Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro (варианты) Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12N1/38 C12R1/32 

Группа изобретений относится к микробиологии и может использоваться в клинической и экспериментальной медицине для исследований механизмов, условий и особенностей образования биопленок M. tuberculosis (МБТ), а также тестирования активности противотуберкулезных препаратов, поиска потенциальных соединений и способов антибактериального воздействия на M. tuberculosis, находящихся в состоянии биопленок.

По современным представлениям, биопленка (БП) – микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ, и демонстрируют изменение фенотипа, выражающееся в изменении параметров роста и экспрессии специфичных генов [1]. Известно, что биопленки способны образовывать более 90% изученных видов бактерий, а их формирование выявляется более при 80% хронических заболеваний микробной этиологии [2].

Туберкулез (ТБ) – хроническое инфекционное заболевание, вызываемое микобактериями группы M. tuberculosis complex, характеризующееся специфическим поражением органов и тканей с полиморфной патологоанатомической картиной очагов поражения. M. tuberculosis способны поражать все органы и системы организма человека, за исключением придатков кожи, но большинстве случаев (≈ 97%) патологический процесс локализуется в органах дыхания [3]. На протяжении многих веков туберкулез является одним из наиболее распространенных инфекционных заболеваний человека, оставаясь и в 21 веке одной из 10 основных смертности и основной причиной смерти, обусловленной каким-либо одним возбудителем инфекции [4]. Так, по оценкам ВОЗ в 2020 от туберкулеза в мире умерло 1,5 (95% ДИ: 1,28-1,64) млн. человек, прервав имевшую место с 2005 г. тенденцию снижения глобального числа смертей от ТБ [5]. В России, несмотря на наблюдаемые в течение последних 20 лет снижение заболеваемости туберкулезом и смертности от него, ТБ продолжает оставаться одной из основных проблем общественного здравоохранения: в 2021 году зарегистрировано почти 45 тыс. (44974) новых случаев заболевания, причем среди взрослых она вновь возросла в почти трети (31,8%), а среди детей - более, чем в половине (51,8%) регионов страны; а общий объем прямых медицинских затрат на борьбу с туберкулезом составил 92,0 млрд. рублей [6,7].

В этиологии туберкулеза среди представителей M. tuberculosis complex на долю M. tuberculosis приходится более 90% случаев [8]. Способность M. tuberculosis образовывать биопленки in vitro обнаружена во многих экспериментальных микробиологических исследованиях. Известно, что биопленочный фенотип M. tuberculosis в бактериальных культурах in vitro имеет характерные видоспецифические морфологические черты:

1) формирование аггрегативного роста на границе поверхностей “жидкость-воздух” (например, на поверхности жидких питательных сред (ЖПС) в виде структур, визуально характеризуемых как “пленка” (синонимы: биопленка, пленочный рост, биопленочный фенотип, biofilm, pellicle) [9,10];

2) образование кордов – микроскопических линейных структур, образуемых M. tuberculosis в бульонных культурах. Корды представляют собой микроколонии/агрегаты микобатериальных клеток, ориентированных вдоль продольной оси в виде длинных тяжей (“шнуров”, “нитей’, «струн” “кос” и т.п.). Внутри кордов поверхности клеток MБТ плотно связаны (“слеплены”) между собой [11]. В многочисленных исследованиях in vitro в корд-структурах обнаружены элементы экстрацеллюлярного матрикса (полисахариды, в частности, целлюлоза [12], экстрацеллюлярные нуклеиновые кислоты, свободные миколовые кислоты, гликопептидолипиды [13]), а также выявлены специфические транскриптомные, биохимические и метаболические сдвиги в микобактериальных клетках [14,15]. По современным представлениям, корды – специфический морфологический субстрат биопленок, образуемых M. tuberculosis.

Хотя способность возбудителя туберкулеза существовать в виде биопленок в организме человека в настоящее время остается дискутабельной, в литературе имеется немало описаний обнаружения БП-подобных структур в клиническом и аутопсийном материале [16-20]. В клиническом аспекте проблема формирования биопленок в организме пациента особенно важна благодаря характерному свойству всех БП - устойчивости к антибактериальным препаратам, т.н. фенотипической резистентности, обусловленной высокой клеточной плотностью, физическим вытеснением АБ средства, гетерогенностью микроорганизмов в БП-сообществе, изменениями физиологии бактериальных клеток, включающими универсальные клеточные стресс-реакции, редукцию ключевых метаболических процессов и индукцию защитных механизмов [1]. Очевидно, что фенотипическая резистентность микобактерий туберкулеза (МБТ) в составе БП снижает эффективность лечения больных ТБ, особенно тех, чье заболевание вызвано МБТ с множественной лекарственной устойчивостью к противотуберкулезным препаратам (генотипической), широко распространённой в настоящее время (на уровне 25-60% от числа зарегистрированных пациентов в разных регионах мира) [3,5,6]. В данном контексте поиск путей эффективного антибактериального воздействия на биопленочные формы M. tuberculosis представляется весьма актуальным, в том числе посредством моделирования БП-фенотипа МБТ in vitro.

Уровень техники

Известна модель “пелликулярных биопленок” (pellicle biofilms model) Ojha, A.K. и соавт., - прототип заявляемой группы изобретений – формирование биопленок M. tuberculosis на поверхности жидкой питательной среды Сотона в условиях статичного культивирования в течение 5 недель. В качестве инокулята в данной модели использовалась 250 мкл культуры M. tuberculosis после предварительного культивирования в среде Middlbrook 7H9 в течение 7-10 суток [21].

Известны несколько модификаций модели Ojha, A.K.:

1) Kerns P.W. и соавт., отличающаяся объемом инокулята (100 мкл) и длительностью статичного культивирования до 7 недель [22];

2) Keating T. предложено статичное культивирование M. tuberculosis в модифицированной среде Сотона с уменьшенным на 10% содержанием KH₂PO₄ в течение 5-6 недель с предварительным 7-суточным шейкерным культивированием в среде Mod2 [23];

3) Richards J.P. помимо среды Сотона использовал статичное культивирование M. tuberculosis в среде Middlbrook 7H9 в течение 5 недель с предварительным 7-10 суточным культивированием в одноименной среде с добавлением 100 мкг/мл пантотеновой кислоты и последующей двойной отмывкой культур [24].

Основными недостатками данных вариантов модели биопленок МБТ являются длительные сроки культивирования (5-7 недель) и необходимость предварительного (в течение 7-10 суток) культивирования M. tuberculosis для получения инокулята.

