Способ получения антигена для определения противобруцеллезного иммунитета Российский патент 2017 года по МПК A61K39/10 A61P31/00 

Предлагаемое изобретение относится к области биотехнологии, а именно к получению биологически активных веществ из микроорганизмов и может использоваться для изготовления диагностикумов с целью контроля иммуногенности противобруцеллезных вакцин.

Известны способы получения бруцеллезных антигенов путем экстракции их из бактериальной массы химическими реагентами фенолом (Proc. Soc. Exp. Biol. 1961, - v. 106, - N 4, - р. 748-752; International symposium on Brucellosis. Develop. Biol. Standart-Rabat, - 1975, - v. 31, - p. 68-91), эфиром (Jornal Bactereology. - 1962, - v. 94, - N 2, - p. 256-268), трихлоруксусной кислотой (Jornal Bacteriology - 1965, - v. 90, - p. 895-902).

Известен способ получения бруцеллезного антигена, включающий накопление бактериальной массы, получение из нее ацетонового порошка, уксуснокислый гидролиз этого порошка при 100°С, отделение гидролизованной бакмассы от супернатанта и осаждение антигена этиловым спиртом на холоду (Авторское свидетельство СССР №467933 1972 г.). Все антигены получаемые вышеописанными способами представляют собой комплексные вещества поверхностного слоя клеточной стенки бруцелл и используются для разработки противобруцеллезных вакцин (Гадельшин И.А. Автореферат дис.кан. мед. наук. - Алма-Ата. - 1986 г, с. 20).

Наиболее близким аналогом, который можно взять за прототип, является способ получения бруцеллезного антигена из штамма Brucella abortus 19 для изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК, заключающийся в культивировании расплодки штамма Brucella abortus 19 на плотной питательной среде, с последующим выращиванием в жидкой питательной среде, содержащей перевар Хоттингера, глицерин, глюкозу, дрожжевой экстракт и воду, концентрирование бакмассы штамма и очистку ее методом ультрафильтрации с последующей инактивацией бакмассы - антигена при температуре 80°С в течение часа (патент на изобретение №2085212, 1996 г.).

Однако данный антиген не позволяет достоверно определять уровень иммунитета у животных, а лишь констатирует факт контакта животного с бруцеллами вакцинных или полевых штаммов находящимися в S-форме, так как то же содержит основной компонент клеточной стенки бруцелл - липополисахарид. Специфические антитела, выявляемые бруцеллезными диагностикумами, состоящими преимущественно из липополисахаридов клеточной стенки бруцелл, не могут являться в полной мере количественным показателем иммунного состояния организма, так как, при бруцеллезной инфекции это показатель, не совпадает с реальным уровнем иммунитета выявляемым по результатам экспериментального заражения. (Физиология и патология иммунной системы. 2006, т. 10, №8, с. 3-7; Патогенез и иммунология бруцеллеза М.: Медицина, 1974, с. 79-148).

Микроорганизмы имеют ряд антигенных детерминант. В результате неоднородности биохимической структуры, некоторые из них выступают в качестве сильных антигенов (липополисахарид грамотрицательных бактерий), другие же, отвечающие за протективный эффект индуцируют менее значительный антигенный стимул. Все это приводит к тому, что при многих заболеваниях, в частности при бруцеллезе, в наибольшем титре стандартными диагностикумами выявляются антитела комплементарные к структурным компонентам, которые не являются необходимыми для жизнедеятельности микроорганизма. Блокирование агглютинирующими и комплемент связывающими антителами таких антигенных макромолекул мало отражается на жизнеспособности возбудителя. Поэтому в подобных случаях отсутствует корреляция между титром специфических антител и протективным эффектом, проверяемым в остром опыте методом экспериментального заражения.

Кроме того, при иммунизации животных слабоагглютиногенными или неагглютиногенными вакцинами антитела, образующиеся на их введение, не выявляются или выявляются коммерческими диагностикумами в очень низких титрах.

