Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему Fab фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 или Fab фрагмент антитела к человеческому MUC1 и лиганд. Настоящее изобретение также относится к диагностической композиции и/или фармацевтической композиции, включающей конъюгат, к способу для диагностики и/или лечения рака с использованием конъюгата и т.п. Кроме того, к конъюгату, включающему лиганд, спейсер, пептидный линкер и биомолекулу, к диагностической композиции и/или фармацевтической композиции, включающей конъюгат, к способу для диагностики и/или лечения заболевания, связанного с биомолекулой, с использованием конъюгата и т.п. Кроме того, настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему комплекс, образованный из лиганда и металла, и Fab фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 или Fab фрагмент антитела к человеческому MUC1. Кроме того, настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему комплекс, спейсер, пептидный линкер и биомолекулу.
Предпосылки создания изобретения
[0002] CEA (Карциноэмбриональный антиген) или CEACAM (родственная карциноэмбриональному антигену молекула клеточной адгезии) представляет собой опухолевый маркер, открытый в 1965 г. (J. Exp. Med.; 1965;121:439-462, PNAS; 1969;64:161-167), и к настоящему времени идентифицированы 23 CEA-родственные молекулы (BioMed Central Biology; 2010;8:12-33). Из них CEACAM5 редко экспрессируется в нормальных тканях, но экспрессируется в фетальном пищеварительном тракте и колоректальном раке (BBA; 1990;1032:177-189, J. Clin. Mol. Pathol.; 1999; 52:174-178). Кроме того, известно, что CEACAM5 также экспрессируется в раке молочной железы, раке легкого и раке щитовидной железы (Diagn. Cytopathol.; 1993;9:377-382, Cancer Res.; 1990; 50:6987-6994, Histopathology; 2000;37:530-535).
[0003] Концентрация CEACAM5 в крови выше у пациентов с колоректальным раком, чем у здоровых субъектов (J. Exp. Med.; 1965; 121:439-462), и CEACAM5 используют в качестве опухолевого маркера. В гистологическом исследовании пациентов с колоректальным раком высокая экспрессия CEACAM5 обнаружена в 90% или более тканей (British J. Cancer; 2013; 108:662-667).
Ранние метастазы колоректального рака локализуются в печени, и, таким образом, частоту рецидивов можно снизить, если можно обнаружить и лечить метастазы в печени на ранней стадии (Cell Mol. Gastroenterol. Hepatol.; 2017; 3:163-173).
Муцин 1 (Муцин 1: MUC1) представляет собой мембраносвязанный гликопротеин, экспрессирующийся на обращенной к просвету стороне эпителиальных клеток, образующих эпителиальные ткани молочной железы, трахеи пищеварительного тракта и т.п. (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1):45-60). MUC1 сверхэкспрессируется в раковых клетках рака молочной железы (Mod. Pathol., 2005 Oct; 18(10):1295-304), рака легкого (Hum. Pathol., 2008 Jan; 39(1):126-36), колоректального рака (Int. J. Oncol., 2000 Jan; 16(1):55-64), рака мочевого пузыря (PLoS One, 2014 Mar; 9(3):e92742), рака кожи (Histopathology, 2000, Sep; 37(3):218-23), рака щитовидной железы; (J. Pathol., 2003 Jul; 200(3):357-69.), рака желудка (J. Pathol., 2000 Mar; 190(4):437-43), рак поджелудочной железы (Int. J. Oncol., 2004 Jan; 24(1):107-13), рака почки (Mod. Pathol., 2004 Feb; 17(2):180-8), рака яичника (Gynecol. Oncol., 2007 Jun; 105(3):695-702), цервикального рака (Am. J. Clin. Pathol., 2004 Jul; 122(1):61-9) и т.п., и MUC1 является полезным в качестве молекулы-мишени для детекции раковых поражений (Nat. Rev. Cancer, 2004 Jan; 4(1):45-60, Pathol. Res. Pract., 2010 Aug15; 206(8):585-9).
MUC1 является O-гликозилированным по треонину 9 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO: 19 в перечне последовательностей настоящей заявки), которая представляет собой последовательность тандемного повтора из 20 аминокислот, присутствующую во внеклеточном домене. Известно, что это O-гликозилирование является неполным в раковых клетках и что O-гликозилирования, такие как T (Galβ1-3GalNAcα1-O-Ser/Thr), Tn (GalNAcα1-O-Ser/Thr) и 2,3ST (Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-O-Ser/Thr), происходят рак-специфическим образом (PTL 1 и NPL 1). MUC1 в нормальных тканях не подвергается этим рак-специфическим O-гликозилированиям, и, таким образом, рак-специфический MUC1 человека является особенно полезным в качестве молекулы-мишени для лечения различных типов рака у человека. В качестве такого антитела к человеческому рак-специфическому MUC1 известно, например, 1B2 антитело (PTL 1), PankoMab антитело (NPL 2) и 5E5 антитело (PTL 2). Из этих антител 1B2 антитело, как сообщалось, имеет более высокую специфичность в отношении человеческого рак-специфического MUC1, чем PankoMab антитело (PTL 1).
КТ (компьютерная томография), МРТ (ядерная магнитно-резонансная томография) и ФДГ-ПЭТ (позитронно-эмиссионная томография с использованием фтордезоксиглюкозы) используют для диагноза метастазов в печени. Чувствительность детекции КТ, МРТ и ФДГ-ПЭТ составляет 74,4, 80,3, и 81,4%, соответственно, и для опухолей 1 см или меньше чувствительность детекции снижается до 47,3% для КТ и 60,2% для МРТ. (Radiology; 2010; 257:674-684). Также используют МРТ печени с контрастированием, и чувствительность детекции этого метода составляет 29-38% для опухолей 1 см или меньше (Radiology; 2005; 237:89-98).
[0004] Противораковые средства и антитела, связанные с радиоизотопами металлов используют для диагностики и лечения рака. Таргетирование с использованием антитела является высокоспецифическим в отношении опухолевых клеток и имеет мало побочных эффектов. На сегодняшний день некоторые меченные радиоизотопами металлов моноклональные антитела клинически применяются в диагностике и лечении (Cancer Control; 2012; 19:196-203).
С другой стороны, антитела как правило, имеют долгий период полужизни в крови, и после их введения в организм необходим период от 4 дней до 5 дней для достижения отношения их содержания в опухоли к содержанию в крови, которое дает достаточный сигнал для визуализации рака (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87:586-592). Кроме того, Fc область антитела вызывает фармакологическое действие антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) или комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC) (Glycoconj. J.; 2013; 30:227-236, Curr. Opin. Biotechnol.; 2002; 13:609-614). Кроме того, антитела метаболизируются в печени, и, таким образом, они в высокой степени аккумулируются в печени независимо от мишени, но ранние метастазы колоректального рака локализуются в печени, и, таким образом, трудно определить поражения, такие как метастазы в печени, с использованием антитела (Clin. Pharmacol. Ther.; 2010; 87:586-592).
Низкомолекулярные рекомбинантные фрагменты антител, такие как Fab, scFv и диатело, обладают высокой способностью к пенетрации в ткани и легко достигают поражений, и ожидают, что их можно будет получить с малыми затратами с использованием системы экспрессии на основе Escherichia coli или дрожжей, и, таким образом, они используются в качестве антител для лечения, при этом они характеризуются как имеющие короткий период полужизни в крови и как экскретируемые почками и, таким образом, они были описаны для использования в качестве диагностических лекарственных средств (Nat. Biotechnol.; 2005; 23:1126-1136).
[0005] В качестве антитела к человеческому CEACAM5, применяемого как диагностическое лекарственное средство, известно M5A (PTL 3), которое представляет собой гуманизированное антитело из мышиного моноклонального антитела T84.66. Что касается M5A, меченного 64Cu, в испытании с использованием мыши с трансплантированными подкожно раковыми клетками сообщалось, что должно пройти 22 часа или более после введения, чтобы получить хорошее ПЭТ изображение (NPL 3), и кроме того, в испытании с использованием мышиной модели метастазов в печени сообщалось, что поглощение в нормальных тканях печени и поглощение в пораженных участках печени было почти одинаковым через 3 часа после введения, и что через 24 часа была существенная разница (NPL 4).
Что касается фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, сообщалось, что CEA-Scan, которое представляет собой мышиное моноклональное антитело NP-4 Fab', меченное 99mTc, можно использовать для диагностики колоректального рака (NPL 5). Однако поглощение CEA-Scan в пораженных участках не превышает поглощение в нормальных тканях печени, и чувствительность детекции метастазов в печени ниже, чем ФДГ-ПЭТ (NPL 6). CEA-Scan было одобрено FDA в качестве диагностического лекарственного средства для колоректального рака в 1999, но оно больше не продается (NPL 7).
DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота) имеет клинические результаты и широко используется в качестве хелатора для радиоактивного металла. В последние годы сообщалось об исследовании, в котором мечение металлом осуществляют с использованием DOTA, с последующим связыванием с пептидом и антителом и таргетированием (NPL 8).
Что касается лечения рака, сообщалось, что Сатореотид тетраксетан (NPL 9) находится в разработке в фазе I в качестве лекарственного средства, содержащего DOTA. Сообщалось, что 90Y-эпратузумаб тетраксетан вводили пациенту, имеющему гематологическую опухоль (NPL 10).
Как правило конъюгат, с которым связан хелатирующий агент, такой как DOTA, и низкомолекулярное антитело или пептид, в высокой степени поглощается, удерживается или аккумулируется в почках (NPLs 11 и 12).
Как описано выше, аккумуляция конъюгата в почках неудобна для точного диагноза и лечения (NPL 13).
[0006] Например, в испытании на мышах, получавших конъюгат [111In]DOTA-Ритуксан Fab, сообщалось, что он в высокой степени аккумулируется в почках (NPL 11).
Чтобы избежать такой высокой аккумуляции в почках, можно сослаться на первое исследование конъюгата, модифицированного до фрагмента антитела, такого как Fab, scFV, Fab' или dsFV, и второе исследование конъюгата, содержащего линкер (также указанный как пептидный линкер), специфически расщепляющийся в почках, между хелатом и антителом (NPL 12).
Сообщалось, что изначально, иодогиппуровая кислота-Gly-Lys-Fab, в которой пептидный линкер представляет собой Gly (глицин)-Lys (лизин), расщепляется ферментом мембраны почечной щеточной каемки, и иодогиппуровая кислота содержится в моче в виде метаболита и выводится (NPL 14). Кроме того, была описана иодогиппуровая кислота-Gly-Tys-Fab, в которой пептидный линкер представляет собой Gly-Tyr (тирозин) (NPL 13).
С другой стороны, сообщалось о [188Re]CpTR-Gly-Lys-Fab, в котором пептидный линкер Gly-Lys связан с ренийорганическим комплексом CpTR-COOH, а не с гиппуровой кислотой (NPL 15).
Кроме того, сообщалось о 99mTc-PGGFML-IT-Fab, в котором пептидный линкер представляет собой Gly-Phe (фенилаланин)-Lys (PTL 4).
Кроме того, фокусируясь на NOTA в качестве хелата, был описан конъюгат, состоящий из NOTA и пептидного линкера (PTL 5).
Конъюгат, содержащий пептидный линкер, был создан, но в зависимости от типа хелатирующего агента возникает проблема отсутствия расщепления ферментом, и конъюгат предназначен для решения проблемы путем введения связывающей части (-CH2-Ph-CO-NH-), имеющей специфическую структуру, между хелатирующим агентом и пептидным линкером (PTL 6). Цель состоит в том, чтобы получить конъюгат, содержащий лиганд, который может координировать атом, имеющий относительно большой атомный радиус, такой как индий, который обычно используется в качестве радиоизотопа. В качестве спейсера через хелат и пептидный линкер был введен спейсер, имеющий структуру тиомочевины, описанную в PTL 5, но указано, что разложение ферментом мембраны щеточной каемки почек не происходит.
О конъюгате 67Ga-NOTA-Met-Ile-Fab, в котором пептидным линкером, нацеленным на расщепление лизосомой, является Met (метионин)-Ile (изолейцин), сообщалось на основании следующих данных (NPL 16).
Сообщалось, что метаболит 67Ga-NOTA-Bn-Met, продуцируемый лизосомным расщеплением конъюгата NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv, не имеющего пептидного линкера, выводится с мочой (NPL 17), а второй от N-конца легкой цепи dsFv указанного выше конъюгата NOTA-(p-SCN-Bz)-dsFv представляет собой Ile, и поэтому был разработан конъюгат 67Ga-NOTA-Met-Ile-Her2 (Герцептин) Fab (NPL 19).
Перечень цитируемых документов
Непатентная литература
[0007] NPL 1: Glycoconj. J., 2013 Apr;30(3):227-36.
NPL 2: Cancer Immunol Immunother, 2006 Nov; 55(11): 1337-47
NPL 3: Bioconjug. Chem.; 2008; 19: 89-96
NPL 4: PLOS ONE; 2014; 9(9): e106921
NPL 5: Ann. Surg.; 1997; 226: 621-631
NPL 6: J. Nucl. Med.; 2000; 41: 1657-1663
NPL 7: Kenneth T.Cheng, "99mTc-Arcitumomab", [online], Update: March 17, 2008., Molecular Imaging and Contrast Agent Database, [searched on May 17, 2017], Internet <URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK23676/>
NPL 8: Bioorg. Med. Chem.; 2019; 27: 3248-3253
NPL 9: Clinical Trials. gov Identifier: NCT02592707
NPL 10: Eur J Haematol. 2013 Dec; 91(6): 552-6
NPL 11: Bioconjugate Chem. 2001, 12, 264-270
NPL 12: Bioconjugate Chem. 2002, 13, 985-995
NPL 13: Bioconjugate Chem. 2013, 24, 291-299
NPL 14: Cancer Res. 1999, 59, 128-134
NPL 15: Bioconjugate Chem. 2007, 18, 190-198
NPL 16: Bioconjugate Chem. 2014, 25, 2038-2045
NPL 17: Bioconjugate Chem. 1997, 8, 365-369CITATION LIST
Патентная литература
[0008] PTL 1: Международная публикация WO2010/050528
PTL 2: Международная публикация WO2008/040362
PTL 3: Международная публикация WO2005/086875
PTL 4: Международная публикация WO2013/081091
PTL 5: Международная публикация WO2017/150549
PTL 6: Международная публикация WO2019/065774
PTL 7: Международная публикация WO2018/092885
Сущность изобретения
Техническая задача
[0009] Одновалентный Fab-фрагмент имеет молекулярную массу около 50 кДа, меньше, чем антитело с молекулярной массой около 150 кДа, выводится почками и имеет короткий период полужизни в крови. Из-за этого в течение 2-32 часов после введения достигается соотношение опухоль/кровь, которое дает достаточный сигнал для визуализации рака. Fab-фрагмент не имеет области Fc и, следовательно, не вызывает ADCC или CDC. Fab-фрагмент в основном выводится почками и, таким образом, не мешает обнаружению метастазов в печени. Исходя из этих характеристик, можно ожидать, что Fab-фрагмент будет более эффективным в качестве диагностического препарата in vivo, чем антитело.
Однако в Fab-фрагменте связывающая активность Fab-фрагмента часто ослабляется из-за того, что он является одновалентным, а не двухвалентным, как антитело. Кроме того, чтобы использовать антитело в качестве диагностического лекарственного средства in vivo или средства, используемого в фотоиммунотерапии, антитело должно быть помечено металлом, флуоресцентным красителем и т.п., но проблема заключается в том, что при мечении таким веществом связывающая активность антитела ослабляется.
Целью настоящего изобретения является обеспечение меченого конъюгата, полезного для диагностического лекарственного средства in vivo и внутренней лучевой терапии с использованием Fab-фрагмента антитела против человеческого CEACAM5, связывающая активность которого не ослабляется даже при мечении металлом, флуоресцентным красителем или т.п. Целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгата, включающего Fab-фрагмент антитела против человеческого MUC1 (PTL 7), пептидный линкер и лиганд, и конъюгата, включающего Fab-фрагмент антитела против человеческого MUC1 и лиганд. Кроме того, другой целью настоящего изобретения является обеспечение диагностической композиции, включающей указанный выше конъюгат, и способа диагностики с ее использованием, а также фармацевтической композиции, включающей указанный выше конъюгат, и способа лечения с ее использованием.
Кроме того, целью настоящего изобретения является обеспечение конъюгата, содержащего хелатор и биомолекулу, аккумулирующуюся в почках и экскретируемую более быстро.
Решение задачи
[0010] Авторы настоящего изобретения ранее получили Fab-фрагмент антитела против человеческого CEACAM5, имеющий хорошее сродство к CEACAM5 человека (международная заявка PCT/JP2018/025618). В результате дополнительных тщательных исследований авторы настоящего изобретения получили конъюгат, в котором лиганд, используемый для мечения, связан с Fab-фрагментом антитела против человеческого CEACAM5 через пептидный линкер (или без него), и обнаружили, что конъюгат имеет такое же сродство к человеческому CEACAM5, как сам Fab-фрагмент антитела против человеческого CEACAM5, то есть активность связывания не ослабляется даже при связывании между метящей частью и Fab-фрагментом, что привело к созданию настоящего изобретения. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела против человеческого CEACAM5, пептидный линкер и лиганд, и конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела против человеческого CEACAM5 и специфический лиганд. Было подтверждено, что конъюгат не ослабляет связывающую активность с человеческим CEACAM5 даже при связывании между метящей частью и Fab-фрагментом, и сохраняет хорошую связывающую активность с человеческим CEACAM5, и, на основании этих результатов, обеспечивается средство для диагностики и средство для лечения с использованием конъюгата по настоящему изобретению.
[0011] Кроме того, авторы настоящего изобретения получили Fab-фрагмент антитела против человеческого MUC1, имеющий хорошее сродство к человеческому рак-специфическому MUC1, и в результате дальнейших тщательных исследований получили конъюгат, в котором лиганд связан с Fab-фрагментом антитела против человеческого MUC1 через пептидный линкер (или без него). Конъюгат имеет такое же сродство к человеческому рак-специфическому MUC1, что и сам Fab-фрагмент антитела против человеческого MUC1. Таким образом, настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела против человеческого MUC1, пептидный линкер и лиганд, и конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела против человеческого MUC1 и специфический лиганд. Кроме того, было подтверждено, что конъюгат не ослабляет активность связывания с человеческим рак-специфическим MUC1 даже при связывании метящей части и сохраняет хорошую активность связывания с человеческим рак-специфическим MUC1, и на основании этих результатов обеспечивается средство для диагностики и средство для лечения с использованием конъюгата по настоящему изобретению.
Кроме того, авторы настоящего изобретения изучили конъюгат, который экскретируется быстрее, поскольку конъюгат, состоящий из из комплекса, образованного из лиганда и металла (также указан как комплекс с металлом), спейсера, пептидного линкера и биомолекулы, такой как антитело, полезное в качестве лекарственного средства, такого как контрастное вещество или противораковое средство, может аккумулироваться в почках. В результате, авторы настоящего изобретения сфокусировались на DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота), которая имеет клинические результаты и широко используется в качестве хелатора для радиоактивного металла, и обнаружили, что конъюгат, состоящий из 3arm DOTA, специфического спейсера, специфического пептидного линкера и биомолекулы, разлагается в почках и выводится.
На основании вышеизложенного, настоящее изобретение относится к следующему конъюгату, включающему Fab антитела к CEACAM5, к диагностической композиции и/или фармацевтической композиции, включающей конъюгат, к способу для диагностики и/или лечения рака с использованием конъюгата и т.п. Кроме того, настоящее изобретение относится к следующему конъюгату, включающему Fab антитела к MUC1, к диагностической композиции и/или фармацевтической композиции, включающей конъюгат, к способу для диагностики и/или лечения рака с использованием конъюгата и т.п. Кроме того, настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему DOTA, спейсер, пептидный линкер и биомолекулу, быстро выводимому почками, к промежуточному продукту конъюгата и к способу для диагностики и/или лечения заболевания, связанного с биомолекулой, с использованием конъюгата и т.п.
[0012] [1] Конъюгат, представленный следующей формулой (I):
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
где
Fab1 представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, выбранный из группы, состоящей из
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2 и в которой глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4,
Fab1 связан с X через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab1;
X представляет собой пептидный линкер или связь;
S1 представляет собой спейсер или связь;
Y представляет собой лиганд; и
p представляет собой натуральное число от 1 до 25 и представляет количество (Y-S1-X), связанных с Fab1;
при условии, что, когда X представляет собой связь, S1 представляет собой -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или связь, и Y представляет собой 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (далее иногда сокращенно указана как DOTA).
[0013] [2] Конъюгат в соответствии с [1], где
Fab1 выбран из группы, состоящей из
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и в котором глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
[0014] [3] Конъюгат в соответствии с [2], где Fab1 включает Fab-фрагмент, включающий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 (далее указан как Fab2).
[4] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[3], где X представляет собой пептидный линкер, включающий пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом мембраны почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом.
[0015] [5] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[4], где
S1 представляет собой
-C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
-C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
-NH-(CH2)2-C(=O)-,
-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
-NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-,
-NH-(CH2)3-C(=O)-,
-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-(1,4-фенилен)-C(=O)-,
-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-,
спейсер, представленный любой из следующих формул (a)-(q), или связь,
[0016] [Химическая формула 1]
[0017] где R1 означает атом водорода, галоген или C1-6 алкил, и то же применимо к нижеследующему; и
X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-дифенилаланин-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3- или
(29) связь,
где Met представляет собой метионин, Ile представляет собой изолейцин, Gly представляет собой глицин, Lys представляет собой лизин, Phe представляет собой фенилаланин, Val представляет собой валин, Tyr представляет собой тирозин, Arg представляет собой аргинин, Asp представляет собой аспарагиновую кислоту, Z1 представляет собой группу, представленную следующей формулой (II-I) или (II-II), и -Lys*-Z2- представляет собой группу, представленную следующей формулой (III-I) или (III-II), Tyr*-CH2- представляет собой группу, представленную следующей формулой (IV), -Lys*-C(=S)- представляет собой группу, представленную следующей формулой (V), -Lys*-Z3- представляет собой группу, представленную следующей формулой (III-III), и
группа (A-3), (A-4) или (A-5) является такой, как представлено следующими формулами.
[0018] [Химическая формула 2]
[0019] [6] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)- или -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-, и
X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2- и
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-.
[7-1] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)- или следующую формулу
[0020] [Химическая формула 3]
,
и
X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
[0021] (1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6)-Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[7-2] Конъюгат в соответствии с [7-1], где S1 представляет собой -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)- или следующую формулу
[0022] [Химическая формула 4]
,
и
[0023] X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[8] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где S1 представляет собой -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, спейсер, представленный любой из следующих формул (a)-(q), или связь
[0024] [Химическая формула 5]
,
и
[0025] X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-дифенилаланин-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0026] [9] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где S1 представляет собой -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, спейсер, представленный любой из следующих формул (e)-(i) или (k), или связь
[0027] [Химическая формула 6]
,
и
[0028] X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[10] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где S1 представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, спейсер, представленный следующей формулой (f) или (g), или связь
[0029] [Химическая формула 7]
,
и
[0030] X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[11] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)- и
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-.
[12] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[13] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[14] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[5], где конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из соединений, представленных следующими формулами, и Fab1 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab1.
[0031] [Химическая формула 8]
[0032] [Химическая формула 9]
[0033] [Химическая формула 10]
[0034] [Химическая формула 11]
[0035] [Химическая формула 12]
[0036] [Химическая формула 13]
[0037] [15] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[14], где Y представляет собой дефероксамин (далее иногда сокращенно указан как DFO) или 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусную кислоту (далее иногда сокращенно указана как DOTA).
[16] Конъюгат в соответствии с [15], где Y представляет собой DFO.
[17] Конъюгат в соответствии с [15], где Y представляет собой DOTA.
[18] Конъюгат в соответствии с [17], где Y представляет собой 3arm DOTA или 4arm DOTA.
[19] Конъюгат в соответствии с [18], где Y представляет собой 3arm DOTA.
[20] Конъюгат в соответствии с [18], где Y представляет собой 4arm DOTA.
[21] Конъюгат в соответствии с любым из [15] или [17]-[20], где конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из соединений, представленных следующими формулами, и Fab1 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab1.
[0038] [Химическая формула 14]
,
[0039] [Химическая формула 15]
,
[0040] [Химическая формула 16]
,
[0041] [Химическая формула 17]
,
[0042] [Химическая формула 18]
,
[0043] [Химическая формула 19]
,
[0044] [Химическая формула 20]
,
[0045] [Химическая формула 21]
,
[0046] [Химическая формула 22]
,
[0047] [Химическая формула 23]
,
[0048] [Химическая формула 24]
[0049] [Химическая формула 25]
[0050] [Химическая формула 26]
[0051] [Химическая формула 27]
[0052] [Химическая формула 28]
[0053] [Химическая формула 29]
[0054] [Химическая формула 30]
[0055] [Химическая формула 31]
[0056]
Кроме того, конъюгат по настоящему изобретению может представлять собой смесь следующих двух конъюгатов.
[0057] [Химическая формула 27]
[0058] [Химическая формула 28]
[22] Конъюгат в соответствии с любым из [15] или [17]-[20], где конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из соединений, представленных следующими формулами, и Fab1 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab1.
[0059] [Химическая формула 32]
[0060] [23] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[22], где p представляет собой натуральное число от 1 до 5.
[24] Конъюгат в соответствии с любым из [1]-[20], где металл скоординирован с Y.
[25] Конъюгат в соответствии с любым из [21]-[22], где металл является скоординированым.
[26] Конъюгат в соответствии с [24] или [25], где металл представляет собой радиоизотоп металла.
[27] Конъюгат в соответствии с [26], где металл представляет собой 89Zr.
[28] Конъюгат в соответствии с [24] или [25], где металл представляет собой парамагнитный металлический ион.
[29] Конъюгат в соответствии с [28], где металл представляет собой Gd3+.
[30] Конъюгат в соответствии с любым из [24]-[29], где конъюгат представляет собой радиофармпрепарат для ПЭТ.
[0061] [31] Диагностическая композиция, включающая один или несколько конъюгатов в соответствии с любым из [24]-[30] и фармацевтически приемлемый носитель.
[32] Диагностическая композиция в соответствии с [31], где диагностическую композицию используют в качестве лекарственного средства для ранней диагностики или лекарственного средства для определения стадии заболевания.
[33] Диагностическая композиция в соответствии с любым из [31] или [32], где диагностическую композицию используют для диагностики рака, экспрессирующего человеческий CEACAM5.
[34] Диагностическая композиция в соответствии с [33], где рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак щитовидной железы или рак, возникший в результате его метастазирования.
