Способ получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers. в условиях in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, к направлению микроклонального размножения растений in vitro. Область применения изобретения: лесное и сельское хозяйство, медицинская и пищевая промышленность.

Oxycoccus palustris Pers. - вечнозеленый стелющийся кустарник, относящийся к семейству Вересковые (Ericaceae D.C.). Химический состав ягод клюквы болотной богат вторичными метаболитами, такими как витамины, органические кислоты, фенольные соединения и другие. Из-за влияния антропогенных факторов на природные процессы происходит сокращение запасов сырья в лесных массивах.

В последние годы возрос интерес и спрос на высококачественный и безвирусный посадочный материал ягодных культур, в том числе и клюква болотная. Благодаря микроклональному размножению растений in vitro можно получить большое количество посадочного материала. Одним из важнейших этапов данного метода является введение растения в культуру in vitro благодаря стерилизации и посадке первичного экспланта на асептические питательные среды.

Анализ патентной и научной литературы показал: прототип способа получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers. не существует.

Согласно работе С.С. Макарова, И.Б. Кузнецова и др. эксплантами служили одревесневшие черенки клюквы болотной сорта «Дар Костромы» и гибридная форма 1-15-635 с двумя почками. Заранее очищенные и промытые черенки клюквы болотной на 30 секунд помещали в 70 % спирт, после этого промывали в 5 порциях стерильной дистиллированной воды. В качестве основных стерилизаторов были применены растворы сулемы (0,2 %), азотнокислого серебра AgNO (0,2 %), 3 экостерилизатора бесхлорного 5 % (в соотношении 1:1), хлорной извести (в соотношении 1:1), препарат Лизоформин 3000 (5 %). Время экспозиции 5, 10, 15 и 20 мин.

Недостатком данной работы является то, что используют раствор Сулемы, который обладает токсичными свойствами, что негативно сказывается на здоровье человека.

В другой работе, где авторы Черемных Е.Н., Т.Г. Леконцев «Клональное размножение клюквы болотной (Vaccinium oxycoccosL.) в Удмурской Республике, рекомендовали черенки промывать под проточной холодной водой в течение 30 минут. В дальнейшем в стерильных условиях экспланты выдерживали в течение 5-8 минут в 33 % перекиси водорода с последующей 5-кратной промывкой в стерильной дистиллированной воде.

Недостатком данной работы является то, что затрачивается большой объем времени.

Суть предполагаемого изобретения заключается в модификации способа получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers. с целью сокращения продолжительности этапа стерилизации и существенного выхода стерильных, жизнеспособных эксплантов для дальнейшего микроклонального размножения в условиях in vitro.

Технический результат заключается в повышении показателя асептических жизнеспособных культур для дальнейшего микроклонального размножения до 95 %, сокращения продолжительности этапа введения в культуру in vitro, снижения затрат на стерилизующие агенты.

Технический результат достигается тем, что способ получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers. заключаются в сборе молодых неодревесневших побегов клюквы болотной, предварительной очистке черенков от листьев, промывке мыльным раствором «Ника» в течение 10-15 мин и трехкратным ополаскиванием дистиллированной водой, нарезке на экспланты - микрочеренки с 2-3 почками, с последующей двухступенчатой стерилизацией в 70 % этиловом спирте в течение 30 секунд и 37 % пероксида водорода в течение 3 минут, трехкратным промыванием стерильной дистиллированной водой, помещением стерильных эксплантов на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) классического состава с добавлением фитогормона 6-Бензиламинопурина в концентрации 0,5 мг/л, инкубации в течение 4-6 недель при температуре 23-25°С и фотопериоде 16/8.

На фиг. 1. изображена зависимость выхода ассептических, жизнеспособных первичных эксплантов от различных стерилизующих агентов и времени экспозиции.

Способ получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers. в условиях in vitro осуществляется следующим образом:

Для получения первичных стерильных микрорастений in vitro используются дикоросы клюквы болотной. На первоначальном этапе проводится подготовка черенков для дальнейшей стерилизации. Черенки предварительно очищаются от листьев, не повредив почки, затем промываются мыльным раствором «Ника» в течение 15 минут и трижды ополаскиваются в дистиллированной воде. Очищенные черенки нарезаются на экспланты с 2-3 почками.