Задачей изобретения является получение антигена из бруцелл, при помощи которого можно осуществлять объективный мониторинг уровня иммунитета индуцируемого у животных в ответ на введение противобруцеллезных вакцин без использования экспериментального заражения.

Поставленная задача решается тем, что культуру бруцелл выращивают на твердой питательной среде в течение 2-х суток, после чего смывают физиологическим раствором и помещают в жидкую питательную среду содержащую натрий хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий паровиноградокислый, аммоний сернокислый, натрий лимоннокислый, натрий сернокислый, азотнокислое железо, сернокислый магний, глюкозу, эритритол, глицин, дистиллированную воду.

Культивирование ведут при температуре 39-40 в течение 24 часов с последующим повышением температуры до 45-50 в течение 6 часов и повышением температуры до 60 градусов в течение 1-2 часов. После окончания культивирования бактериальную массу отделяют, а из культуральной жидкости методом ультрафильтрации или хроматографии получают бруцеллезный антиген представляющий собой вещество в котором определяются сахара по методу Дюбуа до 40% (Anal. Chem. 1956. v. 28, - Р. 350-356), белки по методу по Лоури до 30% (J. Biol. Chem. 1951, v. 193, Р. 265-275) и нуклеотиды спектрофотометрическим методом до 20%. (World Health Organization Expert Commitee on Biological Standartion 1977,Technical Report Series 610. World Health Organization, Geneva.) с молекулярной массой 10-20 кДа.

