ШТАММ Bacillus amyloliquefaciens ВКМ В-2714D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К ТЕТРАЦИКЛИНУ И ТРИМЕТОПРИМУ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/07 

Описание патента на изобретение RU2509148C1

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к пробиотическим бактериальным препаратам, которые могут найти применение в ветеринарии.

Пробиотическими являются бактериальные препараты на основе штаммов микроорганизмов, обладающих антагонистической активностью к энтеропатогенным бактериям.

В классических исследованиях И.А.Мечникова эти свойства были изучены на примере молочнокислых бактерий. Затем круг продуцентов пробиотических препаратов был расширен.

Пробиотики на основе штаммов спорообразующих бактерий сравнительно недавно стали применяться в ветеринарии. Антагонистические свойства этих бактерий привлекают к себе внимание многих разработчиков.

Сложность лечения инфекционных заболеваний заключается в возникновении у патогенных микроорганизмов полирезистентности к антибиотикам. Кроме того, сами антибиотики часто оказывают побочное воздействие на организм животных и вызывают дисбактериоз кишечника, отягчающий течение основного заболевания. Это обусловливает необходимость поиска новых подходов к решению данной проблемы.

Препараты-пробиотики на основе бактерий рода Bacillus, подавляющие развитие патогенных микроорганизмов, находят широкое применение в сельском хозяйстве для подавления фитопатогенных бактерий и грибов, в медицине, ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных [1].

В настоящее время препараты-пробиотики из бактерий рода Bacillus, находят широкое применение в ветеринарии для лечения различных заболеваний птиц и сельскохозяйственных животных. Предложены многочисленные варианты пробиотиков из спорообразующих бактерий: бактиспорин [5], бациллоспорин [6], споролакт [7], споробактерин [8], субалин [9]. Основу вышеперечисленных препаратов - пробиотиков составляют разные штаммы бактерий рода Bacillus, обладающие антагонизмом в отношении патогенных бактерий.

Подавляющее большинство представителей рода Bacillus безвредны для теплокровных животных, проявляют антагонистическую активность к широкому спектру патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, устойчивы к литическим ферментам, технологичны в производстве, стабильны при хранении, экологически безопасны.

Учитывая возможность применения антибиотиков в кормопроизводстве, весьма перспективно использование в составе пробиотических препаратов штаммов, обладающих как высокой антагонистической активностью против энтеропатогенов, так и полирезистентностью к антибиотикам.

Кроме препаратов на основе Bacillus subtillis и Bacillus licheniformis разработаны препараты на основе Bacillus amiloliquefaciens.

В качестве прототипа выбран штамм Bacillus amiloliquefaciens СЕСТ-5940, являющийся основой препарата ЕСОВЮЦ 10].

Задачей настоящего изобретения является получение штамма Bacillus amiloliquefaciens, обладающего антагонистической активностью к широкому спектру патогенных тест-организмов, а также резистентностью к наиболее широко применяемым антибиотикам.

Технический эффект, который может быть получен при использовании полученного штамма, заключается в повышении эффективности лечения за счет возможности сочетанного применения бактериального препарата с антибиотиками.

Для решения указанной проблемы предлагается штамм Bacillus amiloliquefaciens ВКМ B-2714D. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Идентификация штамма была осуществлена по «Определителю микроорганизмов» Берги (1997 г.).

Исходный почвенный изолят выделен в Кировской области. Почвенный изолят был подвергнут мутагенному воздействию нитрозогуанидина (доза от 40 до 100 мкг/мл) с последующим скринингом на селективных средах.

Культурально-морфологические и микроскопические особенности штамма: клетки палочковидные прямые, размер: 0,5-0,7×2,0-3,0 мкм, образуют термоустойчивые эндоспоры, не более 1 в клетке-спорангии, спорообразование не подавляется экспозицией на воздухе, расположение центральное. Клетки подвижны. На стандартных плотных питательных средах (МПА, LB, ГРМ-1) образует белые кратерообразные колонии. Каталаза: положительный_тест, аэроб. Используемые источники углерода при аэробном росте: глюкоза, арабиноза, ксилоза, манит, декстроза, казеин, крахмал. Оптимум pH для роста 6,0-8,0, температура: от +4°C до +45°C. Резистентность к антибиотикам: тетрациклин - 20 мкг/мл, триметоприм - 100 мкг/мл.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Антагонистическую активность проверяли методом отсроченного антагонизма.

Для этого взвесь клеток, смытых с агаровой среды, высевали штрихом по диаметру чашки Петри с агаризованной средой Гаузе N 2. Посевы инкубировали в термостате при 37°C в течение 48 ч. Затем к выросшей культуре подсевали штрихом тест-микроорганизмы (500- миллионные суспензии суточных культур в физиологическом растворе). Учет результатов проводили через 18-20 часов инкубирования при 37°C по величине зон отсутствия роста тест-культур. Контролем роста тест-культур служило параллельное выращивание их на чашках с агаризованной средой Гаузе N 2 без исследуемой культуры. Результаты приведены в таблице.