Известна модификация среды Сотона (Yu Lu и соавт.), отличающаяся от оригинальной [25] увеличенным содержанием некоторых компонентов (цитрата-аммония железа(III), гептагидрата сульфата магния) заменой гидрофосфата калия на тригидрат гидрофосфата калия в эквивалентном или увеличенном количестве. В качестве инокулята также использовалась недельная бульонная культура M. tuberculosis. По данным авторов, предложенная ими модификация среды, позволяла получить МБТ-биопленки в течение 4 недель [26,27].

Заявляемая нами модель имеет принципиальные отличия от всех вышеописанных вариантов модели “пелликулярных биопленок”, а именно: 1) использованием ПАВ в качестве стимуляторов образования биопленок; 2) в качестве инокулята используется суспензия M. tuberculosis без предварительного культивирования МБТ в ЖПС 3) использованием статичного культивирования в среде Middlbrook 7H9 (за исключением варианта Richards J.P.). Использование стимуляторов и отсутствие предварительного культивирования МБТ позволяет получить БП в существенно более короткие сроки.

Описан способ получения БП M. tuberculosis на пластинах из цемента, керамики, стали (Adetunji V. и соавт.) посредством их погружения в среду Middlbrook 7H9 с добавлением 5% экстракта печени крупного рогатого скота, приготовленного ex tempore. Авторы получали биопленки МБТ в сроки до 4 недель и использовали предварительное культивирование M. tuberculosis в ЖПС в течение 14 дней. Данный способ отражает частные случаи БП-формирования МБТ на специфических поверхностях, высоко затратен по времени (6 недель) и материалам (требует использования свежей ткани печени животных, многоэтапной процедуры получения экстракта, добавления комплекса антибиотиков) [28].

Известна модель Ackart D.F. и соавт. - МБТ-биопленок, индуцированных лизатом лейкоцитов (leukocyte lysate-induced biofilm) - культивирование M. tuberculosis в среде RPMI-1640 с 2% плазмы крупного рогатого скота и добавлением лизата лейкоцитов человеческой крови в течение 7-10 дней в полистироловых планшетах или стеклянных камерах [29]. Инокулятом служила культура M. tuberculosis после 7-10 дней экспозиции в среде Проскауэра и Бека. Основные недостатки данной модели – необходимость использования дорогостоящих компонентов донорской крови человека, длительный и сложный этап получения лейкоцитарного лизата, необходимость предварительного культивирования МБТ.

Известна модель Trivedi A. и соавт - МБТ- биопленок, индуцированных тиол-окислительным стрессом (thiol reductive stress-induced biofilms) – после предварительного культивирования в ЖПС до логарифмической фазы роста (7-10 суток), МБТ подвергались 29-часовой обработке дитиотреитолом (ДТТ) или меркаптоэтанолом с последующим образованием БП на поверхности предметного стекла либо стеклянной камеры/планшета в течение 2-35 суток в зависимости от требующейся стадии формирования биопленки [30]. Из недостатков данной модели, кроме предварительного культивирования МБТ, - присутствие индукторов окислительного стресса, способных нарушать параметры роста M. tuberculosis.

Известен способ ускорения роста M. tuberculosis (Cruz A.L.L.) - по данным автора – за счет формирования биопленок – путем добавления в ЖПС керамических микрочастиц на основе гидроксиапатита [31]. Для его осуществления необходима технологически сложная процедура синтеза керамических частиц. Кроме того, твердые минеральные частицы встраиваются во внутреннюю структуру БП, что может препятствовать микроскопической визуализации морфологии БП и требовать дополнительных этапов удаления данных частиц для последующего проведении физико-химических, биохимических, молекулярно-генетических и др. исследований БП.

Известна модель биопленок M. bovis BCG с использованием “трехмерной системы ротации клеточных культур” (RCCS-4DQ) (Cantillon D. и соавт.) – инкубация в условиях ротации в течение 3 недель после предварительного 7-дневного культивирования в среде Сотона. Для осуществления данной модели требуется специфическое сложное оборудование с отдельным источником питания и тахометром, специальные одноразовые расходные материалы [32].

Известен способ получения МБ-биопленок с помощью рекомбинантного штамма Mycobacterium bovis BCGABCG1419c (Flores V.M.A. и соавт.), из ДНК которого исключен фрагмент BCG1419c-гена, кодирующего белок c-di-GMP, ключевой медиатор генеза бактериальных биопленок. Данный способ относится только к биопленкам, формируемых Mycobacterium bovis BCG и не может использоваться для моделирования биопленок M. tuberculosis. Кроме того, осуществление данного способа требует проведения дорогостоящих многоэтапных лабораторных манипуляций для получения генетически трансформированной культуры микобактериальных клеток [33].

Раскрытие сущности и осуществление изобретения

Предлагаемый нами способ моделирования биопленок M. tuberculosis отличается от вышеописанных моделей, а) принципиально иным способом стимуляции БП-формирования МБТ, б) разработан для получения биопленок M. tuberculosis на поверхности ЖПС, для его воспроизведения не требуется дополнительных специальных материалов, оборудования, микобактериальных штаммов, в) отсутствием процедуры предварительного культивирования МБТ для получения инокулята.

Настоящая группа изобретений основана на обнаруженной нами универсальной способности поверхностно-активных веществ (ПАВ) стимулировать формирование микобактериями туберкулеза биопленок в процессе культивирования в жидкой питательной среде. Предлагаемый способ моделирования биопленок МБТ заключается в использовании предварительной культивированию обработки M. tuberculosis поверхностно-активными веществами. ПАВ, воздействуя на микобактериальную клеточную стенку, стимулируют образование на поверхности бульонной культуры МБТ структур, соответствующих биопленочному фенотипу M. tuberculosis.

Способ осуществляют в описанных ниже вариантах.

Для исполнения каждого из вариантов моделирования необходимы следующие материалы и оборудование:

1. Питательная среда для культивирования микобактерий Middlebrook 7H9 (сухая основа промышленного производства) с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment. Объем среды для получения биопленки M. tuberculosis может варьировать в зависимости от задач и условий исполнения модели. В нижеследующих вариантах модели приведены количества используемых материалов на 2 мл среды. В качестве емкости для модели может быть использована любая лабораторная посуда, предназначенная для культивирования микроорганизмов (пробирки, культуральные планшеты, флаконы, чашки Петри и.т.п.); нами использовались стандартные культуральные 24-луночные планшеты (рисунки 1,6,10,14,18,22).