[0062] [35] Фармацевтическая композиция, включающая один или несколько конъюгатов в соответствии с любым из [24]-[29] и фармацевтически приемлемый носитель.
[36] Фармацевтическая композиция в соответствии с [35], где фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию для лечения рака, экспрессирующего человеческий CEACAM5.
[37] Фармацевтическая композиция в соответствии с [36], где рак представляет собой колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак щитовидной железы или рак, возникший в результате его метастазирования.
[38] Применение одного или более в соответствии с любым из [24]-[29] для получения композиции для диагностики рака и/или фармацевтической композиции для лечения рака.
[0063] [39] Конъюгат в соответствии с любым из [24]-[30], где конъюгат используют для диагностики рака и/или лечения рака.
[40] Способ для диагностики рака, включающий введение одного или нескольких конъюгатов в соответствии с любым из [24]-[30] субъекту.
[41] Способ для лечения рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата в соответствии с любым из [24]-[30].
[42] Конъюгат, представленный следующей формулой (Ia)
[0064] [Химическая формула 33]
[0065] где
DOTA1: 3arm DOTA,
U: связь или -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- или -NH-C(=S)-
X: C или N
R1a, R1b: одинаковые или отличные друг от друга, H или C1-6 алкил,
при условии, что R1a и R1b вместе могут образовывать C1-6 алкилен;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25 и связан со смежным атомом углерода через p аминогруппы или тиольные группы в Биомолекуле1;
R1: H, галоген, C1-6 алкил или галоген C1-6 алкил,
R2: C1-6 алкил или галоген C1-6 алкил,
L2: Ile, Gly, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -NHCH(CHCH3N3)C(=O)- или -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, C1-6 алкил,
R4: H, C1-6 алкил,
L3: связь, Arg или His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- или связь,
V1: группа, представленная любой из следующих формул (A-1)-(A-5),
[0066] [Химическая формула 34]
[0067] или группы -L3-L4-V1- вместе образуют следующую формулу
[0068] [Химическая формула 35]
[0069] Биомолекула1: биомолекула
[0070] [Химическая формула 36]
[0071] [43] Конъюгат в соответствии с [42], где L3, L4 и V1 представляют собой следующие группы.
L3: связь, Arg или His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- или связь,
V1: группа, представленная любой из следующих формул (A-1)-(A-5),
[0072] [Химическая формула 37]
[0073] [44]
Конъюгат в соответствии с [43], где
группы -L3-L4-V1- вместе образуют следующую формулу.
[0074] [Химическая формула 38]
[0075] [45]
Конъюгат, представленный следующей формулой (Ib)
[0076] [Химическая формула 39]
[0077] где
DOTA1: 3arm DOTA,
U: связь или -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- или -NH-C(=S)-
X: C или N
R1a, R1b: одинаковые или отличные друг от друга, H или C1-6 алкил,
при условии, что R1a и R1b вместе могут образовывать C1-6 алкилен;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25 и связан со смежным атомом углерода через p аминогруппы или тиольные группы в Биомолекуле2;
R1: H, галоген, C1-6 алкил или галоген C1-6 алкил,
R2: C1-6 алкил или галоген C1-6 алкил,
L2: Ile, Gly, Ala, Val, Phe, -NHCH(CHCH3NR3R4)C(=O)-, -NHCH(CHCH3N3)C(=O)- или -NHCH(CHCH3CH2CH2CH3)C(=O)-,
R3: H, C1-6 алкил,
R4: H, C1-6 алкил,
L3: связь, Arg или His,
L4: -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- или связь,
V1: группа, представленная любой из следующих формул (A-1)-(A-5),
[0078] [Химическая формула 40]
[0079] или группы -L3-L4-V1- вместе образуют следующую формулу
[0080] [Химическая формула 41]
[0081]
Биомолекула2: Fab-фрагмент антитела
[0082] [Химическая формула 42]
[0083] [46-1] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[45], где конъюгат имеет следующую формулу (Ic):
[0084] [Химическая формула 43]
[0085] где
L3: связь,
L4: -NH-(CH2)2- или -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-,
Биомолекула: Биомолекула1 или Биомолекула2.
[46-2] Конъюгат в соответствии с [46-1], где в формуле (Ic),
L3 представляет собой связь, и
L4 представляет собой -NH-(CH2)2-.
[47-1] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[46-2], где конъюгат представлен следующей формулой (Id):
[0086] [Химическая формула 44]
[0087] где
L3: связь,
L4: -NH-(CH2)2- или -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-,
Биомолекула: Биомолекула1 или Биомолекула2
конъюгат в соответствии с любым из [42]-[45].
[47-2] Конъюгат в соответствии с [47-1], где в формуле (Id),
L3 представляет собой связь, и
L4 представляет собой -NH-(CH2)2-.
[48]
[0089] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[47-2], где V1 представляет собой любую из следующих формул (A-3)-(A-5).
[0088] [Химическая формула 45]
[49]
Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[48], где группа (B) в формуле (Ia) или (Ib)
[0090] [Химическая формула 46]
[0091] представляет собой группу, выбранную из группы, состоящей из следующих формул (B-1)-(B-7).
[0092] [Химическая формула 47]
[0093] [Химическая формула 48]
[0094] [50] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[49], где конъюгат выбран из группы, состоящей из соединений, представленных следующими формулами.
[0095] [Химическая формула 49]
[0096] [Химическая формула 50]
[0097] [Химическая формула 51]
[0098] [Химическая формула 52]
[0099] [Химическая формула 53]
[0100] [Химическая формула 54]
[0101] [Химическая формула 55]
[51-1]
Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[50], где Биомолекула1 и Биомолекула2 каждая представляет собой биомолекулу или Fab-фрагмент антитела, отличный от следующих Fab-фрагментов антител:
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, выбранного из группы, состоящей из Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2 и в которой глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.
[51-2]
Конъюгат в соответствии с [51-1], где Биомолекула1 и Биомолекула2 каждая представляет собой биомолекулу или Fab-фрагмент антитела, отличный от следующих Fab-фрагментов антител:
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2 и в которой глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4,
(c) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, или
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включающего фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и в котором глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую легкую цепь, представленную в SEQ ID NO: 4.
[0102] [52] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[51-2], где Биомолекула1 или Биомолекула2 представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, выбранный из группы, состоящей из следующих (a) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16,
и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, выбранного из группы, состоящей из Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, включающего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и в которой глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16.
[53] Конъюгат в соответствии с [52], где Биомолекула1 или Биомолекула2 представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, выбранный из группы, состоящей из следующих (a) и (b):
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, включающего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10; и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, включающего фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
[0103] [54] Конъюгат в соответствии с [53], где Биомолекула1 или Биомолекула2 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
[55] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[54], где p представляет собой натуральное число от 1 до 4.
[56] Конъюгат в соответствии с любым из [42]-[55], где металл скоординирован с DOTA1.
[57] Конъюгат в соответствии с [56], где металл представляет собой радиоизотоп металла.
[58] Конъюгат в соответствии с [57], где металл представляет собой 89Zr.
[59] Конъюгат в соответствии с [56], где металл представляет собой парамагнитный металлический ион.
[60] Конъюгат в соответствии с [59], где металл представляет собой Gd3+.
[61] Конъюгат в соответствии с любым из [56]-[60], где конъюгат представляет собой радиофармпрепарат для ПЭТ.
[62] Диагностическая композиция, включающая один или несколько конъюгатов в соответствии с любым из [56]-[61] и фармацевтически приемлемый носитель.
[63] Диагностическая композиция в соответствии с [62], где диагностическую композицию используют в качестве лекарственного средства для ранней диагностики или лекарственного средства для определения стадии заболевания.
[64] Диагностическая композиция в соответствии с любым из [62] или [63], где диагностическую композицию используют для диагностики заболевания, связанного с Биомолекулой1 или Биомолекулой2.
[65] Диагностическая композиция в соответствии с [64], где заболевание, связанное с Биомолекулой1 или Биомолекулой2 представляет собой заболевание, связанное с MUC1.
[66] Диагностическая композиция в соответствии с [65], где диагностическую композицию используют для диагностики рака, экспрессирующего MUC1.
[67] Диагностическая композиция в соответствии с [66], где рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника или цервикальный рак.
[0104] [68] Фармацевтическая композиция, включающая один или несколько конъюгатов в соответствии с любым из [56]-[60] и фармацевтически приемлемый носитель.
[69] Фармацевтическая композиция в соответствии с [68], где фармацевтическую композицию используют для диагностики заболевания, связанного с Биомолекулой1 или Биомолекулой2.
[70] Фармацевтическая композиция в соответствии с [69], где заболевание, связанное с Биомолекулой1 или Биомолекулой2 представляет собой заболевание, связанное с MUC1.
[71] Фармацевтическая композиция в соответствии с [70], где фармацевтическая композиция представляет собой фармацевтическую композицию для лечения рака, экспрессирующего MUC1.
[72] Фармацевтическая композиция в соответствии с [71], где рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника или цервикальный рак.
[73] Применение одного или более в соответствии с любым из [56]-[60] для получения композиции для диагностики рака и/или фармацевтической композиции для лечения рака.
[74] Конъюгат в соответствии с любым из [56]-[60], где конъюгат используют для диагностики рака и/или лечения рака.
[75] Способ для диагностики рака, включающий введение субъекту одного или нескольких конъюгатов в соответствии с любым из [56]-[60].
[76] Способ для лечения рака, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата в соответствии с любым из [56]-[60].
Полезные эффекты изобретения
[0105] Конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, пептидный линкер и лиганд, и конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 и специфический лиганд, описанные в настоящем изобретении, имеют отличную активность связывания с человеческим CEACAM5. На основании этого ожидают, что конъюгат по настоящему изобретению, дополнительно включающий металл, будет полезным для диагностики и/или лечения рака. Кроме того, конъюгат, включающий Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, пептидный линкер и лиганд, описанный в настоящем изобретении, обладает отличной активностью связывания с человеческим MUC1. Конъюгат, состоящий из 3arm DOTA, спейсера, пептидного линкера и биомолекулы, описанный в настоящем изобретении, выводится почками более быстро. На основании этого ожидают, что конъюгат по настоящему изобретению, дополнительно включающий металл, будет полезным для диагностики и/или лечения рака.
Краткое описание чертежей
[0106] [Фиг. 1] Фиг. 1 представляет ПЭТ/КТ изображение, полученное примерно через 3 часа после введения PBS раствора, содержащего раствор конъюгата 64Cu-белка (A).
[Фиг. 2] Фиг. 2 представляет ПЭТ/КТ изображение, полученное примерно через 3 часа после введения PBS раствора, содержащего раствор конъюгата 64Cu-белка (B).
[Фиг. 3] Фиг. 3 представляет SUV (стандартизированный показатель накопления).
Описание вариантов осуществления
[0107] Настоящее изобретение будет подробно описано ниже, но настоящее изобретение не ограничивается этим. Если не указано иное, научные и технические термины, используемые в контексте настоящего изобретения, должны иметь значения, общеизвестные специалистам в данной области техники.
"Алкил" означает линейную или разветвленную насыщенную углеводородную цепь и означает одновалентную группу.
"C1-6 алкил" относится к алкилу, содержащему от 1 до 6 атомов углерода, такому как метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, н-пентил или н-гексил. В одном варианте осуществления C1-6 алкил представляет собой C1-4 алкил, в одном варианте осуществления C1-6 алкил представляет собой метил или этил, и в одном варианте осуществления C1-6 алкил представляет собой метил.
"C1-6 алкилен" представляет собой двухвалентную группу, полученную путем удаления водорода из указанного выше C1-6 алкила. В одном варианте осуществления C1-6 алкилен представляет собой метилен, этилен, пропилен, метилметилен или т.п.
"Галоген" означает F, Cl, Br или I.
"Галоген C1-6 алкил" представляет собой C1-6 алкил, замещенный одним или несколькими галогенами. В одном варианте осуществления галоген C1-6 алкил представляет собой C1-6 алкил, замещенный 1-5 галогенами, и в одном варианте осуществления галоген C1-6 алкил представляет собой CF3.
[0108] 1-1. Конъюгат по настоящему изобретению
Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой (I):
(Y-S1-X)p-Fab1 (I)
где
Fab1 представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, и Fab1 связан с X через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab1,
X представляет собой пептидный линкер или связь,
S1 представляет собой спейсер или связь,
Y представляет собой лиганд, и
p представляет собой натуральное число от 1 до 25 и представляет собой количество (Y-S1-X), связанных с Fab1,
при условии, что, когда X представляет собой связь, S1 представляет собой -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или связь, и Y представляет собой
[0110] группу, представленную следующей формулой
[0109] [Химическая формула 56]
.
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 (Fab1)
Далее будет описан Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, представленный как "Fab1" в формуле (I).
Основная структура молекулы антитела является общей для каждого класса и состоит из тяжелой цепи с молекулярной массой от 50000 до 70000 и легкой цепи с молекулярной массой от 20000 до 30000. Тяжелая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, включающей около 440 аминокислот, имеет характерную структуру для каждого класса и называется γ, μ, α, δ или цепью, соответствующей IgG, IgM, IgA, IgD или IgE, соответственно. Кроме того, IgG включает IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4, которые называются γ1, γ2, γ3 и γ4, соответственно. Легкая цепь обычно состоит из полипептидной цепи, включающей около 220 аминокислот, и известны два типа, L-тип и K-тип, которые называются λ и κ цепями, соответственно. Пептидная конфигурация основной структуры молекулы антитела такова, что две гомологичные тяжелые цепи и две гомологичные легкие цепи связаны дисульфидными связями (S-S-связями) и нековалентными связями, а молекулярная масса составляет от 150000 до 190000. Две легкие цепи могут быть спарены с любой тяжелой цепью. Каждая молекула антитела всегда состоит из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей.
Есть четыре внутрицепочечных S-S связи в тяжелой цепи (пять для μ и ε цепей) и две внутрицепочечные S-S связи в легкой цепи; одна петля образуется на каждые 100-110 аминокислотных остатков, и эта стерическая структура одинакова среди петель и называется структурной единицей или доменом. Домены, расположенные на N-концах как тяжелой цепи, так и легкой цепи, называются вариабельными областями, потому что их аминокислотные последовательности непостоянны даже в аутентичном образце из одного и того же класса (подкласса) одного и того же вида животных, и их соответствующие домены называются вариабельной областью тяжелой цепи (VH) и вариабельной областью легкой цепи (VL). Аминокислотная последовательность, расположенная ближе к C-концевой стороне, чем к N-концу, почти постоянна для каждого класса или подкласса и называется константной областью, и каждый из доменов представлен как CH1, CH2, CH3 или CL.
[0111] Специфичность связывания антитело-антиген зависит от аминокислотной последовательности части, состоящей из VH и VL. С другой стороны, биологическая активность, такая как связывание с комплементами и различными клетками, отражает различия в структуре константной области между классами Ig. Было обнаружено, что вариабельность вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи в основном ограничена тремя небольшими гипервариабельными областями, присутствующими в обеих цепях, и эти области называются определяющими комплементарность областями (CDR; CDR1, CDR2 и CDR3, начиная с N-конца). Остальная часть вариабельной области называется каркасной областью (FR) и является относительно постоянной.
[0112] Область между доменом CH1 и доменом CH2 константной области тяжелой цепи антитела называется шарнирной областью, и эта область включает много пролиновых остатков и включает множество межцепочечных S-S-связей, соединяющих две тяжелые цепи. Например, шарнирные области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 включают 2, 4, 11 и 2 цистеиновых остатка, соответственно, которые составляют S-S связи между тяжелыми цепями. Шарнирная область является областью, очень чувствительной к протеолитическим ферментам, таким как папаин или пепсин. Когда антитело расщепляется папаином, его тяжелая цепь расщепляется в положении, более близком к N-концевой стороне, чем к SS-связи шарнирной области между тяжелыми цепями, и антитело расщепляется на два Fab-фрагмента и один Fc фрагмент. Fab-фрагмент состоит из легкой цепи и фрагмента тяжелой цепи, включающего вариабельную область тяжелой цепи (VH), домен CH1 и часть шарнирной области. Fab-фрагмент включает вариабельную область и обладает антиген-связывающей активностью.
В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент, имеющий следующие характеристики:
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.
[0113] В качестве константной области тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, можно выбрать любую константную область, такую как Igγ1, Igγ2, Igγ3 или Igγ4. В одном варианте осуществления константная область тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой константную область Igγ1 человека.
В качестве константной области легкой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, можно выбрать любую константную область Igλ или Igκ. В одном варианте осуществления константная область легкой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой константную область Igκ1 человека.
В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой следующий Fab2 фрагмент:
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включающий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4 (указан как Fab2).
Известно, что когда антитело, включающее Fab-фрагмент, экспрессируется в клетке, антитело претерпевает посттрансляционную модификацию. Примеры посттрансляционной модификации включают расщепление лизина на С-конце тяжелой цепи карбоксипептидазой, модификацию глутамина или глутаминовой кислоты на N-концах тяжелой цепи и легкой цепи до пироглутаминовой кислоты путем пироглутамилирования, гликозилирования, окисления, деамидирования и гликозилирования, и известно, что такая посттрансляционная модификация встречается в различных антителах (J. Pharm. Sci.; 2008; 97: 2426-2447).
Fab-фрагмент антитела к CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, также может включать Fab-фрагмент, полученный в результате посттрансляционной модификации. Примеры Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 по настоящему изобретению, который может быть получен путем посттрансляционной модификации, включают Fab-фрагмент пироглутамилированного антитела к человеческому CEACAM5 на N-конце тяжелой цепи. В данной области известно, что такая посттрансляционная модификация посредством N-концевого полиглутамилирования не влияет на активность антитела (Anal. Biochem.; 2006; 348:24-39).
[0114] в одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, имеющий следующие характеристики:
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности аминокислот 1-121 SEQ ID NO: 2 и в которой глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, имеющий следующие характеристики:
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и в котором глутаминовая кислота, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 2, модифицирована до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
В другом варианте осуществления Fab-фрагмент антитела к CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, имеющий следующие характеристики:
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, включающую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 31-35 SEQ ID NO: 2, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 50- 66 SEQ ID NO: 2, и CDR3 состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 99-110 SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, включающую CDR1, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 24-38 SEQ ID NO: 4, CDR2, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 54-60 SEQ ID NO: 4, и CDR3, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 93-101 SEQ ID NO: 4.
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, связывается с человеческим CEACAM5. Примеры способа для измерения активности связывания полученного Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 с человеческим CEACAM5 включают способы, такие как анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) и ELISA. Например, когда используют SPR анализ, константу скорости связывания (ka), константу скорости диссоциации (kd) и константу диссоциации (KD) можно измерить путем иммобилизации набора Biotin CAPture Kit (GE Healthcare Japan Corporation) и биотинилированного человеческого CEACAM5 на сенсорном чипе с использованием Biacore T200 (GE Healthcare Japan Corporation) и добавления серийно разведенного Fab-фрагмента.
Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, легко может быть получен специалистом в данной области техники с использованием известного в данной области способа на основании информации о последовательности фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 по настоящему изобретению, раскрытого в настоящей заявке. Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 по настоящему изобретению конкретно не ограничивается, и его можно получить, например, в соответствии со способом, описанным в разделе <Способ для получения Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению>, описанном ниже.
[0115] 1-2. Лиганд
"Лиганд" представляет собой фрагмент конъюгата, который может образовывать хелатный комплекс с металлом, и означает группу, образованную хелатирующим агентом. Образованная группа относится к группе, которая имеет связь в результате удаления протона из хелатирующего агента. Группа, образованная хелатирующим агентом, связывается с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5 непосредственно или через спейсер и/или пептидный линкер.
"Хелатирующий агент" относится к соединению, которое может вступать в координацию с металлом. Примеры "хелатирующего агента" в контексте настоящей заявки включают сидерофор и не-сидерофор. Примеры сидерофора включают сидерофор типа гидроксамовой кислоты, катехолового типа и смешанно-лигандного типа. Примеры сидерофора типа гидроксамовой кислоты включают феррихром,
[0117] дефероксамин (DFO), представленный следующей формулой:
[0116] [Химическая формула 57]
фузаринин C, орнибактин и родоторуловую кислоту. Примеры катехолового типа сидерофора включают энтеробактин, бациллибактин и вибриобактин. Примеры сидерофора смешанно-лигандного типа включают азотобактин, пиовердин и иерсиниабактин. В случае сидерофоров, описанных выше, DFO может подвергаться взаимодействовию со спейсером или пептидным линкером через -NH2, которая представляет собой его реакционноспособную функциональную группу, и в случае сидерофоров, отличных от DFO, они также могут подвергаться взаимодействовию со спейсером или пептидным линкером через реакционноспособную функциональную группу, такую как карбоксильная группа, гидроксильная группа или амино группа, способом, обычно используемым специалистами в данной области техники.
Примеры не-сидерофора включают
[0119] DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота, CAS номер: 60239-18-1), представленную следующей формулой:
[0118] [Химическая формула 58]
DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота, CAS номер: 67-43-6), DTPA-BMA (1,7-бис(метилкарбамоилметил)-1,4,7-триазагептан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS номер: 119895-95-3), EOB-DTPA (N-[(2S)-2-[бис(карбоксиметил)амино]-3-(4-этоксифенил)пропил]-N-[2-[бис(карбоксиметил)амино]этил]глицин, CAS номер: 158599-72-5), TTHA (триэтилентетрамингексауксусная кислота, CAS номер: 869-52-3), DO3A (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS номер: 217973-03-0), HP-DO3A (10-(2-гидроксипропил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7-триуксусная кислота, CAS номер: 120041-08-9) и их известные реакционноспособные производные.
DOTA может подвергаться взаимодействию со спейсером или пептидным линкером через одну из карбоновых кислот, которые являются ее реакционноспособными функциональными группами (далее DOTA, содержащая три карбоновых кислоты, связанных таким образом, иногда представлена как 3arm DOTA (PLoS One. 2019 Mar 22;14(3):e0213397)).
Из DOTA, примеры 3arm DOTA включают следующие.
[0120] [Химическая формула 59]
[0121] Альтернативно, DOTA, в которой четыре карбоновых кислоты поддерживаются (далее иногда представлена как 4arm-DOTA) с использованием реагента p-SCN-Bn-DOTA следующей формулы, также может подвергаться взаимодействию со спейсером или пептидным линкером.
[0122] [Химическая формула 60]
[0123] Примеры варианта осуществления "хелатирующего агента", который образует лиганд, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, включают DFO, DOTA, DTPA, DTPA-BMA, EOB-DTPA, DO3A и HP-DO3A. В одном варианте осуществления хелатирующий агент представляет собой DFO или DOTA.
Соединения и конъюгаты, представленные в настоящей заявке, также включают их свободные формы и соли, если не указано иное. «Их соли» представляют собой соли, которые, когда кислотно-аддитивная соль или соль с основанием могут быть образованы в зависимости от типа заместителя соединения и его конъюгата, могут быть образованы соединением и конъюгатом. Их конкретные примеры включают кислотно-аддитивные соли с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, бромистоводородная кислота, йодистоводородная кислота, серная кислота, азотная кислота и фосфорная кислота, а также с органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, фумаровая кислота, малеиновая кислота, молочная кислота, яблочная кислота, миндальная кислота, винная кислота, дибензоилвинная кислота, дитолуоилвинная кислота, лимонная кислота, метансульфоновая кислота, этансульфоновая кислота, бензолсульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота, соли с неорганическими основаниями, такими как натрий, калий, магний, кальций и алюминий, и с органическими основаниями, такими как метиламин, этиламин, этаноламин, лизин и орнитин, соли с различными аминокислотами и производными аминокислот, такими как ацетиллейцин, и соли аммония. Например, DFO также существует в виде метансульфоната дефероксамина и другой соли. DTPA существует в виде натриевой соли DTPA, а также в свободной форме.
[0124] Конъюгат по настоящему изобретению, включающий металл, может использоваться для различных контрастных агентов и/или терапевтических средств для лечения рака и используется, например, для контрастного агента для МРТ и агента, используемого для ПЭТ визуализации.
Примеры варианта осуществления «хелатирующего агента» при использовании для контрастного агента для МРТ включают сидерофорные и не сидерофорные хелатирующие агенты, описанные выше.
Примеры варианта осуществления «хелатирующего агента» при использовании для ПЭТ визуализации включают сидерофорные и не сидерофорные хелатирующие агенты, описанные выше, и в одном варианте осуществления хелатирующим агентом является DFO или DOTA.
В конъюгате по настоящему изобретению хелатирующий агент может включать металл. В контексте настоящей заявки термин «металл» означает парамагнитный металлический ион или радиоизотоп металла. Металл конкретно не ограничивается при условии, что он представляет собой металл, который координируется с каждым хелатирующим агентом. Подходящую комбинацию хелатирующего агента и металла выбирают в соответствии с предполагаемым применением конъюгата.
[0125] Парамагнитный металлический ион предпочтительно используют для контрастного агента в МРТ. Примеры варианта осуществления парамагнитного металлического иона включают, но не ограничиваются этим, Fe2+, Fe3+, Cu2+, Ni2+, Rh2+, Co2+, Gd3+, Eu3+, Dy3+, Tb3+, Pm3+, Nd3+, Tm3+, Ce3+, Y3+, Ho3+, Er3+, La3+, Yb3+, Mn3+ или Mn2+. В одном варианте осуществления парамагнитный металлический ион представляет собой Gd3+, Mn3+, Mn2+, Fe2+ или Fe3+. В одном варианте осуществления парамагнитный металлический ион представляет собой Gd3+. В одном варианте осуществления парамагнитный металлический ион представляет собой Mn3+ или Mn2+. В этом случае галоген или т.п. можно использовать в качестве противоаниона в конъюгате. Кроме того, противоанион может представлять собой лиганд C(=O)O-, и, кроме того, конъюгат может содержать противокатион, такой как Na+.
Радиоизотоп металла используют для радиофармпрепарата для ПЭТ и т.п. Примеры варианта осуществления радиоизотопа металла включают, но не ограничиваются этим, 89Zr, 52Mn, 52Fe, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 72As, 90Y, 99mTc, 111In или 177Lu. Примеры варианта осуществления радиоизотопа металла, используемого для радиофармпрепарата для ПЭТ, радиофармпрепарата для ОФЭКТ и т.п., включают 89Zr, 64Cu, 67Ga, 68Ga, 99mTc или 111In. В одном варианте осуществления радиоизотоп металла представляет собой радиоизотоп циркония (Zr). В одном варианте осуществления радиоизотоп металла представляет собой 89Zr. Примеры варианта осуществления радиоизотопа металла, используемого для лечения рака, включают 90Y или 177Lu.
