ПРОИЗВОДНЫЕ ИНДОЛ-3-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2022 года по МПК C07D209/42 C07D401/06 C07D409/06 A61K31/405 A61P35/00 A61P37/02 

Изобретение относится к медицине, а именно к созданию лекарственных средств на основе диалкиламиноалкиловых эфиров производных индол-3-карбоновой кислоты (ИТК), обладающих противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью, которые могут найти применение в фармацевтической промышленности.

Злокачественные новообразования в силу их широкой распространенности и высоких темпов прироста показателей продолжают оставаться важнейшей проблемой здравоохранения большинства стран мира. В этой связи повышение эффективности лечения таких больных – одна из наиболее актуальных проблем современной медицины.

В последние годы в онкологической практике все большее внимание привлекают к себе методы иммунотерапевтического воздействия на злокачественные новообразования. Результаты большого количества отечественных и зарубежных исследований свидетельствуют о способности иммунотерапии при комбинированном лечении некоторых видов опухолей (меланома, рак молочной железы, рак шейки матки и т.д.) повышать 5-летнюю выживаемости на 30-50%, в зависимости от конкретного иммуномодулятора, механизма его действия, локализации опухоли ее морфологии и стадии заболевания (Abe Y., Ishida T. Immunomodulatory drugs in the treatment of multiple myeloma. Japanese Journal of Clinical Oncology. 2019. 49(8): 695-702; Medrano R., Hunger A. et al. Immunomodulatory and antitumor effects of type I interferons and their application in cancer therapy. Oncotarget. 2017. 8(41): 71249-71284; Прохач Н.Э., Срочан П.П., Громакова И.А. Современный опыт и перспективы применения иммуномодуляторов в комплексной терапии онкологических заболеваний//Международн. мед. журнал. – 2006. – № 4, – С. 86-93; Fanwen Wang, Bin Li, Pengcheng Fu et al. Immunomodulatory and enhanced antitumor activity of a modified thymosin α1 in melanoma and lung cancer. International Journal of Pharmaceutics. 2018. 547: 611-620). В частности, изучается перспективность и целесообразность применения цитокинотерапии (IL-2,4,10,12; TNF-α; IFN-α и IFN-γ), а также ряда соединений природного происхождения в качестве противоопухолевых средств с иммуномодулирующим механизмом действия. (Glick R. P., Lichtor T., Cohen E. P. Cytokine immunogene therapy. Neurosurg. Focus. 2000. 9(6): 1-9; Chen L., Wei Y., Zhao S. et al. Antitumor and immunomodulatory activities of total flavonoids extract from persimmon leaves in H 22 liver tumor-bearing mice. Scientific reports. 2018. 8:10523; Bao X., Yuan H., Wang C. Antitumor and immunomodulatory activities of a polysaccharide from Artemisia argyi. Carbohydrate Polymers. 2013. 98 (1):1236-1243).

Однако эффективность противоопухолевых иммуномодулирующих средств в режиме монотерапии пока остается незначительной и малоубедительной (Зинченко С.В. Иммуномодуляторы в комплексной терапии онкологических больных (обзор литературы). Поволжский онкологический вестник. 2014, 1: 57-64;).

Известно, что в клинической практике часто используются рекомбинантный интерлейкин-2 (далее IL-2) Ронколейкин (RU 2105011 С1), полученный в результате экспрессии в бактериальных клетках рекомбинантного вектора, содержащего ген IL-2 человека. Рекомбинантный IL-2 стимулирует рост, дифференцировку и пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов, олигодендроглиальных клеток, клеток Лангерганса и используется в качестве иммуномодулирующего противоопухолевого средства в онкологии.

Однако часто применяемый высокодозный режим монотерапии рекомбинантным IL-2 не редко сопровождается токсическими эффектами, проявляющимися лихорадкой, ознобами, миалгиями и, реже, поражениями печени, что является существенным недостатком Ронколейкина, ограничивающим его применимость в клинической практике. Кроме того, лечение Ронколейкином эффективно лишь у 20-25% онкологических больных.

