Комплексное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное противоопухолевое средство Российский патент 2023 года по МПК C07C335/38 A61K31/155 A61P35/00 C07C255/34 

Изобретение относится к медицине, а именно к новым фармакологически активным соединениям, которые обладают комплексным антиангиогенным и гипоксия-ориентированным действием, и могут найти применение в онкологии, в качестве средств таргетной терапии солидных злокачественных новообразований.

Онкологические заболевания представляют собой серьезную проблему для современной медицины. По данным медицинской статистики в 2020 году только в Российской Федерации на учете с различными онкологическими заболеваниями состояло 3,2 млн пациентов (Каприн А.Д., Старинский В.В., Шахзадова А.О. Состояние онкологической помощи населению России в 2020 году. М.: МНИОИ им. П.А. Герцена − филиал ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, 2021. 239 с. ISBN 978-5-85502-262-9). Несмотря на постоянное совершенствование радио- и химиотерапии, и методов ранней диагностики онкологических заболеваний, многие распространенные злокачественные новообразования по-прежнему с трудом поддаются лечению.

По мнению ведущих специалистов в области онкологии, изменение сложившейся картины возможно лишь с внедрением в клиническую практику таргетных противоопухолевых средств, мишенью которых являются биохимические или патофизиологические процессы, специфичные для злокачественных новообразований или их определенных видов (Willett C.G., Duda D.G., di Tomaso E. et al. Complete pathological response to bevacizumab and chemoradiation in advanced rectal cancer. Nat. Clin. Pract. Oncol. 2007. 4(5): 316-21; Lein S., Lowman H.B. Therapeutic anti-VEFG antibodies. Handb. Exp. Pharmacol. 2008. 181: 131-50).

Так, известно, что на сегодняшний день допущены к клиническому применению или проходят клинические испытания две обширные группы антиангиогенных препаратов. Первая – препараты, узко-селективно блокирующие VGEF–VGEFR систему (бевацизумаб, афлиберцепт, рамуцирумаб), вторая – мультитаргетные ингибиторы тирозинкиназ (сорафениб, сунитиниб, акситиниб, пазопаниб, ленвантиниб, вандетаниб, кабозантиниб, апатиниб, регорафениб, иматиниб, дазатиниб, темзиролимус), действие которых блокирует несколько ангиогенных рецепторов, сигнальных или гормональных путей, стимулирующих ангиогенез. Такое разнообразие лекарственных средств обусловлено сложной организацией опухолевого ангиогенеза, предоставляющего множество молекулярных мишеней для терапевтического воздействия.

Вместе с тем, клинические результаты современной антиангиогенной терапии остаются достаточно ограниченными, вследствие быстрой адаптации опухолей к таким воздействиям. Причем, злокачественные новообразования приобретают резистентность не только к препаратам, воздействующим на один сигнальный путь (ингибиторы VEGF), но и к мультикиназным ингибиторам (Itatani Y.; Kawada K.; Yamamoto T. et al. Resistance to Anti-Angiogenic Therapy in Cancer-Alterations to Anti-VEGF Pathway. 2018. 19(4):1232). Показано, что длительное применение антиангиогенных препаратов вызывает развитие внутриопухолевой гипоксии, которая индуцирует транскрипционные факторы, способствующие адаптации опухолевых клеток к антиангиогеннному воздействию (Mendez-Blanco C., Fondevila F., Garcia-Palomo A. et al. Sorafenib resistance in hepatocarcinoma: role of hypoxia-inducible factors. ExpMolMed. 2018. 50(10):1-9).

Наряду с синтетическими антиангиогенными фармакологическими препаратами известны также средства природного происхождения, обладающие подобной активностью. В частности, известен куркумин (Заявка на изобретение US № 96116127, опубл.10.11.1998), представляющий собой полифенольное соединение, экстрагируемое из корневищ Curcuma longa, Curcuma zedoaria и Acorus calamus L., обладающее антиангиогенным, противовоспалительным, антиоксидантным, антипролиферативным действием.

Недостатком куркумина является его плохая химическая стабильность и низкая биодоступность при пероральном применении. Основные причины, способствующие низким уровням куркумина в плазме и тканях, связаны с плохой абсорбцией, быстрым метаболизмом и быстрым системным выведением куркумина из организма (Kharat M, Du Z, Zhang G, McClements DJ. Physical and chemical stability of curcumin in aqueous solutions and emulsions: impact of pH, temperature, and molecular environment. J Agric Food Chem. 2017; 65(8):1525–1532).

