Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курильщиков популяции Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs11682567 (T>G) гена HSPD1 Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицинской диагностики, может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курильщиков популяции Центральной России.

Мозговой инсульт представляет серьезную угрозу для жизни человека и является одной из наиболее частых причин инвалидности и смерти во всем мире [Gorelick P. B. The global burden of stroke: persistent and disabling //The Lancet Neurology. – 2019. – Vol. 18. – №. 5. – P. 417-418.]. При этом на ишемический инсульт (ИИ) приходится большая доля случаев инсульта [Gorelick P. B. The global burden of stroke: persistent and disabling //The Lancet Neurology. – 2019. – Vol. 18. – №. 5. – P. 417-418.].

С точки зрения генетики, ИИ представляет собой многофакторное заболевание, развивающееся при взаимодействии генетических и средовых факторов риска. Широкомасштабные эпидемиологические исследования доказали, что курение является наиболее значимым средовым фактором развития ИИ [Hackshaw A. et al. Low cigarette consumption and risk of coronary heart disease and stroke: meta-analysis of 141 cohort studies in 55 study reports //Bmj. – 2018. – Vol. 360].

Среди генетических факторов ИИ большое значение отводится генам, кодирующим белки теплового шока (HSPs). HSPs играют ключевую роль в защите клеток и тканей от повреждающего действия при ИИ, стабилизируя белки и способствуя рефолдингу и деградации белков [Manikandan P. et al. Exploring the biological behavior of Heat shock protein (HSPs) for understanding the Anti-ischemic stroke in humans //Journal of Infection and Public Health. – 2022. – Vol. 15. – №. 4. – P. 379-388]. HSPD1, также известный как белок теплового шока 60 (HSP60) семейства D член 1, необходим для фолдинга и сборки вновь импортированных белков в митохондриях человека и может иметь решающее значение для выживания клеток при ишемии благодаря его важной роли в поддержании митохондриальной функциональности [Cappello F. et al. Hsp60 expression, new locations, functions, and perspectives for cancer diagnosis and therapy //Cancer biology & therapy. – 2008. – Vol. 7. – №. 6. – P. 801-809]. Кроме того, HSPD1 играет значительную роль в развитии атеросклероза. Атеросклероз, одним из механизмов которого является иммунная реакция на HSP60, является основным фактором риска мозгового инсульта [Wick G. Atherosclerosis–an autoimmune disease due to an immune reaction against heat-shock protein 60 //Herz. – 2000. – Vol. 25. – P. 87-90].

Ресурс Comparative Toxigenomics Database представил доказательства влияния курения на экспрессию HSPD1 [http://ctdbase.org/]. Таким образом, курение может значительно модифицировать эффекты rs11682567 HSPD1 на риск развития ИИ.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курильщиков на основе данных о генотипирования rs11682567 HSPD1.

Из области техники известен способ прогнозирования развития острого ишемического инсульта по патенту РФ №2012134988 от 20.02.2014. Способ включает учет показателей ферментов антиокислительной защиты в периферической крови, при этом в качестве ферментов антиокислительной защиты определяют каталазу, пероксидазу и показатель перекисного окисления липидов. При увеличении показателей пероксидазы и перекисной резистентности эритроцитов и снижении показателя каталазы более, чем на 70% от референтных значений, судят о высоком риске развития ишемического инсульта. Однако, данный способ не является достаточно информативным, так как уровень ферментов антиокислительной защиты является динамичным показателем и может существенно варьировать у одного же индивидуума под влиянием экзогенных и эндогенных факторов, приема лекарственных препаратов, курения и др., что снижает точность данного метода.

Известен способ прогнозирования риска развития инсульта у мужчин, работающих в условиях воздействия общей вибрации (патент на изобретение RU2718285C1), который включает расчет риска развития инсульта на основе таких параметров, как  возраст (X1), стаж работы в условиях воздействия общей вибрации (Х2), концентрацию общего холестерина в сыворотке крови (Х3), регулярность приема гипотензивных препаратов (Х4), наличие или отсутствие в анамнезе пациента фактора курения (Х5) с последующим расчетом вероятности возникновения инсульта у обследованного по формуле, где z(X)=0,25X1-0,34X2+1,2X3-1,5X4+1,3X5-9,5 (константа), и при значении р(Х), равном или превышающем 0,6, вероятность возникновения инсульта у данного пациента признается высокой.

