ФЕРМЕНТНЫЙ ПРЕПАРАТ ФОСФОЛИПАЗЫ С НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНОГО ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА BACILLUS MOJAVENSIS RCAM05968 BDV-1 PLC 6H ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В ПИЩЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2024 года по МПК C12R1/85 

Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, а также к пищевой промышленности, в частности производству сыров, рафинированию растительных масел.

Фосфолипаза С (PLC) (КФ 3.1.4.3) - фермент класса гидролаз, небольшой белок (28 кДа), катализирующий расщепление фосфолипидов до диацилглицеридов и полярных фосфатсодержащих групп. Была обнаружена у широкого спектра грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий. Все эти ферменты представляют собой одиночные полипептидные белки, секретирующиеся во внеклеточное пространство, с типичными сигнальными последовательностями в структуре.

Наиболее привлекательными технологическими характеристиками обладают бактериальные PLC рода Bacillus. Ферменты характеризуются широким спектром субстратной специфичности - распознает разные фосфолипидные субстраты, которые отличаются только структурой головной группы: фосфатидилхолин (и фосфатидилэтаноламин) (PC-PLC), фосфатидилинозитол (PI-PLC), фосфатидилглицерол, фосфатидилсерин, а также термостабильностью, высокой удельной активностью и абсолютно безопасны для организма человека.

Среди PC-PLC рода Bacillus выделяется PC-PLC из Bacillus thuringiensis, благодаря высокой удельной активности и термостабильности. Данный фермент является небольшим мономерным белком с кофактором в виде ионов Zn²⁺. Фермент представляет собой единственную полипептидную цепь, вторичная структура представлена семью спиралями, образующими скрученную структуру.

Привлекательной системой для получения фосфолипазы С является Bacillus subtilis. Данная система достаточно хорошо изучена, имеет общепризнанный безопасный статус (GRAS), не требует специальных мер предосторожности, с данным видом бактерий удобно проводить генетические манипуляции, рекомбинантный фермент секретируется непосредственно в культуральную среду, за счет чего снижаются расходы на выделение и очистку конечного продукта.

Для внедрения в биотехнологическое производство наиболее перспективными являются генетически модифицированные штаммы-продуценты целевых ферментов, в том числе фосфолипаз. Рекомбинантная фосфолипаза С особенно востребована в связи с возможностью ее практического применения в различных отраслях промышленности: при рафинировании масел (соевого, пальмового, подсолнечного и др.) (Dos Passos et al., 2022; Val et al, 2023), в предварительной обработке масел при получении биодизельного топлива, для ускорения сроков созревания сыров, в качестве эмульгатора в молочной и хлебопекарной промышленности, при производстве майонеза и др. (Merkulyeva et al., 2021). Неочищенное растительное масло состоит преимущественно из триглицеридов, но содержит от 0,5 до 3% (по массе) фосфолипидов (в основном, фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, в меньших количествах - фосфатидилинозитол и фосфатидную кислоту), которые вызывают потемнение масла в ходе дальнейших этапов его рафинирования, а также уменьшают окислительную стабильность масла.

В настоящее время для рафинирования растительного масла используются препараты фосфолипазы A₁ (PLA₁) и А₂ (PLA₂) таких компаний, как Novozymes A/S (Lecitase Novo®, Lecitase ultra® Quara® LowP), Danisco A/S (LysoMax®), AB Enzymes GmbH (Rohalase® PL-XTRA), Mitsubishi Chemical Foods Co. Ltd. (Phospholipase Al®). Однако, использование фосфолипазы С в процессе рафинирования предпочтительнее, поскольку не приводит к высвобождению жирных кислот, которые необходимо удалять в процессе дальнейшей обработки, что позволяет сократить потери сырья.

