СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО ПРЕПАРАТА БАКТЕРИАЛЬНЫХ КЛЕТОК С АКТИВНОСТЬЮ АМИЛАЗЫ И ЛИПАЗЫ Российский патент 2023 года по МПК A23K10/10 

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения иммобилизованного препарата на основе бактериального штамма Bacillus aequororis ВКМ B-3610D, обладающего липазной и амилазной активностью, который может быть использован в качестве кормовой добавки. Клетки бактерий иммобилизованы в процессе роста на кормовых дрожжах в виде биопленки, как целые живые клетки. Полученный препарат обогащен клеточно-связанной липазой и амилазой.

Иммобилизация ферментов является важным этапом технологий их использования, т.к. ограничение их пространственной свободы стабилизирует активность, дает возможность долговременного функционирования и хранения ферментных препаратов. Однако необходимость выделения фермента и его очистки значительно удорожает процесс. В ряде случаев возможна иммобилизация целых клеток микроорганизмов, проявляющих определенную ферментативную активность.

Микроорганизмы различных таксонов, среди которых микромицеты, дрожжи и бактерии, являются источниками эффективных кормовых добавок для промышленного птицеводства: ферментов, пробиотиков и их комплексов. Такие препараты нацелены на достижение оптимальной структуры и функции микробиоты пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных [Феоктистова и др., 2018].

Спорообразующие непатогенные бактерии рода Bacillus используются в сельском хозяйстве в качестве пробиотических препаратов [Феоктистова и др., 2017; Патент РФ 2184774; Патент РФ 2203947; Патент РФ 2246537; Патент РФ 2398872; Патент РФ 2530552; Патент РФ 2663720; Патент РФ 2723411]. Бактерии рода Bacillus относятся к типичным представителям нормальной экзогенной микрофлоры человека и животных: они широко распространены в окружающей среде и постоянно находятся в контакте с живым организмом. Спектр действия пробиотических препаратов на основе бактерий рода Bacillus заключается в подавлении роста патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, нормализации пищеварения, стимуляции неспецифической резистентности макроорганизма, восстановлении эндогеной микрофлоры, синтезе аминокислот и витаминов [Ефимова, Удалова, 2011].

Применение ферментов в кормопроизводстве улучшает питательность кормов. Так, основу комбикормов для птицы составляют семена зерновых и зернобобовых культур, которые являются основными источниками питательных веществ и энергии, но при этом содержат и антипитательные вещества: некрахмалистые полисахариды, фитаты, а для бобовых также характерны ингибиторы пищеварительных ферментов, гликозиды, алкалоиды, танины и другие, которые ухудшают перевариваемость корма [Феоктистова и др., 2018]. Жиры для животных и птицы являются трудноусвояемыми продуктами, что делает актуальным применение экзогенной кормовой липазы, позволяющей повысить эффективность использования животными жиров, входящих в состав корма. Амилазы способствуют усвоению крахмала, а мультиэнзимные комплексы дают сенергический эффект, в результате чего увеличивается питательная ценность корма. Известна разработка мультиэнзимной композиции, предназначенной для введения в комбикормовую продукцию специального состава, содержащего целлюлолитические и амилолитические ферменты [Патент РФ 2170253 С1].

Известен способ получения биологически-активной кормовой добавки на основе биомассы соматических структур гриба Agricus bisporus, образующихся в условиях твердофазной ферментации фуражного зерна [Патент РФ 2097979 С1].