Использование полученного антигена в реакции непрямой гемагглютинации, реакции связывания комплемента позволяет определить уровень антител отражающий уровень противобруцеллезного иммунитета.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм В. abortus 19 выращивают двое суток на 5 матрах с твердой питательной средой - мясопептонно-печеночном агаре. Двухсуточную культуру штамма В. abortus 19 смывают с матр и помещают в реактор с 1000 мл мясопептонно-печоночного-глюкозо-глицеринового бульона с рН 7,0 и культивируют при температуре 39°С при постоянном перемешивании и аэрации до достижения стационарной фазы роста или концентрации 30-50 млрд. микробных клеток. Через 24 часа температуру поднимают до 45°С и культивируют в течение 6 часов. После чего температуру вновь повышают до 60°С и продолжают культивирование в течение 2 часов. Через 2 часа бактериальную массу отделяют. Полученный супернатант подвергают фильтрации через стерилизующий фильтр. Фильтрат лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 100 мл дистиллированной воды и в него вливают 300 мл охлажденного до +4°С этанола. Смесь фильтрата и этанола выдерживают в течение 24 часов при температуре +4°С. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 3 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кДа. Фильтрат вновь лиофилизируют. Получено 65 мг антигена, содержащего сахара 20%, белки 25% и нуклеотиды 36%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 2. Штамм В. abortus 19 выращивают двое суток на 5 матрах с твердой питательной средой - Brucella Agar Base Himedia. Двухсуточную культуру штамма В. abortus 19 смывают с матр и помещают в реактор с 1000 мл питательного бульона для культивирования микроорганизмов (ГРМ-бульон) с рН 7,2 и культивируют при температуре 39°С при постоянном перемешивании и аэрации до достижения стационарной фазы роста или концентрации 30-50 млрд. микробных клеток. Через 24 часа температуру поднимают до 45°С и культивируют в течение 6 часов. После чего температуру вновь повышают до 60°С и продолжают культивирование в течение 2 часов. Через 2 часа бактериальную массу отделяют. Полученный супернатант подвергают фильтрации через стерилизующий фильтр. Фильтрат лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 100 мл дистиллированной воды и в него вливают 300 мл охлажденного до +4°С этанола. Смесь фильтрата и этанола выдерживают в течение 24 часов при температуре +4°С. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 3 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кДа. Фильтрат вновь лиофилизируют. Получено 65 мг антигена, содержащего сахара 8%, белков 45% и нуклеотидов 40%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 3. Штамм В. abortus 19 выращивают двое суток на 5 матрах с твердой питательной средой - мясо-пептонно-печеночном агаре. Двухсуточную культуру штамма В. abortus 19 смывают с матр и помещают в реактор с 1000 мл питательной среды 199 с рН 7,0 и культивируют при температуре 39°С при постоянном перемешивании и аэрации до достижения стационарной фазы роста или концентрации 15-20 млрд. микробных клеток. Через 24 часа температуру поднимают до 45°С и культивируют в течение 6 часов. После чего температуру вновь повышают до 60°С и продолжают культивирование в течение 2 часов. Через 2 часа бактериальную массу отделяют. Полученный супернатант подвергают фильтрации через стерилизующий фильтр. Фильтрат лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 100 мл дистиллированной воды и в него вливают 300 мл охлажденного до +4°С этанола. Смесь фильтрата и этанола выдерживают в течение 24 часов при температуре +4°С. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 3 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кДа. Фильтрат вновь лиофилизируют. Получено 80 мг антигена, содержащего сахара 10%, белки 30% и нуклеотиды 40%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 4. Штамм В. abortus 19 выращивают двое суток на 5 матрах с твердой питательной средой - мясопептонно-печеночном агаре. Двухсуточную культуру штамма В. abortus 19 смывают с матр и помещают в реактор с 1000 мл жидкой питательной среде содержащей перевар Хоттингера 25 мас. %, глицерин 1 мас. %, глюкозу 1 мас. %, дрожжевой экстракт 15 мас. %, Натрий хлористый 0,4 мас. % и воду до 100% с рН 7,2 и культивируют при температуре 39°С при постоянном перемешивании и аэрации до достижения стационарной фазы роста или концентрации 30-60 млрд. микробных клеток. Через 24 часа температуру поднимают до 45°С и культивируют в течение 6 часов. После чего температуру вновь повышают до 60°С и продолжают культивирование в течение 2 часов. Через 2 часа бактериальную массу отделяют. Полученный супернатант подвергают фильтрации через стерилизующий фильтр. Фильтрат лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 100 мл дистиллированной воды и в него вливают 300 мл охлажденного до +4°С этанола. Смесь фильтрата и этанола выдерживают в течение 24 часов при температуре +4°С. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 3 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кДа. Фильтрат вновь лиофилизируют. Получено 120 мг антигена, содержащего сахара 20%, белки 40% и нуклеотиды 35%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 5. Штамм В. abortus 19 выращивают двое суток на 5 матрах с твердой питательной средой - мясопептонно-печеночном агаре. Двухсуточную культуру штамма В. abortus 19 смывают с матр и помещают в реактор с 1000 мл жидкой питательной среды при следующем соотношении компонентов (мас %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,02; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,003; глюкоза - 1; эритритол - 0,3; глицин - 0,03; дистиллированная вода до 100. рН 5,5 и культивируют при температуре 39°С при постоянном перемешивании и аэрации до достижения стационарной фазы роста или концентрации 30-50 млрд. микробных клеток. Через 24 часа температуру поднимают до 45°С и культивируют в течение 6 часов. После чего температуру вновь повышают до 60°С и продолжают культивирование в течение 2 часов. Через 2 часа бактериальную массу отделяют. Полученный супернатант подвергают фильтрации через стерилизующий фильтр. Фильтрат лиофилизируют при общепринятых режимах. Высушенный препарат растворяют в 100 мл дистиллированной воды и в него вливают 300 мл охлажденного до +4°С этанола. Смесь фильтрата и этанола выдерживают в течение 24 часов при температуре +4°С. Выпавший осадок отделяют от жидкой фазы центрифугированием при 3 тыс. g в течение 20 минут. