Штамм дрожжей Lachancea thermotolerans 65-G BKM Y-3573 D как стартовая культура для винификации различных типов виноградных вин Российский патент 2023 года по МПК C12N1/16 C12G1/22 

Изобретение относится к винодельческой промышленности и может быть использовано для подбраживания и полного выбраживания сусла и мезги из различных сортов винограда.

Известно, что в качестве стартовой культуры при сбраживании виноградного сусла и мезги традиционно применяются чистые культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, обладающие высокой устойчивостью к диоксиду серы, который, подавляя бактерии и дикие дрожжи, должен предохранять их от преждевременного забраживания. Доза вводимого SO₂ в качестве превентивной меры зависит от многих факторов и может варьировать от 50,0 до 200,0 мг/дм³.

Однако в последнее десятилетие ученые - энологи, наряду с дрожжами S. cerevisiae, проявляют большой интерес к дрожжам - несахаромицетам, способным участвовать в ферментации муста, влияя на вкус и аромат вина. В этом аспекте заслуживают внимание дрожжи вида Lachancea thermotolerans, которые предлагается использовать в качестве стартовых культур для подбраживания сусла или мезги с последующим введением дрожжей вида Saccharomyces cerevisiae. [1, 2]. В литературе имеются сведения о чувствительности штаммов L. thermotolerans к SO₂, активность которых при сульфитации сусла более 40 мг/дм³ не проявляется. Так отмечено, что из пяти исследованных штаммов только один был активен при концентрации SO₂ в интервале от 20 до 40 мг/л [3]. Отбор штаммов, обладающих высокой устойчивостью к действию SO₂, увеличит использование L. thermotolerans в промышленном масштабе.

В основу заявляемого изобретения поставлена задача - получить сульфитоустойчивый штамм дрожжей L. thermotolerans, что позволит использовать его как эффективную стартовую культуру при сбраживанияи сусла и мезги. В качестве прототипа выбраны культуры дрожжей вида S. cerevisiae, традиционно применяемые в виноделии в качестве стартовых культур, для которых диоксид серы является, в основном, не фунгицидным, а фунгистатическим средством.

Полученный штамм дрожжей L. thermotolerans 65-G (ВКМ Y- 3573 D) имеет следующие культурально-морфологические, физиолого-биохимические и технологические свойства.

Культурально-морфологические свойства:

Размер клеток на среде GPY agar при температуре 23-25°С составляет 3-6 х 4-6 мкм. Форма клеток в основном круглая и округлая (приложение, фиг. 1.). Размножаются почкованием, образование аска со спорами шаровидной формы с гладкими оболочками, 1-4 в аске наблюдали при температуре 23-25° на агаризованной среде GPY через 3-5 дней. При росте в жидкой среде GPY образуется кольцо и плотный пылевидный осадок. Колонии на среде GPY agar через 5-7 дней округлой формы, край ровный, матовые, выпуклые, в профиль конусообразные, диаметр 3-4 мм, цвет кремоватый (приложение, фиг. 2.). По консистенции пастообразные. Гигантская колония, выращенная на среде GPY agar при температуре 25°С в течение 20 дней имеет размер 15x12 мм, край слабофестончатый, по краю валик, середина выпуклая. Цвет кремоватый, вокруг выпуклой середины коричневое кольцо (приложение, фиг. 3). На среде (GPY agar) растет при температуре 37°С.

Физиолого-биохимические и технологические свойства:

Штамм сбраживает глюкозу, сахарозу, раффинозу, не сбраживает лактозу. Сбраживает виноградное сусло сахаристостью более 23,0%, с содержанием общего диоксида серы до 100,0 мг/дм³, рН 3,0-3,2 в интервале температур 18-28°С. Образует незначительное количество летучих кислот, улучшает вкус и аромат вин.

Источник выделения штамма:

Штамм изолирован методом прямого выделения с ягод винограда сорта Бианка, произрастающего в Дагестане. Десорбцию клеток дрожжей проводили в стерильной воде в центрифужных пробирках типа Falcon(50 мл) на пробирочном вортексе MSV-3500 (ООО «BioSan», Латвия) в течение 10 минут, посевы из аликвоты осуществляли на агаризованную глюкозо-пептонно-дрожжевую среду GPY(глюкоза - 2%, пептон - 1%, дрожжевой экстракт - 0.5%, агар - 2%), куда для подавления роста бактерий добавляли левомецитин. Посевы инкубировали при комнатной температуре, учет выросших колоний проводили на 5-6 сутки. При учете результатов проводили дифференцированный подсчет колоний на основе их макроморфологических признаков, по 2-3 колонии каждого типа выделяли в чистую культуру. При идентификация видов использовали метод анализа нуклеотидных последовательностей D1/D2 доменов региона 26S (LSU) рДНК. Для амплификации интересующего нас региона рДНК использовали праймеры ITS1f (5'-СТТ GGT CAT ТТА GAG GAA GTA) и NL4 (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G). Секвенирование амплифицированного региона производили в научно-производственной компании «Синтол» (Москва). Видовая идентификация осуществлялась сравнением полученных нуклеотидных последовательностей с данными, размещенными в генбанке NCBI (ncbi.nlm.nih.gov) и в базе данных MycoID (www.mycobank.org).