Вариант осуществления конъюгата по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DFO, с которым скоординирован 89Zr. Другой вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, с которой скоординирован радиоизотоп металла, состоящий из 90Y, 67Ga, 68Ga и 177Lu. Еще один вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, с которой скоординирован парамагнитный металлический ион, состоящий из Gd3+ и Y3+. Еще один вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y DOTA, с которой скоординирован Gd3+.
[0126] 1-3. Пептидный линкер или связь
В конъюгате по настоящему изобретению лиганд (Y) или спейсер (S1) и Fab1 могут быть непосредственно связаны (т.е. X представляет собой связь) или могут быть связаны через пептидный линкер (т.е. X представляет собой пептидный линкер).
В контексте настоящей заявки "пептидный линкер" представляет собой линкер, включающий пептид, состоящий из 2-4 аминокислот и, если желательно, имеет присоединения Z1 - Z3 или т.п., подходящие для связывания с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5. При этом, пептид, включенный в пептидный линкер, конкретно не ограничивается и предпочтительно представляет собой пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, каждая из которых выбрана из группы, состоящей из глицина (Gly), лизина (Lys), метионина (Met), изолейцина (Ile), фенилаланина (Phe), валина (Val), тирозина (Tyr), аргинина (Arg), аланина (Ala), глутамина (Gln), глутаминовой кислоты (Glu), аспарагина (Asn), аспарагиновой кислоты (Asp), гистидина (His) и лейцина (Leu), 3-(2-нафтил)аланина и дифенилаланина, и более предпочтительно пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, каждая из которых выбрана из группы, состоящей из глицина, лизина, метионина, изолейцина, фенилаланина, валина, тирозина, аспарагиновой кислоты, аргинина, 3-(2-нафтил)аланина и дифенилаланина. Если не указано иное, конфигурация аминокислотных остатков, отличных от глицина, представляет собой L-форму.
[0127] Вариант осуществления пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, который включает пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, имеющих аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом мембраны почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом, а также может иметь присоединение, находящееся между пептидным линкером и биомолекулой или Fab-фрагментом антитела. Сообщалось, что пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом мембраны почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом, специфически расщепляется этими ферментами, присутствующими в почках, таким образом, уменьшая аккумуляцию метящей части в почках, и что можно ожидать уменьшения риска воздействия на почки и почечного расстройства. Например, Adv Drug Deliv Rev. 2008 Sep;60(12):1319-28., Bioconjug Chem. 2005 Nov-Dec; 16(6):1610-6. и Cancer Res. 1999 Jan 1; 59(1):128-34. раскрывают, что глицин-лизиновый линкер специфически расщепляется ферментом мембраны почечной щеточной каемки, присутствующим в почках. Японский патент № 6164556 раскрывает, что линкер глицин-фенилаланин-лизин специфически расщепляется в почках ферментом мембраны почечной щеточной каемки; кроме того, Bioconjug Chem. 2002 Sep-Oct; 13(5):985-95. раскрывает, что линкер, включающий последовательность глицин-лейцин-глицин-лизин, специфически расщепляется в почках ферментом мембраны почечной щеточной каемки; и кроме того, Bioconjug Chem. 2013 Feb 20;24(2):291-9. раскрывает, что глицин-тирозиновый линкер специфически расщепляется ферментом мембраны почечной щеточной каемки. Кроме того, Bioconjug Chem. 2014 Nov 19;25(11):2038-45 раскрывает, что линкер, включающий последовательность метионин-изолейцин, специфически расщепляется лизосомальным ферментом, присутствующим в почках. Вариант осуществления пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из метионин-изолейцин, глицин-лизин, глицин-фенилаланин-лизин, метионин-валин-лизин, глицин-тирозин, глицин-лизин-лизин и глицин-аргинин-лизин, аспарагиновая кислота-глицин-лизин, метионин-глицин-лизин, метионин-изолейцин-лизин, глицин-тирозин-лизин, глицин-валин, глицин-изолейцин, метионин-фенилаланин-лизин, глицин-(3-(2-нафтил)аланин)-лизин и глицин-дифенилаланин-лизин. Вариант осуществления представляет собой пептидный линкер, включающий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из метионин-изолейцин аспарагиновая кислота-глицин-лизин, глицин-фенилаланин-лизин, метионин-глицин-лизин, глицин-лизин и глицин-(3-(2-нафтил)аланин)-лизин.
[0128] "Пептидный линкер" необязательно может иметь присоединение, подходящее для связывания с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5, где присоединение, подходящее для связывания с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5, представляет собой группу, которая, согласно законам органической химии, образует связь между пептидной линкерной частью и амино группой или тиольной группой Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, и вариант его осуществления представляет собой группу, включающую образованную из малеимида группу (например, группу, представленную следующей формулой (II-I) или (II-II)) или образованную из изотиоцианата группу (-NH-C(=S)-) на конце. Вариант осуществления представляет собой -NH-(CH2)2-Z1-, -CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-, -C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- или -NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, где Z1 представлен следующей формулой (II-I) или (II-II). Кроме того, следующая формула (II-I) может быть записана как-Z1(#N)-, а следующая формула (II-II) может быть записана как -Z1(#S)-.
Присоединение образует пептидный линкер путем связывания с амино группой или карбоксильной группой аминокислоты на конце пептида, или с амино группой (например, лизин) или гидроксильной группой (например, тирозин) в боковой цепи аминокислоты. Примеры присоединения, которое образует пептидный линкер путем связывания с функциональной группой в боковой цепи аминокислоты на конце пептида, включают группу, представленную следующей формулой (III-I) или (III-II) в качестве присоединения, интегрированного с Lys, и здесь эти два обобщенно указаны как -Lys*-Z2-. Следующая формула (III-I) может быть представлена как -Lys*-Z2(#N)-, и следующая формула (III-II) может быть представлена как -Lys*-Z2(#S)-. Следующая формула (III-III) может быть представлена как -Lys*-Z3-.
[0129] [Химическая формула 61]
[0130] Кроме того, аналогичным образом в настоящей заявке группа, представленная следующей формулой (IV), и группа, представленная следующей формулой (V), которые имеют структуру, в которой функциональная группа в боковой цепи концевой аминокислоты и присоединение связаны, представлены как -Tyr*-CH2- и -Lys*-C(=S)-, соответственно.
[0131] [Химическая формула 62]
[0132] Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, который включает присоединение. Вариант осуществления представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-дифенилаланин-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0133] Кроме того, вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)- и
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-.
Вариант осуществления представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(13) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-Lys*-Z2-,
(14) -Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(15) -Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(16) -Gly-Val-NH-(CH2)2-Z1-,
(17) -Gly-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(19) -Gly-Tyr-Lys*-Z2-,
(20) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(22) -Gly-дифенилаланин-Lys*-Z2-,
(23) -Gly-Tyr-NH-(CH2)5-Z1-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0134] Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(7) -Gly-Arg-Lys*-Z2- и
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-.
Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2- и
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-.
[0135] Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2- и
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-.
Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(5) -Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1-,
(6) -Gly-Lys-Lys*-Z2-,
(8) -Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0136] Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0137] Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1) -Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(9) -Met-Ile-NH-(CH2)2-NH-C(=S)-NH-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)- и
(27) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)-.
Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(4) -Met-Val-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(18) -Met-Phe-Lys*-Z2- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
Вариант осуществления "X" пептидного линкера представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0138] 1-4. Спейсер или связь (S1)
В конъюгате по настоящему изобретению лиганд (Y) и пептидный линкер (X) непосредственно связаны (т.е. S1 представляет собой связь) или связаны через спейсер (т.е. S1 представляет собой спейсер).
В контексте настоящей заявки S1 "спейсер" представляет собой группу, введенную для создания определенного расстояния между лигандом и пептидным линкером или Fab1, или для связывания между лигандом и пептидным линкером, и примеры варианта его осуществления включают -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)- и спейсеры, представленные следующими формулами (a)-(q).
[0139] [Химическая формула 63]
[0140] В одном варианте осуществления S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)- или -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-. В одном варианте осуществления S1 представляет собой -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-(CH2)2-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, -NH-(CH2)3-C(=O)-, -NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)- или спейсер, представленный любой из представленных выше формул(a)-(q). В одном варианте осуществления S1 представляет собой -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)- или спейсер, представленный представленной выше формулой (g), (i) или (k).
В одном варианте осуществления S1 представляет собой -C(=O)-CH2O-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,3-фенилен)-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)-, -NH-CH2-(1,4-фенилен)-C(=O)- или -C(=O)-(1,3-фенилен)-C(=O)-, или
[0142] представляет собой
[0141] [Химическая формула 64]
.
В одном варианте осуществления S1 представляет собой связь.
Кроме того, в конъюгате, в котором Y представляет собой DOTA в соответствии с настоящим изобретением, DOTA и Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 (Fab1) могут быть непосредственно связаны или связаны через спейсер (-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-). Однако конъюгат, в котором DOTA и Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 (Fab1) связаны через -CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=S)-, который является спейсером, представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой (VI).
[0143] [Химическая формула 65]
[0144] Кроме того, S1 спейсер, описанный в настоящей заявке, включает новый спейсер и спейсеры, представленные формулами (g) и (l), которые особенно полезны в качестве спейсера, когда DOTA связана с пептидным линкером, включающим пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом мембраны почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом. Как показано в испытании для оценки аккумуляции в почках в Примере 4, описанном ниже, в конъюгате, в котором пептидный линкер, расщепляемый ферментом, объединен с DOTA и спейсером, представленным формулой (g), было подтверждено, что аккумуляция метящей части в почках уменьшается. В одном варианте осуществления S1 представляет собой спейсер, представленный формулой (g) или (l).
Вариант осуществления конъюгата по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, S1 представляет собой спейсер, представленный формулой (g) или (l), и X представляет собой пептидный линкер, включающий пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом.
Вариант его осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, S1 представляет собой спейсер, представленный формулой (g) или (l), и X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(2) -Gly-Lys*-Z2-,
(3) -Gly-Phe-Lys*-Z2-,
(10) -Asp-Gly-Lys*-Z2-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2- и
(21) -Gly-(3-(2-нафтил)аланин)-Lys*-Z2-.
Вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, S1 представляет собой -NH-CH2-(1,4-фенилен)-NH-C(=O)- или спейсер, представленный любой из формул (g), (i) или (k), и X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(1)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1-,
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2-,
(12) -Met-Ile-Lys*-Z2-,
(24) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4)-,
(25) -Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-5)-,
(26)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(II-II)-,
(27)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)- и
(28)-Met-Gly-Lys*-Z3-.
Вариант осуществления представляет собой конъюгат, в котором Y представляет собой DOTA, S1 представляет собой спейсер, представленный формулой (g), и X представляет собой пептидный линкер, выбранный из группы, состоящей из
(11) -Met-Gly-Lys*-Z2- и
(28) -Met-Gly-Lys*-Z3-.
[0145] Конъюгат по настоящему изобретению состоит из комбинации представленных выше вариантов осуществления.
Конкретные варианты осуществления конъюгата по настоящему изобретению представляют собой следующие.
В формулах Fab2 представляет собой Fab-фрагмент, включающий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
p представляет собой натуральное число от 1 до 25. Fab2 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab2.
[0146] [Химическая формула 66]
[0147] [Химическая формула 67]
[0148] [Химическая формула 68]
[0149] [Химическая формула 69]
[0150] [Химическая формула 70]
[0151] [Химическая формула 71]
[0152] [Химическая формула 72]
[0153] Метящая часть комбинации, в которой Y представляет собой DOTA, S1 представляет собой спейсер, представленный формулой (g) или (l), и X представляет собой пептидный линкер, включающий пептид, состоящий из 2-4 аминокислот, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом мембраны почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом, является полезной в качестве метящей части, которая, как ожидают, будет снижать нефротоксичность и т.п. в подобных конъюгатах, в которых используются различные Fab антитела, не ограничиваясь при этом комбинацией с Fab1 по настоящему изобретению, и настоящее изобретение также включает изобретение метящей части как таковой.
При получении конъюгата по настоящему изобретению связывание Fab-фрагмента антитела к CEACAM5 с лигандом, спейсером и/или пептидным линкером и связывание лиганда со спейсером и/или пептидным линкером сможет соответствующим образом осуществить специалист в данной области техники известным способом.
[0154] В контексте настоящей заявки "метящая часть" означает, например, часть, отличную от Fab1 в формуле (I), и часть, отличную от Биомолекулы1 или Биомолекулы2 в формуле (Ia) или (Ib). Метящая часть представляет собой (i) лиганд и пептидный линкер (Y-S1-X: где S1 представляет собой связь и X представляет собой пептидный линкер), (ii) лиганд (Y-S1-X: где S1 и X каждый представляет собой связь) или (iii) лиганд, спейсер и пептидный линкер (Y-S1-X: где S1 представляет собой спейсер и X представляет собой пептидный линкер). В одном варианте осуществления метящая часть представляет собой (ii) лиганд. В одном варианте осуществления метящая часть представляет собой (i) лиганд и пептидный линкер или (iii) лиганд, спейсер и пептидный линкер. При этом, лиганд "метящей части" может дополнительно включать металл, и некоторые варианты осуществления представляют собой (i) лиганд, включающий металл, и пептидный линкер, (ii) лиганд или (iii) лиганд, спейсер и пептидный линкер, а также представляют собой (i) лиганд, образующий хелатный комплекс с металлом, и пептидный линкер, (ii) лиганд, образующий хелатный комплекс с металлом, или (iii) лиганд, образующий хелатный комплекс с металлом, спейсер и пептидный линкер. Кроме того, существует случай (iv) пептидного линкера, в котором спейсер также включен в пептидный линкер. Кроме того, в формуле (Ia) или (Ib) метящая часть означает часть, отличную от Биомолекулы1 или Биомолекулы2.
[0155] 1-5. Количество (p) метящей части (Y-S1-X), связанной с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5 (Fab1), и количество (p) метящей части, связанной с Биомолекулой1 и Биомолекулой2 формулы (Ia) или (Ib)
Конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором одна или несколько метящих частей (Y-S1-X) связаны через одну или несколько амино групп или тиольных групп в Fab-фрагменте антитела к человеческому CEACAM5 (Fab1). Кроме того, конъюгат по настоящему изобретению представляет собой конъюгат, в котором одна или несколько метящих частей связаны через одну или несколько амино групп или тиольных групп в Биомолекуле1 и Биомолекуле2 формулы (Ia) или (Ib). Конъюгат по настоящему изобретению может представлять собой смесь конъюгатов, в которой количество метящих частей, которые связаны, отличается друг от друга, и это показывает, что конъюгат представляет собой любой из конъюгатов, в котором 1-25 метящих частей (Y-S1-X) связаны с Fab1 в формуле (I), или их смесь. Для одного Fab1 конъюгат по настоящему изобретению включает 1-25 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления, включает 1-23 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления, включает 1-15 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления, включает 1-11 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления, включает 1-9 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления, включает 1-7 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления, включает 1-5 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления и, кроме того, включает 1-4 метящих частей (Y-S1-X) в одном варианте осуществления.
Показано, что в формуле (Ia) или (Ib) Биомолекула1 и Биомолекула2 являются любым из Fab1, в которых 1-25 метящих частей связаны, или их смесью. Для одной Биомолекулы1 и Биомолекулы2, конъюгат по настоящему изобретению включает 1-25 метящих частей в одном варианте осуществления, включает 1-23 метящих частей в одном варианте осуществления, включает 1-15 метящих частей в одном варианте осуществления, включает 1-11 метящих частей в одном варианте осуществления, включает 1-9 метящих частей в одном варианте осуществления, включает 1-7 метящих частей в одном варианте осуществления, включает 1-5 метящих частей в одном варианте осуществления и, кроме того, включает 1-4 метящих части в одном варианте осуществления.
Т.е. "p", который представляет собой количество метящей части (Y-S1-X), связанной с одним Fab1, и "p", который представляет собой количество метящей части, связанной с одной Биомолекулой1 и Биомолекулой2, являются одинаковыми или отличными друг от друга, и каждый представляет собой натуральное число от 1 до 25 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 23 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 15 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 11 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 9 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 7 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 6 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 5 в одном варианте осуществления, представляет собой натуральное число от 1 до 4 в одном варианте осуществления и, кроме того, представляет собой натуральное число от 1 до 3 в одном варианте осуществления.
[0156] 2. Полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению
В одном варианте осуществления Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, кодируется полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, и полинуклеотидом, включающим нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5.
В одном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4.
Примеры полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность нуклеотидов 1-363 SEQ ID NO: 1. Примеры полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности аминокислот 1-112 SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность нуклеотидов 1-336 SEQ ID NO: 3.
В одном варианте осуществления полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, или полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
Примеры полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, включают полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1. Примеры полинуклеотида, включающего нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, включают полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 3.
Полинуклеотид, кодирующий Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, можно синтезировать с использованием метода синтеза генов, известного в данной области техники, на основании нуклеотидной последовательности, сконструированной на основании аминокислотных последовательностей фрагмента тяжелой цепи и легкой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5. В качестве такого метода синтеза генов, можно использовать различные методы, известные специалистам в данной области техники, такие как способ синтеза гена антитела, раскрытый в Международной публикации 90/07861.
[0157] 3. Вектор экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению
Вектор экспрессии полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению, включает вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, и вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5.
Примеры предпочтительных векторов экспрессии включают вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4, и вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4.
Предпочтительные векторы экспресси включают вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4, и вектор экспрессии, включающий полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
[0158] Эти векторы экспрессии конкретно не ограничиваются при условии, что они могут продуцировать полипептид, кодируемый полинуклеотидом по настоящему изобретению в различных клетках-хозяевах, таких как прокариотические клетки и/или эукариотические клетки. Примеры таких векторов экспрессии включают плазмидный вектор и вирусный вектор (например, аденовирус или ретровирус), и предпочтительно можно использовать pEE6.4 или pEE12.4 (Lonza).
Кроме того, эти векторы экспрессии могут включать промотор, функционально связанный с геном, кодирующим фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь полинуклеотида, кодирующего Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5, включенный в конъюгат по настоящему изобретению. Примеры промотора для экспрессии Fab-фрагмента в клетке-хозяине включают, когда клетка-хозяин представляет собой бактерию рода Escherichia, Trp промотор, lac промотор, recA промотор, λPL промотор, lpp промотор и tac промотор. Примеры промотора для экспрессии в дрожжах включают PH05 промотор, PGK промотор, GAP промотор и ADH промотор, и примеры промотора для экспрессии в бактерии рода Bacillus включают SL01 промотор, SP02 промотор и penP промотор. Кроме того, их примеры включают, когда хозяином является эукариотическая клетка, такая как клетка млекопитающего, промотор, происходящий из вируса, такой как CMV, RSV или SV40, ретровирусный промотор, актиновый промотор, EF (фактор элонгации) 1α промотор и промотор теплового шока.
[0159] Эти векторы экспрессии могут дополнительно включать, когда бактерия, в частности E. coli, используется в качестве клетки-хозяина, стартовый кодон, стоп-кодон, терминаторную область и реплицируемую единицу. С другой стороны, когда дрожжи, животная клетка или клетка насекомого используются в качестве хозяина, векторы экспрессии могут включать стартовый кодон и стоп-кодон. Кроме того, в этом случае векторы экспрессии могут включать энхансерную последовательность, 5'- и 3'-нетранслируемые области гена, кодирующего фрагмент тяжелой цепи и/или легкую цепь по изобретению, секреторную сигнальную последовательность, сплайсинговое соединение, сайт полиаденилирования, реплицируемую единицу или т.п. Кроме того, векторы экспрессии могут включать селектируемый маркер, обычно используемый в зависимости от предполагаемой цели (например, ген устойчивости к тетрациклину, ген устойчивости к ампициллину, ген устойчивости к канамицину, ген устойчивости к неомицину или ген дигидрофолатредуктазы).
[0160] 4. Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии
Клетки-хозяева, трансформированные вектором экспрессии, включают клетку-хозяина, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5;
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5.
[0161] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии представляет собой клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4;
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4.
[0162] В одном варианте осуществления клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии представляет собой клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, выбранную из группы, состоящей из следующих (a)-(d):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4;
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4; и
(d) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
[0163] Примеры клетки-хозяина, трансформированной предпочтительным вектором экспрессии, включают клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению.
[0164] Клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, конкретно не ограничивается при условии, что она совместима с используемым вектором экспрессии и может быть трансформирована вектором экспрессии для экспрессии Fab-фрагмента, и их примеры включают различные клетки, такие как природная клетка или искусственно созданная клетка (например, бактерия (бактерия из рода Escherichia или бактерия из рода Bacillus), дрожжи (из рода Saccharomyces, рода Pichia и т.п.) и клетка животного или насекомого (например, Sf9)), линия клеток млекопитающих (например, культивируемая клетка, такая как клетка CHO-K1SV, клетка CHO-DG44 или клетка 293), обычно используемые в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Саму трансформацию можно осуществить известным методом, таким как метод фосфата кальция или метод электропорации.
5. Способ для получения Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению
Получение Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, включает стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5.
[0165] В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин, культивированная при получении Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих (a)-(c):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению.
[0166] В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин, культивированная при получении Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих (a)-(c):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотных последовательностей, показанных аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-121 SEQ ID NO: 2, и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной аминокислотами 1-112 SEQ ID NO: 4.
[0167] В одном варианте осуществления трансформированная клетка-хозяин, культивированная при получении Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, выбрана из группы, состоящей из следующих (a)-(c):
(a) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4;
(b) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4; и
(c) клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2, и клетка-хозяин, трансформированная вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 4.
[0168] Используемая трансформированная клетка-хозяин предпочтительно представляет собой клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, или клетку-хозяина, трансформированную вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую фрагмент тяжелой цепи Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, и вектором экспрессии, включающим полинуклеотид, включающий нуклеотидную последовательность, кодирующую легкую цепь Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению.
При получении Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, трансформированную клетку-хозяин можно культивировать в питательной среде. Питательная среда предпочтительно включает источник углерода, источник неорганического азота или источник органического азота, необходимый для роста трансформированной клетки-хозяина. Примеры источника углерода включают глюкозу, декстран, растворимый крахмал и сахарозу, а примеры источника неорганического азота или источника органического азота включают соль аммония, нитрат, аминокислоту, кукурузный экстракт, пептон, казеин, мясной экстракт, соевый крахмал и картофельный экстракт. Кроме того, питательная среда может, при желании, включать другое питательное вещество (например, неорганическую соль (например, хлорид кальция, дигидрофосфат натрия или хлорид магния), витамин и антибиотик (например, тетрациклин, неомицин, ампициллин или канамицин).
Само культивирование трансформированной клетки-хозяина осуществляют известным методом. Условия культивирования, такие как температура, pH среды и время культивирования, выбирают соответствующим образом. Например, когда хозяином является клетка животного, в качестве среды можно использовать среду MEM (Science; 1955; 122:501), содержащую около 5-20% фетальной бычьей сыворотки, среду DMEM (Virology; 1959; 8: 396-97), среду RPMI 1640 (J. Am. Med. Assoc.; 1967; 199:519-24.), среду 199 (Proc. Soc. Exp. Biol. Med.; 1950; 73:1-8.) или подобную. pH среды предпочтительно составляет около 6-8, и культивирование обычно осуществляют при температуре около 30-40°C в течение от около 15 до 336 часов, и при необходимости также можно осуществлять аэрацию и перемешивание. Когда хозяином является клетка насекомого, примеры среды включают среду Грейса (PNAS; 1985; 82:8404-8), содержащую фетальную бычью сыворотку, и ее pH предпочтительно составляет около 5-8. Культивирование обычно осуществляют при около 20-40°C в течение 15-100 часов, при необходимости также можно осуществлять аэрацию и перемешивание. Когда хозяином является бактерия, актиномицет, дрожжи или нитчатый гриб, например, подходит жидкая среда, содержащая вышеуказанный источник питательных веществ. Предпочтительна среда с pH 5-8. Когда хозяином является E.coli, примеры предпочтительной среды включают среду LB и среду M9 (Miller et al., Exp. Mol. Genet, Cold Spring Harbor Laboratory; 1972:431). В таком случае культивирование обычно можно осуществлять при температуре 14-43°C в течение примерно 3-24 часов, при необходимости при аэрации и перемешивании. Если хозяином является бактерия рода Bacillus, культивирование можно осуществлять при температуре 30-40°C в течение примерно 16-96 часов, при необходимости при аэрации и перемешивании. Когда хозяином являются дрожжи, примеры среды включают минимальную среду Беркхолдера (PNAS; 1980; 77:4505-4508), и ее рН желательно составляет 5-8. Культивирование обычно осуществляют при температуре примерно 20-35°С в течение 14-144 часов, при необходимости также можно осуществлять аэрацию и перемешивание.
Получение Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, включенного в конъюгат по настоящему изобретению, может включать, помимо стадии культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела против CEACAM5 человека, стадию выделения, предпочтительно выделения и очистки экспрессированного Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5. Примеры методов выделения и очистки включают метод с использованием растворимости, такой как высаливание, или метод осаждения растворителем, метод с использованием разницы в молекулярной массе, такой как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация, или электрофорез с использованием додецилсульфата натрия в полиакриламидном геле, метод с использованием заряда, такой как ионообменная хроматография или хроматография на гидроксилапатите, метод, использующий специфическое сродство, такой как аффинная хроматография, метод, использующий разницу в гидрофобности, такой как высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой, и метод, использующий разницу в изоэлектрической точке, такой как изоэлектрическое фокусирование.
[0170] 6. Способ для получения конъюгата по настоящему изобретению
Способ для получения конъюгата по настоящему изобретению может включать стадию ковалентного связывания Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 с метящей частью (Y-S1-X). Специалисты в данной области техники смогут соответствующим образом осуществить связывание между компонентами в метящей части (Y-S1-X) известным способом. В качестве примера реакции, после связывания лиганда (Y) с пептидным линкером (X) непосредственно или через спейсер (S1) пептидный линкер можно связать с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5. Кроме того, после связывания Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 с пептидным линкером (X) пептидный линкер также можно связать с лигандом (Y) непосредственно или через спейсер (S1). В качестве исходного вещества также можно использовать соединение, в котором заранее связаны лиганд и спейсер (S1).
[0171] Способ для получения конъюгата по настоящему изобретению также может включать стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 и стадию ковалентного связывания Fab-фрагмента и метящей части (Y-S1-X). Способ для получения конъюгата по настоящему изобретению также может включать стадию культивирования трансформированной клетки-хозяина, описанной выше, для экспрессии Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, стадию выделения экспрессированного Fab-фрагмента и стадию ковалентного связывания Fab-фрагмента и метящей части (Y-S1-X). Способ для получения конъюгата по настоящему изобретению может дополнительно включать стадию добавления металла. В качестве хелатирующего агента можно использовать пептидный линкер, спейсер, указанное количество метящих частей, металл и т.п., описанные в настоящей заявке.
