Способ размножения катальпы бигнониевидной (Catalpa bignonioides) Российский патент 2025 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области лесного хозяйства, а также к биотехнологии растений, в частности к способу размножения редких древесных растений, и может быть использовано для массового получения качественного посадочного материала катальпы бигнониевидной (Catalpa bignonioides), трудно размножаемого генеративным и вегетативным способами. Полученные растения могут быть использованы для реинтродукции катальпы бигнониевидной в естественные места произрастания, в качестве ценного ресурса для лесного хозяйства, а также для Фарминдустрии.

Род Катальпа (Catalpa) семейства Бигнониевые (Bignoniaceae) насчитывает 11 видов, из которых самым распространенным является катальпа бигнониевидная (Catalpa bignonioides). Это обусловлено, прежде всего, богатым и разнообразным составом вторичных метаболитов, которые широко применяются в Фарминдустрии и медицине. Химический состав экстрактов представлен широким спектром биологически активных веществ, как правило, фенольной природы, что обуславливает высокую антимикробную, противовоспалительную, диуретическую и репаративную активность экстрактов. Ранозаживляющее и бактерицидное действие коры, плодов и листьев катальпы объясняют наличием в растениях фитонцидов [В.В. Ковалев, Т.Г. Ярных, О.В. Демешко [и др.] Изучение антимикробной активности мазей с сухим экстрактом катальпы бигнониевидной // Вестник фармации. - 2018. - №3(81). - С.81-85].

Как показывают исследования разных авторов, в различных частях растения содержатся иридоиды, как правило, в виде гликозидов и синтезируются растениями, в первую очередь, в качестве защиты от растительноядных животных, насекомых или поражения микроорганизмами.

Иридоиды имеют чрезвычайно широкий спектр биологической активности, в том числе сердечнососудистой, спазмолитической, мочегонной, противоопухолевой, противовирусной и иммуномодулирующей, что дает возможность использовать все части растения в химической и фармацевтической промышлености [Андрианова Л. Н. Химический состав и строение триацилглицеринов масла семян катальпы и некоторых других высыхающих масел: дисс. канд. хим. наук:02.00.01. - Калинин, 1985. 195 с].

Кроме того, катальпа бигнониевидная представляет интерес не только для Фарминдустрии, но и для лесного хозяйства, например, для создания карбоновых плантаций. Прежде всего, это связано с тем, что у растений формируются крупные листья, которые обеспечивают с высокой эффективностью депонирование углекислого газа. Растения катальпы так же характеризуются быстрым ростом и формированием ценной древесины, которая по своей прочности не уступает лиственнице. Поэтому стоит острая необходимость получения высококачественного посадочного материала катальпы, для плантационного выращивания данной культуры, а также для создания карбоновых плантаций [А.Р. Родин, С.А. Родин, Е.А. Калашникова, СБ. Васильев Лесные культуры: учебник, под редакцией В.Ф. Никитина. - 2-е изд. - Москва: МГТУ им. Н.Э. Баумана, 2020].

Основной способ размножения катальпы - семенной, но на практике иногда применяют и вегетативный способ размножения - черенкование. Однако предлагаемые способы не позволяют с высокой эффективностью получать высококачественный посадочный материал.

Одним из направлений получения генетически стабильного посадочного материала и веществ вторичного синтеза является применение методов биотехнологии, в частности, получение in vitro клеточных культур в виде микроклонов или каллусных культур. Работы по культуре клеток и тканей катальпы бигнониевидной малочисленны и носят поисковый характер.

Известен способ размножения катальпы бигнониевидной через семена [Аладина О.Н., Архангельский В.Н., Аладин С.А., Акимова С. В, Способ ускоренного выращивания древесных покрытосеменных растений из семян. Патент, RU 2368130/С2, МПК A01G 23/00, выдан 27.09.2009]. Способ заключается в весеннем посеве стратифицированных семян в искусственный субстрат - обезвоженные стабилизированные осадки городских сточных вод (ОГСВ), срок хранения которых не превышает одного года, с последующим прореживанием появившихся всходов и посадкой в контейнеры. Недостатком данного способа является низкий выход посадочного материала, применение специфического грунта, который не является распространенным в питомниководстве, а также зависимость данного способа размножения от благоприятного для катальпы сезона.

Известен способ размножения катальпы бигнониевидной через семена с предварительной обработкой их биологически активных веществ [Назарян А.И., Таран С.С., Иванисова Н.В. Влияние ФАВ на формирование фитомассы сеянцев катальпы // Современные тенденции развития науки и технологий. 2015. №4-2. С.40-43]. Технология предусматривает применение препарата Байкал в концентрации 0,01-0,03% и позволяет получать прибавку по биомассе. Однако данная технология имеет недостатки, так как действующее вещество препарата оказывает избирательное действие на определенные органы растения.

