Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs1136141 (G>A) гена HSPA8 Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России.

Мозговой инсульт представляет серьезную угрозу для жизни человека и является одной из наиболее частых причин инвалидности и смерти во всем мире [Gorelick P. B. The global burden of stroke: persistent and disabling //The Lancet Neurology. – 2019. – Vol. 18. – №. 5. – P. 417-418]. При этом на ишемический инсульт (ИИ) приходится большая доля случаев инсульта [Gorelick P. B. The global burden of stroke: persistent and disabling //The Lancet Neurology. – 2019. – Vol. 18. – №. 5. – P. 417-418].

С точки зрения генетики, ИИ представляет собой многофакторное заболевание, развивающееся при взаимодействии генетических и средовых факторов риска. Широкомасштабные эпидемиологические исследования доказали, что курение является наиболее значимым средовым фактором развития ИИ [Hackshaw A, Morris JK, Boniface S, Tang JL, Milenković D. Low cigarette consumption and risk of coronary heart disease and stroke: meta-analysis of 141 cohort studies in 55 study reports. BMJ. 2018 Jan 24;360:j5855]. Среди генетических факторов ИИ большое значение отводится генам, кодирующим белки теплового шока (HSPs). Один из наиболее широко изученных HSPs в области нейропротекции - HSP70, поскольку он сильно индуцируются во время ишемического стресса в головном мозге [Doeppner, T.R., Doehring, M., 2017, Dukay, B., Csoboz, B., 2019, Zhan, X. , Андер, Б.П., 2010].

Ген HSPA8 кодирует белок семейства HSP70 и играет ключевую роль в системе контроля качества белков, обеспечивая правильную укладку белков, повторную укладку неправильно свернутых белков и контролируя нацеливание белков на последующую деградацию [Grove D. E. et al. The ER-associated Hsp40 DNAJB12 and Hsc70 cooperate to facilitate RMA1 E3 dependent degradation of nascent CFTRΔF508 //Molecular Biology of the Cell. – 2010]; играет критическую роль в митохондриальном импорте, доставляет препротеины к митохондриальному рецептору импорта TOMM70 [Young J. C., Hoogenraad N. J., Hartl F. U. Molecular chaperones Hsp90 and Hsp70 deliver preproteins to the mitochondrial import receptor Tom70 //Cell. – 2003. – Vol. 112. – №. 1. – С. 41-50]; участвует в пути контроля качества деградации белков [Matsumura Y., Sakai J., Skach W. R. Endoplasmic reticulum protein quality control is determined by cooperative interactions between Hsp/c70 protein and the CHIP E3 ligase //Journal of Biological Chemistry. – 2013. – Т. 288. – №. 43. – С. 31069-31079]. Согласно биоинформатическому ресурсу SNP FuncPred генетический вариант rs1136141 HSPA8 характеризуется высоким регуляторным потенциалом - 0.132 [Xu Z., Taylor J. A. SNPinfo: integrating GWAS and candidate gene information into functional SNP selection for genetic association studies //Nucleic acids research. – 2009. – Vol. 37. – №. suppl_2. – P. W600-W605]. Кроме того, вариантный аллель А-rs1136141 создает участки связывания для 43 транскрипционных факторов [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Эти транскрипционные факторы совместно вовлечены в значимые для этиопатогенеза ИИ биологические процессы, такие как регуляция миграции эндотелиальных клеток кровеносных сосудов (GO:004353), позитивная регуляция ангиогенеза (GO:0045766) [http://geneontology.org/]. Ресурс Comparative Toxigenomics Database [http://ctdbase.org/] представил доказательств влияния курения на снижение экспрессии HSPA8 [Iskandar A. R. et al. A systems toxicology approach for comparative assessment: Biological impact of an aerosol from a candidate modified-risk tobacco product and cigarette smoke on human organotypic bronchial epithelial cultures //Toxicology in vitro. – 2017. – Vol. 39. – P. 29-51]. Кроме того, HSPA8 значительно подвержен регуляции женскими половыми гормонами [Wang D. Y. et al. Identification of estrogen-responsive genes by complementary deoxyribonucleic acid microarray and characterization of a novel early estrogen-induced gene: EEIG1 //Molecular Endocrinology. – 2004. – Vol. 18. – №. 2. – P. 402-411].

Таким образом, курение и пол могут значительно модифицировать эффекты HSPA8 на риск развития ИИ.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курящих женщин на основе данных о генотипирования rs1136141 HSPA8.

Из области техники известен способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта по патенту РФ №2012134988 от 20.02.2014. Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более, чем на 70% от референтных значений, судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Однако, данный способ не является достаточно информативным, так как уровень ферментов антиокислительной защиты является динамичным показателем и может существенно варьировать у одного же индивидуума под влиянием экзогенных и эндогенных факторов, приема лекарственных препаратов, питания, курения и др., что снижает точность данного метода.