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде и подвергают ультрафильтрации через мембрану с размером пор 30 кДа. Фильтрат вновь лиофилизируют. Получено 350 мг антигена, содержащего сахара 10%, белки 50% и нуклеотиды 30%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 6. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 40°С в течение 18 часов, после чего температуру повышают до 50 градусов и культивируют в течение 10 часов, через 10 часов температуру повышают на один час до 60°С. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 320 мг антигена, содержащего сахара 11%, белки 48% и нуклеотиды 34%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 7. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 12 часов, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 6 часов, через 6 часов температуру повышают на один час до 60°С. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 240 мг антигена, содержащего сахара 14%, белки 45% и нуклеотиды 32%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 8. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 36 часов, после чего температуру повышают до 50 градусов и культивируют в течение 10 часов, через 10 часов температуру повышают на один час до 60°С. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 210 мг антигена, содержащего сахара 9%, белки 52% и нуклеотиды 17%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 9. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 37,5°С в течение 24 часа, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 8 часов, через 8 часов температуру повышают до 60°С на два часа. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 300 мг антигена, содержащего сахара 12%, белки 41% и нуклеотиды 23%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 10. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 50°С в течение 24 часов, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 8 часов. Через 8 часов температуру повышают на один час до 60°С. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 210 мг антигена, содержащего сахара 18%, белки 50% и нуклеотиды 12%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 11. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 24 часа, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 2 часов, через 2 часа температуру повышают до 60 С на один час. Далее проводят выделение антигена как описано в примере 5. Получено 170 мг антигена, содержащего сахара 19%, белки 48% и нуклеотиды 24%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 12. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 24 часов, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 15 часов, через 15 часов температуру повышают до 60°С на два часа. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 140 мг антигена, содержащего сахара 12%, белки 50% и нуклеотиды 26%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 13. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 20 часов, после чего температуру повышают до 60 градусов и культивируют в течение 6 часов. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 90 мг антигена, содержащего сахара 20%, белки 41% и нуклеотиды 10%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 14. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 10 часов, после чего температуру повышают до 60 градусов и культивируют в течение 12 часов. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 40 мг антигена, содержащего сахара 15%, белки 45% и нуклеотиды 17%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 15. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 37,5°С в течение 24 часов, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 6 часов, через 6 часов температуру доводят до 70°С и выдерживают два часа. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 150 мг антигена, содержащего сахара 10%, белки 37% и нуклеотиды 41%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 16. Аналогичен примеру 5, однако культивирование в жидкой среде ведут при температуре 39°С в течение 24 часа, после чего температуру повышают до 45 градусов и культивируют в течение 6 часов, через 6 часов температуру повышают до 60°С и выдерживают в течение пяти часов. Далее проводят выделение антигена, как описано в примере 5. Получено 130 мг антигена, содержащего сахара 12%, белки 39% и нуклеотиды 36%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 17. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,1; калий фосфорнокислый однозамещенный - 3,0; натрий паровиноградокислый - 3; аммоний сернокислый - 0,3; натрий лимоннокислый - 0,3; натрий сернокислый - 0,04; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,005; глюкоза - 1; эритритол - 0,5; глицин - 0,04; дистиллированная вода до 100. Получено 306 мг антигена, содержащего сахара 8%, белки 44% и нуклеотиды 23%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 18. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,8; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,0; натрий паровиноградокислый - 1; аммоний сернокислый - 0,1; натрий лимоннокислый - 0,1; натрий сернокислый - 0,01; азотнокислое железо - 0,0001; сернокислый магний - 0,001; глюкоза - 1; эритритол - 0,2; глицин - 0,01; дистиллированная вода до 100. Получено 290 мг антигена, содержащего сахара 9%, белки 52% и нуклеотиды 19%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 19. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 4,0; натрий паровиноградокислый - 4; аммоний сернокислый - 0,5; натрий лимоннокислый - 0,5; натрий сернокислый - 0,06; азотнокислое железо - 0,0001; сернокислый магний - 0,01; глюкоза - 3; эритритол - 0,8; глицин - 0,06; дистиллированная вода до 100. Получено 140 мг антигена, содержащего сахара 20%, белки 30% и нуклеотиды 27%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 20. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1,5; натрий паровиноградокислый - 3; аммоний сернокислый - 0,3; натрий лимоннокислый - 0,05; натрий сернокислый - 0,05; азотнокислое железо - 0,0005; сернокислый магний - 0,008; глюкоза - 0,5; эритритол - 0,1; глицин - 0,005; дистиллированная вода до 100. Получено 165 мг антигена, содержащего сахара 4%, белки 41% и нуклеотиды 29%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 21. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 3; аммоний сернокислый - 0,1; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,01; азотнокислое железо - 0,0001; сернокислый магний - 0,001; глюкоза - 1; эритритол - 0,4; глицин - 0,003; дистиллированная вода до 100. Получено 270 мг антигена, содержащего сахара 5%, белки 46% и нуклеотиды 24%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 22. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,5; натрий паровиноградокислый - 1; аммоний сернокислый - 0,3; натрий лимоннокислый - 0,3; натрий сернокислый - 0,02; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,0021; глюкоза - 2; эритритол - 0,3; глицин - 0,03; дистиллированная вода до 100. Получено 240 мг антигена, содержащего сахара 11%, белки 47% и нуклеотиды 28%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 23. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 3,0; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,1; натрий сернокислый - 0,03; азотнокислое железо - 0,0002; сернокислый магний - 0,001; глюкоза - 2; эритритол - 0,4; глицин - 0,04; дистиллированная вода до 100. Получено 290 мг антигена, содержащего сахара 17%, белки 44% и нуклеотиды 23%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 24. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 3,0; натрий паровиноградокислый - 2; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,03; азотнокислое железо - 0,0002; сернокислый магний - 0,002; глюкоза - 1; эритритол - 0,3; глицин - 0,02; дистиллированная вода до 100. Получено 210 мг антигена, содержащего сахара 4%, белки 39% и нуклеотиды 26%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 25. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,02; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,002; глюкоза - 2; эритритол - 0,2; глицин - 0,02; дистиллированная вода до 100. Получено 280 мг антигена, содержащего сахара 15%, белки 48% и нуклеотиды 21%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 26. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,2; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,003; глюкоза - 2; эритритол - 0,3; глицин - 0,04; дистиллированная вода до 100. Получено 270 мг антигена, содержащего сахара 11%, белки 45% и нуклеотиды 20%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 27. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,03; сернокислый магний - 0,003; глюкоза - 2; эритритол - 0,3; глицин - 0,03; дистиллированная вода до 100. Получено 220 мг антигена, содержащего сахара 19%, белки 43% и нуклеотиды 26%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 28. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,03; азотнокислое железо - 0,001; глюкоза - 2; эритритол - 0,2; глицин - 0,01; дистиллированная вода до 100. Получено 190 мг антигена, содержащего сахара 20%, белки 40% и нуклеотиды 19%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 29. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,03; азотнокислое железо - 0,0001; сернокислый магний - 0,001; эритритол - 0,3; глицин - 0,03; дистиллированная вода до 100. Получено 200 мг антигена, содержащего сахара 6%, белки 49% и нуклеотиды 24%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 30. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2 натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,02; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,002; глюкоза - 2; глицин - 0,02; дистиллированная вода до 100. Получено 230 мг антигена, содержащего сахара 8%, белки 44% и нуклеотиды 27%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 31. Аналогичен примеру 5. Однако жидкая питательная среда содержала следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 2; аммоний сернокислый - 0,2; натрий лимоннокислый - 0,2; натрий сернокислый - 0,02; азотнокислое железо - 0,0003; сернокислый магний - 0,002; глюкоза - 2; эритритол - 0,3; дистиллированная вода до 100. Получено 250 мг антигена, содержащего сахара 13%, белки 42% и нуклеотиды 26%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 32. Аналогичен примеру 5. Однако антиген выделяют из штамма В. abortus 54 и используют жидкую питательную среду содержащую следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,3; калий фосфорнокислый однозамещенный - 2,5; натрий паровиноградокислый - 1; аммоний сернокислый - 0,1; натрий лимоннокислый -0,1; натрий сернокислый - 0,01; азотнокислое железо - 0,0001; сернокислый магний - 0,0001; глюкоза - 1; эритритол - 0,2; глицин - 0,01; дистиллированная вода до 100. Получено 320 мг антигена, содержащего сахара 11%, белки 48% и нуклеотиды 34%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 33. Аналогичен примеру 5. Однако антиген выделяют из штамма В. melitensis 16М и используют жидкую питательную среду содержащую следующее соотношение компонентов (мас. %): натрий хлористый - 0,5; калий фосфорнокислый однозамещенный - 3,0; натрий паровиноградокислый - 3; аммоний сернокислый - 0,3; натрий лимоннокислый - 0,3; натрий сернокислый - 0,04; азотнокислое железо - 0,0005; сернокислый магний - 0,005; глюкоза - 2; эритритол - 0,5; глицин - 0,04; дистиллированная вода до 100. Получено 340 мг антигена, содержащего сахара 12%, белки 45% и нуклеотиды 30%. Результаты биологической активности антигена представлены в таблице 1.