На международном рынке фосфолипаза С представлена линейкой препаратов серии Purifine™ (Purifine, Purifme 2G, Purifine 3G) компании Verenium (Verenium Corporation, США) в основе которого является фосфолипаза С BD16449 Bacillus cereus. Используя гомологичную рекомбинацию, ген фосфолипазы С был непосредственно интегрирован в геномный сайт АОХ1 нетоксигенного и непатогенного штамма Pichia pastoris SMD 1168. Очищенная фосфолипаза обладает специфической активностью примерно 2300 ед/мг, где единица определяется как гидролиз 1 мкмоль фосфатидилхолина в минуту при 37°С и рН 7,3. Фермент имеет оптимум рН 7,5 и температурный оптимум 60°С (Ciofalo et al, 2006). Также, используют фосфолипазу С из Clostridium perfringens (Sigma, США) (Merkulyeva et al., 2021).

В качестве примера известен штамм-продуцент термостабильной фосфолипазы С Thermococcus kodakarensis (7XPLC) (Marchisio et al, 2022). Продуцируемая им фосфолипаза С способна не терять активности при 80°С.

Известен патент RU2676321 «Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/pPICZαA-PhoA2-StV». Штамм P. pastoris X-33/pPICZαA-PhoA2-StV получен при трансформации штамма дрожжей Pichia pastoris Х-33 (Wild Type, «Invitrogen») плазмидой pPICZαA-PhoA2-StV согласно изобретению. Продуцент культивировали в 5 литровом ферментере в течение 95 ч, затем культуральную жидкость центрифугировали и концентрировали методом ультрафильтрации, на выходе получали фермент с активностью 10000 ед/мл. Данное изобретение также является единственным зарегистрированным способом получения рекомбинантной фосфолипазы А2.

Известен патент RU2409671 «Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена фосфолипазы, штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент фосфолипазы». В патенте в качестве продуцента гена фосфолипазы использовали дрожжи Pichia pastoris, активность фермента достигала 200 ед/мл культуральной жидкости. Однако получение фермента в Pichia pastoris требовало использования метанола в качестве индуктора, что осложняло процесс и делало производство опасным для здоровья.

Наиболее близким изобретением является заявка на изобретение: «Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus subtilis - продуцент фосфолипазы С» (RU2500811). В заявке делается акцент на расширение арсенала рекомбинантных микроорганизмов, продуцирующих фосфолипазу С. Заявлено, что активность фермента в культуральной жидкости достигала уровня 210 ед/мл при температуре 30°С при ферментации штамма в 3 литровом ферментере на минимальной по составу среде. Недостатком изобретения является низкая скорость наработки целевого фермента, максимум ферментативной активности фиксируется спустя 48 часов культивирования.

Задачей, стоявшей перед авторами, являлось создание нового ферментного препарата фосфолипазы С в жидкой и сухой форме. Для решения поставленной задачи авторы использовали рекомбинантный штамм бактерии Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H со встроенной плазмидой, содержащий рекомбинантный ген белка фосфолипазы С Bacillus thuringiensis, а также дешевую питательную среду, в состав которой входят отходы пищевых производств, такие как меласса и кукурузный экстракт.

Технический результат, получаемый при осуществлении изобретения, заключается в расширении арсенала способов получения рекомбинантных фосфолипаз, в частности, получения рекомбинантной фосфолипазы С Bacillus thuringiensis в жидкой и сухой форме.

Технический результат достигается следующим образом: новый ферментный препарат в жидкой форме для использования в пищевой промышленности содержит в своем составе рекомбинантную фосфолипазу С и представляет собой сконцентрированную культуральную жидкость от светло-коричневого до темно-коричневого цвета. Сухой ферментный препарат содержит лиофильно высушенный концентрат культуральной жидкости и наполнитель мальтодекстрин, и представляет собой сыпучий порошок со светло-желтыми вкраплениями.

Способ получения рекомбинантной фосфолипазы С в жидкой форме заключается в глубинном культивировании указанного штамма-продуцента в мелассо-кукурузной среде следующего состава (г/л): 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила в ферментационных установках при рН 6,8-7,0, температуре 37°С, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100- 500 об/мин; рО₂ 30-50% в фазе интенсивного роста культуры; продолжительности ферментации 7-13 ч; выделении культуральной жидкости центрифугированием при скорости 15000 об/мин и ее концентрировании методом ультрафильтрации на аппарате разделительном на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа, с последующим добавлении (масс/объем) 10% хлорида натрия и 0,5% бензоата натрия в качестве консерванта.

