Штамм "СК" вируса классической чумы свиней Pestivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики классической чумы свиней Российский патент 2023 года по МПК A61K39/187 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, может быть использовано для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики классической чумы синей.

Классическая чума свиней является вирусным высококонтагиозным заболеванием домашних и диких свиней, проявляющимся лихорадкой, поражением кровеносной и кроветворной систем, крупозным воспалением легких и крупозно-дифтеритическим воспалением толстого кишечника. Классическая чума свиней остается одной из наиболее серьезных трансграничных вирусных болезней свиней во всем мире [1].

Возбудитель инфекции - РНК-содержащий оболочечный вирус, относящийся к классу Flasuviricetes, отряду Amarillovirales, семейству Flaviviridae, род Pestivirus, вид Pestivirus С [1, 2].

Болезнь регистрируется главным образом в Азии, Центральной и Южной Америке, а также в некоторых регионах Европы и Африки [3].

Классическая чума свиней длительное время регистрируется в Российской Федерации. За прошедшие годы наблюдалось несколько периодов активизации эпизоотического процесса этой болезни с последующим снижением ее интенсивности. Филогенетический анализ полевых изолятов, вызвавших вспышки КЧС на территории России в 1980-2007 гг., показал, что часть из них принадлежит к группе 1 (подгруппа 1.1, 1.2) и группе 2 (подгруппа 2.3). При этом в 80-е гг.прошлого столетия превалировал вирус подгрупп 1.2, 2.3 и в единичных случаях - 1.1; в 90-е гг.и вплоть до 2002 г. - 1.1 и единичный случай 2.3; в 2002-2007 гг. - подгруппы 2.3 [2].

Антигенная вариабельность вируса классической чумы свиней не доказана. По вирулентности различают А-, В- и С-варианты вируса. В группу А входят вирулентные эпизоотические штаммы, вызывающие у свиней всех возрастов остро протекающую болезнь. Вирусы подгруппы В вирулентны только для поросят и при циркуляции в стаде вызывают атипичную или хроническую чуму. Подгруппа С - американский слабовирулентный штамм 331 [3].

В настоящее время многие страны (кроме ЕС) с целью контроля или ликвидации КЧС используют традиционные живые вакцины на основе аттенуированных штаммов вируса, размноженных в организме кроликов или в культуре клеток. Имея небольшие различия между собой, все они характеризуются общностью иммунобиологических свойств, в том числе, полной безопасностью и высокой иммуногенностью [3, 4].

Известны производственные штаммы вируса КЧС, которые применяются для производства средств специфической профилактики классической чумы свиней:

- штамм С (синонимы LC, LPC);

- штамм ЛК;

- штамм КС;

- штамм GPE;

- штамм Thiverval.

Известен штамм «ЛК-ВНИИВВиМ» вируса КЧС, используемый для изготовления вирусвакцины. Вирус размножают в первичной культуре клеток тестикул ягнят [5].

Недостатками данного штамма являются: нерентабельность использования некондиционных (молодых) сельскохозяйственных животных, непредвиденные последствия контаминации вирусного сырья другими патогенными или условно патогенными агентами от доноров ткани, сезонность поступления донорской ткани (тестикулы ягнят, весенне-летний период), низкая иммуногенность вакцины, полученной из данного штамма.

Известен штамм «ЛК-К» вируса КЧС для изготовления культуральной вирусвакцины. Штамм «ЛК-К» получен из штамма «ЛК-ВНИИВВиМ» клонированием и селективным отбором полученных клонов по признаку высокого накопления в перевиваемой культуре клеток почки кролика РК-15 [6].

Недостатком данного штамма является низкая иммуногенная активность вакцины, полученной на его основе.

Известен штамм «КС» для изготовления вирусвакцины против КЧС. Вакцину из данного штамма вводят свиньям в неблагополучных хозяйствах многократно в больших дозах с содержанием в прививном объеме 100000-1000000 ИД₅₀ [7]. Недостатком данного штамма является его низкая иммуногенная активность.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового производственного штамма вируса классической чумы свиней, обладающего широким антигенным спектром действия, высокой биологической и иммуногенной активностью и обеспечивающего изготовление эффективной вирусвакцины.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в получении нового производственного штамма вируса классической чумы свиней, обладающего широким спектром действия, высокой биологической и иммуногенной активностью и пригодного для изготовления сухой культуральной вирусвакцины.

