Способ выделения гликолипидов Российский патент 2023 года по МПК C07B63/02 C12N9/20 

Изобретение относится к масложировой промышленности и может быть использовано для выделения гликолипидов из вторичных продуктов переработки растительных масел, в частности, фосфатидных концентратов (ФК) с использованием фосфолиполитических ферментов - фосфолипаз.

Известны способы микробиологического, химического, энзиматического синтеза гликолипидов с использованием сахаров, жирных кислот, бактерий и ферментов [Sascha Siebenhaller, Jens Grüninger, Christoph Syldatk. Lipid Modification by Enzymes and Engineered Microbes. AOCS Press. Chapter 13 - Enzymatic Synthesis of Glycolipid Surfactants. 2018, p. 293-313, DOI: 10.1016/B978-0-12-813167-1.00013-X].

Анализ научно-технической и патентной информации по теме выделения гликолипидов из липидных систем позволил установить, что большинство методов базируется на принципе выделения по методу Фолча, который предполагает использование растворителей типа метанол и хлороформ с последующей очисткой полученного экстракта [Bligh E.C. Dyer W. J. Can.J.Biochem.Physiol. 1959, 37, 911; Eggers, L.F., Schwudke, D. (2016). Liquid Extraction: Folch. In: Wenk, M. (eds) Encyclopedia of Lipidomics. Springer, Dordrecht. DOI:10.1007/978-94-007-7864-1_89-1; Breil, C.; RU 2280454 C1, опубликован 27.07.2006].

Недостатками способов, основанных на методе Фолча, являются высокая продолжительность и трудоемкость процесса извлечения гликолипидов из субстрата. Кроме того, использование токсичных растворителей предполагает необходимость многоэтапной очистки продукта перед его реализацией конечному потребителю, а следовательно, росту затрат на производство. Реализация этих способов в промышленных масштабах на производственных площадях масложировых предприятий достаточно затруднительна.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению, является способ ферментативной гидратации масел [RU 2582044 C2, опубликован 20.04.2016]. С помощью фосфолипаз PLA1 или PLA2, которые ориентированы на деструкцию молекул фосфолипидов по положениям sn-1 и sn-2, соответственно, фосфолипиды модифицируют в более полярную и более гидратируемую форму - лизофосфолипиды. При этом в прототипе выполняют следующие этапы:

a) приведение в контакт неочищенного растительного масла или слизи растительного масла с составом, включающим в себя первый ферментный компонент, включающий в себя по меньшей мере один расщепляющий фосфолипид фермент, а также второй ферментный компонент, включающий в себя по меньшей мере один не расщепляющий фосфолипид фермент, причем вторым ферментным компонентом является α-амилаза;

b) отделение слизей от растительного масла, причем до приведения в контакт согласно этапу а) неочищенное растительное масло контактирует с водой и/или кислотой, но отделения водной фазы до первого этапа а) не происходит, наоборот, предварительно кондиционированное масло используется непосредственно в этапе а) Таким образом, в результате ферментативной деструкции молекулы фосфолипидов разрушаются с образованием продуктов, обладающих отличной от исходного соединения полярностью.

Недостатком прототипа является то, что ферментной обработке подвергаются растительные масла с низким содержанием гликолипидов - от 0,04% до 0,05%, что делает разделение системы со столь низким содержанием целевого соединения затруднительным. Кроме того, предлагаемые ферментные комплексы включают в себя по крайней мере один расщепляющий гликозиды фермент, тем самым разрушая молекулы гликолипидов.

Технической задачей заявляемого изобретения является разработка способа выделения растительных гликолипидов из ФК, содержащихся во вторичных продуктах переработки растительных масел с последующим их применением в различных областях пищевой и фармацевтической промышленности.

Техническим результатом заявляемого изобретения является способ выделения комплекса растительных гликолипидов из ФК методом ферментативного гидролиза фосфолипазами PLA1 и PLA2.