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому прототипом является Патент РФ 2412612 С1 «СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОЙ КОРМОВОЙ ДОБАВКИ ФЕРМ КМ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И ПТИЦЫ». Это изобретение относится к кормопроизводству, в частности к способам приготовления биологически активных кормовых добавок для млекопитающих, птиц, рыб, повышающих эффективность пищеварения, оказывающих разностороннее действие на животный организм и позволяющих применять их как для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний, так и для стимуляции роста и повышения продуктивности животных. Изобретение заключалось в том, что жидкую культуру Bacillus licheniformis ВКПМ В-4162 смешивали со свекловичным жомом и высушивали до влажности 8-9%, в дальнейшем высушенные продукты смешивали и подвергали дроблению до получения однородного продукта. Также культуры бацилл, полученные путем их раздельного аэробного глубинного культивирования на питательных средах заданного состава, наносили на стерильную смесь свекловичного жома и пшеничных отрубей, которую предварительно обрабатывали целлюлолитическим ферментом, и проводили твердофазную ферментацию в условиях ограниченного доступа кислорода в течение 48 ч. Недостатком описанного в патенте РФ 2412612 способа являются многоэтапность и длительность процесса, а также низкая защищенность иммобилизованных сухих клеток в составе препарата от внешнего воздействия, абиотического окисления клеточных структур и, следовательно, снижения жизнеспособности пробиотической бактерии и активности препарата, при приготовлении, хранении и применении.

Полученные заявляемым способом пробиотические бактерии формируют биопленку и окружены в ней полимерным матриксом, который защищает клетки бактерий и ферменты, ассоциированные с клеточной оболочкой, от влияния физических и химических агрессивных факторов среды. Это дает следующие преимущества перед применением пробиотических бактерий как в виде суспензии, так и в иммобилизованном виде без образования биопленки:

- при производстве препарата пробиотические бактерии и их ферменты могут без снижения активности выдерживать нагрев и сушку;

- при хранении полученный пробиотический препарат стабилен и хранится длительное время без снижения активности фермента и жизнеспособности клеток;

- при применении бактерии защищены от действия кислой среды в верхних отделах желудочно-кишечного тракта животных, что позволяет им в высокоактивном состоянии без снижения жизнеспособности и активности фермента проходить в кишечник, где в результате усиливается пищеварение и эффективность усвоения компонентов корма.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение бактериального препарата на основе целых клеток Bacillus aequororis ВКМ B-3610D с активностью амилазы и липазы, иммобилизованных в процессе роста в виде биопленок на кормовых дрожжах. Отличие от прототипа достигается тем, что препарат получают выращиванием бактерий Bacillus aequororis ВКМ B-3610D, проявляющих амилазную и липазную активность, на кормовых дрожжах; рост бактериальной массы происходит в виде биопленки на кормовых дрожжах в одну стадию в жидкой культуральной среде. Известно, что в биопленках бактерии дольше сохраняют свою жизнеспособность, т.к. защищены от воздействий окружающей среды полимерным матриксом. Непатогенные спорообразующие бактерии рода Bacillus могут быть использованы в качестве пробиотического препарата, улучшающего пищеварение.

Задачей изобретения является расширение ассортимента кормовых препаратов, упрощение и удешевление процесса их производства.

Для достижения технического результата и получения кормовой добавки инокулят бактерий Bacillus aequororis ВКМ B-3610D, проявляющих амилазную и липазную активность, вносили в стерильную среду культивирования с питательными субстратами и предварительно стерилизованными нерастворимыми кормовыми дрожжами, и культивировали. В процессе культивирования бактерии образовывали биопленки на кормовых дрожжах. В конце культивирования массу кормовых дрожжей с биопленками Bacillus aequororis ВКМ B-3610D отделяли от среды культивирования центрифугированием или фильтрованием и высушивали при температуре окружающей среды или при нагреве в диапазоне температур от 20 до 50°С, при атмосферном давлении или при вакуумировании. За единицу ферментативной активности клеток (ЕД) принимали количество субстрата в мкмоль, трансформируемое за минуту.

Таким образом, в сравнении с известным способом (прототипом) заявленный способ позволяет получить иммобилизованный препарат в процессе одностадийного культивирования бактерий, проявляющих липазную и амилазную активность, в присутствии кормовых дрожжей в жидкой среде культивирования. При этом кормовые дрожжи являются дополнительным питательным субстратом для бактерий, что приводит к эффективному их росту в виде биопленок, позволяет сократить время культивирования с 5-7 до 2-3 суток. Клетки бактерий в выращенных биопленках более устойчивы к воздействиям окружающей среды, высушиванию, хранению.