Для получения препарата в сухом виде используется лиофильная сушка сконцентрированной культуральной жидкости, получающейся при глубинном культивировании указанного штамма-продуцента в мелассо-кукурузной среде следующего состава (г/л): 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила в ферментационных установках при рН 6,8-7,0, температуре 37°С, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100-500 об/мин; рО₂ 30-50% в фазе интенсивного роста культуры; продолжительности ферментации 7-13 ч; выделении культуральной жидкости центрифугированием при скорости 15000 об/мин и ее концентрировании методом ультрафильтрации на аппарате разделительном на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа, с последующим добавлении (масс/объем) 10% хлорида натрия и 0,5% бензоата натрия в качестве консерванта с последующей лиофильной сушкой сконцентрированной культуральной жидкости и смешиванием высушенной культуральной жидкости с мальтодекстрином в соотношении 50%/50% (по массе) в течение 60 минут.

1. Штаммы и питательные среды для культивирования

В качестве продуцента фосфолипазы С был использован рекомбинантный штамм Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H, полученный электропорацией плазмидой pBSU-PLC6H штамма реципиента Bacillus mojavensis BDV-1 с нокаутированными генами внеклеточных протеаз NprE, AprE, Epr, Bpr, Mpr, NprB, Vpr, WprA, депонированный в ВКСМ (Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения ФГБНУ ВНИИСХМ) под регистрационным номером RCAM05968 в качестве штамма-реципиента в 2022 г. Для этой культуры характерны плоские округлые кремовые колонии, 3-4 мм в диаметре. Интенсивность окрашивания неровного края колонии меньше, чем в центре.

В колбах и чашках Петри штамм культивировался на среде YT×2 (г/л): пептон - 16, дрожжевой экстракт - 10, NaCl - 5, dH₂O - до 1 литра. Для получения твердой питательной среды добавлялся агар в количестве 15 г/л. Посевной материал выращивали на при рН 6,8-7,2 в колбах на качалке «Innova 44» (New Brunswick, США) при 220 об/мин (эксцентриситет 5 см), температуре 37°С в течение 24 ч. В качестве посевной для 250 л ферментера использовали культуру, выращенную в 15 л аппарате. Коэффициент заполнения средой для 15 л - 0,66, для 250 л - 0,4.

Питательная среда для ферментации имела следующий состав на 1 л водопроводной воды: 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила. Ферментацию проводили при рН 6,8, температуре 37°С, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100-500 об/мин; pd 30-50% в фазе интенсивного роста культуры. Продолжительность процесса ферментации 7-13 ч.

2. Температурный профиль и фосфолипазная активность

Определение температурного профиля полученного фермента проводили путем предварительного прогрева образцов в течение 30 мин при температурах 37, 50-80°С.

Затем проверяли фосфолипазную активность с использованием п-нитрофенил-фосфорилхолина (Sigma-Aldrich, Германия) в качестве субстрата. Реакционную смесь, содержащую 20 мкл культуральной жидкости и 180 мкл субстрата в буфере, состоящем из 10 мМ тетрабората натрия, 0,1 М ZnCl₂ и 60% (масс/объем) сорбитола, инкубировали при 37°С в течение 20 мин. (Kurioka, Matsuda, 1976). Образующийся в результате гидролиза п-нитрофенол определяли спектрофотометрически на планшетном флуориметре-спектрофотометре ClarioStar Plus (BMG Labtech, Германия) при длине волны 405 нм.