2. Чистая культура M. tuberculosis. В зависимости от задач моделирования может быть использован любой штамм/изолят M. tuberculosis. В представленных ниже вариантах модели нами использован референтный штамм M. tuberculosis H₃₇Rv (ATCC 27294™). Для формирования биопленок в качестве инокулята используют суспензию M. tuberculosis в среде Middlebrook 7H9 без ADC Enrichment. Концентрация MБТ в суспензии для получения биопленок определяется задачами моделирования и может находиться в диапазоне от 10² до 10¹⁰ и более микробных клеток в миллилитре (мкр. кл/мл), при этом скорость формирования биопленки обратно пропорциональна концентрации МБТ. В предлагаемых нами вариантах модели использовались суспензии МБТ с концентрацией 1,0 – 5,0 x 10^8 мкр. кл /мл. Способ приготовления инокулируемой суспензии МБТ: несколько колоний 28-35 суточной чистой культуры/субкультуры M. tuberculosis, полученной на среде Левенштейна-Йенсена, аккуратно снять с поверхности среды, ресуспендировать в 3-5 мл среды Middlebrook 7H9 до образования равномерно мутной суспензии, при необходимости довести суспензию до требуемой концентрации путем разбавления данной средой; концентрация МБТ может быть измерена любым из стандартных методов – визуальным с использованием стандартов McFarland, спектрофотометрическим либо нефелометрическим.

3. Стимулятор формирования биопленок M. tuberculosis. В предлагаемом способе моделирования используются неионогенные ПАВ, в вариантах: метил-β-циклодекстрин, Poloxamer 407, Tween-80, Tyloxapol, n-октил-beta-D-глюкопиранозид, n-додецил-D–beta-мальтозид.

4. Дистиллированная вода как растворитель ПАВ.

5. Шейкер лабораторный.

6. Центрифуга лабораторная высокоскоростная.

7. Термостат (инкубатор) лабораторный.

8. Вортекс лабораторный.

Для характеристики модели использованы следующие критерии:

1. Способность к образованию микобактериями туберкулеза биопленочного фенотипа, признакам которого являлись:

а) формирование на поверхности жидкой питательной среды макроскопических пленочных структур;

б) формирование M. tuberculosis структур в виде кордов, выявляемых микроскопически в окрашенных и/или нативных препаратах;

в) формирование M. tuberculosis на поверхности среды (агар Middlebrook 7H10) корд-трансформированных колоний.

2. Скорость формирования биопленок M. tuberculosis, в сутках.

Описание вариантов модели

Вариант 1. Модель формирования биопленок M. tuberculosis с использованием в качестве стимулятора метил-β-циклодекстрина.

Необходимые материалы (дополнительно, кроме вышеперечисленных общих для всех вариантов модели):

1. Метил-β-циклодекстрин (синонимы: Methyl-β-cyclodextrin, MβCD, Methyl-β-CD, Methyl-beta-cyclodextrin), порошок. CAS Number:128446-36-6. Квалификация: чистый (purum).

Биоплёнки M. tuberculosis в данном варианте модели получают следующим путем:

1. Приготовление исходного раствора метил-β-циклодекстрина.

В серии предварительных экспериментов нами установлено, что MβCD оказывает на M. tuberculosis стимулирующий биопленкообразование эффект в диапазоне концентраций 10-50 мМ/л, не оказывая при этом бактериостатического действия. Концентрация MβCD 25 мМ/л явилась оптимальной по критериям интенсивности формирования биопленки и выраженности ее характерных морфологических признаков (кордобразование на поверхности агаровой среды). В качестве исходного нами использован 250 мМ раствор MβCD. Способ приготовления: навеску порошка MβCD 3,25 г растворить в 10 мл, дистиллированный воды путем 30-минутного перемешивания при комнатной температуре. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. Готовый раствор можно использовать в течение 6 месяцев, температура хранения - 2-8⁰С.

2. Приготовить требуемый объем бульона Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment в соответствии с инструкциями производителя.

3. Приготовить суспензию МБТ требуемого объема и концентрации вышеописанным способом (стр 8, п.2).

4. Получение биопленки M. tuberculosis (пример):

4.1. Обработка суспензии МБТ (инокулята) стимулятором биопленкоформирования: к 900 мкл суспензии МБТ добавить 100 мкл исходного раствора метил-β-циклодекстрина, перемешать на вортексе в течение 30 секунд, далее – инкубировать при 35-37⁰С в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 150-200 об/мин.

4.2. Получение биопленки: 200 мкл обработанной суспензии МБТ засеять в 1,8-2,0 мл готовой питательной среды Middlebrook 7H9. Посевы инкубировать в стандартных условиях статичного культивирования при 37⁰С в течение 10-30 дней. Сроки инкубации определяются задачами моделирования; экстенсивность формирования на поверхности среды и толщина биопленки M. tuberculosis прямо пропорциональны срокам инкубации и концентрации МБТ в исходной суспензии.

Далее в таблице 1, на рисунках 1, 3-5 представлены результаты формирования биопленок МБТ, полученные нами в данном варианте модели. В качестве объекта моделирования здесь и в нижеследующих вариантах модели был использован референтный штамм M. tuberculosis H₃₇Rv (ATCC 27294™), в качестве контроля использовали необработанную суспензию данного штамма. Все представленные варианты модели были воспроизведены дважды. Экспрессию биопленочного фенотипа M. tuberculosis на ЖПС оценивали визуально; скорость формирования биопленок оценивали в сутках инкубации (указаны минимальное и максимальное значения), по истечении которых фиксировали какие-либо фенотипические признаки формирования биопленки на поверхности среды. Способность МБТ к кордообразованию оценивали: 1) с помощью микроскопии колоний, формирующихся на агаре Middlebrook 7H10 после инокуляции на его поверхность аликвот (50 мкл) суспензии МБТ, обработанной ПАВ; 2) с помощью микроскопии фрагментов биопленок, образованных на поверхности ЖПС, - в нативных и/или окрашенных карболовым фуксином (методом Циля-Нельсена) препаратах.

Таблица 1. Сроки и динамика формирования биопленки M. tuberculosis H₃₇Rv в ЖПС Middlebrook 7H9 после обработки инокулируемой суспензии 25 мМ метил-β-циклодекстрина.