Штамм «СК» был получен в ФГБУ «ВНИИЗЖ» в соответствии с планом научно-исследовательской работы методом последовательного пассирования штамма «СИНЛАК» вируса классической чумы свиней на культуре клеток не свиного происхождения - субкультуре клеток тестикул ягненка (ТЯ-1).

Полученный штамм вируса классической чумы свиней депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №364 - деп/21-25 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Экспериментально подтверждена возможность использования штамма вируса классической чумы свиней «СК» для изготовления средств специфической профилактики классической чумы свиней.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 - Дендрограмма, отражающая филогенетические взаимоотношения штамма «СК» вируса классической чумы свиней с эпизоотическими и вакцинными штаммами. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена кодирующего гликопротеин Е2.

Штамм «СК» вируса классической чумы свиней характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «СК» вируса классической чумы свиней относится к семейству Flaviviridae, роду Pestivirus, виду Pestivirus С и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя классической чумы: форма вириона сферическая, размер 40-60 нм. Вирион состоит из молекулы РНК, заключенной в липопротеиновую оболочку. Нуклеокапсид сформирован коровым белком (14 кДа). Три оболочечных гликопротеина (E^rns (gp44/48), E1 (gp33) и E2 (gp55)) входят в состав оболочки.

Антигенные свойства

При парентеральном введении в организм свиньи штамм «СК» вируса классической чумы свиней вызывает образование вируснейтрализующих антител в титре 1:16-1:64.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Криптограмма - код таксономических параметров вируса классической чумы свиней имеет вид: R/1; 4/?; S/S; V/O, что выражает следующие его характеристики: однонитевая линейная РНК с молекулярной массой 4×10 дальтон, % содержания РНК в вирионе не установлен (?), вирион и нуклеокапсид сферической формы (S), естественным хозяином являются свиньи (V-позвоночные), распространяется без переносчиков.

В ходе определения филогенетического родства на основе анализа нуклеотидной последовательности кодирующего гликопротеин Е2 гена штамм «СК» отнесен к субгенотипу 1.2 (фиг. 1).

Физические свойства

Коэффициент седиментации 140-180S в градиенте сахарозы. Плавучая плотность 1,16-1,20 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «СК» вируса классической чумы свиней чувствителен к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, разрушается трипсином. Наиболее стабилен при рН 6,0-9,0. При 60°С инактивируется через 10 минут. Низкие температуры его консервируют, в замороженном виде вирус сохраняется несколько лет.

Дополнительные признаки и свойства:

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - не патогенен для свиней.

Вирулентность - не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Иммуногенная активность - через 12 дней после иммунизации свиней вызывает у них образование специфических антител.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 50 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Штамм «СК» вируса классической чумы свиней обладает следующими биологическими свойствами: размножается без цитопатического эффекта; выявляется с помощью антител, меченных пероксидазой (PLA) или в полимеразной цепной реакции (PCR); безопасен для свиней любого возраста в том числе для супоросных свиноматок и новорожденных поросят; не реверсибелен; не вызывает персистенции у привитых свиней и не определяется в крови (через 7-10 дней); через 14 дней после иммунизации создает продолжительный напряженный иммунитет (не менее 2 лет, срок наблюдения); свободен от контаминации вирусами, бактериями, грибами и микоплазмами; длительно хранится в сухом и жидком виде при различной температуре не выше минус (70±1)°С.

Биотехнологические характеристики

Штамм «СК» вируса классической чумы свиней репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: РК-13 (почка кролика), РК-15 (почка поросенка) и ТЯ-1 (субкультура тестикул ягненка).

При испытании было проведено 40 последовательных пассажей штамма «СК» вируса классической чумы свиней в перевиваемых культурах клеток РК-15, РК-13, ТЯ-1.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его исследования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Исследование биологических свойств штамма «СК» вируса классической чумы свиней при репродукции в монослойных перевиваемых клеточных культурах

Репродукцию вируса проводили на культуре монослойных перевиваемых линий клеток: РК-15, РК-13, ТЯ-1.

