Способ выделения гликолипидов Российский патент 2024 года по МПК C12P19/00 C12N9/20 C07B63/02 

Изобретение относится к масложировой промышленности и может быть использовано для выделения гликолипидов из вторичных продуктов переработки растительных масел, в частности, фосфатидных концентратов (ФК) с использованием фосфолиполитических ферментов - фосфолипаз.

Анализ научно-технической и патентной информации по теме выделения гликолипидов из липидных систем позволил установить, что большинство методов базируется на принципе выделения по методу Фолча, который предполагает использование растворителей типа метанол и хлороформ с последующей очисткой полученного экстракта [Bligh E.C. Dyer W. J. Can.J.Biochem.Physiol. 1959, 37, 911; Eggers, L.F., Schwudke, D. (2016). Liquid Extraction: Folch. In: Wenk, M. (eds) Encyclopedia of Lipidomics. Springer, Dordrecht. DOI:10.1007/978-94-007-7864-1_89-1; Breil, C.; RU 2280454 C1, опубликован 27.07.2006; Xie M, Song Q, Zhao H. Investigation on the surface-active and antimicrobial properties of a natural glycolipid product. Food Funct. 2021 Nov 15;12(22):11537-11546. doi: 10.1039/d1fo02359d. PMID: 34708225].

Недостатками способов, основанных на методе Фолча, являются высокая продолжительность и трудоемкость процесса извлечения гликолипидов из субстрата. Кроме того, использование токсичных растворителей предполагает необходимость многоэтапной очистки продукта перед его реализацией до конечного потребителя, а следовательно, росту затрат на производство. Реализация этих способов в промышленных масштабах на производственных площадях масложировых предприятий достаточно затруднительна.

Кроме того, существует множество исследований, в которых рассматривают выделение или получение продуктов, в том числе и гликолипидов, путем переработки ресурсов масложировой отрасли методами, основанными на работе фосфолиполитических ферментов типов А, D и C. [Cabezas, Darci & Madoery, Ricardo & Diehl, Bernd & Tomás, Mabel. (2011). Application of Enzymatic Hydrolysis on Sunflower Lecithin Using a Pancreatic PLA2. Journal of the American Oil Chemists' Society. 88. 443-446. 10.1007/s11746-010-1684-9; Liang, S., Wang, S., Meng, Y., & Sun, C. (2020). Enzymatic preparation of glycerophosphatilcholine catalyzed by combinational phospholipases: a comparative study of concerted versus stepwise catalysis. RSC Advances, 10(64), 38727-38735. doi:10.1039/d0ra07012b].

Существующие методы, в подавляющем своем большинстве, предназначены для увеличения выхода содержания масла, свободных жирных кислот и диглицеридов путем разрушения полярных липидов - а именно фосфолипидов. Однако известно, что деструкция молекулы фосфолипида в фосфатидном концентрате способна позволить концентрировать другие полярные соединения - гликолипиды, которые до этого было невозможно выделить на этапе промышленной обработки фосфатидного концентрата из-за сходной с фосфолипидами полярности.

Наиболее близким к заявляемому техническому решению, является способ выделения гликолипидов [RU 2805926 C2, опубликован 24.10.2023]. С помощью фосфолипаз A1 или A2, которые ориентированы на деструкцию молекул фосфолипидов по положениям sn-1 и sn-2, соответственно, фосфолипиды модифицируют в более полярную и более гидратируемую форму - лизофосфолипиды. При этом в прототипе выполняют следующие этапы:

- в небольшом объеме водной реакционной среды с заданным значением pH растворяют фосфолипазы A1 и A2 в соотношении их массовых концентраций 1:1;

- воду из гидролизованной смеси удаляют упариванием посредством упаривания в вакуумном шкафу.

Недостатком прототипа является:

а) в качестве ферментов выступает смесь фосфолипаз типа А, каждая из которых обладает специфической избирательностью. Таким образом, если фосфолипаза А1 гидролизует фосфолипидную молекулу с отщеплением жирной кислоты в положении sn-1, с образованием sn-2-лизофосфолипидов, с которыми фосфолипаза А2 уже не будет взаимодействовать, что приведет к снижению скорости реакции и уменьшению теоретического выхода гликолипидов [Liang, S., Wang, S., Meng, Y., & Sun, C. (2020). Enzymatic preparation of glycerophosphatilcholine catalyzed by combinational phospholipases: a comparative study of concerted versus stepwise catalysis. RSC Advances, 10(64), 38727-38735. doi:10.1039/d0ra07012b], а также высокому расходу фермента.

б) для высушивании реакционной среды под вакуумом используется вакуум-сушильный шкаф, что обуславливает высокую продолжительность процесса (36-48 часов) и обуславливает возникновение периодического интенсивного вспенивания продукта, а следовательно его потери.