Сутки
инкубации Фенотипические признаки роста / формирования биопленки Моделируемый образец (обработанный инокулят M. tuberculosis) Контрольный образец
(необработанный инокулят M. tuberculosis) 5 Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний Видимого роста нет 7 Придонный рост в виде мелких хлопьевидных колоний, покрывающий ≈ 50% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 9 Придонный рост, полностью покрывающий дно лунки Слабовыраженный (до 25% дна лунки) придонный рост 13 Появление пленочного роста на поверхности среды Придонный рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки 15-17 Тонкопленочный рост, полностью покрывающий поверхность ПС Придонный рост, почти полностью покрывающий дно лунки 20-22 Выраженный (грубая пленка, толщиной ≈ 0,5-1,0 мм) пленочный рост Придонный рост, появление пленки на поверхности ПС

Представленные данные демонстрируют, что предварительная 24- часовая обработка суспензии МБТ 25 мМ раствором метил-β-циклодекстрина позволяет получить выраженный биопленочный рост на поверхности ЖПС Middlebrook 7H9; при этом формирование биопленки происходит на ≈ 6-7 суток быстрее по сравнению с ростом в контроле.

Обработка инокулята M. tuberculosis метил-β-циклодекстрином приводила также к выраженным изменениям в морфологии колоний, формируемых МБТ на поверхности агара (рисунок 3). Рисунок 2 демонстрирует типичную морфологию колоний M. tuberculosis на поверхности агара на 5-7 (А), 9-12 (Б) и 17-20 (В) сутки инкубации. Характерные признаки – равномерный рост по окружности от центра формирования колонии; колонии компактные, относительно правильной округлой формы. Края колоний неровные, без глубоких “бухтообразных” изгибов. По мере деления клеток МБТ, образующих колонию, площадь ее увеличивается, центр колонии приподнимется над поверхностью агара, затем к ≈ 15-20 дню инкубации на поверхности колонии формируется характерная складчатость. Продолжение инкубации приводит к дальнейшему росту и слиянию колоний, границы колоний становятся неразличимыми. Клетки МБТ внутри типичных колоний плотно прилежат друг к другу без формирования выраженных (относительно широких и извитых) тяжей - кордов. Далее рисунок 2 с типичными колониями M. tuberculosis следует использовать для сравнения морфологии колоний, формируемых МБТ в других, описываемых ниже вариантах модели.

На рисунке 3 видны резко выраженные отличия в морфологии колоний, образованных M. tuberculosis после обработки 24- часовой обработки 25 мМ/л MβCD. Микроструктура колоний представляет собой агломерат кордов. Выраженное кордоформирование наблюдается с момента образования колоний (А); рост колоний происходит путем увеличения размеров кордов по длине и ширине (Б, В). Корд-трансформированные колонии имеют более уплощенную в сравнении с типичными форму, гладкие, резко извитые, “бухтообразные” границы, а также отличающуюся от типичной своеобразную извитую складчатость внутренней микроструктуры без четко выраженного центра формирования колонии. Очевидно, что предварительная обработка метил-β-циклодекстрином стимулирует корд-трансформацию в ходе дальнейшего роста МБТ на поверхности агара и, тем самым, стимулирует формирование биопленочного фенотипа M. tuberculosis.

На рисунке 4 приведена микрофотография фрагмента биопленки, сформированной на поверхности жидкой ПС микобактериями туберкулеза, стимулированными обработкой MβCD. Хорошо видно, что данный вариант биопленки представляет собой ячеистую структуру, образованную многочисленными переплетениями кордов.

На рисунке 5 представлена сравнительная микроскопическая детализация микроколоний, образованных M. tuberculosis в результате культивирования в жидкой ПС без (А) и с предварительной (Б) обработкой MβCD. Рисунок демонстрирует, что интенсивность корд-формирования МБТ в моделируемом образце существенно более выражена в сравнении с контрольным: ≈ 100 % биопленки моделируемого образца представлена кордами, тогда как в контрольном образце преобладают конгломераты МБТ без или со слабо выраженным кордами; длина кордов моделируемого на несколько порядков больше по сравнению с контролем.

Таким образом, по совокупности вышеперечисленных критериев обработка инокулята M. tuberculosis метил-β-циклодекстрином вышеописанным способом оказывает стимулирующий эффект на формирование биопленочного фенотипа M. tuberculosis в ходе инкубации в ЖПС Middlebrook 7H9.

Вариант 2. Модель формирования биопленок M. tuberculosis с использованием в качестве ПАВ полоксамекра 407.

Необходимые материалы (дополнительно, кроме общих для всех вариантов модели):

1. Полоксамер 407 (синонимы: Poloxamer 407, Poly(ethylene glycol)-block-poly(propylene glycol)-block-poly(ethylene glycol), порошок. CAS Number: 9003-11-6. Квалификация: очищенный (purified).

Биоплёнки M. tuberculosis в данном варианте модели получают следующим путем:

1. Приготовить 10% w/v водный раствор полоксамера 407 (исходный раствор): навеску 1 г. растворить в 10 мл дистиллированной воды, охлажденной до 4-5⁰С, встряхивать на вортексе до полного растворения. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. Исходный раствор можно использовать в течение 6 месяцев, температура хранения 2-8⁰С. Для получения биопленки нами использовалась обработка суспензии M. tuberculosis полоксамером 407 в диапазоне концентраций 0,1-2,0% w/v; установлено, что концентрация 2,0% является оптимальной по критерию скорости формирования микобактериальной пленки на поверхности среды.

2. Приготовить требуемый объем ПС Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment в соответствии с инструкциями производителя.

3. Приготовить суспензию МБТ требуемого объема и концентрации вышеописанным способом (стр 8, п.2).

4. Получение биопленки M. tuberculosis (пример):

4.1. Обработка суспензии МБТ стимулятором биопленкоформирования: к 800 мкл суспензии МБТ добавить 200 мкл исходного раствора полоксамера 407, перемешать на вортексе в течение 30 секунд, затем - инкубировать при комнатной (18-23⁰С) температуре в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 150-200 об/мин.

4.2. Получение биопленки: 200 мкл обработанного инокулята МБТ засеять в 1,8-2,0 мл готовой питательной среды Middlebrook 7H9. Посевы инкубировать в стандартных условиях статичного культивирования при 37⁰С в течение 15-30 суток. Сроки инкубации определяются задачами моделирования; экстенсивность формирования и толщина биопленки M. tuberculosis прямо пропорциональны срокам инкубации и концентрации МБТ в исходной суспензии.

Результаты формирования биопленок МБТ, полученные нами во втором варианте модели представлены в таблице 2 и на рисунках 6-9.