3. Выбор консерванта и температуры хранения

Для оценки влияния консервантов и температуры хранения на органолептические свойства, выпадения осадка, а также активность фосфолипазы С, были заложены карантинные аликвоты культуральной жидкости, содержащей фермент, объемом 100 мл со следующими вариантами консервантов (масс/объем): 1) глицерин - 25%; 2) хлорид натрия (10%)) + бензоат натрия (0,5%); 3) хлорид натрия (10%) + бензоат натрия (0,2%)+сорбат калия (0,3%). Образцы хранили при двух температурных режимах: +4°С и +25°С. В качестве контроля использовали образец без добавления консерванта. Повторное определение активности и оценку органолептических свойств, а также наличие осадка проводили после 30 суток хранения.

4. Технологическая схема производства препарата и его готовый вид

Определена технологическая схема производства готового ферментного продукта. Общая схема получения готового ферментного препарата на основе рекомбинантного штамма Bacillus mojavensis BDV-1 PLC 6H представлена на блок-схеме (фиг. 1).

Культивирование штамма Bacillus mojavensis BDV-1 PLC 6H осуществляется последовательно в 2-х ферментерах объемом 15 и 250 литров.

Для получения продукта в жидкой форме используется ферментер, проточная центрифуга для отделения биомассы клеток штамма-продуцента, аппарат разделительный ультрафильтрационный на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа для концентрирования культуральной жидкости, содержащей фермент.За производственный цикл возможно получить 10 л сконцентрированной культуральной жидкости, содержащей фермент с активностью до 500 ед/мл.

Для получения продукта в сухом виде используется лиофильная сушка сконцентрированного фермента. На выходе получается порошок светло-желтого цвета с содержанием влаги не более 5% и с удельной активностью до 10000 ед/г.

В качестве наполнителя для сухого варианта был выбран мальтодекстрин - углевод (сахаристый крахмалопродукт), представляющий собой промежуточный продукт ферментного расщепления растительного крахмала, в результате чего молекулы крахмала делятся на фрагменты - декстрины, при этом образуются молекулы глюкозы (декстрозы), мальтозы, мальтотриозы.

В заранее промытый и подготовленный смеситель по типу «Пьяная бочка» насыпается частями 50% сухого мальтодекстрина и 50% концентрата фермента, для получения готового продукта с активностью до 5000 ед/г. Затем, содержимое тщательно перемешивается в течение 60 мин, после, ссыпается в полиэтиленовые мешки, соблюдая точный вес на весах, отбирается средняя проба для анализа активности. Мешки упаковываются в трехслойные бумажные крафт-мешки, зашиваются и отправляются в складское помещение на карантин, до получения результатов анализа на микробиологическую чистоту и активность.

Весь процесс изготовления опытно-промышленных партий готового продукта происходил в лаборатории Инжинирингово центра «Промбиотех» АлтГУ на имеющемся оборудовании центра. Таким образом полученный препарат представляет собой жидкость от светло-коричневого до темно-коричневого цвета с активностью до 500 ед/мл. Препарат в сухом виде представляет собой порошок белого цвета со светло-желтыми вкраплениями концентрата фермента с активностью до 5000 ед/г. Специфический запах фермента фактически не идентифицируется.

5. Эффективность препарата при производстве сыра в лабораторных условиях

Разработанный ферментный препарат фосфолипазы С усиливает выраженность сливочного вкуса и аромата сыра за счет более интенсивного метаболизма продуктов липолиза, при совокупном воздействии фосфолипазы С и молочнокислых бактерий на липидные компоненты сыра в дозировке сухого препарата 3,0 г на 100 кг сырной смеси. В связи с тем, что жирность сыров высокая (массовая доля жира в сухом веществе составляет более 50,0%), консистенция сыров определена как удовлетворительная (эластичная, легкая пластичная, мучнистая).