Задачей заявляемого изобретения является расширение арсенала способов выделения растительных гликолипидов из ФК путем ферментативного гидролиза с использованием фосфолиполитических ферментов - фосфолипаз.

Техническим результатом изобретения является реализация способа выделения растительных гликолипидов из ФК путем ферментативного гидролиза с использованием одного типа фосфолипазы - фосфолипазы С, позволяющего улучшить его качественные характеристики, в частности, снизить количество используемого фермента, сэкономить время, затрачиваемое на высушивание продукта после ферментативного гидролиза, а также снизить потери гликолипидов.

Технический результат достигается тем, что способ выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза включает ферментативный гидролиз фосфатидного концентрата, термодиструкцию смеси для инактивации ферментов, удаление воды из смеси, экстрагирование сухого остатка ацетоном, высушивание ацетоннерастворимой фракции, содержащей гликолипиды, при этом ферментативный гидролиз фосфатидного концентрата проводят в присутствии фосфолипазы С при значения рН от 5,0 до 5,5 и термостатировании при температуре от 50° до 60°С, удаление воды из смеси осуществляют сублимационным высушиванием, путем заморозки смеси полученной после гидролиза при температуре минус 60°С в течение 3 часов, с последующим вакуумированием при максимальной температуре в камере 12°С до полного высушивания продукта (массовая доля воды в продукте, определяемая титрованием по методу К.Фишера, не должна превышать 0,3%). Время высушивания при описанном методе удаления влаги составляет от 18 до 24 часов.

Предлагаемый способ выделения гликолипидов основывается на физико-химических свойствах полярных соединений растительных ФК. Выделение гликолипидов осуществляется за счет удаления диглицеридов, которые образуются при деструкции молекул фосфолипидов, содержащихся в ФК, экстракцией полярным растворителем - ацетоном.

Заявленный способ осуществляется следующим образом.

Для осуществления способа используют фосфолипазу C, для которой производителями рекомендовано соблюдать водородный показатель реакционной среды 5,0-5,5 pH и температуру процесса 50-60°С.

Выбранный диапазон значений рН обусловлен характеристикой реакционоспособности фермента фосфолипазы C и обеспечивает максимальную эффективность ферментативного гидролиза. Выбранный диапазон температур обусловлен тем, что при повышении температуры ускоряется скорость химических реакций, но повышать температуру более 60°С нельзя, поскольку это приводит к деструкции фермента, имеющего белковую природу.

Для приготовления реакционной среды используют бидистилированную воду. Необходимое значение pH получают путем добавления в бидистилированную воду растворов NaOH или HCl.

В небольшом объеме реакционной среды растворяют фосфолипазу C.

Навеску ФК, содержащую такие гликолипиды, как моногалактозилдиациглицерол (MDGD), диагалктазилдиацилглицерол (DGDG), стерилгликозид (SG), этерифицированный стерилгликозид (ESG) соединяют с оставшимся после растворения фермента объемом реакционной среды. Полученную смесь гомогенизируют и переносят в термостатируемый реактор с пропеллерной мешалкой, затем к смеси добавляют ранее подготовленный раствор фосфолипазы C.

Процесс ферментативного гидролиза осуществляют при непрерывном перемешивании, заданной температуре, pH и в течение времени, необходимого для деструктурирования молекул фосфолипидов.

Скорость ферментативного гидролиза зависит от активности фермента и массовой доли фосфолипидов в ФК. Если активность фермента, заявленная производителями, отлична от фактической, существует необходимость корректировки количества фосфолипазы вводимой в систему. Рассчитать массу фосфолипазы возможно общедоступными методами.

Экспериментально установлено, что оптимальным временем проведения ферментативного гидролиза, предложенным способом является 3ч.

Диапазон температур устанавливают в соответствии с пределами минимальных и максимальных значений, которые обеспечивают оптимальную работу фермента.

По завершении ферментативного гидролиза полученную смесь подвергают термодеструкции при краткосрочном нагреве до 100°С для инактивации фермента. Затем осуществляют удаление воды методом лиофильной (сублимационной) сушки под вакуумом.

Из сухого остатка удаляют образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза диглицериды экстракцией с использованием в качестве селективного экстрагента охлажденного ацетона по ГОСТ 32052 п.8.8. Ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, высушивают до постоянной массы, получая, таким образом, концентрат гликолипидов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Для приготовления реакционной среды используют бидистилированную воду в количестве 180 г, pH которой регулируют путем добавления в воду растворов NaOH или HCl до 5,0-5,5 pH, рекомендованного производителем фермента (табл. 1).

Фермент в количестве 0,4 г C (при известной активности фосфолипазы C 10000 Unit/г), растворяют в 80 г реакционной среды.