Пример 34. На основе антигена полученного в примерах 1-33 готовят эритроцитарный диагностикум, который используют для постановки реакции непрямой гемагглютинации с сывороткой крови морских свинок иммунизированных полученным антигеном.

Как видно из таблицы 1 наибольший уровень антител в сыворотке крови выявляет эритроцитарный диагностикум полученный сенсибилизацией эритроцитов антигеном полученным в примере 5, 6, 32 и 33.

Пример 35. Морских свинок иммунизируют противобруцеллезными вакцинами. Первую группу животных живой вакциной из штамма 19 в дозе - 1 млрд. м.к.. Вторую группу вакциной из штамма В. abortus 82 в дозе 1 млрд. м.к.. Третью группу - вакциной из штамма В. abortus КВ 17/100 в дозе 0,2 мл (80 млрд. м.к.), четвертую группу вакциной из штамма B. melitensis Rev-1 в дозе 500 тыс. м.к., пятую группу вакциной из штамма В. abortus 75/79 в дозе 2 млрд. м.к.. На 15, 30 и 90 день у животных берут кровь и исследуют в серологических реакциях (РСК, РНГА) с коммерческими антигенами и антигеном полученным предлагаемым способом по примеру 5. С целью установления корреляции между уровнем выявляемых антител и иммуногенностью вакцин, животных через 3 месяца после вакцинации подвергают экспериментальному заражению вирулентным штаммом. Результаты серологических исследований крови и бактериологических исследований животных после заражения представлены в таблицах 2 и 3.

Из таблицы 2 и 3 следует, что уровень антител регистрируемых коммерческими препаратами позволяет судить об агглютиногенности используемой вакцины, что не коррелирует с ее иммуногенностью. В тоже время уровень антител выявляемых диагностикумом с предложенным антигеном коррелирует с иммуногенностью вакцины, что подтверждается бактериологическими исследованиями вакцинированных животных подвергшихся экспериментальному заражению.

Пример 36. Исследуют сыворотку крови от телят иммунизированных противобруцеллезными вакцинами. Первая группа иммунизирована слабоагглютиногенной вакциной (CAB) в дозе 2 мг. Вторая группа - вакциной из штамма В. abortus 19 в дозе 80 млрд. м.к., третья группа - вакциной из штамма В. abortus 82 в дозе 100 млрд. м.к., телята 4-й контрольной группы не иммунизированы.

Динамика уровня антител в сыворотке крови телят, иммунизированных разными противобруцеллезными вакцинами, выявляемых диагностикумом на основе предлагаемого антигена, коррелирует с динамикой развития иммунного ответа в отличие от уровня антител выявляемых коммерческими диагностикумами. Результаты серологических исследований сыворотки крови телят привитых разными противобруцеллезными вакцинами представлены в таблице 4.

Таким образом, представленные эксперименты доказывают возможность получения из бруцелл антигена, позволяющего контролировать иммуногенность противобруцеллезных вакцин, только по результатам серологического исследования без дорогостоящего, длительного и подверженного влиянию субъективных ошибок метода экспериментального заражения.

Предложенный способ получения антигена для определения противобруцеллезного иммунитета апробирован с положительным результатом в экспериментальных условиях на лабораторных и сельскохозяйственных животных. Работы проводили в период с 2009-2016 год на опытной базе ФГБНУ ВИЭВ в Вышнем Волочке.