Известен способ вегетативного размножения катальпы [Quan J., Ni R., Wang Y., Sun J., Ma M., Bi H. Effects of Different Growth Regulators on the Rooting of Catalpa bignonioides Softwood Cuttings // Life 2022, 12,1231 https://doi.org/10.3390/1ife12081231] с использованием черенков, изолированных с 3-х летних растений. Заявленный способ включает замачивание черенков в водном растворе индолилмасляной кислоты (ИМК) в концентрации 1000 мг/л. Недостатком данного способа является низкий процент укоренившихся черенков (62,4%), а также ограничение по времени для проведения работ.

Известен способ размножения in vitro катальпы прекрасной (Catalpa speciosa) [Седун Е.А., Хотляник Н.В., Зубарев А.В., Спиридович Е.В. Подбор перспективных биотехнологических методов для сохранения старовозрастных древесно-кустарниковых насаждений Северо-Западного региона Беларуси // Международная научная конференция «Интродукция, сохранение и использование биологического разнообразия флоры», посвященная 90-летию со дня образования Центрального ботанического сада НАН Беларуси, 2022, с. 160-162], предусматривающий получение асептической культуры за счет применения ступенчатой стерилизации побегов, изолированных с интактных растений. Первоначально побеги обрабатывают 0,01% раствором фунгицида «Прозаро» 7 минут с последующей двукратной отмывкой по 5 минут в стерильной дистиллированной воде, а затем побеги обрабатывают 0,1% раствором нитрата серебра (AgNO₃) 5-7 минут с последующей двукратной отмывкой в стерильной дистиллированной воде по 5 минут. Асептические экспланты культивируют на безгормональной питательной среде WPM с добавлением 15 г/л сахарозы. Недостатком данного способа является низкий процент получения асептической культуры и низкий коэффициент размножения - 1,5-2.

Известен способ клонального микроразмножения катальпы бигнониевидной [Halina Wysokinska, Lucian Swiatek Micropropagation of Catalpa bignonioides Walt, through tissue cultures // Acta societatis botanicorum poloniai, 1989, Vol.58, N2:185-198], заключающийся в получении посадочного материала катальпы из каллусной ткани, которую индуцируют на питательной среде Шенка и Хильдебрандта, содержащей 0,5 мг/л ИУК и 2 мг/л БАЛ с последующим переносим микропобегов на безгормональную среду для укоренения. Недостатком данного способа является получение микропобегов катальпы из каллусной ткани, которая отличается гетерогенностью клеток по числу хромосом, что приводит к появления генетически не стабильного посадочного материала.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу, взятом за прототип, относится способ клонального микроразмножения катальпы бигнониевидной [Manojlovie, М., Vinterhalter, В., Vinterhalter, D. In vitro propagation of Catalpa ovata G. Don and Catalpa bignontoides Walt // Glasnik Instituta za botaniku i botanicke baste LIniverziteta u Beogradu, 1992-1993, Tom XXVI-XXVII. 7 - 14.] с использованием в качестве объекта исследований семена, из которых в дальнейшем получают асептические проростки, а в дальнейшем из них изолируют сегменты эпикотиля. Для получения микропобегов эпикотили культивируют на питательной среде Мурасига и Скуга, содержащей БАП 1 мг/л и ИМК 0,1 мг/л с последующим переносом на питательную среду для укоренения, содержащую 0,5 мг/л ИМК. Недостатком данного способа является получение миниатюрных микрорастений, которые имеют высоту побега и длину корней не более 2 см.

В результате анализа литературных данных и патентного поиска установлено, что исследования, направленные на разработку эффективного способа размножения катальпы бигнониевидной с использованием семенного материала и метода клонального микроразмножения отсутствуют.

Задача предполагаемого изобретения - разработать способ клонального микроразмножения катальпы бигнониевидной (Catalpa bignonioides) за счет использования семенного материала.

Технический результат изобретения - обеспечение ускоренного получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала.

Поставленная задача и заявленный технический результат достигается за счет того, что в качестве первичного экспланта используют семена катальпы бигнониевидной, которые после поверхностной стерилизации культивируют на питательной среде, содержащей минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС) [Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - vol. 5, 95 - P. 473-497] и активированный уголь 1 г/л до образования проростков длиной 2-4 см с хорошо развитыми нормальными листьями, после чего побеги делят на сегменты и переносят на питательную среду МС, содержащую 1 мг/л кинетин в сочетании с 1 г/л активированный уголь. Выращивают в условиях освещения светодиодными лампами красного 70% и синего спектра 30% в течение всего цикла культивирования, при температуре 23-25°С и 16-часовом фотопериоде.