Недостаток метода заключается в том, что показатель уровня холестерина может существенно варьировать в зависимости от приема гиполипидемических препаратов, диеты, уровня стресса. Регулярность приема гипотензивных препаратов (Х4) – показатель, который также может варьировать во времени. Все это снижет точность прогностической модели, поскольку может привести к существенным вариациям в оценке риска развития инсульта. Кроме того, с помощью данного способа можно определить риск развития заболевания в небольшой когорте индивидуумов, работающих в условиях воздействия общей вибрации.

Известен способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у женщин старше 50 лет (патент на изобретение RU2740601C1), который включает определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови, проведение измерения скорости пульсовой волны на каротидно-феморальном сегменте и расчет прогностического коэффициента инсульта по формуле: КИ=0,018×ХСо×VПВк-ф, где КИ – прогностический коэффициент инсульта, 0,018 – константа нелинейной регрессии для данной модели, ХСо – концентрация общего холестерина (ммоль/л), VПВк-ф – скорость распространения пульсовой волны на каротидно-феморальном сегменте (м/с), и при значении коэффициента более 1 прогнозируют высокий риск развития инсульта, при значении коэффициента менее 1 – низкий риск развития инсульта.

Недостаток данного метода заключается в том, что с помощью данного способа может прогнозировать инсульт только у женщин. Кроме того, показатели концентрация общего холестерина и скорость распространения пульсовой волны на каротидно-феморальном сегменте могут изменяться у под влиянием терапевтических препаратов, прогрессирования атеросклероза и других факторов. Соответственно, это будет приводить к модификациям прогностического коэффициента у одного и того же пациента, что потребует многократных измерений данного показателя для коррекции показателей риска.

Наиболее близок по результату исследования способ прогнозирования риска ишемического инсульта по патенту на изобретение RU 2685859 (дата публикации 23.04.2019), включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфизмов генов rs909253 Ltα и rs1800629 TNFα, и при выявлении сочетания генотипа АА rs909253 Ltα с генотипом GG rs1800629 TNFα и злоупотреблении алкоголем прогнозируют высокий риск развития ишемического инсульта у индивидуумов русской национальности, являющихся жителями Центрального Черноземья.

Однако, данный способ прогнозирует повышенный риск развития ишемического инсульта только у лиц, злоупотребляющих алкоголем.

Технический результат заключается в получении критериев оценки риска формирования ишемического инсульта у курильщиков - жителей Центральной России по данным генотипирования полиморфного варианта rs11682567 (T>G) гена HSPD1.

Технический результат достигается тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs11682567 (T>G) гена белка теплового шока 60 семейства D HSPD1 и прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у курящих индивидуумов в случае выявления аллеля rs11682567-G, а при обнаружении генотипа rs11682567-T/T – низкий риск развития ишемического инсульта у курильщиков.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к масс-спектрометрическому анализу. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 10 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs11682567 гена HSPD1 - генотипирование методом матрично-активированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии MALDI-TOF. Использовали следующие последовательности праймеров: F: 5`-ACGTTGGATGGGACTCCCTAAGTAATCTGG-3`, R: 5`-ACGTTGGATGTGTCTCAGATACTTCCTGTC-3`,

праймер удлинения E: 5`-AAAAATTGCTAGGAAGCAAAA-3`.