Известно антиангиогенное лекарственное средство на основе танинов (пат. RU № 2634253,опубл. 24.10. 2017), которое в качестве действующего вещества содержит димерный макроциклический танин, выделенный из побегов и соцветий Chamerion angustifolium, состава C68H48O44, обладающего антиангиогенным действием.

Существенным недостатком данного средства является отсутствие селективности к рецепторам фактора роста эндотелия сосудов и как следствие отсутствие значимого противоопухолевого действия.

В последние десятилетия была установлена важная роль эндогенного оксида азота (NO) в процессах опухолевого ангиогенеза (Wang H., Wang L., Xie Z. etal. Nitric Oxide (NO) and NO Synthases (NOS)-Based Targeted Therapy for Colon Cancer. Cancers (Basel). 2020. 12(7):1881). Существует ряд многообещающих исследований применения эффективных ингибиторов синтаз оксида азота (ингибиторов NOS) в терапии злокачественных опухолей определенных локализаций. В частности, авторами данного изобретения ранее была показана перспективность использования некоторых оригинальных изотиомочевин с NOS-ингибирующим действием (патенты RU № 2503450, опубл. 10.01.2014; № 2699558, опубл. 06.09.2019; № 2751776, опул. 16.07.2021) в качестве антиангиогенных средств (Филимонова М.В. и др. Сравнительное исследование влияния ингибитора NOS T1023 и бевацизумаба на рост и морфологию карциномы легких Льюис. Пат. Физиол. Эксп. Тер. 2019. Т. 63(2). С. 89-98; Филимонова М.В. и др. Экспериментальное исследование противоопухолевой активности нового ингибитора синтаз оксида азота Т1023. Мол. Мед. 2015. № 1. С. 61-64). Вместе с тем, и для ингибиторов NOS также наблюдается недостаток, характерный для фармакопейных антиангиогенных средств – быстрое развитие резистентности у злокачественных опухолей к такому антиангиогенному воздействию.

Прототипом предлагаемого изобретения является оригинальная изотиомочевина – 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины гидробромид (соединение Т1059), со структурной формулой:

,

которая была ранее получена и исследована авторами данного изобретения (патент RU № 2552529, опубл. 10.06.2013).

Соединение Т1059 является эффективным конкурентным ингибитором эндотелиальной и индуцибельной изоформ NOS (eNOS и iNOS), играющих ведущую роль в регуляции сосудистого тонуса и процессах опухолевого ангиогенеза. Согласно экспериментальным данным, соединение Т1059 при хроническом введении в дозах 50-80 мг/кг вызывает развитие нарушений опухолевой васкуляризации.

Однако существенным недостатком прототипа является кратковременность его антиангиогенного действия вследствие быстрого развития резистентности у экспериментальных неоплазий.

Для адаптации к гипоксии опухолевые клетки используют множественные механизмы. Активная экспрессия гипоксия-индуцируемых факторов (HIFs) активирует метаболические пути, способствующие повышению гипоксической устойчивости. В частности, этому способствует стимуляция метаболизма глюкозы и лактата – высокий уровень HIF-1α индуцирует экспрессию транспортера глюкозы GLUT1. И усиленное поступление глюкозы в гипоксические опухолевые клетки обеспечивает их энергетический обмен по гликолитическим путям с образованием лактата и H⁺. А развитию ацидоза в этих клетках противодействует также HIF-1α- зависимая экспрессия монокарбоксилатных транспортеров лактата (MCTs), которые при этом не допускают закисление внутриклеточной среды.

В ряде исследований показано, что гиперэкспрессия изоформ MCT1 и MCT4 играет важную роль в выживании и пролиферации пула гипоксических резистентных опухолевых клеток. Причем, применение ингибиторов MCTs, подавляя выведение лактата, способно вызывать гибель гипоксических опухолевых клеток (Guan X., Morris M. In Vitro and In Vivo Efficacy of AZD3965 and Alpha-Cyano-4-Hydroxycinnamic Acid in the Murine 4T1 Breast Tumor Model. 2020. 22(4): 84; Wang Y., Qin L., Chen W. et al. Novel strategies to improve tumour therapy by targeting the proteins MCT1, MCT4 and LAT1. Eur J Med Chem. 2021. 226:113806).

Учитывая, что антиангиогенное действие ингибиторов NOS повышает внутриопухолевую гипоксию, можно предполагать усиление их противоопухолевой активности при сочетанном применении с агентами, нацеленными на гипоксический пул клеток опухоли – в частности, с ингибиторами MCTs. Для реализации такой стратегии представляется целесообразным применение α-циано-4-гидроксикоричной кислоты (CHC) со структурной формулой:

,

которая является селективным ингибитором MCT1 и MCT4 (Puri S., Juvale K. Monocarboxylate transporter 1 and 4 inhibitors as potential therapeutics for treating solid tumours: A review with structure-activity relationship insights Eur J Med Chem. 2020. 199:112393).