Таблица 2. Сроки и динамика формирования биопленки M. tuberculosis H₃₇Rv в ЖПС Middlebrook 7H9 после обработки инокулята полоксамером-407 в концентрации 2,0%.

Сутки
инкубации Фенотипические признаки роста / формирования биопленки Моделируемый образец (обработанный инокулят M. tuberculosis) Контрольный образец
(необработанный инокулят M. tuberculosis) 7 Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний 9-10 Придонный рост в виде мелких хлопьевидных колоний, покрывающий ≈ 50% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 13-15 Придонный пленочный рост, полностью покрывающий дно лунки Придонный рост в виде мелких хлопьевидных колоний, покрывающий < 50% дна лунки 17-18 Появление пленочного роста на поверхности среды Придонный рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки 20-21 Тонкопленочный рост, полностью покрывающий поверхность ПС Придонный рост, покрывающий ≈ 75% дна лунки 23-25 Выраженный пленочный рост
(пленка, толщиной ≈ 0,5 мм) Придонный рост, почти полностью покрывающий дно лунки

Скорость формирования биопленки на поверхности ЖПС в моделируемом образце была на 5-8 суток выше по сравнению с контрольным (таблица 2, рисунок 6), на поверхности агара наблюдалась ярко выраженная корд-трансформация колоний M. tuberculosis (рисунок 7). Структура биопленки, полученная на поверхности ЖПС представляла собой плотные переплетения кордов (рисунок 8), корд-формирование в моделируемом образце отличалось большей интенсивностью в сравнении с контрольным (рисунок 9).

Таким образом, обработка инокулята M. tuberculosis раствором полоксамера-407 предлагаемым способом стимулировала формирование биопленочного фенотипа в процессе культивирования МБТ в среде Middlebrook 7H9.

Вариант 3. Модель формирования биопленок M. tuberculosis с использованием в качестве ПАВ Твин-80.

Необходимые материалы (дополнительно, кроме общих для всех вариантов модели):

1. Твин-80 (синонимы: Tween 80, Polyoxyethylenesorbitan monooleate, Polyethylene glycol sorbitan monooleate, Polysorbate 80, POE (20) sorbitan monooleate), вязкая жидкость. CAS Number: 9005-65-6. Уровень качества: MQ 200 по системе ISO 9001.

Биоплёнки M. tuberculosis в данном варианте модели получают следующим путем:

1. Приготовить 10% w/v водный раствор Твин-80 (исходный раствор): к 100 мг Твина-80, добавить 1,0 мл дистиллированной воды, перемешать до полного растворения, стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. Исходный раствор можно использовать в течение 3 месяцев, температура хранения 2-8⁰С. Для получения биопленки нами использовалась обработка суспензии M. tuberculosis Твин-80 в диапазоне концентраций 0,05-2,0% w/v; установлено, что концентрация 0,1% является оптимальной по критериям скорости формирования микобактериальной пленки на поверхности жидкой среды, а также по способности M. tuberculosis к формированию корд-трансформированных колоний на поверхности агара.

2. Приготовить требуемый объем ПС Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment в соответствии с инструкциями производителя.

3. Приготовить суспензию МБТ требуемого объема и концентрации вышеописанным способом (стр 8, п.2).

4. Получение биопленки M. tuberculosis (пример):

4.1. Обработка суспензии МБТ стимулятором биопленкоформирования: к 990 мкл суспензии МБТ добавить 10 мкл исходного раствора Твин-80, перемешать на вортексе в течение 30 секунд, затем - инкубировать при 35-37⁰С в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 150-200 об/мин.

4.2. Получение биопленки: 200 мкл обработанного инокулята МБТ засеять в 1,8-2,0 мл готовой питательной среды Middlebrook 7H9. Посевы инкубировать в стандартных условиях статичного культивирования при 37⁰С в течение 7-30 дней. Сроки инкубации определяются задачами моделирования; экстенсивность формирования и размеры биопленки M. tuberculosis прямо пропорциональны срокам инкубации и концентрации МБТ в исходной суспензии.

Результаты формирования биопленок МБТ, полученные нами в третьем варианте модели представлены в таблице 3, на рисунках 10-13.

Таблица 3. Сроки и динамика формирования биопленки M. tuberculosis H₃₇Rv в ЖПС Middlebrook 7H9 после 24-часовой обработки Твин-80 в концентрации 0,1%

Сутки
инкубации Фенотипические признаки роста / формирования биопленки Моделируемый образец (обработанный инокулят M. tuberculosis) Контрольный образец
(необработанный инокулят M. tuberculosis) 5-6 Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний Видимого роста нет 7-8 Придонный тонкопленочный (полупрозрачная пленка) рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 9-10 Придонный тонкопленочный рост, полностью покрывающий дно лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 12-13 Обильный (непрозрачный) придонный пленочный рост Придонный рост в виде мелких хлопьев, покрывающий <50% дна лунки 15-17 Придонный мелкохлопьевидный рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки 20-21 Появление пленочного роста на поверхности среды Придонный рост, покрывающий> 75% дна лунки 22-25 Формирование пленки толщиной до 0,5 мм

В данном варианте модели обработка инокулята M. tuberculosis 0,1% раствором Твин-80 приводила к более быстрому появлению роста (на 2-3 суток в сравнении с контролем), формированию придонной биопленки (на 5-6 суток быстрее контроля) и биопленки на поверхности ЖПС (на 7-10 суток быстрее контроля) (таблица 3, рисунок 10).

На поверхности агаровой среды помимо выраженной корд-трансформации колоний МБТ (рисунок 11, Г, В) наблюдался другой, отличный от типичного (рисунок 2) морфотип колоний – распространяющийся по поверхности агара, “стелющийся” рост (рисунок 11, А, Б) приводивший к быстрому слиянию колоний между собой и быстрому же, в течение 6-10 суток распространению роста МБТ на всю поверхность агаровой среды. При этом во внутренней структуре данного морфотипа микобактериальных колоний хорошо просматривается наличие кордов (рисунок 11, А, Б, В). Т.о, данный морфотип колоний M. tuberculosis следует рассматривать как разновидность биопленочного фенотипа МБТ. Внутренняя структура биопленок M. tuberculosis, как и в предыдущих вариантах модели, представляла собой сеть многочисленных переплетений кордов (рисунок 12), длина и интенсивность формирования которых в моделируемом образце была значительно более выражена, чем в контрольном (рисунок 13).