[0172] Способ для получения конъюгата по настоящему изобретению можно осуществить как способ, включающий две или более стадий, определенных выше в виде серии стадий, или можно осуществить как способ, включающий по меньшей мере одну стадию, определенную выше. Например, способ, включающий стадию связывания Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 с метящей частью (Y-S1-X), и способ, включающий стадию координирования металла с Fab-фрагментом антитела к человеческому CEACAM5, с которым связана метящая часть (Y-S1-X), также включены в способ получения конъюгата по настоящему изобретению. Кроме того, способ для получения конъюгата по настоящему изобретению также включает способ, в котором используют другой порядок стадий. Например, способ для ковалентного связывания Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 с метящей частью (Y-S1-X), в котором металл координируют с лигандом, также включен в способ для получения конъюгата по настоящему изобретению.
Кроме того, конъюгат по настоящему изобретению можно получить таким же способом, также с биомолекулой, описанной в настоящем изобретении, вместо Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, описанного выше.
7. Конъюгат, состоящий из лиганда, спейсера, пептидного линкера и биомолекулы
Далее описан конъюгат, состоящий из лиганда, спейсера, пептидного линкера и биомолекулы в соответствии с настоящим изобретением, представленный следующей формулой.
[0173] [Химическая формула 73]
[0176] Вариант осуществления
[0174] следующей формулы (S2), соответствующей спейсеру
[0175] [Химическая формула 74]
[0178] представляет собой
[0177] [Химическая формула 75]
.
Другой вариант осуществления
[0180] представляет собой группу, где
формула (S2) представляет собой
[0179] [Химическая формула 76]
.
Другой вариант осуществления
[0182] представляет собой группу, где
формула (S2) представляет собой
[0181] [Химическая формула 77]
.
Другой вариант осуществления
[0184] представляет собой группу, где
формула (S2) представляет собой
[0183] [Химическая формула 78]
.
Вариант осуществления группы Q в формуле (S2) представляет собой -C(=O)-, -NH-C(=O)- или -NH-C(=S)-.
Вариант осуществления группы Q в формуле (S2) представляет собой -C(=O)- или -NH-C(=O)-.
Вариант осуществления группы Q в формуле (S2) представляет собой -NH-C(=O)-.
Вариант осуществления группы L2 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой Ile, Phe или Gly.
Вариант осуществления группы L2 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой Ile.
Вариант осуществления группы L2 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой s Phe.
Вариант осуществления группы L2 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой Gly.
Вариант осуществления группы L3 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой связь, Arg или His.
Вариант осуществления группы L3 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой связь.
Вариант осуществления группы L3 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой Arg.
Вариант осуществления группы L3 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой His.
Вариант осуществления группы L4 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой -NH-(CH2)2-, -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4- или связь.
Вариант осуществления группы L4 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой -NH-(CH2)2-.
Вариант осуществления группы L4 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-.
Вариант осуществления группы L4 в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой связь.
Вариант осуществления группы V1 в формуле (Ia) или (Ib)
представляет собой
группу, представленную любой из следующих формул (A-1)-(A-5)
[0185] [Химическая формула 79]
.
[0186] Вариант осуществления группы V1 в формуле (Ia) или (Ib)
представляет собой
группу, представленную следующей формулой (A-1)
[0187] [Химическая формула 80]
.
[0188] Вариант осуществления группы V1 в формуле (Ia) или (Ib)
представляет собой
группу, представленную следующей формулой (A-2)
[0189] [Химическая формула 81]
.
[0190] Вариант осуществления группы V1 в формуле (Ia) или (Ib)
представляет собой
группу, представленную следующей формулой (A-3)
[0191] [Химическая формула 82]
.
[0192] Вариант осуществления группы V1 в формуле (Ia) или (Ib)
представляет собой
группу, представленную следующей формулой (A-4)
[0193] [Химическая формула 83]
.
[0194] Вариант осуществления группы V1 в формуле (Ia) или (Ib)
представляет собой
группу, представленную следующей формулой (A-5)
[0195] [Химическая формула 84]
.
[0196] Следующая формула (B) в формуле (Ia) или (Ib) представляет собой группу, состоящую из спейсера и пептидного линкера.
[0197] [Химическая формула 85]
[0198] Примеры включают группу, выбранную из группы, состоящей из следующих формул (B-1)-(B-7).
[0199] [Химическая формула 86]
[0200] [Химическая формула 87]
[0201] [Химическая формула 88]
[0202] [Химическая формула 89]
[0203] [Химическая формула 90]
[0204] [Химическая формула 91]
[0205] [Химическая формула 92]
[0206] Вариант осуществления представляет собой конъюгат, представленный формулой (Ia), где конъюгат представляет собой конъюгат, выбранный из группы, состоящей из соединений следующих формул, p представляет собой натуральное число от 1 до 25, и Биомолекула1 связана со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Биомолекуле1.
[0207] [Химическая формула 93]
[0208] [Химическая формула 94]
[0209] [Химическая формула 95]
[0210] [Химическая формула 96]
[0211] [Химическая формула 97]
[0212] Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0213] [Химическая формула 98]
[0214] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0215] [Химическая формула 99]
[0216] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0217] [Химическая формула 100]
[0218] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0219] [Химическая формула 101]
[0220] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0221] [Химическая формула 102]
[0222] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0223] [Химическая формула 103]
[0224] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой конъюгат, представленный следующей формулой.
[0225] [Химическая формула 104]
[0226] где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
Кроме того, примеры варианта осуществления настоящего изобретения включают следующие формулы (Ie) и (If).
[0227] [Химическая формула 105]
[0228] [Химическая формула 106]
[0229] Конъюгат по настоящему изобретению может иметь геометрический изомер и таутомер. Кроме того, соединение по настоящему изобретению может иметь асимметрический углерод. Отдельные варианты этих изомеров или их смеси включены в настоящее изобретение. Кроме того, меченая форма, которая представляет собой соединение, в котором один или несколько атомов соединения по настоящему изобретению замещены радиоактивным изотопом или нерадиоактивным изотопом, также включена в настоящее изобретение.
Вариант осуществления биомолекулы может представлять собой любую биомолекулу при условии, что она обладает физиологической активностью, и примеры включают пептид, белок, гормон, лекарственное средство, нуклеотид, олигонуклеотид, нуклеиновую кислоту и полисахарид. В случае белка, включены антитело, фермент, рецептор и их фрагменты.
Другой вариант осуществления биомолекулы представляет собой пептид и белок.
Другой вариант осуществления биомолекулы представляет собой белок.
Другой вариант осуществления биомолекулы представляет собой Fab-фрагмент, фермент, рецептор или фрагмент такого белка. Например, соматостатин, PSMA лиганд, RGD (Arg-Gly-Asp) Пептид, ATSM (Диацетил-бис(N4-метилтиосемикарбазон)) или 211At-AITM (4-211At-астато-N-[4-(6-(изопропиламино)пиридин-4-ил)-1,3-тиазол-2-ил]-N-метилбензамид) соответствует указанному выше.
[0230] Другой вариант биомолекулы представляет собой продаваемое на рынке антитело или его Fab-фрагмент.
Его примеры включают ниволумаб, пембролизумаб, бевацизумаб, ритуксимаб, пертузумаб, даратумумаб, деносумаб, цетуксимаб, ипилимумаб, панитумумаб, брентуксимаб, рамуцирумаб, атезолизумаб, обинутузумаб, элотумитузумаб, авелумаб, ибритумомаб, алемтузумаб, гемтузумаб и нецитумомаб.
Кроме того, другой вариант осуществления биомолекулы является таким, который можно ожидать для терапии альфа-частицами или терапии бета-частицами.
Их примеры включают октреоскан, 131I-MIBG (I-131 метайодобензилгуанидин), 211At-MABG (211 At-астатобензилгуанидин), трастузумаб, гуманизированное антитело A33 (Cancer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 2005 Oct; 20 (5): 514-23.), омбуртамаб, тенатумомаб, антитело к CD45 (ClinicalTrials. gov Identifier: NCT03128034; 9595; NCI-2017-00452), ибритумомаб и актимаб.
Кроме того, другой вариант осуществления биомолекулы представляет собой HuM195, MX35-F(ab')2 моноклональные антитела, мышиный 9.2.27, протеогликановый (MCSP) антиген, антиген CD20, антиген CD30 или т.п., описанные в исследованиях рака и молекулярной медицине (Cancer studies and molecular medicine (2004), 1, 1, 1-7).
Кроме того, другой вариант осуществления биомолекулы представляет собой CD19, GD2, VE кадгерин или т.п.
[0231] Вариант осуществления биомолекулы представляет собой Fab-фрагмент антитела к MUC1 (указан как Fab3, Fab4 или Fab5), и примеры включают те, которые раскрыты в международной публикации WO2018/092885.
[1M] В частности, Fab3 или Fab4 представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, выбранный из группы, состоящей из следующих (a) и (b), и Fab-фрагмент, содержащий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12, указан как Fab3, а Fab-фрагмент, содержащий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14, указан как Fab4:
(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16; и
(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и в которой глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16.
[2M] Вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1 в соответствии с [1M], который выбран из группы, состоящей из следующих (a) и (b):
(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10; и
(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 6 или SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
[3M] Вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1 в соответствии с [1M], который выбран из группы, состоящей из следующих (a) и (b):
(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16; и
(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 14, и в которой глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 10, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 16.
[0232] [4M] Вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1 в соответствии с [3M], который выбран из группы, состоящей из следующих (a) и (b):
(a) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10; и
(b) Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
[5M] Вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1 в соответствии с [4M], который представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
[6M] Вариант осуществления представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1 в соответствии с [4M], который представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
[7M] P10-1 или P10-2 (указан как Fab5), который представляет собой Fab-фрагмент антитела к MUC1, раскрыт в международной публикации WO2018/092885.
Кроме того, конъюгат по настоящему изобретению может состоять из комбинации отдельных вариантов осуществления, описанных выше.
[0233] 7. Диагностическая композиция и способ для диагностики
Настоящее изобретение относится к диагностической композиции, включающей конъюгат по настоящему изобретению, включающий металл (далее, указан как детектируемый конъюгат по настоящему изобретению). Диагностическая композиция по настоящему изобретению может включать один или несколько конъюгатов по настоящему изобретению. То есть, диагностическая композиция по настоящему изобретению может включать один конъюгат по настоящему изобретению или может включать комбинацию двух или более конъюгатов по настоящему изобретению. Детектируемый конъюгат по настоящему изобретению можно сформулировать в соответствии с традиционным способом и использовать в качестве лекарственного средства для ранней диагностики или лекарственного средства для определения стадии заболевания (особенно как средство для диагностики рака).
Лекарственное средство для ранней диагностики означает диагностическое средство, предназначенное для постановки диагноза на стадии, когда никакого болезненного состояния не наблюдается, или на ранней стадии заболевания. Например, в случае рака, средство для ранней диагностики означает диагностическое средство, используемое на стадии, когда никакого болезненного состояния не наблюдается, или на стадии 0 или стадии 1.
Средство для определения стадии заболевания означает диагностическое средство, которое может исследовать, насколько прогрессировало болезненное состояние. Например, в случае рака, средство для определения стадии заболевания означает диагностическое средство, которое может определить его стадию.
Рак, который, как ожидается, можно будет диагностировать при помощи диагностической композиции по настоящему изобретению, представляет собой рак, экспрессирующий человеческий CEACAM5. В одном варианте осуществления его примеры включают колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак щитовидной железы и рак, возникший в результате его метастазирования. В одном варианте осуществления, рак представляет собой колоректальный рак или рак, возникший в результате метастазирования колоректального рака. Более предпочтительно, рак представляет собой рак, возникший в результате метастазирования колоректального рака, и такой рак включает метастатический рак печени. Кроме того, рак представляет собой рак, экспрессирующий человеческий MUC1. В одном варианте осуществления примеры рака включают рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника или цервикальный рак. В одном варианте осуществления рак представляет собой рак молочной железы или рак мочевого пузыря.
[0234] Количество конъюгата по настоящему изобретению, добавляемое при формулировании диагностической композиции по настоящему изобретению, варьируется в зависимости от степени симптома и возраста пациента, используемой лекарственной формы композиции, активности связывания Fab-фрагмента или биомолекулы и т.п., и, например, можно использовать от около 0,001 мг/кг до 100 мг/кг в расчете на массу Fab-фрагмента или биомолекулы на единицу массы тела пациента.
Примеры лекарственной формы диагностической композиции по настоящему изобретению включают парентеральный препарат, такой как инъекция или инфузия, и введение можно осуществить путем внутривенной инъекции, внутримышечной инъекции в определенный участок ткани, подкожной инъекции, путем интравезикального введения или т.п. Кроме того, в композиции можно использовать носитель и добавку в соответствии с этими лекарственными формами в фармацевтически приемлемых пределах. Типы фармацевтически приемлемого носителя и добавки конкретно не ограничиваются, и можно использовать носитель и добавку, хорошо известные специалистам в данной области техники.
Настоящее изобретение также относится к применению детектируемого конъюгата по настоящему изобретению для получения композиции для ранней диагностики или композици для определения стадии рака. Настоящее изобретение также относится к детектируемому конъюгату по настоящему изобретению для применения в ранней диагностике и определении стадии рака.
Кроме того, настоящее изобретение также относится к способу для диагностики рака, включающему введение субъекту детектируемого конъюгата по настоящему изобретению. При этом, "субъект" относится к человеку или другому млекопитающему, которому необходимо определить диагноз. В одном варианте осуществления субъект представляет собой человека, которому нужно поставить диагноз. Эффективное количество детектируемого конъюгата по настоящему изобретению в способе для диагностики по настоящему изобретению может представлять собой такое же количество, как эффективное количество конъюгата по настоящему изобретению в описанной выше композиции. В способе для диагностики по настоящему изобретению детектируемый конъюгат по настоящему изобретению можно вводить путем внутримышечной инъекции в определенный участок ткани, подкожной инъекции или т.п.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 для получения конъюгата, включающего Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 по настоящему изобретению, пептидный линкер и/или лиганд. В одном варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 для получения диагностической композиции, включающей конъюгат по настоящему изобретению.
Кроме того, в одном варианте осуществления, когда обеспечивается диагностическая композиция по настоящему изобретению, включающая радиоизотоп металла, ее можно пометить радиоизотопом металла непосредственно перед применением композиции, и она может быть представлена как диагностическая композиция, включающая радиоизотоп металла.
[0235] 8. Фармацевтическая композиция и способ для лечения
В настоящем изобретении можно использовать от около 0,001 мг/кг до 100 мг/кг в расчете на массу одного или нескольких Fab-фрагментов конъюгата по настоящему изобретению, включающего радиоизотоп металла, такой как 90Y или 177Lu.
Фармацевтическую композицию, включающую конъюгат по настоящему изобретению, можно использовать для лечения рака. Рак, который, как ожидают, можно будет лечить фармацевтической композицией, включающей конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой рак, экспрессирующий человеческий CEACAM5, и его примеры включают колоректальный рак, рак молочной железы, рак легкого, рак щитовидной железы и рак, возникший в результате его метастазирования. Альтернативно, рак, который, как ожидают, можно будет лечить фармацевтической композицией, включающей конъюгат по настоящему изобретению, представляет собой рак, экспрессирующий человеческий MUC1, и его примеры включают рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника или цервикальный рак. В одном варианте осуществления рак представляет собой рак молочной железы или рак мочевого пузыря.
Настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию, включающую конъюгат по настоящему изобретению для лечения колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака. Кроме того, настоящее изобретение включает способ для лечения колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества конъюгата по настоящему изобретению. Кроме того, настоящее изобретение включает способ для индукции клеточной гибели раковых клеток колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака, включающий стадию введения терапевтически эффективного количества конъюгата по настоящему изобретению.
Фармацевтическую композицию для лечения рака также можно использовать для диагностики рака. Например, фармацевтическую композицию для лечения колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака, также можно использовать для диагностики рака.
Кроме того, настоящее изобретение включает конъюгат по настоящему изобретению для применения в лечении колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака. Кроме того, настоящее изобретение включает применение конъюгата по настоящему изобретению для получения фармацевтической композиции для лечения колоректального рака или рака, возникшего в результате метастазирования колоректального рака.
В другом варианте осуществления настоящее изобретение также относится к применению Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 для получения фармацевтической композиции, включающей конъюгат по настоящему изобретению.
В описанных выше вариантах осуществления можно использовать биомолекулу вместо Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5. Конъюгат по настоящему изобретению можно обеспечить в виде диагностической композиции или фармацевтической композиции для заболевания, связанного с биомолекулой.
Настоящее изобретение было описано в общих чертах, и далее будут представлены конкретные Примеры, предназначенные для лучшего понимания изобретения. Однако они представлены в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.
ПРИМЕРЫ
[0236] Следующие аббревиатуры можно использовать в следующих Примерах и в таблицах, представленных ниже.
Gd/DOTA: 3arm DOTA, меченная Gd, Gd/4arm DOTA: 4arm DOTA, меченная Gd, MS: масс-спектрометрия, ESI+: m/z значение (метод ионизации ESI, если не указано иное [M+H]+), ESI-: m/z значение (метод ионизации ESI, если не указано иное [M-H]-), APCI/ESI+: m/z значение (метод ионизации APCI/ESI, APCI/ESI означает одновременное измерение APCI и ESI. Если не указано иное [M+H]+), APCI/ESI-: m/z значение (метод ионизации APCI/ESI, если не указано иное [M+H]-), Пр.-№: номер конъюгата, SNo: номер Примера получения, Str: химическая структурная формула, Me: метил, Et: этил, tBu: трет-бутил, 1,3-Ph: 1,3-фенилен, 1,4-Ph: 1,4-фенилен, diph-Ala: дифенилаланин и naph-Ala: 3-(2-нафтил)аланин.
[0237] (Пример 1: Получение Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5)
T84.66, которое представляет собой антитело к человеческому CEACAM5, происходящее от мыши, было гуманизировано со ссылкой на способ, раскрытый в литературе (Protein Eng. Des. Sel.;2004;17:481-489), и затем молекулярную модель гуманизированного антитела, созданную в соответствии с литературой (Proteins: Structure, Function and Bioinformatics; 2014; 82:1624-1635), использовали для конструирования антитела, имеющего вариабельную область, при этом ожидалось, что аффинность не будет уменьшаться даже при связывании метящей части.
Ген фрагмента тяжелой цепи был образован путем соединения гена, кодирующего сигнальную последовательность (Protein Engineering; 1987; 1:499-505), с 5' концом гена вариабельной области тяжелой цепи антитела, а гена Fab области человеческого Igγ1 (состоящего из нуклеотидной последовательности нуклеотидов 364-678 SEQ ID NO: 1) с 3' концом, и этот ген фрагмента тяжелой цепи встраивали в GS вектор pEE6.4 (Lonza). Кроме того, ген легкой цепи был образован путем соединения гена, кодирующего сигнальную последовательность, с 5' концом гена вариабельной области легкой цепи антитела, а гена константной области человеческого Igκ (состоящего из нуклеотидной последовательности нуклеотидов 337-657 SEQ ID NO: 3) с 3' концом, и этот ген легкой цепи встраивали в GS вектор pEE12.4 (Lonza). Описанные выше pEE векторы, в которые ген фрагмента тяжелой цепи и ген легкой цепи антитела, соответственно, были встроены, подвергали расщеплению рестрикционными ферментами NotI и PvuI и осуществляли лигирование с использованием набора для лигирования TAKARA Ligation Kit Ver2.1 (Takara Bio Inc.) для конструирования GS вектора, в который встроены оба ген фрагмента тяжелой цепи и ген легкой цепи.
[0238] Используя описанный выше вектор GS, в который были встроены как ген фрагмента тяжелой цепи, так и ген легкой цепи, экспрессию антитела осуществляли двумя способами путем транзиентной экспрессии и конститутивной экспрессии. Для транзиентной экспрессии клетки Expi293F (Thermo Fisher Scientific Inc.), культивированные до около 3 миллионов клеток/мл в экспрессионной среде Expi293 (Thermo Fisher Scientific Inc.), трансфицировали описанным выше вектором GS, в который были встроены оба ген фрагмента тяжелой цепи и ген легкой цепи, с использованием набора для трансфекции ExpiFectamine 293 (Thermo Fisher Scientific Inc.) и культивировали в течение 5-7 дней. Культуральный супернатант очищали с использованием KappaSelect (GE Healthcare Japan Corporation) для получения Fab-фрагмента. Для конститутивной экспрессии клетки CHOK1SV (Lonza) трансфицировали описанным выше вектором GS, в который были встроены оба ген фрагмента тяжелой цепи и ген легкой цепи, линеаризованные при помощи PvuI, методом электропорации с использованием Gene Pulser (Bio-Rad Laboratories, Inc.). На следующий день после трансфекции добавляли метионинсульфоксимин и клетки культивировали в течение 5-7 дней. Клетки высевали в полутвердую среду, содержащую метилцеллюлозу, и после колонизации клетки с высоким уровнем экспрессии Fab-фрагмента получали с использованием ClonePix FL (Molecular Devices, LLC). Культурный супернатант клеток очищали с использованием Capto L (GE Healthcare Japan Corporation), Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare Japan Corporation) и BioPro S75 (YMC Co., Ltd.) для получения Fab-фрагмента.
[0239] Нуклеотидная последовательность, кодирующая фрагмент тяжелой цепи полученного Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5 (обозначаемого как PB009-01 или Fab2), показана в SEQ ID NO: 1, а кодируемая ею аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 2, нуклеотидная последовательность, кодирующая легкую цепь PB009-01, показана в SEQ ID NO: 3, а кодируемая ею аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO: 4. Вариабельная область тяжелой цепи PB009-01 состоит из аминокислотной последовательности аминокислот с 1-121 SEQ ID NO: 2, а CDR1, CDR2 и CDR3 тяжелой цепи состоят из аминокислотных последовательностей аминокислот 31-35, 50-66 и 99-110, соответственно, SEQ ID NO: 2. Вариабельная область легкой цепи PB009-01 состоит из аминокислотной последовательности 1-112 SEQ ID NO: 4, а CDR1, CDR2 и CDR3 легкой цепи состоят из аминокислотных последовательностей аминокислот 24-38, 54-60 и 93-101, соответственно, SEQ ID NO: 4.
Последовательности вариабельных областей и CDR определяли в соответствии с нумерацией Kabat (Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda).
[0240] (Пример 2: Получение конъюгата, включающего Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5)
Данный Пример раскрывает Примеры получения конъюгата. При представлении каждого Примера получения в данном Примере после "Примера 2" следует один дефис с последующим "номером конъюгата". Например, "Пример 2-11" показывает, что это Пример получения конъюгата 11 в данном Примере. Кроме того, Fab2 в данном Примере означает Fab-фрагмент антитела к человеческому CEACAM5 (PB009-01/Fab2), полученный в Примере 1, а "p-Fab" означает, что Fab2 связан с p метящих частей, показанных в скобках [ ] или ( ), через p его аминогрупп с образованием конъюгата. В некоторых из следующих Примеров описано количество метящих частей (Y-S1-X), связанных с Fab2 каждого конъюгата, который был подтвержден MS анализом, но результат не показывает, что конъюгат, имеющий связанное количество метящих частей, отличное от указанного выше количества, не включен. Должно быть понятно, что еще может быть конъюгат, имеющий определенное связанное количество метящих частей, присутствие которого невозможно было подтвердить из-за точности оборудования для MS анализа. Кроме того, в структурных формулах в данном Примере структурная формула DOTA, с которой связан Gd, схематически представляет DOTA, меченную Gd.
(Пример 2-11. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2))
[0241] [Химическая формула 107]
[0242] (i) Синтез трет-бутил O4-трет-бутил-N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
Трифторуксусную кислоту (далее сокращенно TFA) (3 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (1,00 г) в дихлорметане (6 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении, затем добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали два раза дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем концентрировали. К этому остатку добавляли O4-трет-бутил водород N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-аспартат (920 мг), дихлорметан (10 мл), диизопропилэтиламин (далее сокращенно DIPEA) (2 мл), 1-(Диметиламино)-N, N-диметил-1-[(3H-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ил)окси]метаниминий гексафлуоридофосфат(1-) (далее сокращенно HATU) (1,2 г) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 16 часов. Добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали два раза дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (2,86 г). MS (ESI+); 809,5 [M+Na]+
[0243] (ii) Синтез трет-бутил O4-трет-бутил-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
Морфолин (6 мл) добавляли к раствору трет-бутил O4-трет-бутил-N-[(9H-флуорен-9-илметокси)карбонил]-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (2,86 г) в тетрагидрофуране (далее сокращенно THF) (10 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь охлаждали на ледяной бане, затем полученное твердое вещество фильтровали и остаток промывали метанолом. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 4% метанол/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (1,04 г). MS (ESI+); 565,5
(iii) Синтез трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)-O4-трет-бутил-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
Смесь трет-бутил O4-трет-бутил-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (570 мг), дихлорметана (6 мл), 3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензойной кислоты (305 мг), DIPEA (520 мкл) и HATU (575 мг) перемешивали при комнатной температуре в течение 43 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 80% этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (712 мг). MS (ESI+); 798,6
[0244] (iv) Синтез трет-бутил N-[3-(аминометил)бензоил]-O4-трет-бутил-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
TFA (2 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)-O4-трет-бутил-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (712 мг) в дихлорметане (2 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 7 часов. Добавляли триэтиламин и амино-содержащий силикагель, полученную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (амино-содержащий силикагель, градиент растворителя; 0 → 2% метанол/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (495 мг). MS (ESI+); 698,4
(v) Синтез трет-бутил O4-трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
Смесь трет-бутил N-[3-(аминометил)бензоил]-O4-трет-бутил-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (495 мг), N, N-диметилформамида (далее сокращенно DMF) (5 мл), [4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]уксусной кислоты (далее сокращенно DOTA-трис(t-Bu) эфир) (446 мг), DIPEA (400 мкл) и HATU (404 мг) перемешивали при комнатной температуре в течение 66 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 20% метанол/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (387 мг). MS (ESI+); 1275,5 [M+Na]+
[0245] (vi) Синтез трет-бутил O4-трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-L-лизината
Смесь трет-бутил O4-трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (387 мг), 10% палладия на углероде (содержание воды 50%, 65 мг) и этанола (4 мл) перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) при комнатной температуре в течение 5 часов. Смесь фильтровали через Целит и концентрировали. К остатку добавляли 10% палладий на углероде (50% влажности, 650 мг) и этанол (8 мл) и полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) при комнатной температуре в течение 20 часов. Смесь фильтровали через Целит и затем концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (336 мг). MS (ESI+); 1140,5 [M+Na]+
(vii) Синтез трет-бутил O4-трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
Раствор метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-карбоксилата (56 мг) и THF (5 мл) добавляли к смеси трет-бутил O4-трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-L-лизината (336 мг) и насыщенного водного раствора гидрокарбоната натрия (2,5 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов. Добавляли 1 M водный раствор гидроксида натрия (60 мкл) при охлаждении льдом и затем полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли этилацетат и 10% водный раствор лимонной кислоты и затем органический слой отделяли. Водный слой экстрагировали смесью 10% метанола/хлороформ и собранный органический слой сушили над безводным сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 20% метанол/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (341 мг). MS (ESI+); 1198,5
[0246] (viii) Синтез N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
TFA (2 мл) добавляли к раствору трет-бутил O4-трет-бутил-N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (341 мг) в дихлорметане (2 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 20% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (99,6 мг). MS (ESI+); 918,3
(ix) Синтез [N-{3-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]бензоил}-L-α-аспартилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния
Водный раствор гидрокарбоната натрия (0,1 M, 800 мкл) добавляли к смеси N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-α-аспартилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина (20,0 мг), воды (2 мл) и хлорида гадолиния (6 мг) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Добавляли водный раствор гидрокарбоната натрия (0,1 M, 60 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Добавляли этилендиаминтетрауксусную кислоту (далее сокращенно EDTA) водный раствор (0,5 M, 300 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 25% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (12,0 мг). MS (ESI-); 1071,4
[0247] (x) Синтез конъюгата No. 11
[N-{3-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]бензоил}-L-α-аспартилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиний (1 мг) растворяли в DMSO (40 мкл). Отмеряли 40 мкл полученного раствора, добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и добавляли 0,1 M водный раствор карбоната натрия для получения pH 6,6.