Технический результат достигается тем, что реализуют способ выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза смесью фосфолипаз PLA1 и PLA2 в водной среде, отличающийся тем, что ферментативному гидролизу подвергают фосфатидный концентрат. На первом этапе фосфатидный концентрат гомогенизируют с водой, затем добавляют водный раствор фосфолипаз PLA1 и PLA2, проводят ферментативный гидролиз смеси при термостатировании. Термостатирование предпочтительно осуществляют при температуре 45-55°С. Затем полученную смесь подвергают термодеструкции для инактивации ферментов, удаляют воду, например, упариванием под вакуумом, после чего из сухого остатка экстрагируют ацетоном нейтральные и малополярные липиды. Ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, высушивают с получением концентрата гликолипидов.

Предлагаемый способ выделения гликолипидов основывается на физико-химических свойствах полярных соединений растительных ФК. Выделение гликолипидов осуществляется за счет удаления жирных кислот и глицерофосфатов, которые образуются при деструкции молекул фосфолипидов, содержащихся в ФК, полярным растворителем - ацетоном.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Для осуществления способа используют коммерчески доступные образцы фосфолипаз PLA1 и PLA2, для которых производителями рекомендовано соблюдать заданные диапазоны pH реакционной среды. Для приготовления реакционной среды используют бидистилированную воду. Необходимое значение pH получают путем добавления в бидистилированную воду растворов NaOH или HCl.

В небольшом объеме реакционной среды растворяют фосфолипазы PLA1 и PLA2 в соотношении их массовых концентраций 1:1.

Навеску ФК, содержащую такие гликолипиды, как моногалактозилдиациглицерол (MDGD), диагалктазилдиацилглицерол (DGDG), стерилгликозид (SG), этерифицированный стерилгликозид (ESG), соединяют с оставшимся после растворения ферментов объемом реакционной среды. Полученную смесь гомогенизируют и переносят в термостатируемый реактор с пропеллерной мешалкой, затем к смеси добавляют ранее подготовленный раствор PLA1 и PLA2.

Процесс ферментативного гидролиза осуществляют при непрерывном перемешивании, заданной температуре, pH и в течение времени, необходимого для деструктурирования молекул фосфолипидов.

Скорость ферментативного гидролиза зависит от активности ферментов и массовой доли фосфолипидов в ФК. Если активность ферментов, заявленная производителями, отлична друг друга, существует необходимость корректировки соотношения массовых концентраций фосфолипаз, которую возможно рассчитать общедоступными методами.

Экспериментально установлено, что оптимальным временем проведения ферментативного гидролиза предложенным способом является 3ч.

Диапазон температур устанавливают в соответствии с пределами минимальных и максимальных значений, которые обеспечивают оптимальную работу ферментов.

По завершении ферментативного гидролиза полученную смесь подвергают термодеструкции при краткосрочном нагреве до 100°С для инактивации присутствующих ферментов. Затем осуществляют удаление воды, например, способом упаривания в вакуумном шкафу.

По окончании упаривания из сухого остатка удаляют нейтральные и малополярные липиды экстракцией с использованием в качестве селективного экстрагента ацетона по ГОСТ 32052 п.8.8. Ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, а также недеструктурированные фосфолипиды, высушивают до постоянной массы, получая таким образом концентрат гликолипидов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Для приготовления реакционной среды используют бидистилированную воду в количестве 180 г, pH которой регулируют путем добавления в воду растворов NaOH или HCl до необходимого значения pH (табл.1).

Ферменты в количестве 0,5 г PLA1 и 0,5 г PLA2, растворяют в 80 г реакционной среды.

Навеску ФК в количестве 20 г гомогенизируют со 100 г реакционной среды и переносят в реактор, нагретый до 45-55°С (табл.1). Затем в реактор добавляют ранее приготовленный раствор фосфолипаз. Включают пропеллерную мешалку для обеспечения перемешивания смеси. Длительность ферментативного гидролиза составляет 3 ч.