Известен способ прогнозирования риска развития инсульта у мужчин, работающих в условиях воздействия общей вибрации (патент на изобретение RU2718285C1), который включает расчет риска развития инсульта на основе таких параметров, как  возраст (X1), стаж работы в условиях воздействия общей вибрации (Х2), концентрацию общего холестерина в сыворотке крови (Х3), регулярность приема гипотензивных препаратов (Х4), наличие или отсутствие в анамнезе пациента фактора курения (Х5) с последующим расчетом вероятности возникновения инсульта у обследованного по формуле, где z(X)=0,25X1-0,34X2+1,2X3-1,5X4+1,3X5-9,5 (константа), и при значении р(Х), равном или превышающем 0,6, вероятность возникновения инсульта у данного пациента признается высокой. Недостаток метода заключается в том, что показатель уровня холестерина может существенно варьировать в зависимости от приема гиполипидемических препаратов, диеты, уровня стресса. Регулярность приема гипотензивных препаратов (Х4) – показатель, который также может варьировать во времени. Все это снижет точность прогностической модели, поскольку может привести к существенным вариациям в оценке риска развития инсульта. Кроме того, с помощью данного способа можно определить риск развития заболевания в небольшой когорте индивидуумов, работающих в условиях воздействия общей вибрации.

Известен способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у женщин старше 50 лет (патент на изобретение RU2740601C1), который включает определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови, проведение измерения скорости пульсовой волны на каротидно-феморальном сегменте и расчет прогностического коэффициента инсульта по формуле: КИ=0,018×ХСо×VПВк-ф, где КИ – прогностический коэффициент инсульта, 0,018 – константа нелинейной регрессии для данной модели, ХСо – концентрация общего холестерина (ммоль/л), VПВк-ф – скорость распространения пульсовой волны на каротидно-феморальном сегменте (м/с), и при значении коэффициента более 1 прогнозируют высокий риск развития инсульта, при значении коэффициента менее 1 – низкий риск развития инсульта. Недостаток данного метода заключается в том, показатели концентрация общего холестерина и скорость распространения пульсовой волны на каротидно-феморальном сегменте могут изменяться под влиянием терапевтических препаратов, прогрессирования атеросклероза и других факторов. Соответственно, это будет приводить к модификациям прогностического коэффициента у одного и того же пациента, что потребует многократных измерений данного показателя для коррекции показателей риска.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска ишемического инсульта по патенту на изобретение RU 2685859 (дата публикации 23.04.2019), включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфизмов генов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα, и при выявлении сочетания генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотреблении алкоголем прогнозируют высокий риск развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья. Однако, данный способ прогнозирует повышенный риск развития ишемического инсульта только у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования ишемического инсульта у курящих женщин - жителей Центральной России по данным генотипирования полиморфного варианта rs1136141 (G>A) гена HSPA8.

Технический результат достигается тем, после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs1136141 (G>A) гена семейства белков теплового шока A HSPA8 и прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России в случае выявления аллеля rs1136141-А, а при обнаружении генотипа rs1136141-G/G – низкий риск развития ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России.

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация генотипов по локусу rs1136141 гена HSPA8 при генотипировании методом ПЦР на амплификаторе CFX96 c детектирующей системой в режиме реального времени с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов: генотипы rs1136141-G/G показаны оранжевыми кружками, генотипы rs1136141-G/A показаны зелеными треугольниками, генотипы rs1136141-A/A показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs1136141 гена HSPA8 - генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Два фланкирующих праймера, прямой 5'-AGAACCCCCAAGCCTCAG-3' и обратный 5'-GGAAACCGGTCTCATTGAACT -3', а также аллель-специфические зонды 5′- FAM-TACCTGGGGTGTAGGCC-RTQ1-3′ и 5′-ROX-TACCTGGGATGTAGGCC-BHQ2-3′ использовали для генотипирования rs1136141 HSPA8. ПЦР в реальном времени проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 3,0 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из начальной денатурации в течение 10 минут при 95°С, за которой следовали 39 циклов [92°С в течение 10 секунд и 61,5°С в течение 1 минуты].

 При проведении ПЦР в амплификаторе с флюоресцентной детекцией (на амплификаторе CFX96) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции). Для rs1136141 HSPA8 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю G, зонд с красителем ROX - аллелю A (фиг.). Генотипы GG показаны кругами, GA-треугольниками, AA - квадратами; ромбом показан отрицательный контроль.

