пациенты из экспериментальной группы 1 в течение 28 дней получали заявленную композицию, включающую олигофруктозу и инулин. Пациенты из контрольной группы 2 не получали заявленной композиции. Выраженность симптомов, характерных для постковидного синдрома оценивали с помощью опросников, которые все пациенты заполняли перед началом эксперимента и через 28 дней от начала эксперимента.

[00101] Опросник GSRS позволяет оценить выраженность гастроэнтерологических симптомов. Опросник состоит из 15 пунктов, которые преобразуются в 5 шкал: абдоминальная боль (а), рефлюкс-синдром (b), диарейный синдром (с), синдром запоров (d) и диспептический синдром (е). Показатели шкал колеблются от 1 до 7, более высокие значения соответствуют более выраженным симптомам и более низкому качеству жизни. Шкала суммарного измерения строится на основе ответов на все 15 вопросов опросника и позволяет оценить общую динамику клинической картины.

[00102] На Фиг. 2 представлены средние значения GSRS в экспериментальной группе 1 и в контрольной группе 2. Среднее значение измеряется в баллах, отложенных по оси ординат. Светло-серые столбцы отражают средние значения GSRS, полученные до начала эксперимента, темно-серые столбцы отражают средние значения GSRS, полученные через 28 дней после начала эксперимента. Видно, что среднее значение GSRS в экспериментальной группе 1 снизилось приблизительно на 40%, в то время как в контрольной группе 2 среднее значение GSRS снизилось менее чем на 15%. Это говорит об уменьшении выраженности гастроэнтерологических симптомов на фоне приема заявленной композиции.

[00103] Наилучшая положительная динамика наблюдалась по шкалам

абдоминальная боль (а), диарейный синдром (с) и диспепсический синдром (е), как показано на Фиг. 3. Высота столбцов отражает выраженность соответствующих симптомов в экспериментальной группе 1 (сплошные столбцы) и в контрольной группе 2 (заштрихованные столбцы). Выраженность симптомов измеряется в баллах, отложенных по оси ординат. Светло-серые столбцы отражают выраженность симптома до начала эксперимента, темно-серые столбцы отражают выраженность симптома через 28 дней после начала эксперимента. В экспериментальной группе 1 выраженность абдоминальной боли (а) снизилась более чем на 45%, в то время как в контрольной группе 2 выраженность этого симптома снизилась менее чем на 20%. Выраженность диарейного синдрома (с) в экспериментальной группе 1 снизилась более чем на 40%, в то время как в контрольной группе 2 выраженность этого симптома снизилась менее чем на 20%. Выраженность диспепсического синдрома (е) в экспериментальной группе 1 снизилась более чем на 50%, в то время как в контрольной группе 2 выраженность этого симптома снизилась менее чем на 15%. Полученные данные говорят о том, что применение заявленной композиции заметно снижает выраженность указанных симптомов.

[00104] Астения является одним из наиболее характерных симптомов постковидного синдрома. Для оценки уровня астении использовали шкалу астенического состояния (ШАС). Результаты представлены на Фиг. 4. Уровень астении измеряется в баллах, отложенных по оси ординат. Светло-серые столбцы отражают уровень астении до начала эксперимента, темно-серые столбцы отражают уровень астении через 28 дней после начала эксперимента. Уровень астении в экспериментальной группе 1 снизился более чем на 60%, в то время как в контрольной группе 2 уровень астении увеличился более чем на 10%. Это говорит о том, что прием заявленной композиции влияет положительно не только на состояние ЖКТ, но и на психоэмоциональное состояние пациентов с постковидным синдромом.

[00105] Таким образом, можно заключить, что пациенты из экспериментальной группы 1 продемонстрировали статистически значимую положительную динамику клинических симптомов в отличие от контрольной группы 2.

[00106] В настоящих материалах заявки представлено предпочтительное раскрытие осуществления заявленного технического решения, которое не должно использоваться как ограничивающее иные, частные воплощения его реализации, которые не выходят за рамки испрашиваемого объема правовой охраны и являются очевидными для специалистов в соответствующей области техники.

Литература

Gibson, G., Hutkins, R., Sanders, M. et al. «Expert consensus document: The International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics (ISAPP) consensus statement on the definition and scope of prebiotics» // Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 2017, 14, 491-502. https://doi.org/10.1038/nrgastro.2017.75.