Таким образом, обработка инокулята M. tuberculosis Твин-80 вышеописанным способом также оказала стимулирующий эффект на формирование биопленочного фенотипа M. tuberculosis в данном варианте модели.

Вариант 4. Модель формирования биопленок M. tuberculosis с использованием в качестве ПАВ тилоксапола.

Необходимые материалы (дополнительно, кроме общих для всех вариантов модели):

1. Тилоксапол (синонимы: Tyloxapol, 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl) phenol polymer with formaldehyde and oxirane), вязкая жидкость. CAS Number: 25301-02-4. Уровень качества: MQ 300 по системе ISO 9001.

Биоплёнки M. tuberculosis в данном варианте модели получают следующим путем:

1. Приготовить 10% w/v водный раствор тилоксапола (исходный раствор): 1,0 г тилоксапола и 9,0 мл дистиллированной воды подогреть отдельно до 55⁰С. Добавить тилоксапол в воду, перемешать вращением, продолжить нагревание смеси до полного растворения. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. Исходный раствор можно использовать в течение 6 месяцев, хранить при 4⁰С, предохраняя от воздействия света и воздуха, например, в герметичном темном флаконе. Можно использовать коммерческий 10% водный раствор тилоксапола (Tyloxapol (10%) water solution). Для получения биопленки нами использовалась обработка суспензии M. tuberculosis тилоксаполом в диапазоне концентраций 0,05-2,0% w/v; установлено, что концентрация 0,05% является оптимальной по критериям скорости формирования микобактериальной пленки на поверхности среды и выраженности морфологических характеристик биопленочного фенотипа M. tuberculosis – кордообразованию, в т. ч. на поверхности агара.

2. Приготовить требуемый объем ПС Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment в соответствии с инструкциями производителя.

3. Приготовить суспензию МБТ требуемого объема и концентрации вышеописанным способом (стр 8, п.2).

4. Получение биопленки M. tuberculosis (пример):

4.1. Обработка суспензии МБТ стимулятором биопленкоформирования: к 995 мкл суспензии МБТ добавить 5 мкл исходного раствора тилоксапола, перемешать на вортексе в течение 30 секунд, затем - инкубировать при комнатной температуре (18-23⁰С) в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 150-200 об/мин.

4.2. Получение биопленки: 200 мкл обработанного инокулята МБТ засеять в 1,8-2,0 мл готовой питательной среды Middlebrook 7H9. Посевы инкубировать в стандартных условиях статичного культивирования при 37⁰С в течение 10-30 суток. Сроки инкубации определяются задачами моделирования; экстенсивность формирования и толщина биопленки M. tuberculosis прямо пропорциональны срокам инкубации и концентрации МБТ в исходной суспензии.

Результаты формирования биопленок МБТ, полученные в четвертом варианте модели представлены в таблице 4, на рисунках 14-17.

Таблица 4. Сроки и динамика формирования биопленки M. tuberculosis H₃₇Rv в ЖПС Middlebrook 7H9 после обработки инокулята тилоксаполом в концентрации 0,05%

Сутки
инкубации Фенотипические признаки роста / формирования биопленки Моделируемый образец (обработанный инокулят M. tuberculosis) Контрольный образец
(необработанный инокулят M. tuberculosis) 5-6 Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний Видимого роста нет 7-8 Придонный тонкопленочный (полупрозрачная пленка) рост, покрывающий < 25% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 9-10 Придонный тонкопленочный (полупрозрачная пленка) рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 11-13 Придонный тонкопленочный рост, полностью покрывающий дно лунки Придонный рост в виде мелких хлопьев, покрывающий <25% дна лунки 14-17 Обильный (непрозрачный) придонный пленочный рост Придонный мелкохлопьевидный рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки 19-21 Появление пленочного роста на поверхности среды Придонный тонкопленочный рост, покрывающий дно лунки 23-25 Формирование пленки толщиной до 0,5 мм

Сроки формирования биопленки M. tuberculosis в четвертом варианте модели опережали на 8-10 суток по сравнению с контрольным образцом формирование придонного и поверхностного пленочного роста M. tuberculosis в среде Middlebrook 7H9 (таблица 4, рисунок 14). На поверхности агаровой среды, как и в третьем варианте модели, наблюдалось образование колоний M. tuberculosis двух морфотипов – быстро распространяющийся по поверхности, стелющийся рост с наличием кордов (рисунок 15, А, Б, В) и колонии с выраженной корд-трансформацией (рисунок 15, Г, Д, Е). На рисунке 16 показан фрагмент биопленки, полученной в данном варианте модели, состоящий из конгломератов кордов разной плотности, рисунок 17 демонстрирует существенно более высокую интенсивность корд-формирования M. tuberculosis в моделируемом образце в сравнении с контрольным.

Таким образом, предварительная обработка инокулята M. tuberculosis тилоксаполом предлагаемым способом оказывает выраженное БП-стимулирующее действие в данном варианте модели.

Вариант 5. Модель формирования биопленок M. tuberculosis с использованием в качестве ПАВ n-октил-β-D-глюкопиранозида.

Необходимые материалы (дополнительно, кроме общих для всех вариантов модели):

1. n-октил-β-D-глюкопиранозид (синонимы: n-Octyl-β-D-glucopyranoside, n-Octyl glucoside, OGP), порошок. CAS Number: 29836-26-8. Квалификация: чистый (purum).

Биоплёнки M. tuberculosis в данном варианте модели получают следующим путем:

1. Приготовить 10% w/v водный раствор n-октил-β-D-глюкопиранозида (исходный раствор): 100 мг порошка растворить в 1 мл дистиллированной воды, встряхивать на вортексе до полного растворения. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. Исходный раствор можно использовать в течение 3 месяцев, температура хранения 2-8⁰С. Для получения биопленки нами тестировалась обработка суспензии M. tuberculosis n-октил-β-D-глюкопиранозидом в диапазоне концентраций 0,1-2,0% w/v; установлено, что по критериям скорости биопленкоформирования M. tuberculosis на поверхности жидкой среды и по способности к образованию корд-трансформированных колоний на поверхности агара оптимальными является обработка 0,5% w/v раствором OGP с последующей отмывкой.

2. Приготовить требуемый объем ПС Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment в соответствии с инструкциями производителя.

3. Приготовить суспензию МБТ требуемого объема и концентрации вышеописанным способом (стр 8., п.2).