Другое известное иммуномодулирующее средство, применяемое в цитокинотерапии злокачественных опухолей – Рефнот. (RU 2690677 С1). Рефнот представляет собой стабилизированную цитокиновую композицию, полученную на основе человеческого рекомбинантного интерферона гамма и фактора некроза опухолей – тимозина (ФНО-Т), обладает противоопухолевой, противовирусной, антиоксидантной, иммуномодулирующей, актопротективной, антимутагенной активностью.

Однако использование Рефнота в качестве монотерапии онкологических заболеваний дает не высокий (10–30%) результат излечения, что является его существенным недостатком. Кроме того, получение препарата генно-инженерным способом обусловливает его высокую стоимость, а узкий спектр применимости (показан только для комплексной терапии рака молочной железы) ограничивает использование Рефнота в онкологии.

Известны также иммуномодулирующие противоопухолевые средства растительного происхождения: настойка травы татарника (RU 2356566 С1); экстракт листьев и цветков аврана лекарственного (RU 2519769 С1); экстракт листьев и (или) цветков обыкновенного персика (RU 2224535 С1).

Недостатками данных средств является сложность в стандартизации получаемых составов, а также в сборе трав (татарник), высокой токсичности за счет присутствия опасных соединений (авран) и достаточно низкой противоопухолевой эффективностью в отношении злокачественных новообразований.

Известно иммуномодулирующее средство «Кумазид» (RU 2271820 С1), представляющее собой комплекс моносульфатированных кукумариозидов со стерином (1:2), обладающее иммуномодулирующим действием.

Недостатком является исключительно превентивное использование данной композиции для профилактики развития опухоли на ранних стадиях, и полная неэффективность в отношении развившихся новообразований.

Приведенный обзор имеющихся противоопухолевых средств с иммуномодулирующим механизмом действия показывает ограниченность их терапевтических возможностей, и наличие у них ряда существенных недостатков, что свидетельствует о необходимости разработки новых, более эффективных противоопухолевых иммуномодулирующих средств.

Известны производные индол-3-карбоновой кислоты, обладающие противовирусной активностью (RU 2552422 С2). Изобретение относится к аминоалкиловым эфирам 5-метоксииндол-3-карбоновой кислоты и их фармакологически приемлемым солям общей формулы (I), где R1 представляет собой циклогексил, C_1-3 алкил; R2 представляет собой фенилтио, фенилокси, в которых фенильная группа может иметь 1-2 заместителя галогена или С_1-4алоксигруппу, или R2 представляет собой 5-6-членный гетероциклоалкил, содержащий 1-2 гетероатома, выбранных из азота и кислорода; n равно 1, 2, 3, 4; каждый из R независимо выбирается из С_1-4алкила; за исключением соединений, указанных в формуле изобретения.

Однако в доступной литературе нет данных о наличии противоопухолевой активности известных по патенту RU 2552422 производных индол-3-карбоновой кислоты, обладающих противовирусной активностью.

Самым близким прототипом предлагаемого технического решения является умифеновир (арбидол) (патент RU 2033157) – гидрохлорид моногидрата 1-метил-2-фенилтиометил-3-карбэтокси-4-диметиламинометил-5-окси-6-броминдола, со структурной формулой:

Результаты исследований показали, что арбидол, воздействуя на диссеминированные опухолевые клетки, оказывает высокую антиметастатическую активность при минимальной токсичности используемых доз. Установлено усиление антиметастатического действия при комбинированном применении арбидола с локальным облучением (Федоровская Е.О. Комбинированные схемы лечения метастазарующих опухолей мышей: значение индукторов интерферона: дисс. канд.био.наук / Научно-исслед. ин-т мед. радиологии. – 1992. – 117 с.)

Основным недостатком прототипа при его применении в лечении злокачественных новообразований является практически полное отсутствие влияния этого соединения на рост первичной опухоли. Это, по мнению многих специалистов, связано с нерастворимостью арбидола в воде, что снижает его биодоступность и ограничивает противоопухолевую эффективность.