Известных в научно-технической и патентной литературе способов с использованием семян, аналогичным составом питательной среды и условий культивирования не обнаружено. Результат, полученный у данного решения и обусловленный применением питательной среды и освещение светодиодными лампами красного и синего спектра в соотношении 70% и 30% соответственно для размножения in vitro катальпы бигнониевидной не достигался в известных решениях.

Конкретный пример осуществления предполагаемого способа.

В качестве объекта исследования использовали семена, изолированные с интактных растений катальпы бигнониевидной. Перед введением в культуру in vitro семена катальпы помещают в марлевые мешочки и переносят в ламинар-бокс, где проводят поверхностную стерилизацию 0,1% раствором хлорида ртути (сулема) в течение 5-7 минут, после чего их промывают три раза стерильной дистиллированной водой и помещают в 200 мл культуральные сосуда на агаризованную питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС) и активированный уголь 1 г/л. рН питательной среды МС доводят до 5,8 перед автоклавированием. В этих условиях семена выращивают в течение 5 недель до формирования проростков высотой 2-4 см, после чего побеги делят на сегменты и переносят на питательную среду МС, содержащую 1 мг/л кинетин в сочетании с 1 г/л активированный уголь. В этих условиях в течение 5 недель вновь формируется основной побег и адвентивные почки (2-3 шт), из которых формируются побеги. Выращивают в условиях освещения светодиодными лампами красного 70% и синего спектра 30% в течение всего цикла культивирования, при температуре 23-25°С и 16-часовом фотопериоде. В этих условиях наблюдается формирование не только микропобегов, но и корней, что приводит к ускорению получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала, за счет сокращения третьего этапа клонального микрорамзножения - укоренение. Сформированные в условиях in vitro микроклоны готовы для перевода для адаптации в условия ex vitro.

Изобретение проиллюстрировано на рисунках.

На фиг.1 сеянцы катальпы бигнониевидной полученные на питательной среде, содержащей активированный уголь 1 г/л

На фиг.2 сеянцы катальпы бигнониевидной полученные на питательной среде, содержащей БАП 1 мг/л

На фиг.3 сеянцы катальпы бигнониевидной полученные на питательной среде, содержащей ИУК 1 мг/л в сочетании с активированным углем 1 г/л

На фиг.4 сеянцы катальпы бигнониевидной полученные на питательной среде, содержащей ИУК 1 мг/л

На фиг 5 сеянцы катальпы бигнониевидной полученные на питательной среде, содержащей кинетин 1 мг/л в сочетании с активированным углем 1 г/л

Пример 1. Для получения стерильной культуры семян катальпы применяли стерилизацию, включающую поверхностную обработку семян 0,1% раствором хлорида ртути (сулема) в течение 5-7 минут, после чего их промывают три раза стерильной дистиллированной водой и помещают в 200 мл культуральные сосуда на агаризованную питательную среду, содержащую минеральные соли по прописи Мурасига и Скуга (МС), а также различные регуляторы роста. Исследовали влияние БАП 1 мг/л, ИУК 0,5 мг/л и активированный уголь 1 г/л. В качестве контроля использовали безгормональную среду. В конце 5 недель культивирования оценивали следующие показатели: всхожесть (%), длина стебля (см), длина корня (см), диаметр каллусной ткани (мм), коэффициент размножения. Основные результаты приведены в таблице 1 и рисунках 1 и 2.

На основании проведенных исследований установлено, что наилучшей питательной средой для проращивания семян катальпы бигнониевидной была среда, содержащая активированный уголь. В этом варианте формировались растения правильной морфологии, с хорошо развитой корневой системой (фиг.1), а также в колеоптильной проростка зоне формование каллусной ткани не наблюдалось, что является одним из важных условий клонального микроразмножения. Вторым по эффективности была питательная среда с БАП 1 мг/л. Однако в этом варианте формировались высокие растения, но листовые пластинки были неправильной морфологии (фиг.2). Остальные варианты были не эффективны.

Пример 2. Получение проростков проводили по методике, описанной в примере 1. Сформировавшиеся проростки делили на сегменты и культивировали на питательной среде МС, содержащей различные регуляторы роста. В работе изучены следующие варианты: 1) кинетин 1 мг/л; 2) кинетин 1 мг/л + ИУК 0,5 мг/л; 3) ИУК 0,5 мг/л + активированный уголь 1 г/л; 4) кинетин 1 мг/л + активированный уголь 1 г/л; 5) БАП 1 мг/л; 6) ИУК 0,5 мг/л. Результаты приведены в таблице 2 и на рисунках 3-5.