Способ иллюстрирован примерами:

Пример 1. Культивирование Bacillus aequororis ВКМ B-3610D.

В. aequororis 5-ДБ выращивали при температуре 25°С на минеральной среде Пфеннига составом (г/л): NH₄Cl - 0.3, KH₂PO₄ - 0.3, MgCl₂ - 0.3, CaCl₂ - 0.03, дрожжевой экстракт - 0.5, 1% (об./об.) раствора микроэлементов, содержащих в 100 мл дистиллированной воды (мг) ЭДТА - 500; FeSO₄*7H₂O - 200; ZnSO₄*7H₂O - 10; MnCl₂*4H₂O 3; CoCl₂*6H₂O - 20; Н₃ВО₃ - 30; NiCl₂*6H₂O - 2; Na₂MoO*2H₂O - 3; CuCl₂*2H₂O - 1, pH среды 11. Культивирование осуществляли с перемешиванием на роторной качалке со скоростью вращения платформы 100-150 об./мин. В качестве источника углерода добавляли 1% крахмал растворимый для индукции амилазной активности и 1% твин-80 для индукции липазной активности. В результате получали биомассу в количестве 15-25 г/л среды с активностью амилазы 1,2-23 мкг/мл/мин и липазы 1,2-23 мкг/мл/мин.

Пример 2. Получение биопленок В. aequororis ВКМ B-3610D с липазной и амилазной активностью на кормовых дрожжах.

Бактерии В. aequororis ВКМ B-3610D культивировали на среде Пфеннига (рН 11), в качестве субстрата вносили 0.25% растворимого крахмала. В питательную среду вносили предварительно стерилизованные кормовые дрожжи в соотношении 30 г дрожжей на 1 л среды. Культивировали в течение 1-7 сут при 25°С с перемешиванием. Осадок отделяли центрифугированием (10 мин при 4500 g) или фильтрованием. Кормовые дрожжи с биопленками В. aequororis ВКМ B-3610D высушивали до остаточной влажности 10-25% при температуре от 20 до 60°С и при атмосферном давлении, либо в вакуумной сушильной установке.

Амилазная активность бактериального препарата на основе В. aequororis ВКМ B-3610D составила 520-878 мкмоль/мин (ЕД)/г в пересчете на клеточную биомассу и 353-484 ЕД/г в пересчете на иммобилизованный препарат (кормовые дрожжи с биопленкой В. aequororis ВКМ B-3610D).

Снижение активности амилазы и липазы после сушки не превышало 10%, а в течение месяца хранения при температуре окружающей среды не превышало 5%.

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения иммобилизованного препарата на основе бактериального штамма Bacillus aequororis ВКМ B-3610D, обладающего липазной и амилазной активностью, который может быть использован в качестве кормовой добавки для сельскохозяйственных животных. Способ заключается в том, что клетки бактерий с амилазной и липазной активностью выращивают в присутствии нерастворимых кормовых дрожжей в одну стадию в жидкой культуральной среде, после окончания культивирования кормовые дрожжи с выращенными на них бактериями, образующими биопленку, отделяют от культуральной среды и высушивают. Изобретение позволяет получить бактериальный препарат на основе целых клеток Bacillus aequororis ВКМ B-3610D с активностью амилазы и липазы, иммобилизованных в процессе роста в виде биопленок на кормовых дрожжах. 2 пр.

Способ получения бактериального препарата с липазной и амилазной активностью, включающий подготовку жидкой питательной среды для выращивания бактерий с липазной и амилазной активностью, внесение инокулята бактерий и стерилизованных нерастворимых кормовых дрожжей, отделение кормовых дрожжей с биопленкой от культуральной жидкости с помощью центрифугирования или фильтрования, где в качестве бактерии с липазной и амилазной активностью используется Bacillus aequororis ВКМ B-3610D.