Техническим решением является применение в качестве противоопухолевых средств водорастворимых диалкиламиноалкиловых эфиров производных индол-3-карбоновой кислоты, для которых не характерно развитие угрожающих побочных эффектов.

Ранее авторами настоящего изобретения были разработаны методы синтеза, впервые получены и исследованы новые оригинальные водорастворимые диалкиламиноалкиловые эфиры производных индол-3-карбоновой кислоты, которые в биологических исследованиях продемонстрировали высокую иммуномодулирующую и противовирусную активность эффектов (Филимонова М.В., Цышкова Н.Г., Наровлянский А.Н. и соавт. Производные индол-3-карбоновой кислоты, обладающие противовирусной активностью / Патент РФ на изобретение RU 2552422. Дата публикации: 27.01.2015; Филимонова М.В., Цышкова Н.Г., Наровлянский А.Н. и соавт).

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в качестве действующего вещества выступают водорастворимые иммуномодулирующие диалкиламиноалкиловые эфиры, обладающие противоопухолевой активностью со структурными формулами (1), (2), (3):

в которых:

(1) - дигидрохлорид диэтиламиноэтилового эфира 6-бром-5-метокси-1-метил-2-метилпиперидил-индолил-3-карбоновой кислоты (далее Т986);

(2) - гидрохлорид 6-бром-1-метил-5-метокси-2-фенилтиометил-3-(2’-диметиламиноэтокси)карбонилиндола (далее Т999А);

(3) - гидрохлорид 6-бром-5-метокси-1-циклогексил-2-метил-3-(3’-диэтиламинопропокси)карбонилиндола (далее Т1054). Причем водорастворимые производные индол-3-карбоновой кислоты обладают противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью при дозах действующего вещества от 20 до 100 мг/кг.

Предлагаемое в настоящем изобретении решение позволяет достичь важного технического результата – реализация выраженного и стабильного противоопухолевого эффекта (торможение роста неоплазий различного генеза) без токсического влияния на организм.

Экспериментальные данные, отражающие токсические свойства, противоопухолевую и иммуномодулирующую активность заявленных соединений.

Пример 1 – Исследование острой токсичности заявленных соединений.

Токсичность соединений Т986, Т999А, Т1054 исследована на беспородных белых мышах-самцах массой 22-26 г по стандартному тесту острой токсичности при однократном введении (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под общей ред. члена-корреспондента РАМН, проф. Р.У.Хабриева. – 2-изд., перераб. и доп.– М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.). Исследуемые вещества растворялись в физиологическом растворе и вводились внутрибрюшинно. Срок наблюдения за опытными животными составлял 14 суток. Оценку среднелетальной дозы (LD50) проводили по методу Литчфильда-Уилкоксона (Litchfild J.T., Wilcoxon F.A. Asimplified method of evaluating dose effect experiments // J. Pharm. Exp. Ther. – 1947. – V.95. – P.99-113).

Результаты этих исследований показали, что соединения Т986, Т999А, Т1054 относятся к третьему классу токсичности и опасности (умеренно токсично) (Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Химико-фармацевтический журнал, 2003. Т.37, №3. С. 32-34).

Показатель средней смертельной дозы (ЛД₅₀) составил для мышей 487 мг/кг, 325 мг/кг (Табл. 1).

Пример 2 - Исследование противоопухолевой активности соединения Т986 на экспериментальных опухолевых моделях карциномы Эрлиха (КЭ) и рака шейки матки (РШМ-5) у мышей.

Исследование выполнено на 40 самках мышей СВА и 40 самках мышей-гибридов F1 (СВА х C₅₇Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации на 2 экспериментальных группы: контрольную и опытную, по 20 особей в каждой. Всем животным трансплантировали КЭ и РШМ-5 по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012). Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животные опытных групп получали внутрибрюшинно 5 инъекций Т986 раз в трое суток в дозе 50 мг/кг. Раствор T986 изготавливали на основе 0,9% асептического раствора хлорида натрия (Дальхимфарм, РФ). Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012).