На основании полученных результатов установлено, что наилучшая среда для микроразмножения была среда, содержащая кинетин 1 мг/л в сочетании с активированным углем 1 г/л. В этом варианте формировались микроклоны высотой в среднем 3,4-3,8 см, и имели длину корней 9,4-10 см. В остальных вариантах корневая система была слабо сформирована и не превышала 4-7 см. Такие растения хуже приживаются к условиям почвенной культуры.

Пример 3. Наилучший вариант питательной среды (пример 2) был использован в следующей серии экспериментов по влиянию спектрального состава света на морфометрические показатели микропобегов катальпы. В работе изучены следующие варинты:1) многоканальный облучатель на базе белых светодиодов (СД) цветовой температуры 3500 К и 6000 К и монохроматический красных и синих светодиодов с пиками 660 нм и 460 нм соответственно. Мощность каналов монохроматических светодиодов составила: красный - 70%, синий - 30%; 2) многоканальный облучатель на базе белых светодиодов (СД) цветовой температуры 3500 К и 6000К и монохроматический красных и синих светодиодов с пиками 660 нм и 460 нм соответственно. Мощность каналов монохроматических светодиодов составила: красный - 30%, синий - 70%. В конце культивирования оценивали следующие показатели: длина стебля (см), длина корня (см), диаметр каллусной ткани (мм), коэффициент размножения. Основные результаты приведены в таблице 3.

На основании полученных результатов установлены наилучшие условия выращивания - применение светодиодных ламп красного и синего спектра в соотношении 70% и 30%. В этих условиях формировались микроклоны с длинной корневой системой (в среднем 14-15 см) и высотой побегов до 5 см. В остальных вариантах учитываемые показатели были существенно ниже.

В результате проведения цикла исследований был разработан способ клонального микроразмножения катальпы бигнонениевидной (Catalpa bignonioides), включающий культивирование семян на питательной среде МС, содержащей 1 г/л активированного угля, с последующим культивированием микрочеренков на питательной среде с добавлением кинетина 1 мг/л и активированного угля 1 г/л при выращивании в условиях освещения светодиодными лампами красного и синего спектра в соотношении 70% и 30% соответственно.

Предлагаемый способ микроразмножения катальпы бигнонениевидной in vitro сочетает ряд положительных свойств, которые позволяют использовать его в практической работе и для получения высококачественного, генетически однородного посадочного материала:

1. Технология предполагает получение генетически однородный материал за счет образования микропобегов из существующих меристем пазушных почек минуя образование каллусной ткани.

2. Технология предполагает проведение работ по размножению и получению ценного посадочного материала в лабораторных условиях не зависимо от сезона и негативных факторов окружающей среды.

3. Предлагаемая технология легка в исполнении и не требует привлечения дорогостоящего оборудования и питательных сред.

4. Предлагаемый способ размножения предполагает ускоренное получение высококачественного, генетически однородного посадочного материала, за счет отсутствия третьего этапа клонального микрорамзножения - укоренения.

Заявляемое изобретение направлено на разработку способа клонального микроразмножения катальпы бигнониевидной (Catalpa bignonioides) с использованием в качестве первичного экспланта семян и оптимальных условий выращивания. Известных в научно-технической и патентной литературе способов размножения катальпы бигнониевидной с использованием семян и аналогичным составом питательной среды и условий выращивания при размножении in vitro не обнаружено.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ клонального микроразмножения катальпы бигнониевидной (Catalpa bignonioides), включающий получение микрорастений в условиях in vitro из сегментов асептических растений катальпы бигнониевидной, где микрорастения получают из сегментов проростков семян катальпы бигнониевидной, культивируя на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно включают на этапе прорастания семян 1 г/л активированного угля, а на этапе размножения кинетин 1 мг/л и 1 г/л активированного угля, и выращивают в условиях освещения светодиодными лампами красного и синего спектра в соотношении 70% и 30% соответственно. Изобретение обеспечивает ускоренное получение высококачественного генетически однородного посадочного материала. 5 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ клонального микроразмножения катальпы бигнониевидной (Catalpa bignonioides), включающий получение микрорастений в условиях in vitro из сегментов асептических растений катальпы бигнониевидной, отличающийся тем, что микрорастения получают из сегментов проростков семян катальпы бигнониевидной, культивируя на питательной среде Мурасига и Скуга, в состав которой дополнительно включают на этапе прорастания семян 1 г/л активированного угля, а на этапе размножения кинетин 1 мг/л и 1 г/л активированного угля, и выращивают в условиях освещения светодиодными лампами красного и синего спектра в соотношении 70% и 30% соответственно.