4. Получение биопленки M. tuberculosis (пример):

4.1. Обработка суспензии МБТ стимулятором биопленкоформирования: к 950 мкл суспензии МБТ добавить 50 мкл исходного раствора n-октил-β-D-глюкопиранозида, перемешать на вортексе в течение 30 секунд, инкубировать при комнатной температуре (18-23⁰С) в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 150-200 об/мин. По завершении инкубации суспензию центрифугировать при 15000 об/мин в течение 5 минут или при 10000 об/мин в течение 7 минут, удалить супернатант, полученный осадок ресуспендировать в среде Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment. Повторить цикл центрифугирование-удаление супернатанта-ресуспендирование.

4.2. Получение биопленки: 200 мкл обработанного вышеописанным способом инокулята МБТ засеять в 1,8-2,0 мл готовой питательной среды Middlebrook 7H9. Посевы инкубировать в стандартных условиях статичного культивирования при 37⁰С в течение 10-30 суток. Сроки инкубации определяются задачами моделирования; экстенсивность формирования на поверхности среды и толщина биопленки M. tuberculosis прямо пропорциональны срокам инкубации и концентрации МБТ в исходной суспензии.

Результаты формирования биопленок МБТ, полученные нами в пятом варианте модели представлены в таблице 5, на рисунках 18-21.

Таблица 5. Сроки и динамика формирования биопленки M. tuberculosis H₃₇Rv в ЖПС Middlebrook 7H9 после обработки инокулята n-Октил-β-D-глюкопиранозидом в концентрации 0,5%

Сутки
инкубации Фенотипические признаки роста / формирования биопленки Моделируемый образец (обработанный инокулят M. tuberculosis) Контрольный образец
(необработанный инокулят M. tuberculosis) 5-6 Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний Видимого роста нет 7-8 Придонный рост в виде мелких хлопьевидных колоний, покрывающий ≈ 50% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 9-10 Придонный рост, полностью покрывающий дно лунки Слабовыраженный придонный рост 13-14 Появление пленочного роста на поверхности среды Придонный рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки 16-18 Тонкопленочный рост, полностью покрывающий поверхность ПС Придонный рост, почти полностью покрывающий дно лунки 21-24 Выраженный (грубая пленка, толщиной ≥1,0 мм) пленочный рост Придонный рост, появление пленки на поверхности ПС

В пятом варианте модели заявляемой модели предварительная обработка инокулята M. tuberculosis n-октил-β-D-глюкопиранозидом позволяла получить биопленку на поверхности ЖПС на 7-10 суток раньше, чем в контрольном образце (таблица 5) – через 21 сутки культивирования формировалась выраженная МБТ-биопленка толщиной более 1 мм (рисунок 18). На поверхности агаровой среды образование колоний M. tuberculosis, стимулированных данным ПАВ, также сопровождалось выраженной корд-трансформацией (рисунок 19). Интенсивность корд-формирования в M. tuberculosis в ЖПС была более выраженной, чем в контроле (рисунок 21), сформированная на поверхности ЖПС биопленка представляла собой густую сеть кордов (рисунок 20).

Таким образом, предварительная обработка инокулята МБТ n-октил-β-D-глюкопиранозидом предлагаемым способом оказывала стимулирующий эффект на формирование БП-фенотипа M. tuberculosis в ЖПС и в пятом варианте модели.

Вариант 6. Модель формирования биопленок M. tuberculosis с использованием в качестве ПАВ n-додецил-D–beta-мальтозида.

Необходимые материалы (дополнительно, кроме общих для всех вариантов модели):

1. n-додецил-D-β-мальтозид (синонимы: n-Dodecyl-β-D-maltoside, DDM, Lauryl-β-D-maltoside), порошок. CAS Number: 69227-93-6. Квалификация: химически чистый (purissimum).

Биоплёнки M. tuberculosis в данном варианте модели получают следующим путем:

1. Приготовить 10% w/v водный раствор n-додецил-D–β-мальтозида (исходный раствор): 100 мг порошка растворить в 1 мл охлажденной до 4-5⁰С дистиллированной воды, встряхивать на вортексе до полного растворения. Стерилизовать фильтрованием через мембранный фильтр с размером пор не более 0,22 мкм. Исходный раствор можно использовать в течение 6 месяцев, температура хранения - -20⁰С, повторно не замораживать. Для получения биопленки нами тестировалась обработка суспензии M. tuberculosis n-додецил-D-β-мальтозидом в диапазоне концентраций 0,05-1,0% w/v; установлено, что по критериям скорости формирования биопленки M. tuberculosis на поверхности жидкой среды и по способности к образованию корд-трансформированных колоний на поверхности агара оптимальными является обработка 1,0% w/v раствором DDM с последующей отмывкой.

2. Приготовить требуемый объем ПС Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment в соответствии с инструкциями производителя.

3. Приготовить суспензию МБТ требуемого объема и концентрации вышеописанным способом (стр 8, п.2).

4. Получение биопленки M. tuberculosis (пример):

4.1. Обработка суспензии МБТ стимулятором биопленкоформирования: к 900 мкл суспензии МБТ добавить 100 мкл исходного раствора n-додецил-D–β-мальтозида, перемешать на вортексе в течение 30 секунд, инкубировать при комнатной (18-23⁰С) температуре в течение 24 часов при постоянном перемешивании при 150-200 об/мин. По завершении инкубации суспензию центрифугировать при 15000 об/мин в течение 5 минут или при 10000 об/мин в течение 7 минут, удалить супернатант, полученный осадок ресуспендировать в среде Middlebrook 7H9 с 10% Middlebrook ADC Enrichment. Повторить цикл центрифугирование-удаление супернатанта-ресуспендирование.

4.2. Получение биопленки: 200 мкл обработанного вышеописанным способом инокулята МБТ засеять в 1,8-2,0 мл готовой питательной среды Middlebrook 7H9. Посевы инкубировать в стандартных условиях статичного культивирования при 37⁰С в течение 10-30 суток. Сроки культивирования определяются задачами моделирования; экстенсивность формирования на поверхности среды и толщина биопленки M. tuberculosis прямо пропорциональны срокам инкубации и концентрации МБТ в исходной суспензии.

Результаты формирования биопленок M. tuberculosis, полученные нами в шестом варианте модели представлены в таблице 6, на рисунках 22-25.