Антигена для определения противобруцеллезного иммунитета может найти применение для изготовления диагностических тест систем для контроля иммуногенности противобруцеллезных вакцин.

Список литературы

1. Proc. Soc. Exp. Biol. 1961, - v. 106, - N 4, - р. 748-752.

2. International symposium on Brucellosis. Develop. Biol. Standart - Rabat, - 1975, - v. 31, - p. 68-91).

3. Jornal Bactereology. - 1962, -v. 94, - N 2, - p. 256-268.

4. Jornal Bacteriology. - 1965, - v. 90, - p. 895-902.

5. Авторское свидетельство СССР №467933, 1972 г.

6. Гадельшин И.А. / Определение реактогенности, безвредности и антигенной активности бруцеллезной химической вакцины. // Автореферат дисс. кан. мед. наук. - Алма-Ата. - 1986 г., - с. 20).

7. Скичко Н.Д., Мельник Н.В., Зенов Н.И., Тройнин А.С., Алкеева О.С., Каськов А.В., Шумилов К.В., Климанов А.И. / Способ изготовления единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК // Патент №2085212, 1996 г.

8. Федоров А.И., Искандаров М.И., Игнатов П.Е., Альбертян М.П., Нестреляев С.С., Некрасов А.В., Хаитов P.M., Петров Р.В. / Значение гуморального и клеточного иммунитета при бруцеллезе // Физиология и патология иммунной системы. 2006. Т. 10. №8, с. 3-7.

9. Патогенез и иммунология бруцеллеза. М.: Медицина, 1974, с. 79-148.

10. Dubois М., Gilles K.A., Hamilton J.K. Colorimetric method of determination of sugar and related substances // Anal. Chem. – 1956, - v. 28, - p. 350-356.

11. Protein measurement with the Folin phenol reagent / Lowry O.H., Resenbrough N.J., Farr A.L., Randalle R.J. Hi. Biol. Chem. – 1951, - v. 193, - p. 265-275.

12. World Health Organization Expert Commitee on Biological Standartion. 1977, Technical Report Series 610. World Health Organization, Geneva.

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для получения антигена с целью определения противобруцеллезного иммунитета. Способ включает культивирование культуры бруцелл в жидкой питательной среде с последующим выделением целевого продукта. Культивирование ведут при температуре 39-40 в течение 18-24 часов с последующим повышением температуры до 45-50 в течение 6-10 часов и повышением температуры до 60 градусов в течение 1-2 часов с последующей отделением бакмассы и выделением антигена из культуральной среды. Использование данного способа позволяет получить антиген бруцелл, при помощи которого можно осуществлять объективный мониторинг уровня иммунитета индуцируемый у животных в ответ на введение противобруцеллезных вакцин. 1 з.п. ф-лы, 4 табл., 36 пр.

1. Способ получения антигена для определения противобруцеллезного иммунитета, включающий культивирование культуры бруцелл в жидкой питательной среде с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что культивирование ведут при температуре 39-40 °C в течение 18-24 часов с последующим повышением температуры до 45-50 °C в течение 6-10 часов и повышением температуры до 60 °C в течение 1-2 часов с последующим отделением бакмассы и выделением антигена из культуральной среды.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что культивирование проводят в жидкой питательной среде, содержащей натрий хлористый, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий паровиноградокислый, аммоний сернокислый, натрий лимоннокислый, натрий сернокислый, азотнокислое железо, сернокислый магний, глюкозу, эритритол, глицин и дистиллированную воду, при следующем соотношении компонентов, мас. %:

натрий хлористый 0,3-0,4 калий фосфорнокислый однозамещенный 2,5-3,0 натрий паровиноградокислый 1-3 аммоний сернокислый 0,1-03 натрий лимоннокислый 0,1-0,39 натрий сернокислый 0,01-0,04 азотнокислое железо 0,0001-0,0005 сернокислый магний 0,001-0,005 глюкоза 1-2 эритритол 0,2-0,5 глицин 0,01-0,04 дистиллированная вода до 100