Предварительно подготовленный раствор добавляли к 4,45 мг/мл содержащего Fab2 боратного буфера (160 мкл) и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Добавляли 0,05 M водный раствор EDTA (40 мкл) и затем полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 10 минут. Смесь очищали через колонку PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием центрифужного фильтра Amicon Ultra-0,5 мл (Merck Millipore). Выделенный раствор промывали фосфатно-солевым буферным раствором 7 раз, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Asp-Gly-Lys*-Z2(#N)], имеющий молекулярную массу 1073, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-12. Синтез ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2))
[0248] [Химическая формула 108]
[0249] (i) Синтез трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
трет-Бутил N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизинат моногидрохлорид (2,1 г), Et3N (2,4 мл) и HATU (2,5 г) последовательно добавляли к жидкой смеси N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланина (1,5 г) в дихлорметане (30 мл) и полученную смесь оставляли для взаимодействия в течение ночи при комнатной температуре.
Реакционную смесь концентрировали и затем очищали через колонку с силикагелем (градиент растворителя; 10 → 50% этилацетат/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (3,16 г). MS (ESI+): 606,4 [M+Na]+
(ii) Синтез трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-лизината
Смесь этанольного раствора (60 мл) трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (3150 мг) и 10% палладия на углероде (содержание воды 50%, 1000 мг) перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) при комнатной температуре в течение 4 с половиной часов. Оставались исходные вещества и, таким образом, систему продували аргоном, затем смесь фильтровали через Целит и фильтрат концентрировали. Остаток растворяли в метаноле (60 мл), добавляли 10% палладий на углероде (50% влажности, 1000 мг) и полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) при комнатной температуре в течение 5 часов. Было подтверждено исчезновение исходного вещества, затем систему продували аргоном, смесь фильтровали через Целит и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (2520 мг). MS (ESI+): 450,4
[0250] (iii) Синтез трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
Раствор метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-карбоксилата (340 мг) в THF (12 мл) добавляли к суспензии трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-L-лизината (825 мг) в насыщенном водном растворе гидрокарбоната натрия (6 мл) при охлаждении льдом. Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов и затем добавляли 1 M водный раствор гидроксида натрия (0,36 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь разбавляли этилацетатом и водой и затем подкисляли 10% водным раствором лимонной кислоты. Органический слой отделяли, промывали насыщенным водным раствором гидрокарбоната натрия и насыщенным солевым раствором, сушили над сульфатом магния и фильтровали и затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали через колонку с силикагелем (градиент растворителя; 0 → 8% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (743 мг). MS (ESI+): 552,4 [M+Na]+
(iv) Синтез трет-бутил L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата)
TFA (2 мл) добавляли по каплям к раствору трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (325 мг) в дихлорметане (4 мл) при охлаждении льдом. Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (418 мг). MS (ESI+): 430,4
[0251] (v) Синтез трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
N-(трет-бутоксикарбонил)глицин (118 мг), триэтиламин (далее сокращенно TEA) (0,26 мл) и HATU (256 мг) последовательно добавляли к смеси трет-бутил L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата) (415 мг) в дихлорметане (10 мл) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь концентрировали при пониженном давлении и затем очищали через колонку с силикагелем (градиент растворителя; 0 → 30% ацетона/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (206 мг). MS (ESI+): 609,4 [M+Na)+
[0252] (vi) Синтез трет-бутил глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата)
С использованием трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (205 мг), неочищенный продукт указанного в заголовке соединения (223 мг) получали таким же способом, как в Примере 2-12 (iv) выше. MS (ESI+): 487,4
(vii) Синтез глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина моно(трифторацетата)
TFA (1 мл) добавляли к смеси трет-бутил глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата) (9 мг) в дихлорметане (1 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (8 мг). MS (ESI+): 431,3
[0253] (viii) Синтез N-[(4-{[1,4,7,10-тетракис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил]метил}фенил)карбамотиоил]глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
DIPEA (35 мкл) добавляли к смеси глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина моно(трифторацетата) (8 мг) и 2,2',2'',2'''-{2-[(4-изотиоцианатофенил)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетраил}тетрауксусной кислоты (сокращенно p-SCN-Bn-DOTA) (8 мг) в DMF (1 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Смесь разбавляли 1% водным раствором TFA (около 5 мл) и очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя 5 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (13 мг). MS (ESI+): 982,3
(ix) Синтез водород [N-{[4-({1,4,7,10-тетракис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил-κ4N1,N4,N7,N10}метил)фенил]карбамотиоил}глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(4-)]гадолината(1-)
N-[(4-{[1,4,7,10-тетракис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил]метил}фенил)карбамотиоил]глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцин (12 мг) разбавляли водой (5 мл) и добавляли хлорид гадолиния (4 мг). pH смеси доводили до 5-6 раствором 0,1 M гидрокарбоната натрия и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. К смеси добавляли 0,5 M водный раствор EDTA (80 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Добавляли TFA (10 мкл) и затем полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя 5 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (5 мг). MS (ESI+): 1137,0
(x) Синтез конъюгата No. 12
С использованием водород [N-{[4-({1,4,7,10-тетракис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил-κ4N1,N4,N7,N10}метил)фенил]карбамотиоил}глицил-L-фенилаланил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(4-)]гадолината(1-) конъюгат получали таким же способом, как на стадии (x) Примера 2-11 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-Gly-Phe-Lys*-Z2(#N)], имеющий молекулярную массу 1136, был связан с одним Fab2, имеющий молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-13. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2))
[0254] [Химическая формула 109]
[0255] (i) Синтез трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
TFA (3 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (1,00 г) в дихлорметане (6 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении, затем добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали два раза дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем концентрировали. К этому остатку добавляли N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионин (556 мг), дихлорметан (10 мл), DIPEA (2 мл) и HATU (1,16 г) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор концентрировали, затем к остатку добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали два раза дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали 1 M водным раствором гидроксида натрия и насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (1,70 г). MS (ESI+); 625,5
(ii) Синтез трет-бутил L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
TFA (4 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (1,70 г) в дихлорметане (10 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 7 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (амино-содержащий силикагель, градиент растворителя; 0 → 4% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (663 мг). MS (ESI+); 525,4
[0256] (iii) Синтез трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
Смесь трет-бутил L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (663 мг), дихлорметана (6 мл), 3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензойной кислоты (480 мг), DIPEA (700 мкл) и HATU (960 мг) перемешивали при комнатной температуре в течение 39 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 100% этилацетата/гексан) с получением указанного в заголовке соединения (935 мг). MS (ESI+); 758,5
(iv) Синтез трет-бутил N-[3-(аминометил)бензоил]-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
TFA (2 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (935 мг) в дихлорметане (2 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Добавляли Et3N и амино-содержащий силикагель, полученную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (амино-содержащий силикагель, градиент растворителя; 0 → 10% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (260 мг). MS (ESI+); 658,5
[0257] (v) Синтез трет-бутил N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
С использованием трет-бутил N-[3-(аминометил)бензоил]-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (260 мг) указанное в заголовке соединение (353 мг) получали таким же способом, как на стадии (v) Примера 2-11 выше. MS (ESI-); 1210,4
(vi) Синтез трет-бутил N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-L-лизината
С использованием трет-бутил N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (353 мг) указанное в заголовке соединение (245 мг) получали таким же способом, как на стадии (vi) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 1078,8
[0258] (vii) Синтез трет-бутил N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
С использованием трет-бутил N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-L-лизината (245 мг) указанное в заголовке соединение (139 мг) получали таким же способом, как на стадии (vii) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 1158,8
(viii) Синтез N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
С использованием трет-бутил N-[3-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (341 мг) указанное в заголовке соединение (38,2 мг) получали таким же способом, как на стадии (viii) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 934,4
(ix) Синтез [N-{3-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния
С использованием N-[3-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина (28 мг) указанное в заголовке соединение (13,8 мг) получали таким же способом, как на стадии (ix) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 1089,2
(x) Синтез конъюгата No. 13
С использованием [N-{3-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния, конъюгат получали таким же способом, как на стадии (x) Примера 2-11 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)], имеющий молекулярную массу 1089, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-15. Синтез ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2))
[0259] [Химическая формула 110]
[0260] (i) Синтез трет-бутил глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата)
TFA (4 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (400 мг) в дихлорметане (4 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при охлаждении льдом в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (642 мг). MS (ESI+); 340,4
(ii) Синтез трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензойную кислоту (228 мг), DIPEA (1,5 мл) и HATU (345 мг) добавляли к смеси трет-бутил глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата) (642 мг) и дихлорметана (6 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 4% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (489 мг). MS (ESI+); 573,4
(iii) Синтез трет-бутил N-[3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
TFA (2 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (489 мг), анизола (280 мкл) и дихлорметана (5 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем добавляли дихлорметан (7 мл) и добавляли 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11,14-тетраокса-5-азагексадекан-16-овую кислоту (289 мг), DIPEA (1,5 мл) и HATU (487 мг) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 1% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (427 мг). MS (ESI+); 762,5
[0261] (iv) Синтез трет-бутил N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
TFA (1,3 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-[3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (427 мг), анизола (200 мкл) и дихлорметана (4 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем добавляли DMF (6 мл) и добавляли DOTA-трис(t-Bu)эфир (353 мг), DIPEA (0,96 мл) и HATU (320 мг) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 10% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (863 мг). MS (ESI+): 1238,9 [M+Na]+
(v) Синтез N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
С использованием трет-бутил N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (863 мг) указанное в заголовке соединение (40,0 мг) получали таким же способом, как на стадии (viii) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 992,5
(vi) Синтез [N-{3-[3-оксо-15-(оксо-ко)-16-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5)-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния
С использованием N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина (40 мг) указанное в заголовке соединение (15,9 мг) получали таким же способом, как на стадии (ix) Примера 2-11 выше. MS (ESI-); 1145,0
(vii) Синтез конъюгата No. 15
[0262] С использованием [N-{3-[3-оксо-15-(оксо-ко)-16-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5)-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния, конъюгат получали таким же способом, как на стадии (x) Примера 2-11 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#N)], имеющий молекулярную массу 1147, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-24. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2))
Синтез конъюгата No. 24 (конъюгирование через иминотиолан)
Раствор в 0,1 M боратном буфере (5 мкл) 2 мг/мл 2-иминотиолана (далее сокращенно 2-IT) добавляли к 4,45 мг/мл Fab2 боратного буфера (160 мкл) и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 40 минут. Избыточное количество 2-IT промывали фосфатно-солевым буферным раствором 3 раза с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра и в завершение концентрировали.
[N-{3-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-13 (ix), растворяли в DMSO (40 мкл). К полученному раствору добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и добавляли 0,1 M водный раствор карбоната натрия для получения pH 6,0.
Полученный раствор линкера добавляли к полученному фильтрату, содержащему антитело, и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Добавляли EDTA-содержащий фосфатно-солевой буферный раствор (pH 6,0) и затем полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 10 минут. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали фосфатно-солевым буферным раствором 7 раз, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)], имеющий молекулярную массу 1190, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-29. Синтез ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2))
[0263] [Химическая формула 111]
[0264] (i) Синтез метил 3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензоата
Метил 3-(Аминометил)бензоат моногидрохлорид (286 мг), HATU (590 мг) и Et3N (900 мкл) добавляли к раствору 2,2-диметил-4-оксо-3,8,11,14-тетраокса-5-азагексадекан-16-овой кислоты (396 мг) в дихлорметане (10 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 2 → 6% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (598 мг). MS (ESI+); 455,2
(ii) Синтез 3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензойной кислоты
1 M водный раствор гидроксида натрия (4 мл) и воду (5 мл) добавляли к раствору метил 3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензоата (597 мг) в THF (15 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 часов. Реакционный раствор разбавляли водой, добавляли 10% лимонную кислоту, затем полученную смесь экстрагировали этилацетатом и собранный органический слой промывали насыщенным солевым раствором. Органический слой сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали и затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (662 мг). MS (ESI+); 441,1
(iii) Синтез трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
TFA (3 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (1,63 г) и дихлорметана (5 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. DIPEA (5 мл) добавляли к смеси N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионина (1,11 г), дихлорметана (8 мл) и HATU (2,12 г) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Раствор остатка, полученного в предыдущей реакции, в дихлорметане (4 мл) добавляли к этой реакционной смеси и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 часов. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 5% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (1,63 г). MS (APCI/ESI+); 571,3
[0265] (iv) Синтез трет-бутил N-[3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
TFA (2 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (150 мг) и дихлорметана (2 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. DIPEA (360 мкл) добавляли к смеси 3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензойной кислоты (120 мг), дихлорметана (3 мл) и HATU (150 мг) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. Раствор остатка, полученного в предыдущей реакции, в дихлорметане (2 мл) добавляли к этой реакционной смеси и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 5% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (113 мг). MS (ESI+); 893,4
(v) Синтез трет-бутил N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил)]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината тетракис(трифторацетата)
TFA (2 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-[3-(17,17-диметил-3,15-диоксо-5,8,11,16-тетраокса-2,14-диазаоктадекан-1-ил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (113 мг) и дихлорметана (2 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа и затем концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта. DIPEA (0,22 мл) добавляли к смеси DOTA-трис(t-Bu)эфира (80 мг), HATU (80 мг) и диметилацетамида (далее сокращенно DMAc) (1 мл) при комнатной температуре, полученную смесь перемешивали в течение 10 минут, затем добавляли смесь ранее полученного неочищенного продукта в DMAc (1 мл) и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (178 мг). MS (ESI-); 1345,8
(vi) Синтез N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
С использованием трет-бутил N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината тетракис(трифторацетата) (178 мг) указанное в заголовке соединение (60,0 мг) получали таким же способом, как на стадии (viii) Примера 2-11 выше. MS (APCI/ESI+); 1123,4
[0266] (vii) Синтез [N-{3-[3-оксо-15-(оксо-ко)-16-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния
С использованием N-(3-{3,15-диоксо-16-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил}бензоил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина (40 мг) указанное в заголовке соединение (10,3 мг) получали таким же способом, как на стадии (ix) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 1278,3
(viii) Синтез конъюгата No. 29
С использованием [N-{3-[3-оксо-15-(оксо-ко)-16-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния конъюгат получали таким же способом, как на стадии (x) Примера 2-11 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)], имеющий молекулярную массу 1278, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-33. Синтез ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)]p-Fab2))
[0267] [Химическая формула 112]
[0268] (i) Синтез трет-бутил N-[2-(трет-бутоксикарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
TFA (2 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (150 мг) и дихлорметана (2 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. Раствор остатка, полученного в предыдущей реакции, в дихлорметане (2 мл) добавляли к смеси 2-(трет-бутоксикарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбоновой кислоты (88 мг), дихлорметана (2 мл), HATU (150 мг) и DIPEA (360 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 6% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (231 мг). MS (APCI/ESI+); 752,2 [M+Na]+
(ii) Синтез трет-бутил N-(2-{[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината тетракис(трифторацетата)
С использованием трет-бутил N-[2-(трет-бутоксикарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (231 мг) указанное в заголовке соединение (222 мг) получали таким же способом, как на стадии (v) Примера 2-29 выше. MS (ESI-); 1182,7
(iii) Синтез N-(2-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
С использованием трет-бутил N-(2-{[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината тетракис(трифторацетата) (222 мг) указанное в заголовке соединение (53 мг) получали таким же способом, как на стадии (viii) Примера 2-11 выше. MS (APCI/ESI+); 960,2
[0269] (iv) Синтез {N-[2-({4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетил-ко)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)}гадолиния
С использованием N-(2-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина (22 мг) указанное в заголовке соединение (7,0 мг) получали таким же способом, как на стадии (ix) Примера 2-11 выше. MS (ESI+): 1115,3
(v) Синтез конъюгата No. 33
С использованием соединения (iv) конъюгат получали таким же способом, как на стадии (x) Примера 2-11 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#N)], имеющий молекулярную массу 1115, был связан с одним Fab2, имеющий молекулярную массу 47,9 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-35. Синтез ([Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2))
Синтез конъюгата No. 35
С использованием [N-{3-[3-оксо-15-(оксо-ко)-16-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}-5,8,11-триокса-2,14-диазагексадекан-1-ил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(3-)]гадолиния, синтезированного в Примере 2-29, (vii), конъюгат получали таким же способом, как на стадии Примера 2-24 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой конъюгат, в котором один [Gd/DOTA-NH-(CH2CH2O)3-CH2-C(=O)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)], имеющий молекулярную массу 1380, был связан с одним Fab2, имеющий молекулярную массу 47,9 кДа.
(Пример 2-40. Синтез [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2))
[0270] [Химическая формула 113]
[0271] (i) Синтез трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
С использованием трет-бутил N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (690 мг) указанное в заголовке соединение (710 мг) получали таким же способом, как на стадии (i) Примера 2-33 выше. MS (ESI+): 726,5 [M+Na]+
(ii) Синтез трет-бутил N-[3-(аминометил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата)
С использованием трет-бутил N-(3-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензоил)-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (41 мг) неочищенный продукт указанного в заголовке соединения (42 мг) получали таким же способом, как в Примере 2-12 (iv) выше. MS (ESI+): 604,3
(iii) Синтез N-[3-(аминометил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина моно(трифторацетата)
TFA (2 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-[3-(аминометил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината моно(трифторацетата) (41 мг) в дихлорметане (4 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении и затем подвергали азеотропной сушке с толуолом с получением неочищенного продукта (43 мг). 16 мг неочищенного продукта очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 5 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (11 мг). MS (ESI+): 548,2
(iv) Синтез N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-тетракис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил]метил}фенил)карбамотиоил]амино}метил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
С использованием N-[3-(аминометил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина моно(трифторацетата) (11 мг) указанное в заголовке соединение (17 мг) получали таким же способом, как на стадии (viii) Примера 2-12 выше. MS (ESI+): 1099,5
[0272] (v) Синтез водород [N-{3-[({[4-({1,4,7,10-тетракис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил-κ4N1,N4,N7,N10}метил)фенил]карбамотиоил}амино)метил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(4-)]гадолината(1-)
С использованием N-[3-({[(4-{[1,4,7,10-тетракис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил]метил}фенил)карбамотиоил]амино}метил)бензоил]-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина (16 мг) указанное в заголовке соединение (6 мг) получали таким же способом, как на стадии (ix) Примера 2-12 выше. MS (ESI+): 1254,6
(vi) Синтез конъюгата No. 40
С использованием водород [N-{3-[({[4-({1,4,7,10-тетракис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-2-ил-κ4N1,N4,N7,N10}метил)фенил]карбамотиоил}амино)метил]бензоил}-L-метионилглицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинато(4-)]гадолината(1-) конъюгат получали таким же способом, как на стадии Примера 2-24 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)-NH-CH2-(1,3-Ph)-C(=O)-Met-Gly-Lys*-Z2(#S)], имеющий молекулярную массу 1355, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-47: Синтез ([Gd/DOTA]p-Fab2))
[0273] [Химическая формула 114]
[0274] 1 M водный раствор гидроксида натрия (80 мкл) добавляли к смешанному раствору 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA) (16 мг) и воды (810 мкл) при охлаждении льдом для доведения pH до 6. 1-Гидрокси-2,5-диоксопирролидин-3-сульфонат натрия (2,3 мг), растворенный в воде (117 мкл), добавляли к полученному раствору (239 мкл) при охлаждении льдом. Затем добавляли водный раствор 3-{[(этилимино)метилиден]амино}-N, N-диметилпропан-1-амина моногидрохлорида (далее сокращенно EDC HCl) (8,3 мкл, 25 мг/мл) и полученную смесь перемешивали в течение 30 минут при охлаждении льдом с получением раствора N-гидроксисульфосукцинимидил DOTA. Перед добавлением Fab2 добавляли 0,2 M водный раствор динатрий гидрофосфата (pH 9) (40 мкл) для доведения pH до 7.
(i) Полученный раствор N-гидроксисульфосукцинимидил DOTA (200 мкл) добавляли к 0,1 M водному раствору динатрий гидрофосфата (390 мкл) с 17,8 мг/мл Fab2 (60 мкл) и полученную смесь инкубировали при 4°C в течение 23 часов. Избыточное количество линкера промывали при помощи 10 мМ фосфатного буфера с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра 3 раза, промывали буфером 0,3 M ацетата аммония, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата.
[0275] [Химическая формула 115]
[0276] (ii) 0,3 M аммонийацетатный буфер, содержащий конъюгат, полученный в (i), разбавляли этим же буфером и pH доводили до 6,62 с использованием 0,25 M ацетатного буфера. Водный раствор GdCl3 (35 мкл), полученный до 0,057 M, добавляли к раствору Fab2, полученному до 2,8 мг/мл, и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 0,5 часов. После реакции добавляли 0,05 M EDTA (525 мкл) и затем полученную смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали фосфатно-солевым буферным раствором 5 раз, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один или два [Gd/DOTA], имеющих молекулярную массу 542, были связаны с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа.
(Пример 2-48. Синтез ([Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2))
[0277] [Химическая формула 116]
[0278] (i) для связывания DOTA, которая представляет собой хелатирующий агент, с Fab2 использовали p-SCN-Bn-DOTA (Macrocyclics, Inc.). 0,1 M раствор карбонат натрия (pH 9,0) добавляли к раствору Fab2, полученному до 2,54 мг/мл с использованием фосфатно-солевого буферного раствора (pH 7,4) и глицерина для доведения pH до 8,8-9,5. К смеси добавляли P-SCN-Bn-DOTA и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 2 часов. После реакции продукт реакции выделяли с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра для очистки конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой конъюгат, в котором один или два [4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)], имеющих молекулярную массу 553, были связаны с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа.
[0279] [Химическая формула 117]
[0280] (ii) С использованием конъюгата, полученного в (i), конъюгат получали таким же способом, как на стадии (ii) Примера 2-47 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой конъюгат, в котором один [Gd/4arm-DOTA-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=S)], имеющий молекулярную массу 706, был связан с одним of Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа.