Культуры клеток выращивали на соответствующих питательных средах с добавлением сыворотки крови КРС до 10%, в динамических условиях в роллерах с площадью поверхности 800 см² или матрасах с площадью поверхности 600 см², отмывали от ростовой среды раствором Хэнкса и заражали суспензией вирусного материала (множественность заражения составляла 1-10 ТЦД₅₀/клетка), приготовленной на среде Игла. После 40-минутного контакта вируса с клеточной культурой при 37°С в роллеры или матрасы вносили по 250 и 200 см³ соответственно, поддерживающей среды с 5% фетальной сыворотки крови КРС и инкубировали при 37°С в течение 5 суток. По истечении данного срока роллеры или матрасы подвергали замораживанию-оттаиванию, отбирали пробы суспензии для контроля стерильности, инфекционной активности. Полученный вируссодержащий материал использовали для последующих пассажей. Вирус считался адаптированным к культуре клеток, если по окончанию срока культивирования (5 суток) инфекционная активность штамма «СК» вируса классической чумы свиней составляла не менее 5,5 lg ККИД/см³. Адаптация штамма «СК» вируса классической чумы свиней к различным клеточным линиям наступала на уровне 35 пассажа для культуры клеток ТЯ-1 и 40 пассажа для культур клеток РК-15 и РК-13. Результаты адаптации вируса к различным клеточным культурам представлены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о высокой адаптационной способности штамма «СК» вируса классической чумы свиней к субкультуре клеток ТЯ-1 по сравнению с другими культурам.

Пример 2. Исследование биологических свойств штамма «СК» вируса классической чумы свиней полученного на субкультуре клеток ТЯ-1.

Провели проверку биологических свойств штамма «СК» вируса классической чумы свиней полученного на субкультуре клеток ТЯ-1 (36 пассаж) по следующим показателям:

- отсутствие бактериальной и грибковой контаминации;

- специфичность и отсутствие вирусной контаминации (метод ПЦР);

- антигенная активность и специфичность (метод ИФА);

- определение реверсибельности.

Для определения отсутствия бактериальной и грибковой контаминации штамма «СК» вируса классической чумы свиней использовали питательную среду Сабуро, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), среду Китта-Тароцци, сахарный бульон, тиогликолевую среду. Все используемые среды были проверены на ростовые свойства согласно ГОСТ 28085-89. Для испытания из трех флаконов (отдельно из каждого) с культуральным вирусом отбирали по 1 см³ вируссодержащего материала и вносили в 4 пробирки с тиогликолевой средой. Пробирки инкубировали при разных температурных режимах.

Две пробирки с содержимым из каждого флакона выдерживали в термостате при температуре 37±0,5°С, одну - при 30±0,5°С, одну - при 22±0,5°С. Через 7 суток из 3 разных пробирок, инкубируемых при 37±0,5°С, делали пересев на следующие бактериальные среды: агар и жидкую среду Сабуро, МПБ и МПА, среду Китта-Тароцци. В среду Китта-Тароцци вносили по 1 см³, а в остальные - по 0,5 см³ исследуемого материала и выдерживали в течение 7 суток при температуре 37±0,5°С, со средой Сабуро - при температуре 22±0,5°С.

Все пробирки подвергались ежедневному визуальному контролю в течение 14 суток. Результаты проверки представлены в таблице 2. На всех средах с высевами и пересевами роста бактериальной и грибковой микрофлоры не наблюдалось. Испытания показали, что штамм «СК» вируса классической чумы свиней (36 пассаж) не контаминирован бактериальной и грибковой микрофлорой

Проверку штамма «СК» вируса классической чумы свиней на специфичность и отсутствие вирусной контаминации проводили методом ПЦР на наличие генома вируса классической чумы свиней, и отсутствие геномов вирусов:

- вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС);

- вируса болезни Ауески (ВБА);

- вируса парвовирусной инфекции свиней (ПВИС);

- вируса гриппа свиней (ВГС);

- возбудителя микоплазмоза свиней (М. hyopneumoniae).

В результате проведенных исследований в пробах культуральной суспензии обнаружен только геном вируса классической чумы свиней. Геномы вирусов РРСС, болезни Ауески, ПВИС, ВГС и возбудителя М. hyopneumoniae не обнаружены.

Проведенное секвенирование и выравнивание последовательности анализируемого фрагмента гена штамма «СК» вируса классической чумы свиней показало его 100% идентичность с последовательностью штамма RUCSFPLUM (фиг. 1).