Для приготовления ПЦР-микса (в расчете на один спектральный чип) в центрифужную микропробирку вносили 80,6 мкл ddH2O, 50,4 мкл 10x буфера, 40,3 мкл MgCl2 (концентрация 25 ммоль/л), 10,1 мкл смеси дНТФ (концентрация 25 ммоль/л), 100,8 мкл смеси ПЦР-праймеров (концентрация 0,5 мкмоль/л) и 20,16 мкл HotStartTaq полимеразы (концентрация 5 ЕД/мкл). Смесь вортексировали и раскапывали в 96-луночный ПЦР-планшет по 3 мкл в лунку, после чего с помощью восьмиканального дозатора вносили по 2 мкл ДНК (концентрация 10 нг/мкл). Планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 125 мин при следующем режиме: денатурация 2 мин при 95°С, амплификация 44 цикла, состоящая из денатурации 30 сек при 95°С, отжига 30 сек при 56°С и элонгации 60 сек при 72°С. После чего пробы инкубировали 5 мин при 72°С. Не прореагировавшие в ходе ПЦР дНТФ удаляли с помощью реакции SAP (shrimp alkaline phosphatase), в ходе которой щелочная фосфатаза креветки гидролизовала дНТФ до нуклеозидов и фосфатов. Для приготовления SAP-микса в микропробирке смешивали 161,6 мкл ddH2O, 18 мкл 10хTS буфера и 31,7 мкл SAP фермента. Далее вносили по 2 мкл SAP-смеси в каждую лунку, планшет заклеивали, центрифугировали 20 сек при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 55 мин при следующем режиме: 45 мин при 37°С и 10 мин при 85°С. Для проведения третьей реакции iPLEX готовили Е-праймер-микс из расчета 8,8 мкл праймеров Е1-Е9, 11,7 мкл праймеров Е10-Е18, 14,6 мкл праймеров Е19-Е27, 17,5 мкл праймеров Е28-Е35 и 45,1 мкл ddH2O. После масс-спектрометрической оценки интенсивности пиков Е-праймеров в полученной смеси, в микс добавляли Е-праймеры в количествах, необходимых для достижения одинаковой интенсивности сигнала. Для приготовления iPLEX-микса в микропробирке смешивали 65,4 мкл ddH2O, 21,2 мкл iPLEX буфера, 21,2 мкл терминирующей смеси, 99,3 мкл Е-праймер-микса и 4,33 мкл iPLEX-фермента, вортексировали и раскапывали в лунки по 2 мкл. Планшет заклеивали, центрифугировали 20 секунд при 1000 об/мин и загружали в термоциклер CFX96 Bio-Rad на 135 мин при следующем режиме: денатурация 30 сек при 94°С, затем 40 циклов, состоящие из денатурации 5 сек при 94°С, отжига 5 сек при 52°С, элонгации 5 сек при 80°С, с последующим инкубированием в течение 3 мин при 72°С. По завершении реакции iPLEX, планшет охлаждали до +4˚С, добавляли по 30 мкл воды во все лунки, центрифугировали 1 мин при 1000 об/мин и загружали в масс-спектрометр. Ввиду того, что небольшие полярные молекулы и положительно заряженные катионы натрия и калия могут образовывать аддукты с олигонуклеотидами и создавать серию контаминантных пиков, ампликоны были подвергнуты роботизированному обессоливанию путем их обработки смолой SpectroCLEAN (Agena Bioscience). Перенос образцов на спектральный чип с матрицей для ионизации осуществлялся в автоматическом режиме на рабочей станции Nanodispenser.

Статистические расчеты проводили с помощью программы SNPStats [Solé X. et al. SNPStats: a web tool for the analysis of association studies //Bioinformatics. – 2006. – Vol. 22. – №. 15. – P. 1928-1929].

4. Прогнозирование повышенного риска формирования ишемического инсульта у курящих индивидуумов в случае выявления аллеля rs11682567-G HSPD1 и пониженного риска развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов при выявлении генотипа rs11682567-T/T HSPD1.

Возможность использования предложенного способа для определения риска развития ишемического инсульта подтверждает анализ результатов наблюдений 447 курящих индивидуумов, у 365 из которых был диагностирован ИИ. В исследование включались лица славянской национальности, жителей Центральной России. Диагноз ИИ был установлен врачами-неврологами РСЦ БМУ КОКБ и отделения неврологии ОБУЗ ГК БСМП на основе комплексного клинического и лабораторно-инструментального обследования.

Установлено, что присутствие хотя бы одного аллеля G значимо повышало риск развития ИИ у курильщиков: генотипы rs11682567-T/G и rs11682567-G/G чаще встречались у курящих с ИИ (30,1%) в сравнении с курящими без данного заболевания (17,1%), что увеличивало риск ИИ в 2,09 раза независимо от пола и возраста. При этом генотип rs11682567-T/T чаще встречался у курильщиков без ИИ в анамнезе (82,9%) в сравнении с курящими индивидуумами, у которых был диагностирован ИИ (69,9%). Таким образом, носительство генотипов rs11682567-T/G и rs11682567-G/G HSPD1 ассоциировало с повышенным риском развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов: OR=2,09, 95% CI 1,12-3,90, P=0,015 (таблица 1).