(Пример 2-60. Синтез ([DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2))
[0281] [Химическая формула 118]
[0282] (i) Синтез 3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензойной кислоты
2-Метилбут-2-ен (6 мл), дигидрофосфат натрия дигидрат (3,35 г) и хлорит натрия (3,64 г) добавляли к смеси бензил (3-формилфенокси)ацетата (2,90 г), 2-метилпропан-2-ола (60 мл) и воды (30 мл) при комнатной температуре и полученную смесь перемешивали в течение 2 часов. К реакционной жидкости добавляли этилацетат и раствор 1 M хлористоводородной кислоты (60 мл) и полученную смесь экстрагировали этилацетатом. Органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали. Фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (2,93 г). MS (ESI-); 285,1
(ii) Синтез трет-бутил N-[(бензилокси)карбонил]глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозината
трет-Бутил N-[(бензилокси)карбонил]глицил-L-тирозинат (2,49 г) растворяли в ацетоне (50 мл) и добавляли этилбромацетат (2,05 г) и карбонат калия (2,41 г) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Нерастворимое вещество отфильтровывали, фильтрат концентрировали и полученный остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (этилацетат:гексан=30:70 → 60:40) с получением указанного в заголовке соединения (2,99 г). MS (ESI+): 537,4 [M+Na]+
(iii) Синтез трет-бутил N-{3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензоил}глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозината
трет-Бутил N-[(бензилокси)карбонил]глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозинат (2,75 г) растворяли в этаноле (55 мл), добавляли 10% палладий на углероде (содержание воды 50%, 550 мг) в атмосфере аргона и полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) в течение ночи при комнатной температуре. Систему продували аргоном, затем нерастворимое вещество отфильтровывали, фильтрат концентрировали, остаток растворяли в дихлорметане (55 мл), добавляли 3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензойную кислоту (1,99 г), HATU (2,84 г) и Et3N (1,5 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную жидкость концентрировали и очищали колоночной хроматографией на силикагеле (этилацетат:гексан=30:70 → 70:30) с получением указанного в заголовке соединения (3,07 г). MS (ESI-); 647,4
[0283] (iv) Синтез трет-бутил N-[3-(карбоксиметокси)бензоил]глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозината
трет-Бутил N-{3-[2-(бензилокси)-2-оксоэтокси]бензоил}глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозинат (3282 мг) растворяли в THF (66 мл), добавляли 10% палладий на углероде (50% влажности, 328 мг) в атмосфере аргона и полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную жидкость фильтровали через Целит и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (2,54 г). MS (ESI-); 557,4
(v) Синтез трет-бутил N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозинат
DMF (5 мл) и Et3N (0,16 мл) добавляли к N4-{5-[ацетил(гидрокси)амино]пентил}-N1-(5-{4-[(5-аминопентил)(гидрокси)амино]-4-оксобутанамидо}пентил)-N1-гидроксибутандиамиду монометансульфонату (DFO.MeSO3H) (500 мг), трет-бутил N-[3-(карбоксиметокси)бензоил]глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозинату (446 мг), EDC HCl (175 мг) и 1H-бензотриазол-1-олу (далее сокращенно HOBt) (123 мг) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. К реакционной жидкости добавляли 0,1% водный раствор TFA (1 мл) и TFA (0,03 мл) и полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 0:100) с получением указанного в заголовке соединения (548 мг). MS (ESI-); 1099,7
(vi) Синтез трет-бутил N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(карбоксиметил)-L-тирозината
Метанол (5 мл) и DMF (5 мл) добавляли к трет-бутил N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(2-этокси-2-оксоэтил)-L-тирозинату (500 мг) и слегка нагревали для растворения, добавляли 1 M водный раствор гидроксида натрия (600 мкл) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли 1 M водный раствор гидроксида натрия (600 мкл) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Добавляли TFA (90 мкл) при охлаждении льдом, метанол отгоняли при пониженном давлении и полученный раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 0:100) с получением указанного в заголовке соединения (315 мг). MS (ESI-); 1071,6
[0284] (vii) Синтез трет-бутил N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)-L-тирозината
DMF (4 мл) добавляли к смеси трет-бутил N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(карбоксиметил)-L-тирозината (269 мг), EDC HCl (58 мг) и HOBt (41 мг), затем добавляли 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-дион моногидрохлорид (44 мг) и Et3N (35 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. К реакционной жидкости добавляли 0,1% водный раствор TFA (1 мл) и полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 0:100) с получением смеси исходного вещества карбоновой кислот и указанного в заголовке соединения (155 мг, около 6:4). Эту смесь растворяли в DMSO (1 мл) и добавляли DMF (2 мл), EDC HCl (22 мг) и HOBt (15 мг), полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут, затем добавляли 1-(2-аминоэтил)-1H-пиррол-2,5-дион моногидрохлорид (15,5 мг) и Et3N (12 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной жидкости добавляли 0,1% водный раствор TFA (1 мл) и полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 10:90) с получением указанного в заголовке соединения (118 мг). MS (ESI-); 1193,6
(viii) Синтез N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)-L-тирозина
трет-Бутил N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]амино}-2-оксоэтил)-L-тирозинат (118 мг) растворяли в TFA (1,2 мл) и полученный раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционную жидкость концентрировали, добавляли DMF (1,5 мл) и воду (0,5 мл) и полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 10:90) с получением указанного в заголовке соединения (82 мг). MS (ESI-); 1137,5
[0285] (ix) Синтез конъюгата No. 60
Раствор 2-IT, полученный с 0,1 M боратного буфера, добавляли к раствору Fab2, полученному до 4,45 мг/мл с использованием 0,1 M боратного буфера, и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Избыточное количество 2-IT промывали EDTA-содержащим фосфатно-солевым буферным раствором (pH 6,0) с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр. N-{3-[(9,20,31-тригидрокси-2,10,13,21,24,32-гексаоксо-3,9,14,20,25,31-гексаазатритриаконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-O-(2-{[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил)]амино}-2-оксоэтил)-L-тирозин, растворенный в DMF, добавляли к полученному фильтрату и полученную смесь разбавляли 0,1 M боратным буфером (pH 8,5) и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Избыточное количество реагента промывали EDTA-содержащим фосфатно-солевым буферным раствором (pH 6,0) с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра, это повторяли 3 раза, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр.
Затем раствор 2-иодацетамида, полученный до 10 мг/мл с использованием фосфатно-солевого буферного раствора (pH 6,0), добавляли к полученному супернатанту и затем полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Избыточное количество иодацетамида промывали фосфатно-солевым буферным раствором с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра 3 раза, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр для очистки Fab2-связанного конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [DFO-C(=O)-CH2O-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Tyr*-CH2-C(=O)-NH-(CH2)2-Z1(#S)], имеющий молекулярную массу 1241, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа.
(Пример 2-61. Синтез ([DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#S)]p-Fab2))
[0286] [Химическая формула 119]
[0287] (i) Синтез трет-бутил N-(3-гидроксибензоил)глицината
HATU (3,3 г) и DIPEA (3 мл) добавляли к смеси 3-гидроксибензойной кислоты (1,0 г) и трет-бутилглицината моногидрохлорида (1,2 г) в DMF (10 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. К смеси добавляли воду и этилацетат, полученную смесь подвергали разделению слоев и экстрагированию два раза, органический слой промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали, затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении, к полученному твердому веществу добавляли этилацетат, полученную смесь перемешивали при комнатной температуре, затем нерастворимое вещество собирали фильтрованием и фильтрат концентрировали. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат=95/5 → 50/50), фракции, содержащие желаемый продукт, собирали, концентрировали и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (1,23 г). MS (ESI+): 274,2 [M+Na]+
(ii) Синтез бензил 3-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)этокси]этокси}пропаноата
Раствор 4 M хлористый водород/диоксан (10 мл) добавляли к трет-бутил 3-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)этокси]этокси}пропаноату (3,0 г) при охлаждении льдом и затем полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали и затем подвергали азеотропной сушке два раза с толуолом, затем добавляли метанол (20 мл) и 1 M водный раствор гидроксида натрия (13 мл) при комнатной температуре и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1,5 часов. Смесь концентрировали, затем добавляли THF (10 мл), метанол (10 мл) и бензилбромид (1,8 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 дней. Смесь концентрировали и остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (гексан/этилацетат=95/5 → 0/100 → хлороформ/метанол=90/10) с получением указанного в заголовке соединения (2,19 г). MS (ESI+): 313,2
(iii) Синтез трет-бутил N-{3-[(3-оксо-1-фенил-2,6,9,12-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]бензоил}глицината
Добавляли трет-бутил N-(3-Гидроксибензоил)глицинат (915 мг), бензил 3-{2-[2-(2-гидроксиэтокси)этокси]этокси}пропаноат (1,38 г), диэтил азодикарбоксилат (40% раствор в толуоле, около 2,2 M, 3,4 мл) и THF (20 мл), затем добавляли по порциям трифенилфосфин (2,0 г) при комнатной температуре и затем полученную смесь перемешивали в течение ночи при температуре бани 60°C. Добавляли хлорид магния (1,5 г) и толуол (20 мл) и полученную смесь нагревали и перемешивали при температуре бани 60°C в течение 2 часов. Смеси давали охладиться до комнатной температуры, затем осажденное твердое вещество удаляли фильтрованием и отгоняли растворитель. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (силикагель; гексан/этилацетат=95/5 → 20/80) и затем снова очищали колоночной хроматографией на силикагеле (амино-содержащий силикагель; гексан/этилацетат=95/5 → 50/50) с получением указанного в заголовке соединения (1,12 г). MS (ESI+): 546,4
(iv) Синтез N-{3-[(3-оксо-1-фенил-2,6,9,12-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]бензоил}глицина
трет-Бутил N-{3-[(3-Оксо-1-фенил-2,6,9,12-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]бензоил}глицинат (1,11 г) растворяли в смеси 4 M хлористый водород/диоксан (5 мл) при комнатной температуре и полученный раствор перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (1,12 г). MS (ESI+): 490,3
[0288] (v) Синтез трет-бутил N-{3-[(3-оксо-1-фенил-2,6,9,12-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]бензоил}глицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
HATU (1,2 г) и DIPEA (1,4 мл) добавляли к раствору N-{3-[(3-оксо-1-фенил-2,6,9,12-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]бензоил}глицина (1300 мг), трет-бутил N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината моногидрохлорида (1,0 г) в DMF (20 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. К смеси добавляли воду и этилацетат для разделения слоев и экстрагирования, органический слой промывали водой и насыщенным солевым раствором, затем сушили над безводным сульфатом магния и фильтровали и затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (амино-содержащий силикагель; гексан/этилацетат=90/10 → 0/100) с получением указанного в заголовке соединения (1,14 г). MS (ESI+): 808,5
(vi) Синтез трет-бутил N-[3-(2-{2-[2-(2-карбоксиэтокси)этокси]этокси}этокси)бензоил]глицил-L-лизината
10% Палладий на углероде (50% влажности, 200 мг) добавляли к смеси трет-бутил N-{3-[(3-оксо-1-фенил-2,6,9,12-тетраоксатетрадекан-14-ил)окси]бензоил}глицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (1,12 г), Et3N (20 мкл) и этанола (20 мл) при комнатной температуре и полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода в течение ночи при этой же температуре. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут или более в открытой системе, затем реакционную жидкость фильтровали через Целит и фильтрат концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (825 мг). MS (ESI+): 584,5
(vii) Синтез трет-бутил N-[3-(2-{2-[2-(2-карбоксиэтокси)этокси]этокси}этокси)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
Метил 2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-карбоксилат (150 мг) и Et3N (500 мкл) добавляли к смеси трет-бутил N-[3-(2-{2-[2-(2-карбоксиэтокси)этокси]этокси}этокси)бензоил]глицил-L-лизината (350 мг), THF (3 мл) и DMF (1 мл) при комнатной температуре и полученную смесь перемешивали при температуре бани 60°C в течение 4 дней. Смесь охлаждали до комнатной температуры и затем добавляли TFA (300 мкл) и воду (500 мкл) для нейтрализации смеси. К смеси добавляли подходящие количества воды и DMF и полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 0:100). Фракции, содержащие желаемый продукт, собирали, концентрировали и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (250 мг). MS (ESI+): 664,5
[0289] (viii) Синтез трет-бутил N-{3-[(19,30,41-тригидрокси-12,20,23,31,34,42-гексаоксо-3,6,9-триокса-13,19,24,30,35,41-гексаазатритетраконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината
EDC HCl (140 мг), HOBt (100 мг) и DIPEA (200 мкл) добавляли к смеси N4-{5-[ацетил(гидрокси)амино]пентил}-N1-(5-{4-[(5-аминопентил)(гидрокси)амино]-4-оксобутанамидо}пентил)-N1-гидроксибутандиамида монометансульфоната (DFO.MeSO3H) (240 мг), трет-бутил N-[3-(2-{2-[2-(2-карбоксиэтокси)этокси]этокси}этокси)бензоил]глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцината (243 мг) в DMF (3 мл) и DMSO (1 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Добавляли TFA (100 мкл) и воду (500 мкл) и полученный раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 10:90) и сушили замораживанием с получением указанного в заголовке соединения (207 мг). MS (ESI+): 1228,5 [M+Na]+
(ix) Синтез N-{3-[(19,30,41-тригидрокси-12,20,23,31,34,42-гексаоксо-3,6,9-триокса-13,19,24,30,35,41-гексаазатритетраконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина
TFA (1 мл) добавляли к трет-бутил N-{3-[(19,30,41-тригидрокси-12,20,23,31,34,42-гексаоксо-3,6,9-триокса-13,19,24,30,35,41-гексаазатритетраконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцинату (202 мг) при комнатной температуре и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали, добавляли DMF (4 мл) и воду (500 мкл) и полученную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (0,1% водный раствор TFA:ацетонитрил=95:5 → 10:90) и сушили замораживанием с получением указанного в заголовке соединения (137 мг). MS (ESI-); 1148,7
(x) Синтез конъюгата No. 61
С использованием N-{3-[(19,30,41-тригидрокси-12,20,23,31,34,42-гексаоксо-3,6,9-триокса-13,19,24,30,35,41-гексаазатритетраконтан-1-ил)окси]бензоил}глицил-6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)-L-норлейцина конъюгат получали таким же способом, как на стадии (ix) Примера 2-60 выше. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [DFO-C(=O)-(CH2CH2O)4-(1,3-Ph)-C(=O)-Gly-Lys*-Z2(#S)], имеющий молекулярную массу 1252, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-18. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab2))
[0290] [Химическая формула 120]
[0291] (i) Синтез 4-нитрофенил (4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}фенил)карбамата
Раствор 4-нитрофенилкарбонохлоридата (952 мг) в дихлорметане (10 мл) охлаждали льдом в атмосфере азота, добавляли по каплям смешанный раствор трет-бутил [(4-аминофенил)метил]карбамата (1000 мг) и пиридина (430 мкл) в дихлорметане (10 мл) и затем полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 10 → 100% этилацетат/гексан) с получением неочищенного продукта. К неочищенному продукту добавляли этилацетат и полученную смесь перемешивали для растирания твердого вещества в порошок. Твердое вещество собирали фильтрованием, промывали этилацетатом и затем сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (861 мг). MS (ESI+): 410,3 [M+Na]+
(ii) Синтез L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида моно(трифторацетата)
TFA (2 мл) добавляли по каплям к раствору N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида (257 мг) в дихлорметане (4 мл) при охлаждении льдом. Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении, добавляли диизопропиловый эфир, два раза осуществляли декантирование и осажденное твердое вещество промывали с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (248 мг). MS (ESI+): 385,3
(iii) Синтез N-[(4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}фенил)карбамоил]-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида
TEA (59 мкл) добавляли к смешанному раствору 4-нитрофенил (4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}фенил)карбамата (54 мг) и L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро)-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида моно(трифторацетата) (70 мг) в дихлорметане (5 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 2 → 6% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (55 мг). MS (ESI+): 633,5
[0292] (iv) Синтез N-{[4-(аминометил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида моно(трифторацетата)
TFA (2 мл) добавляли по каплям к раствору N-[(4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}фенил)карбамоил]-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида (54 мг) в дихлорметане (4 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении, добавляли диизопропиловый эфир, два раза осуществляли декантирование и осажденное твердое вещество промывали с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (65 мг). MS (ESI+): 555,4 [M+Na]+
(v) Синтез N-{[4-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида тетракис(трифторацетата)
HATU (66 мг) и DIPEA (45 мкл) добавляли к смешанному раствору N-{[4-(аминометил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида моно(трифторацетата) (64 мг) и DOTA-трис(t-Bu)эфира (50 мг) в DMAc (2 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. К реакционной смеси добавляли 1% водный раствор TFA (около 4 мл) и ацетонитрил (около 1 мл), затем разбавленный раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 20 → 100% 0,1% TFA ацетонитрил/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (92 мг). MS (ESI+): 1109,4 [M+Na]+
(vi) Синтез N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида тетракис(трифторацетата)
TFA (4 мл) добавляли к раствору N-{[4-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида тетракис(трифторацетата) (90 мг) в дихлорметане (4 мл) и полученную смесь перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. Смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 5 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (57 мг). MS (ESI+): 919,4
(vii) Синтез N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиния
Гадолиний хлорид (8 мг) добавляли к смеси N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамида тетракис(трифторацетата) (22 мг) и воды (3 мл), добавляли 0,1 M водный раствор гидрокарбоната натрия для доведения pH до 5-6 и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляли TFA (10 мкл) и затем раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя 5 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (16 мг). MS (ESI-); 1072,1
[0293] (viii) Синтез конъюгата No. 18
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-18 (vii), растворяли в DMSO (40 мкл). К полученному раствору добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и pH доводили до 7,3 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия и 0,25 M ацетатного буфера.
40 мкл предварительно подготовленного раствора добавляли к 4,45 мг/мл Fab2 в боратном буфере (160 мкл) и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали фосфатно-солевым буферным раствором 7 раз, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)], имеющий молекулярную массу 1074, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
[0294] (Пример 2-66. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 и/или A-5)]p-Fab2))
(i) Синтез конъюгата No. 66
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-18 (vii), растворяли в DMSO (40 мкл). К полученному раствору добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и pH доводили до 6,5 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия.
Предварительно подготовленный раствор добавляли к 4,45 мг/мл Fab2 в боратном буфере (320 мкл) и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Добавляли 10 мкл 0,05 M EDTA и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 10 минут. С использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра смесь промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором и полученный раствор выделяли.
20 мМ бис трис пропановый буферный раствор (pH 9,5) добавляли к выделенному раствору, разбавляли до 5-кратного количества, поддверживали на 5 мл HiTrap Q колонке (GE Healthcare) и давали выстояться при комнатной температуре в течение 6 часов. Колонку промывали с использованием 20 мМ бис трис пропанового буферного раствора (pH 9,5) и 1 M водного раствора хлорида натрия и поддерживающий раствор выделяли. Буферный раствор обменивали с фосфатно-солевым буферным раствором с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра, затем раствор очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 и/или A-5)], имеющий молекулярную массу 1092, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором четыре такие молекулы были связаны с ним.
[0295] (Пример 2-67. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab2))
(i) Синтез конъюгата No. 67
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (2 мг), синтезированный в Примере 2-18 (vii), растворяли в DMSO (80 мкл), добавляли 0,1 M боратный буфер (80 мкл) и затем pH доводили до 7,3 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия.
Раствор 2 мг/мл 2-IT (10 мкл), полученный с использованием 0,1 M боратного буфера, добавляли к 4,45 мг/мл Fab2 в боратном буфере (320 мкл) и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 40 минут. Избыточное количество 2-IT промывали фосфатно-солевым буферным раствором с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра и концентрировали до 200 мкл, затем добавляли предварительно подготовленный раствор и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Добавляли 0,05 M EDTA (10 мкл), полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 10 минут, затем смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата.
MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)], имеющий молекулярную массу 1175, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-68. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab2))
[0296] [Химическая формула 121]
[0297] (I) Синтез N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-N2-(трет-бутоксикарбонил)-L-изолейцинамида
DIPEA (6,6 мл) и бензил (2-аминоэтил) карбамат моногидрохлорид (3,29 г) последовательно добавляли к смешанному раствору N-(трет-бутоксикарбонил)-L-изолейцина (3,00 г) и HATU (5,92 г) в дихлорметане (30 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. К реакционной смеси добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали два раза дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем концентрировали. К остатку добавляли 200 мл раствора этилацетат/дихлорметан (1:2) и затем полученную смесь концентрировали с получением 100 мл раствора, который затем охлаждали льдом. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием и промывали раствором этилацетат/дихлорметан (1:1) с получением твердого вещества. Фильтрат концентрировали снова и затем охлаждали льдом и осажденное твердое вещество собирали фильтрованием и промывали раствором этилацетат/дихлорметан (1:1) с получением твердого вещества. Полученные твердые вещества объединяли и сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (4,10 г). MS (ESI+): 408,3
(ii) Синтез N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида
TFA (7,51 мл) добавляли к раствору N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-N2-(трет-бутоксикарбонил)-L-изолейцинамида (2,00 г) в дихлорметане (10 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении, затем к этому остатку добавляли N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионин (1,35 г), DIPEA (4,2 мл), дихлорметан (20 мл) и HATU (2,24 г) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали дихлорметаном и метанолом и затем сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (1,58 г). MS (ESI+): 539,4
(iii) Синтез L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида
TFA (3 мл) добавляли по каплям к раствору N-(трет-бутоксикарбонил)-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида (1,05 г) в дихлорметане (6 мл) при охлаждении льдом. Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 2 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении, добавляли дихлорметан и насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия и полученную смесь экстрагировали два раза дихлорметаном. Объединенные органические слои промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия и затем сушили над безводным сульфатом натрия, фильтровали и затем концентрировали с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (690 мг). MS (ESI+): 439,4
[0298] (iv) Синтез N-[(4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}фенил)карбамоил]-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида
Дифенилфосфоразитат (680 мкл) добавляли к смешанному раствору 4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}бензойной кислоты (395 мг), TEA (660 мкл) и толуола (20 мл) в атмосфере аргона и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа и затем перемешивали при температуре бани 100°C в течение 2 часов. Реакционному раствору давали охладиться до комнатной температуры, добавляли раствор L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида (690 мг) в THF (7 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Реакционный раствор концентрировали при пониженном давлении, добавляли водный раствор гидрокарбоната натрия и этилацетат и полученное твердое вещество фильтровали, промывали этилацетатом и затем сушили при пониженном давлении с получением указанного в заголовке соединения (790 мг). MS (ESI+): 687,5
(v) Синтез N-{[4-(аминометил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида
TFA (2 мл) добавляли по каплям к раствору N-[(4-{[(трет-бутоксикарбонил)амино]метил}фенил)карбамоил]-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида (790 мг) в дихлорметане (3 мл) при охлаждении льдом. Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Смесь концентрировали при пониженном давлении и добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия. Осажденное твердое вещество собирали фильтрованием, промывали водой и затем сушили при пониженном давлении с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (720 мг). MS (ESI+): 587,6
(vi) Синтез N-{[4-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида
HATU (280 мг) добавляли к смешанному раствору N-{[4-(аминометил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида (360 мг), DOTA-трис(t-Bu)эфира (386 мг) и DIPEA (320 мкл) в DMAc (2 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 20% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (683 мг). MS (ESI+); 1141,9
[0299] (vii) Синтез N-{[4-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-аминоэтил)-L-изолейцинамида
Смесь N-{[4-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-{[(бензилокси)карбонил]амино}этил)-L-изолейцинамида (683 мг), 10% палладия на углероде (50% влажности, 382 мг) и метанола (10 мл) перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь фильтровали для удаления нерастворимого вещества и затем концентрировали. К остатку добавляли 10% палладий на углероде (содержание воды 50%, 382 мг) и метанол (10 мл) и полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода (1 атм) при комнатной температуре в течение 2 часов. Смесь фильтровали для удаления нерастворимого вещества и затем концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (417 мг). MS (ESI+); 1007,7
(viii) Синтез N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-аминоэтил)-L-изолейцинамида пентакис(трифторацетата)
Смешанный раствор N-{[4-({2-[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-аминоэтил)-L-изолейцинамида (417 мг), воды (210 мкл), три(пропан-2-ил)силана (210 мкл) и TFA (8 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 3 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 33% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (255 мг). MS (ESI+); 839,7
(ix) Синтез N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-{[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]амино}этил)-L-изолейцинамида тетракис(трифторацетата)
TEA (200 мкл) добавляли к раствору N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-аминоэтил)-L-изолейцинамида пентакис(трифторацетата) (255 мг) в DMAc (2 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 10 минут. К этому раствору добавляли раствор 1,4-диизотиоцианатобензола (174 мг) в DMAc (2 мл) и полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (136 мг). MS (ESI+); 1031,4
[0300] (x) Синтез N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-{[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]амино}этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиния
Гадолиний хлорид (10 мг) и 0,1 M водный раствор гидрокарбоната натрия (1,7 мл) добавляли к смеси N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-[2-{[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]амино}этил]-L-изолейцинамида тетракис(трифторацетата) (36 мг) и воды (1,8 мл) для доведения pH до 5,4 и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (33,0 мг). MS (ESI-); 1184,3
(xi) Синтез конъюгата No. 68
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-{[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]амино}этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-68 (x), растворяли в DMSO (310 мкл).
30 мкл предварительно подготовленного раствора добавляли к раствору 4,45 мг/мл Fab2 в фосфатно-солевом буферном растворе (320 мкл), pH доводили до около 9,0 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)], имеющий молекулярную массу 1187, был связан с одним Fab2, имеющий молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 2-69. Синтез ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab2))
[0301] [Химическая формула 122]
[0302] (i) Синтез трет-бутил N-[2-(трет-бутоксикарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината
TEA (0,24 мл) и HATU (241 мг) добавляли к смешанному раствору трет-бутил L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (303 мг) и 2-(трет-бутоксикарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбоновой кислоты (160 мг) в дихлорметане (10 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (градиент растворителя; 0 → 4% метанола/хлороформ) с получением указанного в заголовке соединения (191 мг). MS (ESI+); 784,4
(ii) Синтез трет-бутил N-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината моно(трифторацетата)
TFA (1 мл) добавляли по каплям к раствору трет-бутил N-[2-(трет-бутоксикарбонил)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината (190 мг) в дихлорметане (3 мл) при охлаждении льдом. Полученную смесь перемешивали при этой же температуре в течение 1 часа и затем концентрировали при пониженном давлении с получением неочищенного продукта указанного в заголовке соединения (262 мг). MS (ESI+): 684,5
(iii) Синтез трет-бутил N-(2-{[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината тетракис(трифторацетата)
HATU (184 мг) и DIPEA (124 мкл) добавляли к раствору DOTA-трис(t-Bu)эфира (138 мг) в DMAc (1 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут. К реакционному раствору добавляли раствор трет-бутил N-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината моно(трифторацетата) (261 мг) в DMAc (1 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 часов. Реакционную смесь разбавляли 1% водным раствором TFA (около 1 мл) и затем полученный раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 20 → 100% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (231 мг). MS (ESI+); 1260,7 [M+Na]+
[0303] (iv) Синтез трет-бутил N-(2-{[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-L-лизината тетракис(трифторацетата)
Смесь трет-бутил N-(2-{[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-N6-[(бензилокси)карбонил]-L-лизината тетракис(трифторацетата) (230 мг), 10% палладия на углероде (50% влажности, 300 мг) и метанола (10 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 минут. Смесь фильтровали для удаления нерастворимого вещества и затем фильтрат концентрировали. К остатку добавляли 10% палладий на углероде (50% влажности, 300 мг) и метанол (10 мл) и затем полученную смесь перемешивали в атмосфере водорода (3 атм) при комнатной температуре в течение 18 часов. Смесь фильтровали для удаления нерастворимого вещества и затем концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (152 мг). MS (ESI+); 1104,5
(v) Синтез N-(2-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-L-лизина пентакис(трифторацетата)
TFA (1,5 мл) добавляли к раствору трет-бутил N-(2-{[4,7,10-трис(2-трет-бутокси-2-оксоэтил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-L-лизината тетракис(трифторацетата) (152 мг) в дихлорметане (1 мл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 часов. Смесь концентрировали при пониженном давлении и затем остаток очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 33% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (76 мг). MS (ESI+); 880,4
(vi) Синтез N-(2-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-N6-[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]-L-лизина тетракис(трифторацетата)
TFA (60 мкл) добавляли к раствору N-(2-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-L-лизина пентакис(трифторацетата) (76 мг) и 1,4-диизотиоцианатобензола (50 мг) в DMAc (1 мл) при охлаждении льдом и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 часа. Реакционный раствор очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 50% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (46 мг). MS (ESI-); 1070,6
(vii) Синтез {N-[2-({4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетил-ко)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-N6-[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]-L-лизинато(3-)}гадолиния
Гадолиний хлорид (8 мг) и 0,1 M водный раствор гидрокарбоната натрия (700 мкл) добавляли к смеси N-(2-{[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетил}-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил)-L-метионилглицил-N6-[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]-L-лизина тетракис(трифторацетата) (16 мг) и воды (800 мкл) и полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 30 минут. Реакционную смесь очищали обращенно-фазовой колоночной хроматографией (градиент растворителя; 0 → 40% ацетонитрила/0,1% водный раствор TFA) с получением указанного в заголовке соединения (7,4 мг). MS (ESI-); 1225,3
[0304] (viii) Синтез конъюгата No. 69
{N-[2-({4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетил-ко)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-N6-[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]-L-лизинато(3-)}гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-69 (vii), растворяли в DMSO (310 мкл).