Определение специфичности и отсутствия контаминации штамма «СК» вируса классической чумы свиней проверяли на подсвинках.

Из вирусного образца, полученного по примеру 1 на культуре клеток ТЯ-1, получили лиофилизат с добавлением стабилизатора состоящего из 20%-ного раствора гидролизата лактоальбумина (20%), 50%-ного раствора сахарозы (6%) и 10%-ного раствора желатозы (4%). Вирусную суспензию со стабилизатором расфасовали по 4,0 см³ в стеклянные флаконы соответствующей вместимости. Провели лиофилизацию по общепринятой методике. После лиофилизации флаконы вакуумировали, герметично укупорили резиновыми пробками и закатали алюминиевыми колпачками.

Для проведения испытания использовали 3 подсвинков массой 25-30 кг.

Все животные были серонегативными по отношению к вирусам КЧС, РРСС, ПВИС, болезни Ауески, ВГС и М. hyopneumoniae.

Лиофилизированную вирусную суспензию восстановили до первоначального объема стерильным физиологическим раствором. Для этого во флакон с лиофилизатом при помощи шприца вносили по 4,0 см³ растворителя.

После полного растворения лиофилизата, полученную суспензию объединенную из 4 флаконов перенесли в стерильный флакон большего объема для объединения.

Всем животным вводили внутримышечно по 5 см³/гол объединенной пробы штамма «СК» вируса классической чумы свиней с титром 5,5 lg ККИД/см³. До и через 28 суток после заражения от подсвинков отбирали пробы крови и исследовали методами ИФА и РТГА на наличие антител против следующих возбудителей используя соответствующие наборы:

- вируса классической чумы свиней с использованием коммерческого набора «Classical Swine Fever Virus (CSFV) Antibody Test Kit» (IDEXX), значение s/p<40 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>50 - наличие специфических антител;

- вируса РРСС с использованием коммерческого набора «Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Antibody Test Kit» (IDEXX), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p≥0,4 - наличие специфических антител;

- вируса ПВИС с использованием коммерческого «Набора для серодиагностики ПВИС в РТГА» производства ФГБУ «ВНИИЗЖ», значение ≥1:256 - наличие специфических антител;

- вируса болезни Ауески с использованием коммерческого набора «HerdChek PPV gB Antibody Test Kit» (IDEXX), значение s/p<50 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>100 - наличие специфических антител;

- ВГС с использованием коммерческих наборов ИФА HerdChek Swine Influenza H3N2 and H1N1 Antibody Test Kits (IDEXX Laboratories, USA) на наличие антител к вирусу гриппа свиней подтипов H1N1 и H3N2.), значение s/p<0,4 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p≥0,4 - наличие специфических антител;

- М. hyopneumoniae с использованием набора фирмы Chekit, значение s/p<20 - специфические антитела отсутствуют, значение s/p>30 - наличие специфических антител.

Результаты исследований сывороток крови подсвинков на наличие антител к вышеуказанным возбудителям инфекций представлены в таблице 3.

Приведенные в таблице 3 данные показывают, что в испытанных образцах сыворотки крови свиней антитела к вирусам РРСС, ПВИС, болезни Ауески, ВГС, М. hyopneumoniae не выявлены, что свидетельствует об отсутствии контаминации штамма «СК» вируса классической чумы свиней вышеуказанными возбудителями.

Определение антигенной активности штамма «СК» вируса классической чумы свиней проводили методом ИФА путем выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных через 14, 21 и 28 дней после их иммунизации образцом вакцины, изготовленным из штамма «СК» вируса классической чумы свиней.

Образец вакцины для иммунизации подсвинков приготовили следующим образом. Лиофилизированную вирусную суспензию из 2 флаконов, восстановили до первоначального объема стерильным физиологическим раствором. Для этого во флакон с лиофильным образцом при помощи шприца внесли 4,0 см³ растворителя. После полного растворения лиофилизата, полученный концентрированный раствор из 2 флаконов перенесли в стерильный флакон большего объема, куда соблюдая правила асептики, добавили физиологический раствор - 196,0 см³ на 1 флакон экспериментальной вакцины, исходя из инфекционного тира 5,3 lg ККИД/см³ (100 прививных доз).