По завершении ферментативного гидролиза смесь подвергают термодеструкции при краткосрочном нагреве до 100°С для инактивации присутствующих ферментов. Затем осуществляют удаление воды путем упаривания в вакуумном шкафу при температуре 80°С и остаточном давлении 50 мБар.

По окончании упаривания нейтральные и малополярные липиды удаляют экстракцией с помощью ацетона. Ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, а также недеструктурированные фосфолипиды, высушивают при температуре 103°С до постоянной массы, получая концентрат гликолипидов с массовой долей от 30% до 38%.

Ацетон из ацетонрастворимой фракции отгоняют и получают жирные кислоты.

Таблица 1 - Параметры ферментативного гидролиза ФК № опыта рН Температура
°С Содержание гликолипидов в концентрате, % 1 5,0 45 32 2 5,5 50 30 3 5,5 55 38 4 6,0 55 35 5 6,5 55 33

Экспериментально установлено, что температура проведения ферментативного гидролиза в диапазоне 45-55°С не оказывает существенного влияния на выход продукта, а после 60°С ферменты денатурируют из-за своей белковой природы.

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет выделить комплекс растительных гликолипидов из ФК с использованием смеси фосфолипаз PLA1 и PLA2 методом ферментативной деструкции молекул фосфолипида. Предложенный способ выделения является относительно простым по реализации в производственных масштабах и не нуждается в сложных технологических решениях. Растворитель, используемый для экстрагирования, может подлежать рекуперации и повторно использоваться для производственных нужд. Кроме того, способ применим для переработки некондиционных фосфатидных концентратов, которые реализуют в кормовых целях. При этом получают более экономически выгодный продукт - гликолипиды, а жирные кислоты, которые образуются в результате деструкции молекул фосфолипидов, возможно использовать в мыловарении, изготовлении смазочных материалов, технических и непищевых поверхностно-активных веществ.

Исследования выполнялись с использованием оборудования ЦКП "Исследовательский центр пищевых и химических технологий" КубГТУ (CKP_3111), развитие которого поддерживается Минобрнауки РФ (Соглашение № 075-15-2021-679).

Изобретение относится к масложировой промышленности, а именно к способу выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза смесью фосфолипаз PLA1 и PLA2 в водной среде. Способ выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза смесью фосфолипаз PLA1 и PLA2 в водной среде, отличающийся тем, что ферментативному гидролизу подвергают фосфатидный концентрат, причем фосфатидный концентрат гомогенизируют с водой, затем добавляют водный раствор фосфолипаз PLA1 и PLA2, проводят ферментативный гидролиз смеси при pH, выбранном из pH 5,0, pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5, и термостатировании при температуре, выбранной из 45°C, 50°C, 55°C, затем подвергают термодеструкции для инактивации ферментов, удаляют воду, после чего из сухого остатка экстрагируют ацетоном нейтральные и малополярные липиды, затем ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, высушивают. Вышеуказанный способ позволяет выделять комплекс растительных гликолипидов из фосфатидных концентратов. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза смесью фосфолипаз PLA1 и PLA2 в водной среде, отличающийся тем, что ферментативному гидролизу подвергают фосфатидный концентрат, причем фосфатидный концентрат гомогенизируют с водой, затем добавляют водный раствор фосфолипаз PLA1 и PLA2, проводят ферментативный гидролиз смеси при pH, выбранном из pH 5,0, pH 5,5, pH 6,0, pH 6,5, и термостатировании при температуре, выбранной из 45°C, 50°C, 55°C, затем подвергают термодеструкции для инактивации ферментов, удаляют воду, после чего из сухого остатка экстрагируют ацетоном нейтральные и малополярные липиды, затем ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, высушивают.

2. Способ выделения гликолипидов по п.1, отличающийся тем, что воду удаляют упариванием под вакуумом.