Таблица 6. Сроки и динамика формирования биопленки M. tuberculosis H₃₇Rv в ЖПС Middlebrook 7H9 после обработки n-додецил-D–β-мальтозидом в концентрации 1,0%

Сутки
инкубации Фенотипические признаки роста / формирования биопленки Моделируемый образец (обработанный инокулят M. tuberculosis) Контрольный образец
(необработанный инокулят M. tuberculosis) 5-6 Появление видимого роста в виде единичных мелких колоний Видимого роста нет 7-9 Придонный рост в виде мелких хлопьевидных колоний, покрывающий ≈ 50% дна лунки Единичные мелкие колонии на дне лунки 10-12 Придонный рост, полностью покрывающий дно лунки Придонный рост, покрывающий < 50% дна лунки 13-15 Появление пленочного роста на поверхности среды Придонный рост, покрывающий ≈ 50% дна лунки 17-18 Тонкопленочный рост, полностью покрывающий поверхность ПС Придонный рост, почти полностью покрывающий дно лунки 22-25 Выраженный (толщиной ≈ 0,5-1,0 мм) пленочный рост Придонный рост, появление пленки на поверхности ПС

Результаты шестого варианта моделирования, как и в предыдущих вариантах модели, характеризовались ускорением сроков формирования биопленки на поверхности ЖПС Middlebrook 7H9 на 8-10 суток в сравнении с контрольным образцом (таблица 6, рисунок 22), выраженной корд-трансформацией колоний M. tuberculosis, формируемых на поверхности агара после обработки инокулята данным ПАВ (рисунок 23), значительно более выраженной по сравнению с контролем интенсивностью корд-формирования M. tuberculosis в ЖПС (рисунок 25) и характерной структурой сформированной на поверхности ЖПС биопленки – в виде плотной сети кордов (рисунок 24).

Таким образом, эффект от предварительной обработки инокулята МБТ n-додецил-D–β-мальтозидом вышеописанным способом, стимулирующий формирование БП-фенотипа M. tuberculosis в ЖПС, имел место и в шестом варианте заявляемой модели.

Представленные выше все шесть вариантов моделирования биопленок M. tuberculosis in vitro демонстрируют, что предварительная обработка инокулята МБТ неионогенными ПАВ оказывает стимулирующее действие на формирование биопленочного фенотипа M. tuberculosis в процессе их культивирования в жидкой питательной среде Middlebrook 7H9, а именно: 1) ускоряет формирования специфического биопленочного роста M. tuberculosis на поверхности среды ≈ на 7-10 суток по сравнению с моделью пелликулярных пленок, прототипом данной группы изобретений; 2) способствует интенсивному формированию кордов МБТ – специфического морфологического субстрата биопленок M. tuberculosis. Предлагаемый способ моделирования является универсальным, и осуществим с ПАВ-ми разных химических классов. Так, метил-β-циклодекстрин является циклическим олигомером глюкозы, полоксамер-407 и тилоксапол представляют собой сополимеры, Твин-80 – производное сорбитана и олеиновой кислоты, n-октил-β-D-глюкопиранозид и n-додецил-D–β-мальтозид – алкилированные моно- и дисахарид соответственно.

Применение неионогенных ПАВ в качестве стимуляторов формирования биопленок M. tuberculosis является принципиальной новым подходом в моделировании биопленок МБТ in vitro. Принцип, на котором основан предлагаемый способ моделирования, может быть применен для разработки новых вариантов моделей биопленок M. tuberculosis in vitro с использованием широкого выбора ПАВ и временных интервалов их экспозиций с микобактериями туберкулеза.

Предлагаемый способ моделирования биопленок M. tuberculosis in vitro является простым в исполнении, позволяет получать биопленки M. tuberculosis в бульонной культуре с минимальными материально-техническими затратами и доступен для любой лаборатории, выполняющей культуральные исследования микобактерий туберкулеза. Использование стандартизированной по составу питательной среды Middlebrook 7H9 промышленного производства позволяет получать модели биопленок M. tuberculosis с высокой воспроизводимостью.

Предлагаемая модель может использоваться для исследований in vitro с целью изучения физических, молекулярно-генетических, биохимических, морфологических и других характеристик M. tuberculosis в составе биопленок, закономерностей и особенностей процессов их формирования, поиска способов эффективного бактерицидного воздействия на биопленочные формы М. tuberculosis различных антибактериальных агентов (антибиотиков, дезинфектантов, физических факторов среды и т.п.), а также применяться в клинике туберкулеза для тестирования лекарственной чувствительности M. tuberculosis к противотуберкулезным препаратам.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment, при этом проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации суспензии в присутствии 25мМ/л метил-β-циклодекстрина, или полоксамера-407 в концентрации 2,0% w/v, или твин-80 в концентрации 0,1% w/v, или тилоксапола в концентрации 0,05% w/v, или n-октил-β-D-глюкопиранозида в концентрации 0,5% w/v, или n-додецил-D-β-мальтозида в концентрации 1,0% w/v при заданной температуре в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин (варианты). Изобретения обеспечивают расширение арсенала способов моделирования биопленок микобактерий туберкулеза для изучения физических, молекулярно-генетических, биохимических, морфологических и других характеристик M. tuberculosis в составе биопленок и для тестирования их лекарственной чувствительности к противотуберкулезным препаратам. 6 н.п. ф-лы, 25 ил., 6 табл.

1. Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment и отличающийся тем, что проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации в присутствии 25мМ/л метил-β-циклодекстрина суспензии при температуре 35-37°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин.

2. Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment и отличающийся тем, что проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации в присутствии полоксамера-407 в концентрации 2,0% w/v суспензии при температуре 18-23°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин.

3. Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment и отличающийся тем, что проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации в присутствии твин-80 в концентрации 0,1% w/v суспензии при температуре 35-37°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин.

4. Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment и отличающийся тем, что проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации в присутствии тилоксапола в концентрации 0,05% w/v суспензии при температуре 18-23°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин.

5. Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment и отличающийся тем, что проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации в присутствии n-октил-β-D-глюкопиранозида в концентрации 0,5% w/v суспензии при температуре 18-23°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин с последующей отмывкой центрифугированием.

6. Способ моделирования биопленок Mycobacterium tuberculosis in vitro, заключающийся в получении биопленок Mycobacterium tuberculosis в интервале между 7-30 сут статичного культивирования их в жидкой питательной среде Middlbrook 7H9 с обогащающей добавкой Middlebrook ADC Enrichment и отличающийся тем, что проводят предварительную культивированию обработку инокулируемой суспензии M. tuberculosis посредством инкубации в присутствии n-додецил-D-β-мальтозида в концентрации 1,0% w/v суспензии при температуре 18-23°С в течение 24 ч при постоянном перемешивании 150-200 об/мин с последующей отмывкой центрифугированием.