Ongena M, Jourdan E, Adam A, Paquot M, Brans A, Joris B, Arpigny JL, Thonart P. «Surfactin and fengycin lipopeptides of Bacillus subtilis as elicitors of induced systemic resistance in plants» // Environ Microbiol. 2007 Apr;9(4): 1084-90. doi: 10.1111/j.1462-2920.2006.01202.x. PMID: 17359279.

Roberts PH, Davis КС, Garstka W, Bhunia AK, «Lactate dehydrogenase release assay from Vero cells to distinguish verotoxin producing Escherichia coli from non-verotoxin producing strains» // Journal of Microbiological, 2001, Methods, 43: 171-181. https://doi.org/10.1016/S0167-7012(00)00222-0.

Rychen G, Aquilina G, Azimonti G, Bampidis V, Bastos ML, Bories G, Chesson A, Cocconcelli PS, Flachowsky G, Gropp J, Kolar B, Kouba M, Lopez-Alonso M, Lopez Puente S, Mantovani A, Mayo B, Ramos F, Saarela M, Villa RE, Wallace RJ, Wester P, Glandorf B, Herman L, Karenlampi S, Aguilera J, Anguita M, Brozzi R, Galobart J «EFSA FEEDAP Panel (EFSA Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed): Guidance on the characterisation of microorganisms used as feed additives or as production organisms» // EFSA Journal, 2018, 16(3), 5206, 24 pp. https://doi.org/10.2903/j.efsa.2018.5206.

Shah Т., Baloch Z., Shah Z., Cui X., Xia X. «The Intestinal Microbiota: Impacts of Antibiotics Therapy, Colonization Resistance and Diseases» // hit. J. Mol. Sci. 2021, 22, 6597. https://doi.org/10.3390/ijms22126597.

https://lexparency.org/eu/32008R1333/ANX_III/

Архипов В.Ю. «Инулин и олигофруктоза: эффективность в качестве пребиотического волокна для кондитерской промышленности» // Фундаментальные исследования. 2014. №9(6) С.1216-1219.

Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. «Дисбактериозы кишечника у взрослых» //М.: КМК. - 2003. - 224 с.

Бухарин О.В. «Персистенция патогенных бактерий» // М.: Медицина - 1999. - 364 с.

Воробейчиков Е.В., Василенко А.Ж., Синица А.В и др. «Методологические аспекты применения пробиотиков и антибиотиков для экстренной профилактики инфекционных заболеваний» // Сб. научн. тр. III съезда общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. - М: МаксПресс, 2005. - С.35-36.

ГОСТ Р 52349-2005 «Продукты пищевые. Продукты пищевые функциональные. Термины

и определения» (с Изменением N 1) // ГОСТ Р от 31 мая 2005 г. №52349-2005. Жучкова Т.В., «Современные представления о микрофлоре человека: что такое

дисбактериоз?» // Медицинская энциклопедия Видаль: Гастроэнтерология, 2015. Кнунянц И. Л. «Химическая энциклопедия»//М.: Советская энциклопедия. 1988. Крамарь Л.В. «Микроэкология кишечника здоровых людей в условиях техногенного воздействия крупного промышленного города» // Вестн. РАМН. - 2002. - №8. - С.37-40.

Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. «Лактофлора и колонизационная резистентность» // Антибиотики и мед. биотехнология. - 1987. - №3. - С.173-179.

Лузина Е.В. «Пищевая ценность цикория» // Вопр. питания. 2013; №2: 62-65.

Минушкин О.Н., Ардатская М.Д., Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В. «Дисбактериоз кишечника» // Рос.мед. журнал. - 1999. - №3. - С.40-45.

Петровская В.Г. «Общие закономерности взаимодействия в системе паразит-хозяин и проблема смешанных инфекций»//Журн. микробиол. - 1982. - №8. - С.24-31.

Тагиева С.А., Гахраманова Ф. X. «Преимущества применения бактериоцинных препаратов по сравнению с химическими антибиотиками для лечения инфекций у человека и животных» // Вестник ВГУ, Серия: Химия. Биология. Фармация, 2020, №4.

Тарантула В.З. «Словарь биотехнологических терминов» // Москва: Роспатент, 2005. Технический регламент Таможенного союза TP ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции».

Фирсов Н.Н., «Микробиология: словарь терминов» // М: Дрофа, 2006.