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:

Пример 1. Получение рекомбинантного штамма Bacillus mojavensis BDV-1 PLC 6H

Полученной рекомбинантной плазмидой pBU-PLC (заявка №2023103585) была проведена трансформация методом электропорации клеток Bacillus mojavensis RCAM05968 (BDV-1). Культуру клеток в количестве 50 мл подращивали до ODλ₆₀₀=0.2 о.е. Затем в культуру добавили 0,5 г трионина, 1 г глицил-глицина, 0,05 г триптофана и 15 мкл Tween 80 и инкубировали в течение часа при 30°С. После культуру клеток инкубировали 20 мин на льду. 50 мл культуры центрифугировали 10 мин 5000g при +4°С на центрифуге AvantiJ-301. Осажденную биомассу дважды промыли в 5 мл ЕР Buffer (0,5 М трегалоза, 0,5 М сорбитол, 0,5 М маннитол, 0,7 мМ MgCl₂, 0,5 мМ K₂HPO₄, 0,5 мМ KH₂PO₄, рН=7,4). После промывки ресуспендировали в 0,5 мл EPBuffer. 100 мкл суспензии клеток перенесли в 2 мл холодные кюветы для электропорации и добавили ДНК с расчетом 25 нг/мкл. Произвели электропорацию при 2,5 kV на электропораторе MicroPulser. К про электропорированным клеткам добавили питательную среду YT×2 с 0,5 М сорбитолом и 0,38 М маннитолом. Инкубировали 3 часа при 37°С. 50 и 200 мкл культуры высевали на чашки с агаризованной средой YT×2, содержащие 5 мкг/мл хлорамфеникола. Чашки помещали в термостат при 30°С и инкубировали в течение ночи. На следующий день были идентифицированы отдельные колонии, содержащие плазмиду pBU-PLC.

Пример 2. Определение температурного профиля

Одной из важных характеристик любого фермента является определение его температурного профиля и нахождение температурного оптимума. Для этого эксперимента была проведена отдельная наработка рекомбинантной фосфолипазы С (PLC) в колбах объемом 50 мл с использованием шейкера-инкубатора «Innova 44» при температуре 37°С в течение 8 ч. После центрифугирования в образцах надосадочной жидкости определяли фосфолипазную активность, предварительно прогревая пробы в течение 30 мин в диапазоне температур 37, 50-80°С с шагом в 10°С. На фиг. 2 представлены данные по изменению активности PLC (ед/мл) в сравнении с аналогичными значениями, полученными для коммерческого препарата фосфолипазы С из Bacillus cereus («Sigma-Aldrich», Израиль). Температурные оптимумы действия коммерческого препарата и фосфолипазы С, полученной в эксперименте, совпадают и приходятся на 60°С. При дальнейшем повышении температуры активность обоих образцов достоверно снижается: при 80°С активность коммерческой фосфолипазы С в 1,6 раз ниже значений, полученных при 60°С, а полученной нами рекомбинантной PLC в 2,1 раз. Фосфолипазная активность рекомбинантного фермента при культивировании в колбах оказалась ниже, чем при наработке в ферментерах, что объясняется разницей в условиях культивирования: дополнительная аэрация в ферментерах, поддержание уровня рН на задаваемом уровне, питательные среды и их компоненты.

Пример 3. Влияние консервантов и температуры хранения на фосфолипазную активность

При оценке органолептических свойств препарата, а также выпадению осадка, по истечении 4 месяцев установлено, что темно-коричневый цвет всех образцов сохранялся на протяжении всего периода хранения, характерный специфичный метаболитный бациллярный запах, присутствующий во всех образцах, более выражен у хранившихся при +25°С.

Результаты, полученные при изучении влияния температуры хранения и различных консервантов на активность фермента, представлены в таблице 1.

У образца без консервантов активность достоверно не изменилась относительно первоначального значения независимо от температуры хранения и осталась на более высоком уровне, чем в образцах с консервантами. В пробах без добавления консервантов вне зависимости от температуры хранения формировался осадок, отсутствующий в вариантах с консервантами. Отрицательное влияние на активность фермента оказало сочетание консервантов: хлорид натрия (10%) + бензоат натрия (0,2%) + сорбат калия (0,3%). При этом температура хранения принципиально не повлияла на показатели фосфолипазной активности.