Анализ нуклеотидных последовательностей, позволил среди выделенных культур идентифицировать штаммы L. thermotolerans. Скрининг штаммов вида L. thermotolerans. по признакам, имеющим значение в виноделии позволил отобрать указанный штамм 65-G

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №12-04-01222 (микробиологический анализ) и РНФ 14-50-00029 (работы по видовой идентификации).

Исследуемый штамм дрожжей вида L. thermotolerans хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов (VKM) ИБФМ РАН Россия, г. Пущино (ВКМ Y - 3573 D), Коллекции дрожжей кафедры биологии почв факультета Почвоведения МГУ (КБП) Россия, г. Москва, МГУ (КБП Y-5674); лаборатории биохимии и биотехнологии ПИБР ДФИЦ РАН (65-G).

Для выявления штаммов L. thermotolerans, способных начать брожение как стартовая культура, применяли синтетическую среду YNB, содержащую 6,7 г/л азотной основы, куда вводили глюкозу в количестве 5 г/ 100 см³. В работе использовали 7 штаммов L. thermotolerans и в качестве прототипов 16 культур S. cerevisiae, хранящихся в вышеназванных коллекциях. Опыты ставили в двух повторностях, в течение 14 дней фиксировали начало забраживания

В результате было зафиксировано, что в этот период, только один из штаммов L. thermotolerans 65- G, наряду с 15 культурами S. cerevisiae, проявил способность к забраживанию среды. Начало ферментации на штамме 65- G был отмечено на 5-6 дней позже по сравнению со штаммами S. cerevisiae. Массовые концентрации летучих и титруемых кислот, продуцируемого диоксида серы, антиоксидантной активности после остановки брожения представлены в таблице 1.

При выявлении толерантности штамма 65-G к диоксиду серы проводили его тестирование. С этой целью в жидкую среду GPY, содержащую 5,0% глюкозы, вводили разрешенный ГОСТом Р54956-2012 пиросульфит калия (K₂S₂O₅) в количестве, обеспечивающем концентрацию диоксида серы в интервале 40,0 - 100,0 мг /дм³ и фиксировали начало забраживания среды. В результате во всех вариантах были отмечены признаки брожения на вторые - третьи сутки после внесения инокулята.

Кроме того, штамм 65 - G культивировали на стерильном виноградном соке сорта Молдова с концентрацией сахаров 23,3 г/100 см³. В контрольном варианте сок не сульфитировали, в опытных SO₂ вводили из расчета концентрации в среде - 70 и 100 мг /дм³, которые обычно рекомендуются для сульфитирования сусла из здорового винограда. Активную разводку дрожжей вводили через два часа после сульфитации. Результаты наблюдений, проведенные в течение 21 суток, представлены в таблице 2.

Таким образом, отмечено, что сульфитирование среды до 70,0 мг/дм³, несмотря на достаточно высокое содержание сахара, не влияет на активность ее забраживания; при увеличении дозы SO₂ до 100,0 мг/дм³ брожение начиналось позже, при этом, его интенсивность была идентична другим опытным образцам. Количество сброженных сахаров за одинаковый период во всех вариантах было практически на одном уровне.

В качестве стартовой культуры штамм 65-G был опробован на свежем виноградном сусле из различных сортов винограда в сравнении с культурами S. cerevisiae.

Пример 1. Сусло из красного сорта винограда дагестанской селекции Фиолетта с массовой концентрацией сахаров - 22,6 г/100 см³, титруемых кислот - 5,9 г/дм³ (урожай 2019 г.). Сусло засульфитировали до 70,0 мг /дм³, разделили на 2 части и вводили дрожжевые разводки штамма 65- G (опыт) и №1 S. cerevisiae (контроль) в количестве 3% от объема сусла. В таблице 3 представлена динамика сбраживания сахаров до момента введения в бродящее сусло опытного варианта культуры S. cerevisiae.