Результаты исследования показали, что при использованной схеме и дозе соединение Т986 на всех этапах наблюдения оказывало значимое противоопухолевое действие по отношению к РШМ-5 (Табл.2). Максимальная активность наблюдалась уже после второй инъекции Т986 (ТРО – 30-40%), и при дальнейшем наблюдении эффект снижался (ТРО – 18-25%), но сохранялся на значимом уровне. Важно отметить, что в этом исследовании действие Т986 не сопровождалось летальным действием на животных-опухоленосителей и не вызывало у них развитие интоксикации.

В тоже время на экспериментальной опухолевой модели КЭ активность Т986 при той же схеме введения проявлялась нестабильно (Табл.3) – наблюдалось выраженное действие на раннем этапе применения (9-е сутки), но в последующем влияние вещества до конца курса применения было недостоверным, тем не менее, после окончания курса применения Т986 в этой группе развивалось выраженное торможение роста опухоли (ТРО – 29-35%). На этой модели действие Т986 также не сопровождалось токсическими эффектами.

Пример 3 - Исследование противоопухолевой активности соединений Т999А и Т1054 на экспериментальной опухолевой модели карциномы Эрлиха (КЭ) у мышей.

Исследование выполнено на 60 самках мышей-гибридов F1 (СВА х C₅₇Bl/6j) в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации на 3 экспериментальных группы: контрольную и 2 опытных, по 20 особей в каждой. Всем животным трансплантировали КЭ по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012). Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животные опытных групп получали внутрибрюшинно 5 инъекций Т999А и Т1054 раз в трое суток в дозе 50 мг/кг. Растворы T999А и Т1054 изготавливали на основе 0,9% асептического раствора хлорида натрия (Дальхимфарм, РФ). Противоопухолевые эффекты изучали по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012).

Результаты данного исследования (табл.4) свидетельствуют, что соединения Т999А и Т1054 значимо тормозили рост КЭ уже к концу первой недели применения, и в дальнейшем поддерживали стабильное торможение неоплазии на уровне 30-40%. После окончания курса влияние Т1054 в течение 3-5 суток ослабевало до уровня 20%. Последействие Т999А было значительно более стойким – по окончанию курса применения торможение неоплазии сохранялось на уровне 30% до конца наблюдения (не менее 9-ти суток).

Как и в предыдущем примере, действие изучаемых соединений Т999А и Т1054 в течение срока наблюдения не вызывало у подопытных животных интоксикации и гибели.

Пример 4 - Иммуномодулирующая активность Т1054 – влияние на продукцию интерлейкина-4 (IL4) у мелких лабораторных животных.

Определение уровня IL4 проводилось на мышах-самках линии CBA, в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации на 4 группы: контроль и 3 опытных. Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животным второй опытной группы вводили соединение Т1054. Животным третьей и четвертой опытной группы перевивали опухоль РШМ-5 подкожно в область латеральной поверхности правого бедра, по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012) и животным четвертой группы вводили соединение Т1054. Исследуемое соединение Т1054 вводилось мышам внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг на 7 и 10 сутки роста опухоли. Растворы T1054 изготавливали на основе воды для инъекций (Фармасинтез-Тюмень). На 11 сутки от начала исследования проводили забор крови у животных, отделяли плазму. Содержание IL4 в плазме крови мышей определяли с помощью ИФА в соответствии с инструкцией набора ELISA Kit for Interleukin 4 (Cloud-Clone Corp.).

Результаты исследований иммуномодулирующей активности Т1054 показали выраженное, достоверное повышение содержания IL4 на фоне роста РШМ-5 (Табл. 5). Соединение Т1054 снижало этот опухолезависимый эффект в 2 раза, что позволяет предположить о возможных механизмах действия исследуемого соединения.

Пример 5 - Иммуномодулирующая активность Т1054 – влияние на продукцию интерферона-гамма (IFN-γ) у мелких лабораторных животных.