Таблица 1

Ассоциация полиморфного варианта rs11682567 гена HSPD1 с повышенным риском развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов

SNP ID Генотип, аллель Контроль, курильщики
(n=82) Больные ИИ, курильщики
(n=365) _adjOR (95% CI)¹ _adjР² rs11682567 (T>G) HSPD1 T/T 68 (82,9%) 255 (69,9%) 1.00 0,015 T/G -G/G 14 (17,1%) 110 (30,1%) 2,09 (1,12-3,90) G 8,5% 16,2% - - ¹ Отношения шансов и 95% доверительный интервал с поправками на пол и возраст;
² Уровень значимости ассоциации с поправками на пол и возраст

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа приведено генетическое обследование неродственных русских индивидуумов, уроженцев Центральной России: проведено генетическое обследование по локусу rs11682567 (T>G) HSPD1.

Пример 1. Пациент С., 57 лет, находился на стационарном лечении в РСЦ БМУ КОКБ г. Курска в 2018 г. с диагнозом ишемический инсульт от 11.11.2018 по атеротромботическому типу в бассейне правой средней мозговой артерии с левосторонним выраженным гемипарезом, парезом VII, XII ЧМН, с выраженным бульбарным синдромом. При анкетировании установлено, что пациент С. курит в течение 40 лет. У пациента была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs11682567 был генотип rs11682567- G/G.

Пример 2. Пациентка П., 65 лет, находилась на стационарном лечении в РСЦ БМУ КОКБ г. Курска в 2017 г. с диагнозом ишемический инсульт по атеротромботическому типу в вертебро-базилярном бассейне от 2.08.2017 г. с пирамидномозжечковой симптоматикой, дизартрией. При анкетировании установлено, что пациентка П. курит в течение 23 лет. У пациентки была взята венозная кровь, при генотипировании полиморфного локуса rs11682567 был выявлен аллель А в составе генотипа rs11682567- T/G.

Пример 3. У пациента Т., 69 лет после забора венозной крови из локтевой вены и последующего генотипирования выявлен генотип T/T по локусу rs11682567 HSPD1. При анкетировании установлено, что пациент Т. курит в течение последних 42 лет. По данным генотипирования пациент Т. не включается в группу с высоким риском развития ишемического инсульта. Дальнейшее наблюдение и результаты компьютерной томографии показали, что нарушений мозгового кровообращения у пациента Т. не выявлено.

Резюме

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что аллель

rs11682567-G гена HSPD1 является генетическим фактором развития ишемического инсульта у курящих индивидуумов и повышает риск данного заболевания в 2,09 раза (OR=2,09).

Использование предложенного способа позволит прогнозировать развитие ишемического инсульта у курильщиков, что даст возможность в группе индивидуумов с данным средовым фактором риска осуществлять мероприятия по профилактике ишемического инсульта – диспансерное наблюдение, регулярный контроль уровня артериального давления, уровня холестерина, достаточную физическую активность, правильное питание с ежедневным включением в рацион свежих овощей и фруктов, а также отказ от курения.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской диагностике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курильщиков популяции Центральной России. Осуществляют забор образца венозной крови. После экстракции ДНК проводят генотипирование полиморфного варианта rs11682567 (T>G) гена белка теплового шока 60 семейства D HSPD1. В случае выявления аллеля rs11682567-G прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у курящих индивидуумов. При обнаружении генотипа rs11682567-T/T прогнозируют низкий риск развития ишемического инсульта у курильщиков. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска формирования ишемического инсульта у курильщиков - жителей Центральной России на основе генотипирования полиморфного варианта rs11682567 (T>G) гена HSPD1. 1 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска развития ишемического инсульта у курильщиков популяции Центральной России на основе генотипирования полиморфизма rs11682567 (T>G) гена HSPD1, включающий забор образца венозной крови, отличающийся тем, что после экстракции ДНК проводят анализ полиморфного варианта rs11682567 (T>G) гена белка теплового шока 60 семейства D HSPD1 и прогнозируют повышенный риск формирования ишемического инсульта у курящих индивидуумов в случае выявления аллеля rs11682567-G, а при обнаружении генотипа rs11682567-T/T – низкий риск развития ишемического инсульта у курильщиков.