Пример 2. Сусло из сорта Фиолетта, массовая концентрация Сахаров 22,2 г/100 см³, титруемых кислот - 5,0 г/дм³(урожай 2020 г.). сульфитация до 70,0 мг /дм³. Постановка эксперимента аналогична примеру 1, вместо штамма 1 использовали другой штамм S. cerevisiae №2 также выделенный из ампелоценоза Дагестана. Разводки были внесены 16.09.20 г., брожение в контрольном (штамм №2) и опытном варианте (штамм 65- G) отмечено на следующие сутки. В момент внесения штамма №2 в опытный вариант (21.09). количество сброженных сахаров здесь превышало контроль на 2,6%.

Пример 3. Мезга из сорта винограда Фиолетта, массовая концентрация сахаров 22,2 г/100 см³, титруемых кислот - 5,0 г/дм³ (урожай 2020 г.). Мезгу приготовили и засульфитировали до 70,0 мг /дм³, разделили на 3 части и вводили дрожжевые разводки штамма 65- G (опыт), №1 и №2 S. cerevisiae (контроль) в количестве 3% от объема сусла (16.09.22 г.). На следующий день отмечено брожение во всех вариантах. К моменту спиртования бродящего сусла (21.09.22 г. ) количество сброженных сахаров составило, г/100 см³: штамм 65- G - 4.9; штамм №1 - 5.7, штамм №2 - 5,2.

Пример 4. Сусло из сорта Ркацители, массовая концентрация сахаров - 19.6 г/100 см³, титруемых кислот - 4.6 г/дм³ (урожай 2021 г.). Сусло засульфитировали до 70,0 мг /дм³, разделили на 2 части и вводили дрожжевые разводки штамма 65 - G (опыт) и №1 S. cerevisiae (контроль) в количестве 3% от объема сусла. Брожение на штамме 65-G началось на 2 дня позже, чем в контроле. В момент введения в опытный вариант дрожжей-сахаромицетов количество сброженных сахаров составило, г/100 см³: в опыте 11,3 в контроле 8,1.

Результатами проведенных исследований выявлена способность штамм 65 - G осуществлять активное брожение виноградного сусла (приложение, фиг. 4.) и мезги, которые содержат до 100,0 мг/дм³ общего диоксида серы, что позволяет предложить его в качестве стартовой культуры для подбраживания и полного сбраживания мезги и виноградного сусла, в зависимости от типа производимого вина.

Использование штамма 65 - G как в монокультуре, так и с последующим введением дрожжей S. cerevisiae способствует получению виноматериалов с низким содержанием летучих кислот, более сложных по аромату, мягких по вкусу со сливочными, медовыми тонами, тонким ароматом с нотками различных фруктов в отличие от образцов, полученных только на сахаромицетах.

Опытный образец ликерного вина «Фиолетта», полученный с использованием штамма 65-G, представленный на Международный дегустационный конкурс винодельческой продукции «Антицея», проходивший в г. Краснодаре в июле 2021 г. получил высокие баллы (84,86).

Литература:

1. Benito S. The impacts of Lachancea thermotolerans yeast strains on winemaking /S.Benito // ApplMicrobiolBiotechnol. - 2018. - Vol. 102(16) - P. 6775 - 6790. DOI: 10.100 7/s00253-018-9117-z.

2. Benito A, Calderon F, Palomero F, BenitoS Quality and composition of Airen wines fermented by sequential inoculation of Lachanceathermotolerans and Saccharomyces cerevisiae./A Benito [et al]//Food TechnolBiotechnol. - 2016. - Vol. 54. - P. 135-144. DOI: 10.17113/ftb. 54.02.16.4220.

3. Comitini F., Gobbi M., Domizio P.,Romani C., Lencioni L., Mannazu I., Ciani M. Selected non-Saccharomyces wine yeasts in controlled multistarter fermentations with Saccharomyces cerevisiae /Comitini F.[et al] //Food Microbiol. - 2011 - Vol. 28. - P. 873-882. DOI:10.1016/j.fm.2010.12.001.

Изобретение относится к области микробиологии. Описан штамм дрожжей Lachancea thermotolerans 65-G ВКМ Y-3573 D для использования в качестве стартовой культуры при производстве различных типов виноградных вин. Изобретение позволяет использовать штамм как эффективную стартовую культуру при сбраживания и сусла и мезги. 4 ил., 3 табл., 4 пр.

Штамм дрожжей Lachancea thermotolerans 65-G ВКМ Y-3573 D для использования в качестве стартовой культуры при производстве различных типов виноградных вин.