Пример 4. Проверка экспериментального образца рекомбинантной фосфолипазы-С при выработке сыра в лабораторных условиях

Проведено две выработки одного и того же вида сыра по единой технологии. В молочную смесь 1-й выработки добавляли экспериментальный лиофильно высушенный образец фермента фосфолипаза С. 2-ю выработку проводили без добавления этого фермента. При выработке сыров применяли бактериальную закваску, приготовленную беспересадочным способом из бактериального препарата "БК-Алтай-3", производимого ООО «Барнаульская биофабрика».

Присутствие фосфолипазы С не повлияло на протекание молочнокислого процесса (Табл. 2). Параметры экспериментальных выработок сыров соответствовали среднестатистическим данным процессов выработок сыров подобного плана.

Сыры были помещены в камеру созревания с температурой 13 (±1)°С на 45 суток. В начале и после созревания сыры были проанализированы по основным физико-химическим показателям (Табл. 3).

Содержание влаги в зрелом сыре №2 выше, чем в сыре №1 на 0,8%. Такая разница во влажности образцов повлияла на интенсивность ферментативных процессов. Сыр №2 заметно "кислее", чем сыр №1, так как молочнокислая микрофлора в нем, при более высокой влажности, развивалась активнее, что отражается снижением значений рН на 0,14 и 0,10 ед. соответственно.

Фосфолипаза С гидролизует фосфолипидную оболочку молочной жировой глобулы, облегчая липазам доступ к триглицеридам.

Под действием нативных липолитических ферментов молока, либо ферментов, образовавшихся в процессе жизнедеятельности молочнокислой микрофлоры, а также экзогенных липаз, в процессе созревания в сыре должны образовываться и накапливаться свободные жирные кислоты (СЖК).

Вследствие накопления СЖК, в том числе летучих (муравьиной, уксусной, пропионовой, изомасляной, масляной, изовалериановой, капроновой и каприловой кислот), органолептические свойства сыра улучшаются. Отсюда следует что, регулируя интенсивность и направленность липолиза молочного жира в сырах можно воздействовать на их вкусовые свойства.

После созревания сыров провели их органолептическую оценку по следующим показателям: вкус, запах, консистенция. Исследуемые образцы были оценены по вкусу и запаху как отличные, с выраженным сбалансированным вкусом. Вместе с тем образец №1 отличался объемным насыщенным сырным вкусом со сливочным привкусом и ароматом. В образце №2 отмечалась яркая кислинка с менее выраженными сливочным и сырным вкусом.

Пример 5. Установление срока годности ферментного препарата

Для установления срока годности готового препарата на протяжении времени хранения при +4 и +25°С проверяли изменение активности жидкого фермента на протяжении 4 мес, активность сухого фермента производили в этот же период, активность оставалась на одном уровне и не выходила из зоны погрешности измерений. Как показывают полученные результаты, после хранения препарата на протяжении 4 месяцев, активность фермента фосфолипазы С остается на высоком уровне, не снижается относительно исходного значения.

Литература

1. Патент N 2409671 Российская Федерация, МПК C12N 15/00 (2006.01). Рекомбинантная плазмида для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris гена фосфолипазы, штамм дрожжей Pichia pastoris - продуцент фосфолипазы: N 2009126298/10: заявл. 10.07.2009: опубл. 20.01.2011 / Борщевская Л.Н., Гордеева Т.Л., Бавыкина Н.Б., Синеокий С.П.; заявитель ФГУП ГосНИИгенетика. - 10 с: ил. - Текст: непосредственный.

2. Патент N 2500811 Российская Федерация, МПК C12N 1/21 (2006.01), C12N 9/16 (2006.01), C12R 1/085 (2006.01). Рекомбинантный штамм бактерий Bacillus subtilis -продуцент фосфолипазы С: N 2012143355/10: заявл. 10.10.2012: опубл. 10.12.2013 / Синеокий С.П., Борщевская Л.Н., Соболевская Т.И., Калинина А.Н., Патрушева Е.В.; заявитель ФГУП ГосНИИгенетика. - 9 с: ил. - Текст: непосредственный.