Задержка роста тест-культур, мм E.coli S.typhi-murium S.typhi Ps.aeruginosa St.aureus L.monocytogenes 0 0 14 0 9 13

Пример 2. Была изучена резистентность к следующим антибиотикам: канамицин, стрептомицин, гентамицин, триметоприм, налидиксовая кислота, цефазолин, ампициллин, бензилпенициллина натриевая соль. Проверку осуществляли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом при различных концентрациях антибиотиков. Было установлено, что штамм обладает резистентностью к антибиотикам: тетрациклин - 20 мкг/мл, триметоприм - 100 мкг/мл.

Пример 3.

Активности ферментов в культуральной жидкости определяли при глубинном культивировании продуцента на глюкозо-пептонной среде с дрожжевым экстрактом в течение двух суток. Были определены следующие значения ферментативной активности:

α-амилазная активность - 0,09 Ед/ мл среды при pH 6,0, ксиланазная активность - 2,0 Ед/мл среды при pH 7,0, протеазная активность - 2,143 Ед/мл среды при pH 7,0.

Следует отметить высокую протеазную и ксиланазную активность штамма Bacillus amiloliquefaciens ВКМ B-2714D.

Источники информации

1.Смирнов В.В., Резник С.Р., Вьюницкая В.О. Современные представления о механизмах лечебно-профилактического действия пробиотиков из бактерий рода Bacillus. // Микробиол. журн. - 1993. - №4. - с.92-112.

2. Бакулина Л.Ф., Тимофеев И.В., Перминова Н.Г., Полушкина А.Ф., Печуркина Н.И. Пробиотики на основе спорообразующих микроорганизмов рода Bacillus и их использование в ветеринарии. // Биотехнология. 2001, №2, с.48-56.

3. Hong, Н.А., Due L.H., Cutting S.M. The use of bacterial spore formers as probiotics .// FEMS Microbiol.Rev. - 2005. - Vol.29, N 4. - P. 813-835.

4. Probiotics Microbes: The Scientific Basis / R.J. Collier, et al. // A Report from American Academy of Microbiology - Washington, 2006. - 28 p.

5. Патент РФ 2130316. Лечебно-профилактический биопрепарат бактиспорин. A61K 35/74, БИ № 14, 1999, приор. 23.01.97.

6. Патент СССР 1710575. Штамм бактерий Bacillus sp - компонент лечебно-профилактического препарата против дисбактериозов и аллергий, С 12 N1/20, БИ №5, 1992.

7. Патент РФ 2035186. Профилактический биопрепарат споролакт. A61K 35/66, БИ №14, 1995.

8. Алешкин, А.В., Афанасьев, С.С., Давыдкин, В.Ю., Манько, Т.Н., Давыдкин, И.Ю. Бактерийный препарат нового поколения «Споробактерин». // Мед. картотека. - 2003. - №4

9. Патент РФ №2035185 Профилактический биопрепарат Субалин. -1995 Приор. 31.01.1992.

10. Haipeng Cao, Shan Не, Ruopeng Wei, Marek Diong, Liqun Lu. Safety and efficacy of Ecobiol (Bacillus amiloliquefaciens) as feed additive for chickens for fattening. The EFSA Journal (2008) 773, 1-13.

Похожие патенты RU2509148C1

название год авторы номер документа
ШТАММ Bacillus subtilis subsp. Subtilis ВКМ В-2711D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Escherichia coli, Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И ТЕТРАЦИКЛИНУ 2012
  • Иваненко Алексей Александрович
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Пунтус Ирина Филипповна
  • Филонов Андрей Евгеньевич
RU2509149C1
ШТАММ Bacillus licheniformis, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphyloccus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И НАЛИДИКСОВОЙ КИСЛОТЕ 2012
  • Иваненко Алексей Александрович
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Пунтус Ирина Филипповна
  • Филонов Андрей Евгеньевич
RU2501851C1
ШТАММ BACILLUS LICHENIFORMIS ВКМ B-2713D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К SALMONELLA TYPHI, STAPHYLOCCUS AUREUS, LISTERIA MONOCYTOGENES И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К СТРЕПТОМИЦИНУ И НАЛИДИКСОВОЙ КИСЛОТЕ 2012
  • Иваненко Алексей Александрович
  • Самойленко Владимир Александрович
  • Пунтус Ирина Филипповна
  • Филонов Андрей Евгеньевич
RU2501849C1
Штамм бактерий Bacillus mojavensis RCAM05965, обладающий антагонистической активностью по отношению к Candida albicans, Serratia marcescens, Escherichia coli и перспективный для производства пробиотика для человека и/или животных 2023
  • Малкова Ангелина Владимировна
  • Иркитова Алена Николаевна
  • Евдокимов Иван Юрьевич
  • Ширманов Максим Вячеславович
  • Дудник Дина Евгеньевна
  • Каргашилова Екатерина Николаевна
RU2804275C1
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS, ОБЛАДАЮЩИЙ ШИРОКИМ СПЕКТРОМ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И УСТОЙЧИВОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ 1999
  • Байгузина Ф.А.
  • Кузнецова Т.Н.
  • Баданова С.Ч.
RU2169767C1
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ ПРОТИВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ И ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТЬЮ 2010
  • Денисов Евгений Николаевич
  • Кузнецова Татьяна Николаевна
RU2444366C1
ШТАММ BACILLUS SUBTILIS ТРАХС, РЕЗИСТЕНТНЫЙ К ТЕТРАЦИКЛИНУ, РИФАМПИЦИНУ, АМПИЦИЛЛИНУ, ХЛОРАМФЕНИКОЛУ, СТРЕПТОМИЦИНУ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К ПАТОГЕННЫМ ВИДАМ МИКРООРГАНИЗМОВ 1997
  • Буланцев А.Л.
  • Тихонов Н.Г.
  • Липницкий А.В.
RU2118364C1
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ 1999
  • Байгузина Ф.А.
  • Кузнецова Т.Н.
  • Баданова С.Ч.
RU2172175C1
БИОПРЕПАРАТ "ИРИЛИС" ВЕТЕРИНАРНОГО НАЗНАЧЕНИЯ 2003
  • Сорокулова Ирина Борисовна
  • Осипова И.Г.
  • Васильева Е.А.
  • Евлашкина В.Ф.
  • Харитонова Е.Ю.
  • Трофимов С.Г.
  • Остроумов Ю.И.
  • Доронин А.Н.
RU2264453C2
ЛЕКАРСТВЕННЫЙ ПРЕПАРАТ ИЗ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS 2001
  • Байгузина Ф.А.
  • Алсынбаев М.М.
  • Штроман Г.А.
  • Кулагин В.Ф.
  • Осипова И.Г.
  • Байгузина С.Н.
RU2181596C1