Прогнозирование повышенного риска формирования ишемического инсульта у курящих женщин в случае выявления аллеля rs1136141-А HSPA8 и пониженного риска развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов при выявлении генотипа rs1136141-G/G HSPA8.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 193 курящих женщин, у 127 из которых был диагностирован ИИ. В исследование включались лица славянской национальности, жители Центральной России. Диагноз ИИ был установлен врачами-неврологами РСЦ БМУ КОКБ и отделения неврологии ОБУЗ ГК БСМП на основе комплексного клинического и лабораторно-инструментального обследования.

Установлено, что генотип rs1136141-G/G значимо чаще встречался у курящих женщин без ИИ в анамнезе (81,8%) по сравнению с курящими женщинами, у которых был диагностирован ИИ (63,8%). Генотипы rs1136141-G/A и rs1136141-A/A в 2 раза чаще встречались у курящих женщин с ИИ (36,2%) в сравнении с курящими здоровыми женщинами (18,2%), что увеличивало риск ИИ в 3,1 раза независимо от возраста женщин. Таким образом, носительство генотипов rs1136141-G/A и rs1136141-A/A HSPA8 ассоциировало с повышенным риском развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов: OR=3,10, 95% CI 1,33-7,21, P=0,006 (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs1136141 гена HSPA8 с повышенным риском развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов

SNP ID Генотип, аллель Контроль, курильщики
(n=66) Больные ИИ, курильщики
(n=127) _adjOR (95% CI)¹ _adjР² rs1136141
(G>A) HSPA8 G/G 54 (81.8%) 81 (63.8%) 1.00 0.006 G/A- A/A 12 (18.2%) 46 (36.2%) 3.10 (1.33-7.22) A 9,8% 22% - - ¹ Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправкой возраст;
² Уровень значимости ассоциации с поправкой возраст

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центральной России: проведено генетическое обследование по локусу rs1136141 (G>A) HSPA8.

Пример 1. Пациентка Б., 62 лет, находилась на стационарном лечении в Региональном сосудистом центре ОБУЗ КОКБ г. Курска в 2017 г. с диагнозом «Ишемический инсульт от 4.04.2017, по атеротромботическому типу в бассейне правой среднемозговой артерии с левосторонним гемипарезом, парезом VII, XII ЧМН на фоне ГБ III стадии, риск IV, ГМЛЖ. При анкетировании установлено, что пациентка Б. курит в течение последних 20 лет. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs1136141 был выявлен аллель А в составе генотипа rs1136141-G/A.

Пример 2. Пациентка Р., 64 лет, находилась на стационарном лечении в Региональном сосудистом центре ОБУЗ КОКБ г. Курска в 2016 г. с диагнозом «Ишемический инсульт от 29.12.2016 в вертебробазилярном бассейне с вестибулоатаксией, левосторонним гемипарезом на фоне АГ III степени, системного атеросклероза. При анкетировании установлено, что пациентка Р. курит в течение 39 лет. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs1136141 был выявлен генотип rs1136141-A/A.

Пример 3. У пациентки К., 59 лет после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип G/G по локусу rs1136141 HSPA8. При анкетировании установлено, что пациентка К. курит в течение последних 18 лет. По данным генотипирования пациентка К. не включается в группу с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее наблюдение и результаты компьютерной томографии показали, что нарушений мозгового кровообращения у пациентки К. не выявлено.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель

rs1136141-A гена HSPA8 является генетическим фактором риска развития ишемического инсульта у курящих женщин (OR=3,1).

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди курящих женщин популяции Центральной России выявить группы риска по развитию ишемического инсульта и своевременно проводить среди таких пациенток необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития острого нарушения мозгового кровообращения – диспансерное наблюдение, регулярный контроль уровня артериального давления, уровня холестерина, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов, а также отказ от курения.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России. Осуществляют забор образца венозной крови. После экстракции ДНК проводят генотипирование полиморфного варианта rs1136141 (G>A) гена семейства белков теплового шока A HSPA8. В случае выявления аллеля rs1136141-А прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у курящих женщин. При обнаружении генотипа rs1136141-G/G прогнозируют низкий риск развития ишемического инсульта. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования ишемического инсульта у курящих женщин - жителей Центральной России по данным генотипирования полиморфного варианта rs1136141 (G>A) гена HSPA8. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs1136141 (G>A) гена HSPA8, включающий забор образца венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs1136141 (G>A) гена семейства белков теплового шока A HSPA8 и прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России в случае выявления аллеля rs1136141-А, а при обнаружении генотипа rs1136141-G/G – низкий риск развития ишемического инсульта у курящих женщин популяции Центральной России.