3. Патент N 2676321 Российская Федерация, C12N 15/52 (2006.01), C12N 15/81 (2006.01), C12N 1/19 (2006.01), C12R 1/84 (2006.01), C12N 9/18 (2006.01), СПК C12N 15/52 (2006.01), C12N 15/81 (2006.01), C12N 1/16 (2006.01), C12R 1/84 (2006.01), C12N 9/18 (2006.01), C12Y 301/01004 (2006.01). Способ получения ферментного препарата фосфолипазы А2 с применением рекомбинантного штамма-продуцента Pichia pastoris X-33/ pPICZαA-PhoA2-StV: N 2018108650: заявл. 07.03.2018 / Беклимешев А.Б., Кирьянова С.В., Анисимов Р.Л., Смирнов К.В., Сычев А.А., Бытяк Д.С; заявитель ООО "ИЦ "Бирюч-НТ". - 10 с: ил. - Текст: непосредственный.

4. Чиркова В.Ю., Щербаков Д.Н., Шарлаева Е.А., Ширманов М.В., Колосов П.В., Колосова Е.А., Иркитова А.Н., Малкова А.В., Дудник Д.Е., Каргашилова Е.Н., Евдокимов И.Ю. Оценка ферментативной активности рекомбинантной фосфолипазы С, полученной в системе Bacillus mojavensis при глубинном культивировании в полупромышленных ферментерах // Биотехнология, 2023, 39(2): 17-22. https://doi.org/10.56304/S0234275823020023

5. Dos Passos R.M., Silva R.M., Pontes P.V. de A., Morgano M.A., Meirelles A.J.A., Stevens Ch.V., Ferreira M.C, Sampaio K.A. Phospholipase cocktail: A new degumming technique for crude soybean // LWT - Food Sci. Technol, 2022, 159, 113197. https://doi.org/10.1016/i.lwt.2022.113197

6. Kurioka S., Matsuda M. Phospholipase С assay using p-Nitrophenylphosphorylcholine together with sorbitol and its application to studying the metal and detergent requirement of the enzyme // Anal. Biochem., 1976, 75(1), 281-289. https://doi 10.1016/0003-2697(76)90078-6

7. Marchisio F., Nardo L.Di, Val D.S., Cerminati S., Espariz M., Rasia R.M., Menzella H.G., Castelli M.E. Characterization of a novel thermostable phospholipase С from T. kodakarensis suitable for oil degumming // Applied Microbiology and Biotechnology, 2022, 106:5081-5091. https://doi.org/10.1007/s00253-022-12081-z

8. Merkulyeva Y.A., Shcherbakov D.N., Sharlaeva E.A., Chirkova V.Y. Phospholipases С from the genus Bacillus: biological role, properties, and fields of application // Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2021, 47(3), 653-659. https://doi.org/10.1134/S1068162021030134

9. Val D. S., Marchiso F., Nardo L. Di., Peiru S., Aguirre A., Abriata L. A., Palacios L. E., Rasia R. M., Castelli M. E., Menzella H. G. Sustainable Refining of Vegetable Oil Made Easy with a Designer Phospholipase С Enzyme // J. Agric. Food Chem, 2023, 159(13), 5275-5282. https://doi.org/10.1021 /acs.iafc.2c09176

10. Ciofalo V., Barton N., Kreps J., Coats I., Shanahan D. Safety evaluation of a lipase enzyme preparation, expressed in Pichia pastoris, intended for use in the degumming of edible vegetable oil // Regul. Toxicol. Pharmacol, 2006, 45, 1-8. https://doi:10.1016/i.vrtph.2006.02.001

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой жидкий и сухой рекомбинантный ферментный препарат, произведенный на основе генно-модифицированного штамма Bacillus mojavensis RCAM05968 BVD-1 PLC 6H. Предложенный ферментный препарат содержит очищенную сконцентрированную надосадочную жидкость штамма Bacillus mojavensis RCAM05968 BVD-1 PLC 6H и консервант - смесь хлорида натрия и бензоата натрия, также для стандартизации возможно добавление сухого наполнителя - мальтодекстрина. Способ получения препарата включает культивирование указанного штамма в ферментационных установках на мелассно-кукурузной среде, проточное концентрирование - центрифугирование, ультрафильтрационное концентрирование надосадочной жидкости, в случае получения сухого препарата - дополнительно сублимационную сушку концентрата фермента. Для стандартизации активности производится смешивание концентрата с мальтодекстрином до содержания в готовом препарате необходимой удельной активности. Изобретение обеспечивает получение ферментного препарата, который обладает высокой активностью, чистотой в отношении посторонних продуцируемых соединений в культуральной жидкости, продолжительным сроком хранения и эффективностью в отношении целевых субстратов. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 табл.