Реферат патента 2014 года ШТАММ Bacillus amyloliquefaciens ВКМ В-2714D, ОБЛАДАЮЩИЙ ВЫРАЖЕННЫМ АНТАГОНИЗМОМ ПО ОТНОШЕНИЮ К Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes И РЕЗИСТЕНТНОСТЬЮ К ТЕТРАЦИКЛИНУ И ТРИМЕТОПРИМУ

Изобретение относится к области биотехнологии. Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКМ B-2714D обладает выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, резистентностью к антибиотикам тетрациклину и триметоприму. Депонирован во Всероссийской Коллекции Микроорганизмов ИБФМ Г.К. Скрябина РАН (ВКМ) под регистрационным номером ВКМ B-2714D и может быть использован при производстве пробиотических бактериальных препаратов, которые могут найти применение в ветеринарии. Изобретение позволяет повысить протеазную и ксиланазную активности. 1 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 509 148 C1

Штамм Bacillus amyloliquefaciens ВКМ B-2714D, обладающий выраженным антагонизмом по отношению к Salmonella typhi, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes и резистентностью к антибиотикам тетрациклину и триметоприму.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2014 года RU2509148C1

SHAN HE, et al., Safety and efficacy of ecobiol (Bacillus amiloliquefaciens) as feed additive for chickens for fattening., The EFSA Journal, 2008, 773, p.1-13
ШТАММЫ БАКТЕРИЙ Bacillus subtilis И Bacillus amyloliquefaciens-ПРОДУЦЕНТЫ ИНОЗИНА И СПОСОБ ПРОДУКЦИИ ИНОЗИНА С ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ 2005
  • Лившиц Виталий Аркадьевич
  • Казаринова Людмила Анатольевна
  • Закатаева Наталия Павловна
  • Кутукова Екатерина Александровна
  • Херсонская Анастасия Михайловна
RU2333949C2
ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS - ПРОДУЦЕНТ ТИМИДИНА 1995
  • Королькова Н.В.
  • Миронов А.С.
  • Гарибян А.Г.
  • Полануер Б.М.
  • Тяглов Б.В.
RU2088659C1
RU 2003689 С1, 30.11.1993
Штамм бактерий BacILLUS амYLоLIQUеFасIеNS-продуцент @ -амилазы BacILLUS LIснеNIFоRмIS 1991
  • Баев Вадим Борисович
  • Попов Дмитрий Геннадиевич
  • Орлова Мария Николаевна
  • Йомантас Юргис Владович
  • Сорокин Алексей Васильевич
  • Болотин Александр Петрович
  • Рябченко Николай Федорович
  • Народицкая Вера Ароновна
  • Козлов Юрий Иванович
  • Стеркин Виктор Эмильевич
  • Дебабов Владимир Георгиевич
  • Вольфович Лев Давидович
SU1788966A3
ЛЕЧЕБНО-ПРОФИЛАКТИЧЕСКИЙ БИОПРЕПАРАТ "БАКТИСПОРИН" 1997
  • Михайлова Н.А.
  • Кузнецова Т.Н.
  • Кунягина О.В.
RU2130316C1

RU 2 509 148 C1

Авторы

Иваненко Алексей Александрович

Самойленко Владимир Александрович

Пунтус Ирина Филипповна

Филонов Андрей Евгеньевич

Даты

2014-03-10Публикация

2012-08-31Подача