Все дальнейшие манипуляции осуществляются строго в асептических условиях ламинарного бокса. Основная поверхностная стерилизация подготовленных эксплантов проводится двухступенчато, чтобы увеличить процент стерильных эксплантов.

В ходе проведения экспериментов были использованы два варианта поверхностной стерилизации:

- в первом варианте стерилизация состоит из двух этапов: 70 % этиловый спирт и 37 % водорода пероксид (Н₂О₂) с различным временем экспозиции.

- во втором варианте используется также двухступенчатая поверхностная стерилизация: 70 % этиловый спирт и 5 % раствор «Лизоформин-3000» с различным временем экспозиции.

После поверхностной стерилизации микрочеренки (экспланты) трижды промываются стерильной дистиллированной водой и высаживаются в пробирки с питательной средой: Мурасиге-Скуга (MS) классического состава с добавлением фитогормона 6-Бензиламинопурина в концентрации 5 мг/л. Кислотность среды (pH) для вересковых культур до автоклавирования доводится до 5,2-5,3; режим автоклавирования - 30 мин при давлении 1,0 атм.

Дальнейшая инкубация проводится в течение двух недель. В культуральной комнате поддерживаются условия: температура 23-25°С, фотопериод 16/8 и влажность воздуха 70-75 %.

Результаты стерилизации эксплантов Oxycoccus palustris Pers. различными стерилизующими агентами и временем экспозиции приводятся в таблице 1.

Таблица 1. Стерилизации эксплантов Oxycoccus palustris Pers. Стерилизующий агент/ концентрация активного вещества Время экспозиции Асептические, жизнеспособные, % Асептические, нежизнеспособные, % Инфицированные, % Первый вариант стерилизации 1. Этиловый спирт/ 70 % 30 сек 2. Пероксид водорода / 37 % 3 мин 95,56 - 4,44 4 мин 80,89 19,11 - 5 мин 65,35 34,65 - Второй вариант стерилизации 1. Этиловый спирт/ 70 % 30 сек 2. Лизоформин-3000 / 5 % 3 мин - - 100,00 4 мин - - 100,00 5 мин 12,00 - 88,00 6 мин 23,12 4,88 72,00 7 мин 34,23 21,77 44,00

Установлено, что наилучшим методом двухступенчатой поверхностной стерилизацией эксплантов клюквы болотной является применение 70 % этилового спирта в течение 30 сек и пероксида водорода 37 % со временем экспозиции 3 мин.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers., включающий сбор молодых неодревесневших побегов клюквы болотной, предварительную очистку черенков от листьев, промывку мыльным раствором «Ника» в течение 10-15 мин и трехкратное ополаскивание дистиллированной водой, нарезку на экспланты – микрочеренки с 2-3 почками, последующую двухступенчатую стерилизацию в 70 % этиловом спирте в течение 30 с и 37 % пероксида водорода в течение 3 мин, трехкратное промывание стерильной дистиллированной водой, помещение стерильных эксплантов на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) классического состава с добавлением фитогормона 6-бензиламинопурина в концентрации 5 мг/л, инкубацию в течение 4-6 недель при температуре 23-25 °С и фотопериоде 16/8. Способ обеспечивает повышение асептических жизнеспособных культур Oxycoccus palustris Pers для дальнейшего микроклонального размножения. 1 ил., 1 табл.

Способ получения асептической культуры Oxycoccus palustris Pers., заключающийся в сборе молодых неодревесневших побегов клюквы болотной, предварительной очистке черенков от листьев, промывке мыльным раствором «Ника» в течение 10-15 мин и трехкратным ополаскивании дистиллированной водой, нарезкой на экспланты – микрочеренки с 2-3 почками, последующей двухступенчатой стерилизации в 70 % этиловом спирте в течение 30 с и 37 % пероксида водорода в течение 3 мин, трехкратным промывании стерильной дистиллированной воде, помещении стерильных эксплантов на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга (МС) классического состава с добавлением фитогормона 6-бензиламинопурина в концентрации 5 мг/л, инкубации в течение 4-6 недель при температуре 23-25 °С и фотопериоде 16/8.