30 мкл предварительно подготовленного раствора добавляли к раствору 4,45 мг/мл Fab2 в фосфатно-солевом буферном растворе (320 мкл), pH доводили до около 9,0 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 24 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15-мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)], имеющий молекулярную массу 1228, был связан с одним Fab2, имеющим молекулярную массу 47,9 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним, конъюгата, в котором четыре такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором пять таких молекул были связаны с ним.
Конъюгаты, полученные в описанных выше Примерах получения, показаны в таблицах 1 и 2.
[0305]
[0306]
[0307] В представленных выше таблицах и Таблицах 15-18, представленных ниже, - представляет собой связь и символы (a)-(q) в S1 колонке, означают спейсеры, представленные следующими формулами (a)-(q), соответственно.
[0308] [Химическая формула 123]
[0309] Соединения Примеров получения №№ A1-A43 и B1-B4 в таблицах 3-14 были синтезированы с использованием таких же способов, как в описанных выше Примерах получения, или способов, известных специалистам в данной области техники, и эти соединения использовали для получения конъюгатов, показанных в таблицах 15-18 ниже.
[0310]
[0311]
[0312]
[0313]
[0314]
[0315]
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320]
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325]
[0326] MS анализы соединений Примеров, показанных в таблицах 15-18 показаны в таблицах 19-23 ниже.
[0327]
[0328]
[0329]
It was confirmed by MS analysis that the conjugate was a mixture of a conjugate in which one low molecular weight molecule having a molecular weight of 1259 was bound to one Fab2 having a molecular weight of 47.9 kDa, a conjugate in which two such molecules were bound thereto, and a conjugate in which three such molecules were bound thereto.
[0330]
[0331]
[0332] Пример 3-1: Оценка активности связывания конъюгата Fab-фрагмента антитела к CEACAM5
Каждый конъюгат Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, полученный в Примере 2, подвергали анализу ELISA для оценки его активности связывания с CEACAM5. В данном испытании фосфатный буфер (Nacalai Tesque Inc., 0,1 моль/л-Фосфатный Буферный Раствор (pH 7,2)), полученный до 10 мМ путем 10-кратного разбавления дистиллированной водой, использовали в качестве растворителя для антиген-иммобилизирующей жидкости, и 20X PBS/Tween 20 Буфер (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352), разбавленный 20-кратно дистиллированной водой, использовали в качестве промывочной жидкости. Кроме того, что касается бычьего сывороточного альбумина (BSA), используемого в данном испытании, 30% раствор бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) добавляли в подходящей пропорции для применения. CEACAM5 (R&D Systems, 4128-CM-050) разбавляли при помощи 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,2) до 0,1 мкг/мл и добавляли в белый 384 планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 4603272) при 30 мкл на лунку и планшет инкубировали в течение ночи при 4°C для иммобилизации. Иммобилизирующую CEACAM5 жидкость удаляли реверсивным центрифугированием и затем осуществляли блокирование путем добавления PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA. Затем блокирующий раствор удаляли реверсивным центрифугированием, раствор каждого конъюгата Fab2 фрагмента антитела к CEACAM5, описанного выше, или Fab2 фрагмента, не имеющего метящей части (PB009-01), в качестве контроля при около 10000 нг/мл разбавляли в 14 стадий путем 3-кратного разведения с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 1,0% BSA, и добавляли 30 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и меченное пероксидазой хрена (HRP) козлиное античеловеческое IgG (H+L цепь) антитело (MBL Life Sciences, 206), разбавленное 1000-кратно с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA, добавляли при 30 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и добавляли реагент ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare, RPN2232) в качестве субстрата при 30 мкл на лунку. Субстрат инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и затем значение его сигнала измеряли с использованием счетчика Envision (PerkinElmer, Inc.).
Испытание для каждого антитела осуществляли в двух повторах и EC50 значение рассчитывали с использованием модели 4-параметрической логистической кривой. Геометрическое среднее (среднее геометрическое значение), стандартное отклонение (геометрический SD-фактор) и нижний предел (нижнее значение) и верхний предел (верхнее значение) 95% доверительного интервала (95% CI геом. среднего) EC50 значений (нМ) для 9 экспериментов для PB009-01 показаны в таблице 24. Кроме того, EC50 значение каждого конъюгата, испытанного в двух повторах, показано в таблице 25. Пр.-№ в таблице представляет номер конъюгата в Примере 2.
[0333]
[0334]
[0335] Пример 3-2:
Каждый конъюгат Fab-фрагмента антитела к человеческому CEACAM5, полученный в Примере 2, подвергали анализу ELISA для оценки его активности связывания с CEACAM5. В данном испытании фосфатный буфер (Nacalai Tesque Inc., 0,1 моль/л-Фосфатный Буферный Раствор (pH 7,2)), полученный до 10 мМ путем 10-кратного разбавления дистиллированной водой, использовали в качестве растворителя для антиген-иммобилизирующей жидкости, и 20X PBS/Tween 20 Буфер (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352), разбавленный 20-кратно дистиллированной водой, использовали в качестве промывочной жидкости. Кроме того, что касается бычьего сывороточного альбумина (BSA), используемого в данном испытании, 30% раствор бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) добавляли в подходящей пропорции для применения. CEACAM5 (R&D Systems, 4128-CM-050) разбавляли при помощи 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,2) до 0,1 мкг/мл и добавляли в белый 384 планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 4603272) при 30 мкл на лунку и планшет инкубировали в течение ночи при 4°C для иммобилизации. Иммобилизирующую CEACAM5 жидкость удаляли реверсивным центрифугированием и затем осуществляли блокирование путем добавления PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA. Затем блокирующий раствор удаляли реверсивным центрифугированием, раствор каждого конъюгата Fab2 фрагмента антитела к CEACAM5, описанного выше, или Fab2 фрагмента, не имеющего метящей части (PB009-01), в качестве контроля при около 10000 нг/мл разбавляли в 14 стадий путем 3-кратного разведения с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 1,0% BSA, и 30 мкл добавляли на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и меченное пероксидазой хрена (HRP) козлиное античеловеческое IgG (H+L цепь) антитело (MBL Life Sciences, 206), разбавленное 1000-кратно с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA, добавляли при 30 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и добавляли реагент ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare, RPN2232) в качестве субстрата при 30 мкл на лунку. Субстрат инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и затем значение его сигнала измеряли с использованием счетчика Envision (PerkinElmer, Inc.).
[0336] Испытание для каждого антитела осуществляли в двух повторах и EC50 значение рассчитывали с использованием модели 4-параметрической логистической кривой. EC50 значение (нМ) для каждого из 2 экспериментов для PB009-01 показано в таблице 26. Кроме того, EC50 значение каждого конъюгата, испытанного в двух повторах, показано в таблице 27. Пр.-№ в таблице представляет номер конъюгата в Примере 2.
[0337]
[0338]
[0339] Пример 4-1: Испытание для оценки аккумуляции в почках Gd-меченных конъюгатов (нормальные мыши)
Конъюгат включает конъюгат, содержащий пептидный линкер, имеющий аминокислотную последовательность, расщепляемую ферментом мембраны почечной щеточной каемки или лизосомальным ферментом, в качестве пептидного линкера "X." Конъюгат по настоящему изобретению, содержащий такой линкер, специфически расщепляется по линкерной группе любым из этих ферментов, присутствующих в почках, и, таким образом, ожидается, что аккумуляция метящей части в почках уменьшается. Результаты оценки аккумуляции в почках такого конъюгата по настоящему изобретению показаны ниже.
(Метод испытания)
Gd-меченный конъюгат, такой как конъюгат, содержащий пептидный линкер, полученный в одном из описанных выше Примеров, вводили через хвостовую вену мышам (BALB/c или BALB/c nu/nu) таким образом, чтобы масса белка составляла 0,02 мг (100 мкл) на животное. Примерно через 24 часа мышей умерщвляли и почки удаляли и количество Gd в почках измеряли с использованием ICP-MS. Это испытание осуществляли в 3 случаях в каждой группе, рассчитывали среднее значение от 3 случаев и количество содержащегося Gd на почку после введения было показано как процент (% дозы/ткань) от общего количества введенного Gd. Результаты показаны в таблице 28 ниже. Пр.-№ в таблице представляет номер конъюгата в Примере 2. Кроме того, такое же испытание осуществляли с использованием Пр.-№. 47 ([Gd/DOTA]p-Fab), полученного в Примере получения 2-47, который не содержал пептидный линкер, в качестве контрольного конъюгата и рассчитывали геометрическое среднее (среднее геометрическое значение), стандартное отклонение (геометрический SD-фактор) и значение нижнего предела (нижнее значение) и верхний предел значение (верхнее значение) 95% доверительного интервала (95% CI геом. среднего) для 5 экспериментов.
[0340] (Результаты)
Результаты показаны в таблице 29 ниже. На основании процентного содержания контрольного конъюгата (% дозы/ткань), был определен процент уменьшения количества Gd, содержащегося в почках, для каждого из конъюгатов, содержащих пептидный линкер, и показан в таблице 28. Как показано в таблице 28, аккумуляция метящей части в почках была на 39,6-82,9% пунктов ниже в конъюгатах, содержащих пептидный линкер, по сравнению с контрольным конъюгатом.
[0341]
[0342]
[0343] Пример 4-2: Испытание для оценки аккумуляции в почках Gd-меченных конъюгатов (нормальные мыши)
(Метод испытания)
Gd-меченный конъюгат, такой как конъюгат, содержащий пептидный линкер, полученный в одном из описанных выше Примеров, вводили через хвостовую вену мышам (BALB/c или BALB/c nu/nu) таким образом, чтобы масса белка составляла 0,02 мг (100 мкл) на животное. Примерно через 24 часа мышей умерщвляли и почки удаляли и количество Gd в почках измеряли с использованием ICP-MS. Это испытание осуществляли в 3 случаях в каждой группе, рассчитывали среднее значение от 3 случаев и количество содержащегося Gd на почку после введения было показано как процент (% дозы/ткань) от общего количества введенного Gd. Результаты показаны в таблице 30 ниже. Пр.-№ в таблице представляет номер конъюгата в Примере 2. Кроме того, такое же испытание осуществляли с использованием Пр.-№ 47 ([Gd/DOTA]p-Fab), полученного в Примере получения 2, который не содержал пептидный линкер, в качестве контрольного конъюгата.
(Результаты)
Результаты показаны в таблице 30 ниже. На основании процентного содержания контрольного конъюгата (% дозы/ткань), был определен процент уменьшения количества Gd, содержащегося в почках, для каждого из конъюгатов, содержащих пептидный линкер, и показан в таблице 30. Как показано в таблице 30, аккумуляция метящей части в почках была на 92,15-95,38% пунктов ниже в конъюгатах, содержащих пептидный линкер, чем в контрольном конъюгате 47.
[0344]
Остаточное количество в почках (нормальные мыши)
[0345] Пример 4-3: Испытание для оценки аккумуляции в почках Gd-меченных конъюгатов (нормальные мыши)
(Метод испытания)
Gd-меченный конъюгат, такой как конъюгат, содержащий пептидный линкер, полученный в одном из описанных выше Примеров, вводили через хвостовую вену мышам (BALB/c или BALB/c nu/nu) таким образом, чтобы масса белка составляла 0,02 мг (100 мкл) на животное. Примерно через 24 часа мышей умерщвляли и почки удаляли и количество Gd в почках измеряли с использованием ICP-MS. Это испытание осуществляли в 3 случаях в каждой группе, рассчитывали среднее значение от 3 случаев и количество содержащегося Gd на почку после введения было показано как процент (% дозы/ткань) от общего количества введенного Gd. Такое же испытание осуществляли с использованием Пр.-№. 47, полученного в Примере получения 2 выше, который не содержал пептидный линкер, в качестве контрольного конъюгата и среднее значение остаточных количеств в почках для 5 экспериментов для Пр.-№. 47 показано в таблице 31.
(Результаты)
На основании процентного содержания контрольного конъюгата (% дозы/ткань), процент (%) уменьшения количества Gd, содержащегося в почках, для каждого из конъюгатов, содержащих пептидный линкер, был определен и показан в таблице 32. Как показано в таблице 32, аккумуляция метящей части в почках была на 21,00-94,66% пунктов ниже в конъюгатах, содержащих пептидный линкер, по сравнению с контрольным конъюгатом.
[0346] [Таблица 31]
Остаточное количество в почках (нормальные мыши)
(% дозы/ткань)
[0347]
Остаточное количество в почках (нормальные мыши)
[0348] Пример 4-4: Испытание для оценки аккумуляции в почках Gd-меченных конъюгатов (опухоль-несущие мыши)
(Метод испытания)
Gd-меченный конъюгат, такой как конъюгат, содержащий пептидный линкер, полученный в одном из описанных выше Примеров, вводили через хвостовую вену опухоль-несущим мышам таким образом, чтобы масса белка составляла 0,02 мг (100 мкл) на животное. В качестве опухоль-несущих мышей, используемых в этом Примере, использовали мышей (BALB/c nu/nu), которые находились в опухоль-несущем состоянии в результате трансплантации LS174T клеток клеточной линии колоректального рака человека (ATCC(зарегистрированная торговая марка); CL-188), при 2,0-5,0 × 106 клеток/мышь подкожно в область спины до введения образца. Через 24 часа после введения образца мышей умерщвляли, почки и опухоль удаляли и количество Gd в почках и в опухоли измеряли с использованием ICP-MS. Это испытание осуществляли в 3 случаях в каждой группе и рассчитывали среднее значение от 3 случаев. Количество содержащегося Gd на почку после введения было показано как процент от введенного количества Gd (% дозы/ткань), и количество Gd, содержащегося на г опухолевой ткани, было показано как процент от общего количества введенного Gd (% дозы/г). Результаты показаны в таблицах 35 и 36. Пр.-№ в таблицах представляет номер конъюгата в Примере 2. Кроме того, такое же испытание осуществляли с использованием Пр.-№. 47, полученного в Примере получения 2-47, который не содержал пептидный линкер, в качестве контрольного конъюгата. Средние значения для 2 экспериментов для Пр.-№. 47 показаны в таблицах 33 и 34.
(Результаты)
Как показано в таблицах 35 и 36, аккумуляция метящей части в почках была на 52,26-77,68% пунктов ниже в конъюгатах, содержащих пептидный линкер, по сравнению с контрольным конъюгатом.
[0349]
Остаточное количество в почках (опухоль-несущие мыши)
(% дозы/ткань)
[0350]
Аккумуляция в опухоли
(% дозы/г)
[0351]
Остаточное количество в почках (опухоль-несущие мыши)
[0352]
Аккумулированное в опухоли количество (опухоль-несущие мыши)
[0353] (Пример 5-1: Получение конъюгата Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1)
Данный Пример раскрывает Примеры получения конъюгата. При представлении каждого Примера получения в этом Примере после слов "Пример 5" следует один дефис с последующим "номером конъюгата." Например, "Пример 5-101" означает, что это Пример получения конъюгата 101 в данном Примере. Кроме того, в качестве Fab5 в этом Примере использовали (P10-2), раскрытый в международной публикации WO2018/092885. "p-Fab5" показывает, что Fab5 связан с p метящих частей, заключенных в скобки [ ] или ( ), через p его амино групп с образованием конъюгата. В некоторых из следующих Примеров описано количество метящих частей, связанных с Fab5 каждого конъюгата, который был подтвержден MS анализом, но результат не показывает, что конъюгат, имеющий связанное количество метящих частей, отличное от указанного выше количества, не включен. Должно быть понятно, что еще может быть конъюгат, имеющий определенное связанное количество метящих частей, присутствие которого невозможно было подтвердить из-за точности оборудования для MS анализа. Кроме того, в структурных формулах в данном Примере структурная формула DOTA, с которой связан Gd, схематически представляет DOTA, меченную Gd.
[0354] (Пример 5-101. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)]p-Fab5))
(i) Синтез конъюгата No. 101
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-18 (vii), растворяли в DMSO (40 мкл). К полученному раствору добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и pH доводили до 6,6 с использованием 0,25 M ацетатного буфера.
80 мкл предварительно подготовленного раствора добавляли к 5,2 мг/мл Fab5 боратного буфера (240 мкл) и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Добавляли 15 мкл 0,05 M EDTA и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 10 минут. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали фосфатно-солевым буферным раствором 7 раз, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#N)], имеющий молекулярную массу 1074, был связан с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
[0355] (Пример 5-104. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 и/или A-5)]p-Fab5))
(i) Синтез конъюгата No. 104
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (1 мг), синтезированный в Примере 2-18 (vii), растворяли в DMSO (40 мкл). К полученному раствору добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и pH доводили до 10,2 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия.
[0356] Весь предварительно подготовленный раствор добавляли к 5,2 мг/мл Fab5 боратного буфера (240 мкл) и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Смесь выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра и промывали фосфатно-солевым буферным раствором.
Буферный обмен осуществляли два раза с использованием 3 мл HEPES-NaOH буфера (pH=4,5) и осуществляли концентрирование с получением 100 мкл раствора с pH=4,52 и затем раствор инкубировали при 45°C в течение 30 минут.
Раствор очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали фосфатно-солевым буферным раствором 3 раза, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-4 и/или A-5)], имеющий молекулярную массу 1092, был связан с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
[0357] (Пример 5-107. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)]p-Fab5))
(i) Синтез конъюгата No. 107
[N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (0,75 мг), синтезированный в Примере 2-18 (vii), растворяли в DMSO (40 мкл), добавляли 0,1 M боратный буфер (40 мкл) и затем pH доводили до 8,2 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия и 0,25 M ацетатного буфера.
2 мг/мл 2-IT раствора (7,5 мкл), полученного с использованием 0,1 M боратного буфера, добавляли к 5,2 мг/мл Fab5 боратного буфера (240 мкл) и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 40 минут. Избыточное количество 2-IT промывали фосфатно-солевым буферным раствором с использованием Amicon Ultra-0,5 мл центрифужного фильтра и концентрировали, затем добавляли предварительно подготовленный раствор и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата.
MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-Z1(#S)], имеющий молекулярную массу 1175, был связан с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 5-112. Синтез ([Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5))
(i) Синтез конъюгата No. 112
[0358] [N-({4-[(2-{4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил-κ4N1,N4,N7,N10}ацетамидо-ко)метил]фенил}карбамоил)-L-метионил-N1-[2-{[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]амино}этил]-L-изолейцинамидато(3-)]гадолиний (0,46 мг), синтезированный в Примере 2-68 (x), растворяли в DMSO (155 мкл).
30 мкл 0,1 M водного раствора карбоната натрия и предварительно подготовленный раствор добавляли к раствору Fab5 (240 мкл), полученному до 5,2 мг/мл с использованием боратного буфера, и раствору глицерина для доведения pH до 8,8 и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)], имеющий молекулярную массу 1187, был связан с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
[0359] (Пример 5-113. Синтез ([Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)]p-Fab5))
(i) Синтез конъюгата No. 113
{N-[2-({4,7,10-трис[(карбокси-ко)метил]-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-y-κ4N1,N4,N7,N10}ацетил-ко)-1,2,3,4-тетрагидроизохинолин-5-карбонил]-L-метионилглицил-N6-[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]-L-лизинато(3-)}гадолиний (0,22 мг), синтезированный в Примере 2-69 (vii), растворяли в DMSO (72 мкл).
30 мкл 0,1 M водного раствора карбоната натрия и предварительно подготовленного раствора добавляли к раствору Fab5 (240 мкл), полученному до 5,2 мг/мл с использованием боратного буфера, и раствору глицерина для доведения pH до 9,3 и полученную смесь инкубировали при 37°C в течение 2 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [Gd/DOTA-[2,5-(1,2,3,4-тетрагидроизохинолин)]-C(=O)-Met-Gly-Lys*-C(=S)-NH-(1,4-Ph)-NH-C(=S)], имеющий молекулярную массу 1228, был связан с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, и конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним.
Химические структурные формулы конъюгатов, полученных в описанных выше Примерах получения, показаны в таблицах 37 и 38.
[0360]
[0361]
[0362] Соединения Примера получения № C1 и C2 в таблице 39 были синтезированы с использованием таких же способов, как в описанных выше Примерах получения, или способов, известных специалистам в данной области техники, и использовали эти соединения или использовали соединения, синтезированные в Примере 2, для получения конъюгатов с Fab5, показанных в таблицах 40 и 41 ниже.
[0363]
[0364]
[0365]
[0366] MS анализы соединений Примеров, показанных в таблицах 40 и 41, показаны в таблице ниже.
[0367]
[0368] Соединение Примера в таблице 43 получали с использованием такого же способа, как в описанных выше Примерах получения, или способа, известного специалистам в данной области техники.
[0369] MS анализ соединения Примера, показанного в таблице 43, показан в таблице 44 ниже.
[0370]
Кроме того, конъюгаты в таблицах 45-50 могут быть получены с использованием таких же способов, как в описанных выше Примерах получения, или способов, известных специалистам в данной области техники.
[0371]
[0372]
[0373]
[0374]
[0375]
[0376]
[0377] Пример 6-1: Оценка активности связывания конъюгата Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1
Каждый конъюгат Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1, полученный способом Примера 5, подвергали анализу ELISA для оценки его активности связывания с человеческим рак-специфическим MUC1. В данном испытании 20X PBS/Tween 20 Буфер (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352), разбавленный 20-кратно дистиллированной водой, использовали в качестве промывочной жидкости. Кроме того, что касается бычьего сывороточного альбумина (BSA), используемого в данном испытании, 30% раствор бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) добавляли в подходящей пропорции для применения. Человеческий рак-специфический MUC1 пептид (PTL 1) при 0,5 мкмоль/л добавляли в белый 384 планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 460372) при 30 мкл на лунку и планшет инкубировали в течение ночи при 4°C для иммобилизации. MUC1 пептид удаляли реверсивным центрифугированием и затем осуществляли блокирование путем добавления PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA. Затем блокирующий раствор удаляли реверсивным центрифугированием, раствор каждого конъюгата Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1 (Пр.-№. 104, 108 или 112), описанного выше, при около 10000 нг/мл разбавляли в 14 стадий путем 3-кратного разведения с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 1,0% BSA, и добавляли 30 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и меченное пероксидазой хрена козлиное античеловеческое Igκ антитело (Southern Biotechnology Associates, Inc.) разбавляли 10000-кратно с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA, добавляли при 30 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и добавляли реагент ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare, RPN2232) в качестве субстрата при 30 мкл на лунку. Субстрат инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и затем значение его сигнала измеряли с использованием счетчика Envision (PerkinElmer, Inc.).
Испытание для каждого антитела осуществляли в двух повторах и EC50 значение рассчитывали с использованием модели 4-параметрической логистической кривой. EC50 значение (нМ) для каждого из 3 экспериментов для P10-2 показано в таблице 51. Кроме того, EC50 значение каждого конъюгата, испытанного в двух повторах, показано в таблице 52.
[0378]
[0379]
[0380] Пример 6-2: Оценка активности связывания конъюгата Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1
Каждый конъюгат Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1, полученный способом Примера 5, подвергали анализу ELISA для оценки его активности связывания с человеческим рак-специфическим MUC1. В данном испытании 20X PBS/Tween 20 Буфер (Thermo Fisher Scientific Inc., 28352), разбавленный 20-кратно дистиллированной водой, использовали в качестве промывочной жидкости. Кроме того, что касается бычьего сывороточного альбумина (BSA), используемого в данном испытании, 30% раствор бычьего сывороточного альбумина (Sigma-Aldrich, Inc., A9576-50ML) добавляли в подходящей пропорции для применения. Человеческий рак-специфический MUC1 пептид (PTL 1) при 0,5 мкмоль/л добавляли в белый 384 планшет Nunc MaxiSorp (Nunc, 460372) при 30 мкл на лунку и планшет инкубировали в течение ночи при 4°C для иммобилизации. MUC1 пептид удаляли реверсивным центрифугированием и затем осуществляли блокирование путем добавления PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA. Затем блокирующий раствор удаляли реверсивным центрифугированием, раствор каждого конъюгата Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1 (Пр.-№. 101-113), описанного выше, при около 10000 нг/мл разбавляли в 14 стадий путем 3-кратного разведения с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 1,0% BSA, и 30 мкл добавляли на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и меченное пероксидазой хрена козлиное античеловеческое Igκ антитело (Southern Biotechnology Associates, Inc.) разбавляли 10000-кратно с использованием PBS/Tween 20 буфера, содержащего 5,0% BSA, добавляли при 30 мкл на лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Планшет промывали 3 раза PBS/Tween 20 буфером и добавляли реагент ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare, RPN2232) в качестве субстрата при 30 мкл на лунку. Субстрат инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут и затем значение его сигнала измеряли с использованием счетчика Envision (PerkinElmer, Inc.).
Испытание для каждого антитела осуществляли в двух повторах и EC50 значение рассчитывали с использованием модели 4-параметрической логистической кривой. EC50 значение (нМ) для каждого из 3 экспериментов для P10-2 показано в таблице 53. Кроме того, EC50 значение каждого конъюгата, испытанного в двух повторах, показано в таблице 54.
[0381]
[0382]
[0383] Пример 7: Испытание для оценки аккумуляции в почках Gd-меченных конъюгатов (нормальные мыши)
(Метод испытания)
Gd-меченный конъюгат, такой как конъюгат, содержащий пептидный линкер, полученный в одном из описанных выше Примеров, вводили через хвостовую вену мышам (BALB/c или BALB/c nu/nu) таким образом, чтобы масса белка составляла 0,02 мг (100 мкл) на животное. Примерно через 24 часа мышей умерщвляли и почки удаляли и количество Gd в почках измеряли с использованием ICP-MS. Это испытание осуществляли в 3 случаях в каждой группе, рассчитывали среднее значение от 3 случаев и количество содержащегося Gd на почку после введения было показано как процент (% дозы/ткань) от общего количества введенного Gd. Такое же испытание осуществляли с использованием Пр.-№ 108, полученного в Примере получения 5, который не содержал пептидный линкер, в качестве контрольного конъюгата. Среднее значение для 2 экспериментов для Пр.-№ 108 показано в таблицах 55.
(Результаты)
Результаты показаны в таблице 56. На основании количества Gd, содержащегося в почках при использовании контрольного конъюгата, определяли процент уменьшения количества Gd, содержащегося в почках, для каждого из конъюгатов, содержащих пептидный линкер. Как показано в таблице 56, аккумуляция метящей части в почках была на 91,52-93,03% пунктов ниже в конъюгатах, содержащих пептидный линкер, по сравнению с контрольным конъюгатом.