Определение уровня IFN-γ проводилось на мышах-самках линии CBA, в возрасте 2-2,5 месяцев с массой тела 19-22 г, распределенных методом рандомизации на 4 группы: контроль и 3 опытных. Контрольные животные в дальнейшем не получали каких-либо экспериментальных воздействий. Животным третьей опытной группы вводили соединение Т1054. Животным второй и четвертой опытной группы перевивали опухоль РШМ-5 подкожно в область латеральной поверхности правого бедра, по методике, описанной в Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств (2012) и животным четвертой группы вводили соединение Т1054. Исследуемое соединение Т1054 вводилось мышам внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг на 7 и 10 сутки роста опухоли. Растворы T1054 изготавливали на основе воды для инъекций (Фармасинтез-Тюмень). На 11 сутки от начала исследования проводили забор крови у животных, отделяли плазму. Содержание IFN-γ в плазме крови мышей определяли с помощью ИФА в соответствии с инструкцией набора ELISA Kit for IFN-γ (Cloud-Clone Corp.).

Результаты оценки влияния Т1054 на продукцию IFN-γ показали выраженное, достоверное опухолезависимое снижение содержания IFN-γ у животных-опухоленосителей. Т1054 не влиял на продукцию IFN-γ у интактных животных, в то время как в группе животных-опухоленосителей Т1054 устранял опухолезависимую депрессию IFN-γ (Табл. 6).

Соединение Т1054 снижало этот опухолезависимый эффект в 2 раза, что позволяет предположить о возможных механизмах действия исследуемого соединения.

Доказательство достижения заявленного результата

Результаты токсикологических исследований (пример 1) свидетельствуют, что водорастворимые химические аналоги арбидола – соединения Т986, Т999А и Т1054, являются относительно безопасными соединениями. Показатели острой токсичности этих соединений (ЛД50) составляют 325-480 мг/кг, что позволяет отнести их к 3 классу токсичности – вещества «умеренно опасные» (Березовская И.В. Классификация химических веществ по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения // Химико-фармацевтический журнал, 2003. Т.37, №3. С. 32-34).

Данные иммунологических исследований (примеры 4, 5) свидетельствуют, что при хроническом применении заявленные соединения оказывают выраженную иммуномодулирующую активность, характер которой имеет отчетливую противоопухолевую направленность – подавление опухолезависимой гиперпродукции IL-4 и устранение опухолезависимой депрессии IFN-γ.

Результаты экспериментов на опухолях различного гистогенеза (карцинома Эрлиха, рак шейки матки у мышей) свидетельствуют, что все три заявленных соединения при хроническом парентеральном введении в безопасных дозах (1/9-1/6 ЛД50) вызывают выраженное торможение роста неоплазий без индукции токсических и летальных эффектов. В то время как хроническое применение арбидола не оказывает значимого влияния на развитие этих неоплазий (Федоровская Е.О. Комбинированные схемы лечения метастазирующих опухолей мышей: значение индукторов интерферона: дисс. канд.био.наук / Научно-исслед. ин-т мед. радиологии. – 1992. – 117 с).

Совокупность этих данных свидетельствует о достижении заявленного результата – реализация выраженного и стабильного противоопухолевого эффекта (торможение роста неоплазий различного генеза) без индукции значимых токсических эффектов.

Предложенные соединения могут применяться в лечении онкологических заболеваний в качестве иммуномодулирующих противоопухолевых средств как при монотерапии, так и в сочетании с химиотерапией или лучевой терапией, при назначении их в эффективной дозе 20-100 мг/кг (1/9-1/6 ЛД50) или в составе фармацевтических композиций, содержащих эффективное количество этих соединений.

Изобретение относится к органической химии, а именно к применению производных индол-3-карбоновой кислоты структурных формул (1), (2), (3) в качестве водорастворимых иммуномодулирующих противоопухолевых средств. Дозы действующего вещества могут составлять от 20 до 100 мг/кг. 1 з.п. ф-лы, 6 табл., 5 пр.

1. Применение производных индол-3-карбоновой кислоты структурных формул (1), (2), (3) в качестве водорастворимых иммуномодулирующих противоопухолевых средств:

(1)

(2)

(3)

2. Применение водорастворимых производных индол-3-карбоновой кислоты по п.1, отличающееся тем, что они обладают противоопухолевой и иммуномодулирующей активностью при дозах действующего вещества от 20 до 100 мг/кг.