Хурса Р. В., Месникова И. Л., Микша Я. С.«Кишечная микрофлора: роль в поддержании здоровья и развитии патологии, возможности коррекции» // Минск БГМУ, 2017.

Шендеров Б.А., Ткаченко Е.И., Лазебник Л. Б., Ардатская М. Д., Синица А.В., Захарченко М. М. «Метабиотики новая технология профилактики и лечения заболеваний, связанных с микроэкологическими нарушениями в организме человека» // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2018; 151(3): 83-92.

Шендеров Б.А. «Медицинская микробная экология и функциональное питание: в 3 т./ Т. 1: Микрофлора человека и животных и ее функции» // М.: ГРАНТЪ, 1998. - 288 с. Юшков В.В. и др. «Иммунокорректоры: Руководство для врачей и провизоров» // Екатеринбург: ООО «ИРА УТК», 2002. - 255 с.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложена метабиотическая композиция для нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника. Заявленная композиция включает метаболиты пробиотического штамма B. subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа и наполнитель, при этом соотношение компонентов, мас. %: метаболиты Bacillus subtilis - 0,6-5; наполнитель - 95-99,4. Предложен способ получения метаболитов Bacillus subtilis для последующего их использования в метабиотической композиции. Способ включает выращивание Bacillus subtilis в жидкой питательной среде; центрифугирование культуральной суспензии на проточной центрифуге с получением культуральной жидкости; ультрафильтрацию полученной культуральной жидкости с порогом отсечения 100 кДа с получением пермеата; ультрафильтрацию полученного пермеата с порогом отсечения 5 кДа. Предложено применение заявленной композиции для терапии постковидного синдрома. Заявленная композиция обладает широким антагонистическим действием в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, а также иммуномодулирующим действием. Прием заявленной композиции положительно влияет на состояние желудочно-кишечного тракта и на психоэмоциональное состояние пациентов с постковидным синдромом. 3 н. и 14 з.п. ф-лы, 4 ил., 4 табл., 7 пр.

1. Метабиотическая композиция для нормализации качественного и количественного состава микрофлоры кишечника, отличающаяся тем, что включает метаболиты Bacillus subtilis с молекулярным весом 5-100 кДа и наполнитель, при этом соотношение компонентов, мас. %:

метаболиты Bacillus subtilis - 0,6-5;

наполнитель - 95-99,4.

2. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что метаболиты Bacillus subtilis представляют собой метаболиты, выделенные из культуральной жидкости путем ультрафильтрации.

3. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что метаболиты Bacillus subtilis представляют собой метаболиты, выделенные из культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis ВКМ B-3536D.

4. Метабиотическая композиция по п. 1, отличающаяся тем, что наполнитель включает пребиотик.

5. Метабиотическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что пребиотик представляет собой дисахарид, олигосахарид, полисахарид или их смесь.

6. Метабиотическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что пребиотик представляет собой полифруктозан.

7. Метабиотическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что полифруктозан представляет собой олигофруктозу, инулин или их смесь.

8. Способ получения метаболитов Bacillus subtilis для последующего их использования в метабиотической композиции по п. 1, включающий:

а) выращивание Bacillus subtilis в жидкой питательной среде;

б) центрифугирование культуральной суспензии на проточной центрифуге с получением культуральной жидкости;

в) ультрафильтрацию полученной культуральной жидкости с порогом отсечения 100 кДа с получением пермеата;

г) ультрафильтрацию полученного пермеата с порогом отсечения 5 кДа.

9. Способ по п. 8, в котором выращивание Bacillus subtilis проводят глубинным способом.

10. Способ по п. 9, в котором выращивание проводят в ферментере с коэффициентом заполнения 60-70%.

11. Способ по п. 9, в котором выращивание проводят при температуре 36-38°С.

12. Способ по п. 9, в котором выращивание проводят при постоянном перемешивании и аэрации.

13. Способ по п. 8, в котором используют питательную среду с исходным рН 6,8-7,2.

14. Способ по п. 10, в котором выращивание Bacillus subtilis проводят до достижения жидкой питательной средой рН=8,5-8,9.

15. Способ по п. 8, в котором применяют тангенциальную ультрафильтрацию.

16. Способ по п. 14, в котором тангенциальную ультрафильтрацию проводят до снижения скорости фильтрации в 2-3 раза.

17. Применение композиции по п. 1 для терапии постковидного синдрома.