Навеску ФК в количестве 20 г гомогенизируют со 100 г реакционной среды и переносят в реактор, нагретый до температуры 50-60°С, рекомендованной производителем фермента (табл. 1). Затем в реактор добавляют, ранее приготовленный раствор фосфолипазы С. Включают пропеллерную мешалку для обеспечения интенсивного перемешивания смеси. Длительность ферментативного гидролиза составляла 3 ч.

По завершении ферментативного гидролиза смесь подвергают термодеструкции при краткосрочном нагреве до 100°С для инактивации фермента. Затем осуществляют удаление воды методом сублимационного высушивания путем заморозки смеси полученной после гидролиза при минус 60°С в течение 3 часов, с последующим вакуумированием при остаточном давлении 10 мБар при максимальной температуре в камере 12°С до полного высушивания продукта, при этом массовая доля воды в продукте, определяемая титрованием по методу К. Фишера, не должна превышать 0,3%

По окончании высушивания диглицериды удаляют экстракцией с помощью охлажденного ацетона. Ацетоннерастворимую фракцию, содержащую гликолипиды, а также недеструктурированные фосфолипиды, высушивают при температуре 103°С до постоянной массы, получая концентрат гликолипидов с массовой долей от 30 % до 39%.

Ацетон из ацетонрастворимой фракции отгоняют и получают диглицериды.

Таблица 1 - Параметры ферментативного гидролиза ФК

№ опыта рН Температура °С Содержание гликолипидов в концентрате, % 1 5,0 50 30 2 5,0 55 34 3 5,0 60 32 4 5,3 50 34 5 5,3 55 39 6 5,3 60 36 7 5,5 50 33 8 5,5 55 35 9 5,5 60 32

Таким образом, заявляемое изобретение расширить арсенал способов выделения растительных гликолипидов из ФК путем ферментативного гидролиза с использованием одного типа фосфолипазы - фосфолипазы С, позволяющего улучшить его качественные характеристики, в частности, снизить количество используемого фермента, сэкономить время затрачиваемое на высушивание продукта после ферментативного гидролиза, а также снизить потери гликолипидов, за счет исключения вспенивания продукта.

Растворитель, используемый для экстрагирования, может подлежать рекуперации и повторно использоваться для производственных нужд. Кроме того, способ применим для переработки некондиционных фосфатидных концентратов, которые реализуют в кормовых целях. При этом получают более экономически выгодный продукт - гликолипиды, а диглицериды, которые образуются в результате деструкции молекул фосфолипидов, в пищевой промышленности могут использоваться в качестве стабилизаторов, эмульгаторов и консервантов.

Исследования выполнялись с использованием оборудования ЦКП "Исследовательский центр пищевых и химических технологий" КубГТУ (CKP_3111), развитие которого поддерживается Минобрнауки РФ (Соглашение № 075-15-2021-679).

Изобретение относится к масложировой промышленности и может быть использовано для выделения гликолипидов из вторичных продуктов переработки растительных масел, в частности, фосфатидных концентратов (ФК) с использованием фосфолиполитических ферментов - фосфолипаз. Способ выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза включает ферментативный гидролиз фосфатидного концентрата, термодисрукцию смеси для инактивации ферментов, удаление воды из смеси, экстрагирование сухого остатка ацетоном, высушивание ацетоннерастворимой фракции, содержащей гликолипиды. При этом ферментативный гидролиз фосфатидного концентрата проводят в присутствии фосфолипазы С при значения рН от 5,0 до 5,5 и термостатировании при температуре от 50° до 60°С, удаление воды из смеси осуществляют сублимационным высушиванием, путем заморозки смеси полученной после гидролиза при температуре минус 60°С в течение 3 часов, с последующим вакуумированием при максимальной температуре в камере 12°С до полного высушивания продукта. Техническим результатом изобретения является реализация способа выделения растительных гликолипидов из ФК путем ферментативного гидролиза с использованием одного типа фосфолипазы - фосфолипазы С, позволяющего улучшить его качественные характеристики, в частности, снизить количество используемого фермента, сэкономить время, затрачиваемое на высушивание продукта после ферментативного гидролиза, а также снизить потери гликолипидов.

Способ выделения гликолипидов методом ферментативного гидролиза, включающий ферментативный гидролиз фосфатидного концентрата, термодеструкцию смеси для инактивации ферментов, удаление воды из смеси, экстрагирование сухого остатка ацетоном, высушивание ацетоннерастворимой фракции, содержащей гликолипиды, отличающийся тем, что ферментативный гидролиз фосфатидного концентрата проводят в присутствии фосфолипазы С при значения рН от 5,0 до 5,5 и термостатировании при температуре от 50° до 60°С, удаление воды из смеси осуществляют сублимационным высушиванием, путем заморозки смеси, полученной после гидролиза, при температуре минус 60°С в течение 3 часов, с последующим вакуумированием при максимальной температуре в камере 12°С до полного высушивания продукта.