После проверки на стерильность и инфекционную активность препарат ввели 4 серонегативным к вирусу классической чумы свиней подсвинкам массой 25-30 кг внутримышечно в область верхней трети шеи в объеме 2 см³/гол.

Инфекционная активность штамма «СК» вируса классической чумы свиней составляла 5,3 lg ККИД/см³.

Сыворотки крови животных отобранные на 14, 21 и 28 день после иммунизации исследовали методом ИФА используя коммерческий набор «Classical Swine Fever Virus (CSFV) Antibody Test Kit» (IDEXX).

Результаты изучения антигенной активности штамма «СК» вируса классической чумы свиней представлены в таблице 4.

Данные таблицы 4 показывают, что до иммунизации в сыворотках крови подсвинков специфические антитела к вирусу классической чумы свиней не выявлялись, а через 14 дней после вакцинации у трех из четырех животных были обнаружены вирусспецифические антитела. Через 21 и 28 дней у всех подсвинков выявлялись антитела на достаточном уровне.

Изучение реверсибельности штамма «СК» вируса классической чумы свиней проводили методом последовательных пассажей на группе безмолозивных поросят. Образец вакцины, приготовленный из штамма «СК» вируса классической чумы свиней (как описано выше), вводили безмолозивному поросенку в объеме 5 см³/гол внутримышечно в область верхней трети шеи.

Через 3-5 дней у животного проводили отбор крови. Кровь дефибринировали и вводили в объеме 5 см³/гол внутримышечно в область верхней трети шеи следующему поросенку. Таким образом выполнили 6 последовательных пассажей. После каждого пассажа проводили клиническое наблюдение за животными в течение 21 дня.

Результаты исследований показали, что штамм «СК» вируса классической чумы свиней не обладает реверсибельностью при прямых пассажах на чувствительных животных, так как отсутствуют характерные для классической чумы свиней клинические признаки заболевания и является авирулентным.

В результате анализа подтвердили эффективность изготовленного вакцинного препарата из штамма «СК» вируса классической чумы свиней (предлагаемое изобретение) и возможность применения данного штамма для специфической профилактики свиней от данного заболевания.

Таким образом, заявляемый штамм «СК» вируса классической чумы свиней может быть использован для изготовления биопрепаратов, используемых для специфической профилактики классической чумы свиней.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента Российской Федерации на изобретение «Штамм «СК» вируса классической чумы свиней Pestivirus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики классической чумы свиней»:

1. Инфекционная патология животных: в 2 т.Т. 1. Под ред. А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьева, Е.А. Непоклонова, Е.С. Воронина. М.: Академкнига; 2006. 911 с.

2. Актуальные инфекционные болезни свиней: руководство для студентов, научных и практических специалистов. Под ред. Т.И. Алипера. М.: ЗооВетКнига; 2019. 400 с.

3. Шевченко А.А., Черных О.Ю., Шевченко Л.В., Джаилиди Г.А., Зеркалев Д.Ю. Диагностика классической чумы свиней: учебное пособие. Краснодар: КубГАУ, 2013. 18 с.

4. Корицкая М.А. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма КС вируса классической чумы свиней: автореф. дис....канд. биол. наук. Москва; 2005. 24 с.

5. Патент RU №2064302С1, МПК A61K 39/187. Опубл. 27.07.1996.

6. Патент RU №2057805С1, МПК A61K 39/187, C12N 7/00. Опубл. 10.04.1996.

7. Патент RU №2129443 С1, МПК A61K 39/187, C12N 7/00. Опубл. 27.04.1999.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается нового штамма «СК» вируса классической чумы свиней Pestis suum сем. Flaviviridae, рода Pestivirus, вид Pestivirus С, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №364 - деп/21-25 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ». Представленный штамм репродуцируется в перевиваемой культуре клеток тестикул ягненка (ТЯ-1) в течение 3-4 суток инкубирования и накапливается в титре 5,5 lg ККИД/см³, сохраняет исходные характеристики при пассировании в клеточной культуре на протяжении 5-10 пассажей. Представленный штамм может быть использован для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики классической чумы свиней. 1 ил., 4 табл., 2 пр.

Штамм «СК» вируса классической чумы свиней семейство Flaviviridae, род Pestivirus, вид Pestivirus С, депонированный во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №364 - деп/21-25 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики классической чумы свиней.