Причем, химические и физико-химические свойства соединения Т1059 и CHC (Т1059 – слабое основание, а CHC – сильная органическая кислота) позволили реализовать сочетание этих двух соединений на химическом уровне в виде соли 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамата (далее, соединения Т1114), со структурной формулой:

.

В молекулярной структуре соединения Т1114 присутствует фрагмент, реализующий NOS-ингибирующее, антиангиогенное действие (1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевина), и фрагмент, реализующий МСТ-ингибирующее действие, вызывающее гибель резистентного гипоксического пула опухолевых клеток (α-циано-4-гидроксициннамат).

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в создании нового комплексного антиангиогенного и гипоксия-ориентированного противоопухолевого средства, обеспечивающего более выраженное, стабильное и длительное противоопухолевое действие в отношении неоплазий различного гистогенеза, без усиления токсических эффектов.

Технический результат достигается тем, что комплексное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное противоопухолевое средство, содержит химическое соединение 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамат в качестве действующего вещества, общей формулы:

,

обладающее NOS- ингибирующей и MCT- ингибирующей активностью, и оказывающее сочетанное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное токсическое воздействие на неоплазии.

Химический синтез соединения Т1114 и его противоопухолевая активность, а также достижение заявленного технического результата отражены в примерах.

Сущностью настоящего изобретения является получение химического соединения 1-циклогексаноил- 2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамата и применение этого соединения в качестве антиангиогенного и гипоксия-ориентированного противоопухолевого средства.

Пример 1. Синтез химического соединения 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамата(соединения Т1114).

3г (10 ммоль) гидробромида 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины растворили в 10 мл воды. По каплям добавили концентрированный водный раствор аммиака до рН 8 (5 мл). Выделившееся масло экстрагировали эфиром (2х 15мл). Эфирный экстракт промыли водой и сушили б/в Na₂SO₄. Упарили растворитель, маслянистый остаток составил 2г (9,3 ммоль) основания 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины. Растворили 2г (9,3 ммоль) основания в 2 мл ацетона. Затем 1,76 г (9,3 ммоль) α-циано-4-гидроксикоричной кислоты растворили при нагревании в 10 мл ацетона с добавлением 1 мл диметилсульфоксида. Горячий раствор влили в раствор основания в ацетоне и оставили на 30 минут при комнатной температуре, а затем убрали в холодильник. Образовавшийся белый осадок отфильтровали и перекристаллизовали из этилацетата. Выход 1,6 г (39 ,7%). Т_пл 105-108⁰С (с разложением). Спектр ПМР (DMSO-d6, δ): 1,21-1,23 (м., 9 Н); 1,60-1,67(м., 4Н); 2,0 (с., 1Н); 2,2 (т., 1Н); 2,9 (т., 2Н); 4,0 (т., 1Н); 6,95 (д., 2Н); 7,95(д.,2Н); 8,2 (с., 1Н); 10,4-11,0 (ш., 2Н). Вычислено (%): С 57,0; Н 6,46; N 9,97. Найдено (%): С 57,36; Н 6,22; N 10,1. Химическая формула: C₂₀H₂₇N₃O₅S.

В доступной научной и патентной литературе способы получения 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннаматаи его свойства не описаны, что свидетельствует о том, что данное соединение получено нами впервые.

Пример 2. Оценка противоопухолевой активности соединения 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевиныα-циано-4-гидроксициннамата (Т1114) в сравнении с соединением-прототипом (Т1059) на модели солидной карциномы Эрлиха (СКЭ) у мышей.

Исследование выполнено на 60 самках мышей-гибридов F₁ (СВА х C57Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации на 3 экспериментальные группы по 20 особей в каждой. Всем животным трансплантировали суспензию карциномы Эрлиха (СКЭ), содержащую 2,5*10⁶ млн. клеток в 0,1мл среды 199 (ПанЭко, Россия), в предварительно депилированную латеральную поверхность правого бедра. Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животным опытной группы с 7-х по 20-е сутки роста СКЭ проводили ежедневое внутрибрюшинное введение соединения Т1114 и соединения Т1059 в эквимолярных дозах 96 и 70 мг/кг соответственно (по 0,1 мл на 10 г массы тела животного). Соединение Т1114 применяли в виде суспензии, которую изготавливали на основе воды для инъекций (Дальхимфарм, Россия) с 0,5% 2-гидроксипропиловым эфиром целлюлозы (гипролоза, Nipponsoda, Япония), раствор Т1059 изготавливали на основе воды для инъекций. Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. — М.: Гриф и К, 2012. — 944 с.).