[0384]
Остаточное количество в почках (нормальные мыши)
[0385]
Остаточное количество в почках (нормальные мыши)
[0386] Пример 8: Испытание для оценки аккумуляции в почках Gd-меченных конъюгатов (опухоль-несущие мыши)
(Метод испытания)
Gd-меченный конъюгат, такой как конъюгат, содержащий пептидный линкер, полученный в одном из описанных выше Примеров, вводили через хвостовую вену опухоль-несущим мышам таким образом, чтобы масса белка составляла 0,02 мг (100 мкл) на животное. В качестве опухоль-несущих мышей, используемых в этом Примере, использовали мышей (BALB/c nu/nu), которые находились в опухоль-несущем состоянии в результате трансплантации клеточной линии рака молочной железы человека MDA-MB-468 (ATCC(зарегистрированная торговая марка); HTB-132) при 5,0 × 106 клеток/мышь подкожно в область спины до введения образца. Через 24 часа после введения образца мышей умерщвляли, почки и опухоль удаляли и количество Gd в почках и в опухоли измеряли с использованием ICP-MS. Это испытание осуществляли в 3 случаях в каждой группе и рассчитывали среднее значение от 3 случаев. Количество содержащегося Gd на почку после введения было показано как процент от введенного количества Gd (% дозы/ткань), а количество Gd, содержащегося на г опухолевой ткани, было показано как процент от общего количества введенного Gd (% дозы/г). Результаты показаны в таблицах 59 и 60. Пр.-№ в таблицах представляет номер конъюгата в Примере 5. Кроме того, такое же испытание осуществляли с использованием Пр.-№. 108, полученного в Примере получения 5, который не содержал пептидный линкер, в качестве контрольного конъюгата. Средние значения для 2 экспериментов для Пр.-№. 108 показаны в таблицах 57 и 58.
(Результаты)
Как показано в таблицах 57-60, аккумуляция метящей части в почках была на 88,08-90,87% пунктов ниже в конъюгатах, содержащих пептидный линкер, по сравнению с контрольным конъюгатом.
[0387]
Остаточное количество в почках
(% дозы/ткань)
[0388]
Аккумуляция в опухоли
(% дозы/г)
[0389]
Остаточное количество в почках (опухоль-несущие мыши)
[0390]
Аккумулированное в опухоли количество (опухоль-несущие мыши)
[0391] Пример 9: Получение конъюгата Fab5 фрагмента антитела к человеческому MUC1
(Пример 9-115: Синтез [Gd/DOTA]p-Fab5)
[0392] [Химическая формула 124]
[0393] 1 M водный раствор гидроксида натрия (80 мкл) добавляли к смешанному раствору 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусной кислоты (DOTA) (16 мг) и воды (810 мкл) при охлаждении льдом для доведения pH до 5,5-6. К полученному раствору (239 мкл) добавляли 1-гидрокси-2,5-диоксопирролидин-3-сульфонат натрия (2,3 мг), растворенный в воде (117 мкл), при охлаждении льдом. Затем добавляли водный раствор EDC HCl (8,3 мкл, 25 мг/мл) и полученную смесь перемешивали при охлаждении льдом в течение 30 минут с получением раствора N-гидроксисульфосукцинимидил DOTA. Перед добавлением Fab5 добавляли 0,2 M водный раствор динатрий гидрофосфата (pH 9) (40 мкл) для доведения pH до 7.
Полученный раствор N-гидроксисульфосукцинимидила DOTA (300 мкл) добавляли к 0,1 M водному раствору динатрий гидрофосфата (585 мкл) с 20,8 мг/мл Fab5 (90 мкл) и полученную смесь инкубировали при 4°C в течение 23 часов. Избыточное количество линкера промывали при помощи 10 мМ фосфатного буфера с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра два раза, промывали буфером 0,3 M ацетата аммония, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата Пр.-№. 115. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором одна молекула [DOTA], имеющая молекулярную массу 387, была связана с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором четыре такие молекулы были связаны с ним.
(Пример 9-116. Синтез [DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)]p-Fab5)
[0394] [Химическая формула 125]
[0395] N-{[4-({2-[4,7,10-трис(карбоксиметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан-1-ил]ацетамидо}метил)фенил]карбамоил}-L-метионил-N1-(2-{[(4-изотиоцианатофенил)карбамотиоил]амино}этил)-L-изолейцинамид тетракис(трифторацетат) (1 мг), синтезированный в Примере 2-68 (ix), растворяли в DMSO (336 мкл).
30 мкл предварительно подготовленного раствора добавляли к раствору 5,2 мг/мл Fab5 в фосфатно-солевом буферном растворе (240 мкл), pH доводили до около 8,0 с использованием 0,1 M водного раствора карбоната натрия и полученную смесь инкубировали при 30°C в течение 2 часов. Смесь очищали с использованием колонки PD-10 и полученный раствор выделяли с использованием Amicon Ultra-15 мл центрифужного фильтра. Выделенный раствор промывали два раза фосфатно-солевым буферным раствором, в завершение концентрировали и затем фильтровали через мембранный фильтр с получением конъюгата Пр.-№. 116. Такую же процедуру осуществляли снова и полученный конъюгат Пр.-№. 116 смешивали. MS анализом было подтверждено, что конъюгат представлял собой смесь конъюгата, в котором один [DOTA-NH-CH2-(1,4-Ph)-NH-C(=O)-Met-Ile-NH-(CH2)2-(A-3)], имеющий молекулярную массу 1032, был связан с одним Fab5, имеющим молекулярную массу 47,5 кДа, конъюгата, в котором две такие молекулы были связаны с ним, конъюгата, в котором три такие молекулы были связаны с ним, и конъюгата, в котором четыре такие молекулы были связаны с ним.
[0396] Пример 10: Исследование фармакокинетики металлокомплексных соединений у обыкновенных игрунок
Пример получения 1 64Cu-меченного белка
139 мкл 0,1 моль/л натрий-ацетатного буфера (pH 6,5) добавляли к 10 мкл (19,8 мБк, FUJIFILM Toyama Chemical Co., Ltd.) раствора 0,05 моль/л [64Cu]CuCl2 в хлористоводородной кислоте и смешивали. Затем добавляли 51 мкл белкового конъюгата, полученного в Примере 9-115, и эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут для взаимодействия. Реакционную жидкость добавляли на ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 10K, Millipore) и затем добавляли 50 ммоль/л натрий-ацетатного буфера для осуществления ультрафильтрационной очистки с получением раствора 64Cu-белкового конъюгата (A), представляющего интерес. 140 мкл белкового конъюгата и 145 мкл PBS раствора смешивали в полученном растворе и полученную смесь фильтровали с использованием фильтровального шприца (Millex-GV 0,22 мкм, Millipore) с получением PBS раствора, содержащего 64Cu-белковый конъюгат (A) (11,5 мБк, 19,17 мБк/мг).
Пример получения 2 64Cu-меченного белка
285 мкл 0,1 моль/л натрий-ацетатного буфера (pH 6,5) добавляли к 20 мкл (37,1 мБк, FUJIFILM Toyama Chemical Co., Ltd.) раствора 0,05 моль/л [64Cu]CuCl2 в хлористоводородной кислоте и смешивали. Затем добавляли 94,7 мкл белкового конъюгата, полученного в Примере 9-116, и эту смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 60 минут для взаимодействия. Реакционную жидкость добавляли на ультрафильтрационную мембрану (Amicon Ultra 10K, Millipore) и затем добавляли 50 ммоль/л натрий-ацетатного буфера для осуществления ультрафильтрационной очистки с получением раствора 64Cu-белкового конъюгата (B), представляющего интерес. 260 мкл белкового конъюгата и 377 мкл PBS раствора смешивали в полученном растворе и полученную смесь фильтровали с использованием фильтровального шприца (Millex-GV 0,22 мкм, Millipore) с получением PBS раствора, содержащего 64Cu-белковый конъюгат (B) (31,5 мБк, 26,27 мБк/мг).
ПЭТ/КТ визуализация
Обыкновенную игрунку (возраст 2 года) анестезировали изофлураном и 175-185 мкл PBS раствора, содержащего раствор конъюгата 64Cu-белка (A) или (B), вводили через хвостовую вену. После введения, под анестезией, получали изображения с использованием устройства ПЭТ/КТ визуализации (ПЭТ: Clairvivo PET, изготовитель Shimadzu Corporation, КТ: Aquilion, изготовитель TOSHIBA).
Фиг. 1 представляет ПЭТ/КТ изображение, полученное примерно через 3 часа после введения PBS раствора, содержащего раствор конъюгата 64Cu-белок (A). Кроме того, Фиг. 2 представляет ПЭТ/КТ изображение, полученное примерно через 3 часа после введения PBS раствора, содержащего раствор конъюгата 64Cu-белок (B). Фиг. 3 представляет SUV (стандартизованный уровень накопления). SUV представляет собой значение, полученное путем деления радиоактивности на г ткани на введенную радиоактивность на г массы тела, т.е. значение, представленное SUV=радиоактивность на г ткани/введенная радиоактивность на г массы тела. В качестве радиоактивности используется значение с поправкой на затухание. Наблюдали, что аккумуляция в почках была ниже в Фиг. 2, чем на Фиг. 1.
Промышленная применимость
[0397] Настоящее изобретение включает конъюгат, имеющий отличную активность связывания с человеческим CEACAM5 и который, как ожидают, будет полезным для диагностики и/или лечения рака с вовлечением человеческого CEACAM5.
Кроме того, настоящее изобретение включает включает конъюгат, имеющий отличную активность связывания с MUC1 и который, как ожидают, будет полезным для диагностики и/или лечения рака с вовлечением MUC1.
Кроме того, конъюгат, состоящий из 3arm DOTA, специфического спейсера, специфического пептидного линкера и биомолекулы, который представляет собой конъюгат по настоящему изобретению, разрушаетя в почках и экскретируется, и, таким образом, как ожидают, он будет полезным для диагностики и/или лечения заболевания, связанного с биомолекулой.
Свободный текст перечня последовательностей
[0398] Под номером <223> в следующем перечне последовательностей представлено описание типичной "Искусственной Последовательности". В частности, нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 1 и 3 в перечне последовательностей, представляют собой нуклеотидную последовательность фрагмента тяжелой цепи и нуклеотидную последовательность легкой цепи PB009-01, соответственно, и аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 2 и 4, представляют собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемые SEQ ID NO: 1 и 3, соответственно. Кроме того, нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 5 и 9 в перечне последовательностей, представляют собой нуклеотидную последовательность фрагмента тяжелой цепи и нуклеотидную последовательность легкой цепи P10-1, соответственно, и аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 6 и 10, представляют собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемые SEQ ID NO: 5 и 9, соответственно. нуклеотидные последовательности, представленные SEQ ID NO: 7 и 9 в перечне последовательностей, представляют собой нуклеотидную последовательность фрагмента тяжелой цепи и нуклеотидную последовательность легкой цепи P10-2, соответственно, и аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 8 и 10, представляют собой аминокислотную последовательность фрагмента тяжелой цепи и аминокислотную последовательность легкой цепи, кодируемые SEQ ID NO: 7 и 9, соответственно. SEQ ID NO: 11 и 15 представляют собой вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи P10-1, соответственно, и аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 12 и 16, представляют собой аминокислотныые последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, кодируемые SEQ ID NO: 11 и 15, соответственно. SEQ ID NO: 13 и 15 представляют собой вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи P10-2, соответственно, и аминокислотные последовательности, представленные SEQ ID NO: 14 и 16, представляют собой аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, кодируемые SEQ ID NO: 13 и 15, соответственно.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Astellas Pharma Inc.
<120> Конъюгат, включающий лиганд, спейсер, пептидный линкер и
биомолекулу
<130> A20002A00
<150> JP 2019-000530
<151> 2019-01-07
<150> JP 2019-206560
<151> 2019-11-14
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 678
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая тяжелую цепь Fab PB009-01
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(678)
<400> 1
gaa gtg cag ctg gtg gaa tct ggc ggc gga ctg gtg cag cct ggc gga
48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
tct ctg aga ctg agc tgt gcc gcc agc ggc ttc aac atc cgg gac acc
96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
tac atg cac tgg gtg cgc cag gcc cct ggc aag gga ctg gaa tgg gtg
144
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
gcc aga atc gac ccc gcc aac ggc aac agc aga tac gtg ccc aag ttc
192
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
cag ggc cgg ttc acc atc agc gcc gac acc agc aga aac acc gcc tac
240
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
ctg cag atg aac agc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgt
288
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
gcc ccc ttc ggc tac tac gtg tcc gac tac gcc atg gcc tat tgg ggc
336
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
cag ggc acc ctc gtg aca gtg tcc tca gcc tcc acc aag ggc cca tcg
384
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca gcg
432
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg gtg
480
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg gct
528
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctt agt agc gtg gtg acc gtg
576
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat cac
624
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aaa gtt gag ccc aaa tct tgt
672
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
gac tga
678
Asp
225
<210> 2
<211> 225
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Arg Asp Thr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Arg Tyr Val Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Arg Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp
225
<210> 3
<211> 657
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая легкую цепь PB009-01
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(657)
<400> 3
gac atc cag ctg acc cag agc cct agc agc ctg tct gcc agc gtg ggc
48
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
gac aga gtg acc atc acc tgt aga gcc ggc gag agc gtg gac atc ttc
96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
ggc gtg gga ttt ctg cac tgg tat cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc
144
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
aag ctg ctg atc tac aga gcc agc aac ctg gaa agc ggc atc ccc agc
192
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
aga ttc agc ggc agc ggc tcc aga acc gac ttc acc ctg acc atc agc
240
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
agc ctg cag ccc gag gac ttc gcc acc tac tac tgc cag cag acc aac
288
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
gag gac ccc tac acc ttt ggc cag ggc acc aag gtg gaa atc aag cgt
336
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
acg gtg gct gca cca tct gtc ttc atc ttc ccg cca tct gat gag cag
384
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
ttg aaa tct gga act gcc tct gtt gtg tgc ctg ctg aat aac ttc tat
432
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
ccc aga gag gcc aaa gta cag tgg aag gtg gat aac gcc ctc caa tcg
480
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
ggt aac tcc cag gag agt gtc aca gag cag gac agc aag gac agc acc
528
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
tac agc ctg agc agc acc ctg acg ctg agc aaa gca gac tac gag aaa
576
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
cac aaa gtc tac gcc tgc gaa gtc acc cat cag ggc ctg agc tcg ccc
624
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
gtc aca aag agc ttc aac agg gga gag tgt tag
657
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 4
<211> 218
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 4
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105 110
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
115 120 125
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
130 135 140
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
145 150 155 160
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
165 170 175
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
180 185 190
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
195 200 205
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 5
<211> 669
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-1
<400> 5
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg
60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct
120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac
180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac
240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc
300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc
360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca
420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac
480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc
540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct
660
tgtgactga
669
<210> 6
<211> 222
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Фрагмент тяжелой цепи Fab P10-1
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 7
<211> 669
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая фрагмент тяжелой цепи Fab P10-2
<400> 7
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg
60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct
120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac
180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac
240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc
300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctcagcctcc
360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca
420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac
480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc
540
tactccctta gtagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc
600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct
660
tgtgactga
669
<210> 8
<211> 222
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Фрагмент тяжелой цепи Fab P10-2
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
<210> 9
<211> 660
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая легкую цепь антитела
<400> 9
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc
60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg
120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc
180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc
240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc
300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgta cggtggctgc accatctgtc
360
ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg
420
ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa
480
tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctg
540
agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa
600
gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag
660
<210> 10
<211> 219
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Легкая цепь антитела
<400> 10
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 11
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-1
<400> 11
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg
60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct
120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac
180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac
240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc
300
ggcaccagag gctttgccta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca
354
<210> 12
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи Fab P10-1
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 354
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи Fab P10-2
<400> 13
caggtgcagc tggtgcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac caggcgccag cgtgaaggtg
60
tcctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggcc tgagctgggt gcgccaggct
120
cctggacagg gactggaatg gatgggcgag aaccaccctg gcagcggcat catctaccac
180
aacgagaagt tccggggcag agtgaccctg accgccgacc ggagcaccag caccgcctac
240
atggaactga gcagcctgcg gagcgaggac accgccgtgt actactgtgc cagaagcagc
300
ggcaccagag gctttgacta ttggggacag ggcaccctcg tgaccgtgtc ctca
354
<210> 14
<211> 118
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область тяжелой цепи Fab P10-2
<400> 14
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Leu Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Glu Asn His Pro Gly Ser Gly Ile Ile Tyr His Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Arg Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Arg Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Ser Gly Thr Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 15
<211> 339
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ДНК, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела
<400> 15
gacgtcgtga tgacccagac ccctctgagc ctgagcgtga cacctggaca gcctgccagc
60
atcagctgca gatccagcca gagcatcgtg cacagcaacg gcaacaccta cctggaatgg
120
tatctgcaga agcccggcca gagcccccag ctgctgatct acagggtgtc caaccggttc
180
agcggcgtgc ccgacagatt ttctggcagc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc
240
tcccgggtgg aagccgagga cgtgggcgtg tactactgtt ttcaaggcag ccacggcccc
300
tggacctttg gccagggaac aaagctggaa atcaagcgt
339
<210> 16
<211> 113
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вариабельная область легкой цепи антитела
<400> 16
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Gly Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 17
<211> 19
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальная последовательность тяжелой цепи
<400> 17
Met Glu Trp Ser Trp Val Phe Leu Phe Phe Leu Ser Val Thr Thr Gly
1 5 10 15
Val His Ser
<210> 18
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Сигнальная последовательность легкой цепи
<400> 18
Met Ser Val Pro Thr Gln Val Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp Leu Thr
1 5 10 15
Asp Ala Arg Cys
20
<210> 19
<211> 20
<212> Белок
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность тандемного повтора внеклеточного домена
MUC1
<400> 19
His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr
1 5 10 15
Ala Pro Pro Ala
20
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| НОВЫЙ FAB-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ CEACAM5 ЧЕЛОВЕКА | 2018 |
|
RU2779165C2 |
| КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2781444C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ КОМПЛЕКС МАРКИРУЮЩИЙ САЙТ - FAB-ФРАГМЕНТ АНТИЧЕЛОВЕЧЕСКОГО АНТИТЕЛА | 2019 |
|
RU2800924C2 |
| КОНЪЮГАТЫ СВЯЗУЮЩЕГО И АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА (ADC), ИМЕЮЩИЕ ФЕРМЕНТАТИВНО РАСЩЕПЛЯЕМЫЕ ГРУППЫ | 2017 |
|
RU2761390C2 |
| КОНЪЮГАТ АНТИТЕЛО ПРОТИВ MUC1-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2019 |
|
RU2804703C2 |
| ПОЛИПЕПТИДНЫЙ ЛИНКЕР ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ | 2018 |
|
RU2776302C2 |
| КОНЪЮГАТ АНТИ-HER3 АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2015 |
|
RU2802211C2 |
| АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО И КОНЪЮГАТ АНТИ-CDH6-АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2018 |
|
RU2798285C2 |
| КОНЪЮГАТ АНТИ-TROP2 АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2014 |
|
RU2743077C2 |
| НОВЫЙ Fab-ФРАГМЕНТ АНТИТЕЛА ПРОТИВ MUC1 ЧЕЛОВЕКА | 2017 |
|
RU2767793C2 |
Изобретение относится к конъюгату формулы (Ic), включающему лиганд, спейсер и пептидный линкер, полезный для диагностического средства in-vivo и внутренней радиационной терапии, с использованием Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, активность связывания которого не ослабляется даже при мечении металлом, флуоресцентным красителем или т.п. Также предложены диагностическая и фармацевтическая композиции, предназначенные для диагноститки или лечения рака, экспрессирующего человеческий MUC1. 13 н. и 18 з.п. ф-лы, 3 ил., 60 табл., 10 пр.
1. Конъюгат, который имеет активность связывания с человеческим MUC1 и представленный следующей формулой (Ic):
,
где DOTA1 представляет собой 3arm DOTA, которая выбрана из следующего:
U: связь или -NH(CH2)2O(CH2)2O(CH2)2OCH2C(=O)-,
Q: -C(=O)-, -NH-C(=O)- или -NH-C(=S)-,
R1a, R1b: одинаковые или отличные друг от друга, H или C1-6 алкил,
при условии, что R1a и R1b вместе могут образовывать C1-6 алкилен;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25 и связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Биомолекуле;
R1: H, галоген, C1-6 алкил или галоген C1-6 алкил,
R2: C1-6 алкил или галоген C1-6 алкил,
L3: связь,
L4: -NH-(CH2)2- или -NHCH(C(=O)OH)(CH2)4-,
V1: группа, представленная любой из следующих формул (A-1)-(A-5):
[Химическая формула 127]
или формула -L3-L4-V1- вместе образует следующую формулу:
[Химическая формула 128]
Биомолекула представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, выбранный из группы, состоящей из:
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, содержащего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16, и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, выбранного из группы, состоящей из Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, содержащего фрагмент тяжелой цепи, включающий вариабельную область тяжелой цепи, которая состоит из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, и в которой глутамин, аминокислота 1 последовательности SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 14, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, включающую вариабельную область легкой цепи, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной SEQ ID NO: 16,
и фрагмент связан с V1 через p число аминогрупп или тиольных группы в фрагменте,
2. Конъюгат по п. 1, где конъюгат представлен следующей формулой (Id):
[Химическая формула 135]
.
3. Конъюгат по любому из пп. 1, 2, где V1 в формуле (Id) представляет собой любую из следующих формул (A-3)-(A-5):
[Химическая формула 136]
.
4. Конъюгат по любому из пп. 1-3, где 3arm DOTA представляет собой
.
5. Конъюгат по любому из пп. 1-4, где конъюгат выбран из группы, состоящей из соединений, представленных следующими формулами:
[Химическая формула 137]
,
[Химическая формула 138]
,
[Химическая формула 139]
,
[Химическая формула 140]
,
[Химическая формула 141]
,
Биомолекула1 представляет собой Биомолекулу, раскрытую в п. 1.
6. Конъюгат по любому из пп. 1-5, где Биомолекула представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, выбранный из группы, состоящей из:
(a) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, включающего фрагмент тяжелой цепи, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10; и
(b) Fab-фрагмента антитела к человеческому MUC1, включающего фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
7. Конъюгат по п. 6, где Биомолекула представляет собой Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10.
8. Конъюгат, который может связываться с человеческим MUC1 и представлен следующей формулой:
[Химическая формула 144]
,
где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25; и
Fab5 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab5.
9. Конъюгат, который может связываться с человеческим MUC1 и представлен следующей формулой:
[Химическая формула 145]
,
где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25; и
Fab5 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab5.
10. Конъюгат, который может связываться с человеческим MUC1 и представлен следующей формулой:
[Химическая формула 146]
,
где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25; и
Fab5 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab5.
11. Конъюгат, который может связываться с человеческим MUC1 и представлен следующей формулой:
[Химическая формула 147]
,
где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25; и
Fab5 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab5.
12. Конъюгат, который может связываться с человеческим MUC1 и представлен следующей формулой:
[Химическая формула 148]
,
где Fab5 представляет собой следующий Fab-фрагмент антитела:
Fab-фрагмент антитела к человеческому MUC1, включающий фрагмент тяжелой цепи, который состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 8, и в котором глутамин, аминокислота 1 в SEQ ID NO: 8, модифицирован до пироглутаминовой кислоты, и легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 10;
p представляет собой натуральное число от 1 до 25; и
Fab5 связан со смежным атомом углерода через p число аминогрупп или тиольных групп в Fab5.
13. Конъюгат по любому из пп. 1-12, где p представляет собой натуральное число от 1 до 4.
14. Хелатный комплекс конюгата с металлом, имеющий активность связывания с человеческим MUC1, где конъюгат представляет собой конъюгат, раскрытый в любом из пп. 1-13, и металл скоординирован с 3arm DOTA.
15. Хелатный комплекс по п. 14, где металл представляет собой радиоизотоп металла.
16. Хелатный комплекс по п. 15, где металл представляет собой 89Zr.
17. Хелатный комплекс по п. 14, где металл представляет собой парамагнитный металлический ион.
18. Хелатный комплекс по п. 17, где металл представляет собой Gd3+.
19. Хелатный комплекс по любому из пп. 14-16, где хелатный комплекс применяют в качестве радиофармпрепарата для ПЭТ.
20. Хелатный комплекс по п. 15, где конъюгат представляет собой конъюгат по любому из пп. 8-12.
21. Диагностическая композиция для диагностики рака, экспрессирующего человеческий MUC1, включающая эффективное количество одного или нескольких хелатных комплексов по любому из пп. 14-19 и фармацевтически приемлемый носитель.
22. Диагностическая композиция по п. 21, где диагностическую композицию используют в качестве лекарственного средства для ранней диагностики или лекарственного средства для определения стадии заболевания.
23. Диагностическая композиция по любому из пп. 21 или 22, где рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника или цервикальный рак.
24. Фармацевтическая композиция для лечения рака, экспрессирующего человеческий MUC1, включающая эффективное количество одного или нескольких хелатных комплексов по любому из пп. 14-18 и фармацевтически приемлемый носитель.
25. Фармацевтическая композиция по п. 24, где рак представляет собой рак молочной железы, рак легкого, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рак кожи, рак щитовидной железы, рак желудка, рак поджелудочной железы, рак почки, рак яичника или цервикальный рак.
26. Применение хелатного комплекса по любому из пп. 14-18 для получения композиции для диагностики рака, экспрессирующего человеческий MUC1.
27. Применение хелатного комплекса по любому из пп. 14-18 для получения фармацевтической композиции для лечения рака, экспрессирующего человеческий MUC1.
28. Хелатный комплекс по любому из пп. 14-18, где хелатный комплекс используют для диагностики рака, экспрессирующего человеческий MUC1.
29. Хелатный комплекс по любому из пп. 14-18, где хелатный комплекс используют для лечения рака, экспрессирующего человеческий MUC1.
30. Способ для диагностики рака, экспрессирующего человеческий MUC1, включающий введение субъекту эффективного количества хелатного комплекса по любому из пп. 14-18.
31. Способ для лечения рака, экспрессирующего человеческий MUC1, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества хелатного комплекса по любому из пп. 14-18.
| TOMOYA UEHARA et al., "A Gallium-67/68-Labeled Antibody Fragment for Immuno-SPECT/PET Shows Low Renal Radioactivity Without Loss of Tumor Uptak", CLINICAL CANCER RESEARCH, 2018, vol | |||
| Пишущая машина для тюркско-арабского шрифта | 1922 |
|
SU24A1 |
| Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
| WO 2011005322 A2, 13.01.2011 | |||
| WO 2018092885 A1, 24.05.2018. | |||