1. Способ получения ферментного препарата фосфолипазы С в жидкой форме, заключающийся в глубинном культивировании штамма Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H в мелассно-кукурузной среде следующего состава (г/л): 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила в ферментационных установках при рН 6,8-7,0, температуре 37°С, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100-500 об/мин; рО₂ 30-50% в фазе интенсивного роста культуры; продолжительности ферментации 7-13 ч; выделении культуральной жидкости центрифугированием при скорости 15000 об/мин и ее концентрировании методом ультрафильтрации на аппарате разделительном на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа, с последующим добавлением (масс/объем) 10% хлорида натрия и 0,5% бензоата натрия в качестве консерванта.

2. Способ получения ферментного препарата фосфолипазы С в сухой форме, заключающийся в глубинном культивировании штамма Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H в мелассно-кукурузной среде следующего состава (г/л): 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила в ферментационных установках при рН 6,8-7,0, температуре 37°C, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100-500 об/мин; рО₂ 30-50% в фазе интенсивного роста культуры; продолжительности ферментации 7-13 ч; выделении культуральной жидкости центрифугированием при скорости 15000 об/мин и ее концентрировании методом ультрафильтрации на аппарате разделительном на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа, с последующим добавлением (масс/объем) 10% хлорида натрия и 0,5% бензоата натрия в качестве консерванта, и лиофильную сушку; смешивание в течение 60 минут высушенной культуральной жидкости с мальтодекстрином в соотношении 50%/50% по массе.

3. Ферментный препарат фосфолипазы С на основе рекомбинантного штамма-продуцента Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H для пищевой промышленности, представляющий собой жидкость от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, получающуюся при глубинном культивировании штамма Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H в мелассно-кукурузной среде следующего состава (г/л): 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила в ферментационных установках при рН 6,8-7,0, температуре 37°С, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100-500 об/мин; рО₂ 30-50% в фазе интенсивного роста культуры; продолжительности ферментации 7-13 ч; выделении культуральной жидкости центрифугированием при скорости 15000 об/мин и ее концентрировании методом ультрафильтрации на аппарате разделительном на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа, с последующим добавлением (масс/объем) 10% хлорида натрия и 0,5% бензоата натрия в качестве консерванта, и порошок, получающийся при глубинном культивировании штамма Bacillus mojavensis RCAM05968 BDV-1 PLC 6H в мелассно-кукурузной среде следующего состава (г/л): 25 г мелассы, 12,5 г кукурузного экстракта, 1 г дрожжевого экстракта, 0,5 г триптона, 0,25 г MgSO₄, 0,03 г MnSO₄, 0,046 г CoCl₂, 1 г CaCl₂, 0,05 г FeSO₄, 0,05 г CuSO₄ и 2 мл софэксила в ферментационных установках при рН 6,8-7,0, температуре 37°С, расходе воздуха 0,250-1,5 м³/ч, скорости перемешивания 100-500 об/мин; pO₂ 30-50% в фазе интенсивного роста культуры; продолжительности ферментации 7-13 ч; выделении культуральной жидкости центрифугированием при скорости 15000 об/мин и ее концентрировании методом ультрафильтрации на аппарате разделительном на полых волокнах с пределом задержания 15 кДа, с последующим добавлением (масс/объем) 10% хлорида натрия и 0,5% бензоата натрия в качестве консерванта, и лиофильную сушку; смешивание в течение 60 минут высушенной культуральной жидкости с мальтодекстрином в соотношении 50%/50% по массе.