В сравнительном исследовании противоопухолевой активности (табл. 1) соединение-прототип ингибитор NOS Т1059 при используемой дозе и схеме введения самостоятельно оказывал крайне слабое противоопухолевое действие – статистически значимый эффект отмечался только в начале применения. Анализ данных торможения роста опухолевых узлов показал, что слабое влияние соединения-прототипа Т1059 крайне слабо отразилось и на торможении роста опухоли – всего на 15-20%.

В то же время соединение Т1114 при ежедневном в/б введении в дозе 96 мг/кг оказывало более стабильное влияние на рост СКЭ в сравнении с соединением-прототипом Т1059. Противоопухолевая активность соединения Т1114 реализовывалась к 3-4-м суткам от начала применения, и в эти же сроки достигала своих максимальных значений. Активность соединения Т1114 в течение всего срока наблюдения была умеренно выраженной и сопровождалась значимыми статистическими различиями в объемах опухолевых узлов в сравнении с животными-опухоленосителями контрольной группы. При этом соединение Т1114 стабильно тормозило рост опухоли на 20-35%.

Таблица 1 – Влияние соединений Т1114 и Т1059 в эквимолярных дозах на рост и торможение роста СКЭ у самок мышей F1(СВА х C₅₇Bl/6j), n=16-18

Срок наблюдения, сутки Средний объем опухоли (V), относительные единицы (М±σ); индекс ТРО, % Контроль Т1059, 70 мг/кг Т1114, 96мг/кг V V ТРО V ТРО 6 1,0 1,0 1,0 9 3,1 ± 0,7 2,3 ± 0,5* 25,2 ± 15,7 2,0 ± 0,5* 34,7 ± 17,3 12 4,6 ± 1,2 3,9 ± 1,1 20,3 ± 16,5 3,5 ± 0,7* 24,9 ± 14,4 14 7,4 ± 1,9 6,4 ± 1,7 18,0 ± 16,2 5,8 ± 1,0* 21,6 ± 14,0 16 10,6 ± 3,1 9,1 ± 2,1 17,0 ± 15,9 8,4 ± 1,3* 21,0 ± 12,0 19 16,3 ± 4,0 14,4 ± 4,0 15,9 ± 18,0 12,9 ± 1,3* 20,9 ± 8,3 21 21,3 ± 4,2 18,6 ± 5,0 17,5 ± 17,6 17,7 ± 2,2* 17,1 ± 10,5 23 26,0 ± 4,7 21,2 ± 5,2* 19,9 ± 18,2 21,7 ± 2,6* 18,6 ± 10,0

Символ * – статистически значимые различия с контрольной группой по U-критерию Манна-Уитни с поправкой Холма-Бонферрони

Анализ динамики веса (табл. 2) опытных животных не выявил статистически значимых различий. Относительные массы тела животных в группах, получавших лечение, соответствовали показателям контрольных опухоленосителей. При этом развития летальных эффектов применения соединения Т1114 не наблюдалось, что свидетельствует о безопасности используемых доз и, в целом, о безопасности применения такого лечения.

Таблица 2 – Динамика относительной массы тела в группах, получавших соединения Т1114 и Т1059.

Срок наблюдения, сутки Масса тела, % (M ± SD); Контроль Т1059, 70 мг/кг Т1114, 96мг/кг 6 100,0 100,0 100,0 9 102,9 ± 3,5 103,5 ± 2,5 104,1 ± 4,0 12 103,2 ± 4,0 102,8 ± 2,8 102,9 ± 3,1 14 107,3 ± 4,5 108,1 ± 3,3 107,0 ± 5,1 16 111,8 ± 5,5 111,6 ± 3,9 110,8 ± 4,9 19 117,6 ± 4,8 115,9 ± 4,6 117,4 ± 6,2 21 119,3 ± 4,9 120,2 ± 4,9 121,3 ± 7,4 23 121,3 ± 5,6 122,9 ± 5,0 124,2 ± 6,7

Пример 3. Оценка противоопухолевой активности соединения 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамата в сравнении с соединением-прототипом (Т1059) на модели рака шейки матки (РШМ-5) у мышей.

Исследование выполнено на самках мышей CBA в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации на 3 экспериментальных группы: контрольную и две опытных, по 20 особей в каждой. Всем животным трансплантировали суспензию РШМ-5, содержащую 2,5*10⁶ млн. клеток в 0,3 мл среды 199 (ПанЭко, Россия), в предварительно депилированную латеральную поверхность правого бедра. Соединения вводили в схемах и дозах, описанных в примере 2.

Результаты исследования противоопухолевой активности соединений Т1059 и Т1114 на модели РШМ-5 (табл. 3), в целом, повторяют результаты, полученные на опухолевой модели СКЭ в примере 2. Самостоятельное применение соединения-прототипа Т1059 (70 мг/кг, в/б, ежедневно) оказывало достаточно слабое влияние на рост РШМ-5 у мышей, которое сопровождалось торможением роста опухоли на 12-18%. Статистически значимый противоопухолевый эффект соединения Т1059 развивался только на поздних сроках применения.

Самостоятельное влияние соединения Т1114 в эквимолярной дозе (96 мг/кг, в/б, ежедневно) на рост РШМ-5 было существенно более выраженным. Значимый противоопухолевый эффект соединения Т1114 развивался к концу первой недели применения и далее сохранялся на стабильном уровне – ТРО 22-25%.

Таким образом, присутствие фрагмента α-циано-4-гидроксикоричной кислоты в составе соединения Т1114 значимо усиливает его противоопухолевую активность в сравнении с соединением-прототипом.

Таблица 3 – Влияние соединений Т1114 и Т1059 в эквимолярных дозах на рост и торможение роста РШМ-5 у самок мышей СВА х C₅₇Bl/6j, n=16-18

Срок наблюдения, сутки Средний объем опухоли (V), относительные единицы (М±σ); индекс ТРО, % Контроль Т1059, 70 мг/кг Т1114, 96 мг/кг V V ТРО V ТРО 8 1,0 1,0 1,0 12 3,77 ± 0,56 3,36 ± 0,71 14,6 ± 12,8 3,43 ± 0,68 11,9 ± 13,6 15 7,04 ± 1,23 6,81 ± 1,60 9,9 ± 10,5 5,68 ± 1,57 * 22,0 ± 18,2 18 11,83 ± 2,98 10,69 ± 2,77 14,2 ± 13,8 9,08 ± 1,38 * 23,2 ± 11,7 20 16,44 ± 2,99 13,63 ± 2,64 17,6 ± 15,3 12,34 ± 1,87 * 24,9 ± 11,4 22 22,53 ± 3,05 18,47 ± 2,50 * 18,0 ± 11,1 17,27 ± 1,60 * 23,4 ± 7,1

Символ * – статистически значимое различие с контрольной группой по U-критерию Манна-Уитни с поправкой Холма-Бонферрони

Таким образом, заявляемое изобретение достигает технического результата, заключающегося в более выраженном, стабильном и длительном противоопухолевом действии, по сравнению с прототипом, в отношении неоплазий различного генеза, без усиления токсических эффектов.

Так, в экспериментальных исследованиях на перевиваемых опухолях животных различного гистогенеза (примеры 2-3) установлено, что 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамат (Т1114) при хроническом парентеральном введении вызывает достоверно более выраженное и стабильное противоопухолевое действие, чем соединение прототип 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины гидробромид (Т1059), примененное сходным образом в эквимолярных дозах.

В пользу безопасности предложенного соединения свидетельствуют наблюдения в экспериментах с животными-опухоленосителями, где Т1114 при хроническом применении не вызывало у животных летальных или токсических эффектов.

Совокупность заявленных существенных признаков свидетельствует о достижении заявленного технического результата. Соединение Т1114 – 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамат способно создать новые возможности в таргетной терапии злокачественных новообразований человека.

Изобретение относится к медицине, а именно к комплексному антиангиогенному и гипоксия-ориентированному противоопухолевому средству, содержащему химическое соединение 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамат в качестве действующего вещества общей формулы (I), обладающему NOS-ингибирующей и MCT-ингибирующей активностью и оказывающему сочетанное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное токсическое воздействие на неоплазию. Технический результат - комплексное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное противоопухолевое средство, обеспечивающее более выраженное, стабильное и длительное противоопухолевое действие в отношении неоплазий различного гистогенеза, без усиления токсических эффектов. 1 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.

(I)

1. Комплексное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное противоопухолевое средство, содержащее химическое соединение 1-циклогексаноил-2-этилизотиомочевины α-циано-4-гидроксициннамат в качестве действующего вещества общей формулы

,

обладающее NOS-ингибирующей и MCT-ингибирующей активностью и оказывающее сочетанное антиангиогенное и гипоксия-ориентированное токсическое воздействие на неоплазию.

2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что химическое соединение проявляет NOS-ингибирующую и MCT-ингибирующую активность при дозе 96 мг/кг действующего вещества.