Способ ускоренного получения оздоровленных безвирусных растений ягодных культур in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, растениеводства, сельского хозяйства и может найти применение в ускоренном размножении и получении перспективных генотипов растений в культуре in vitro, отзывчивых на искусственное светодиодное освещение с использованием агробиотехносистем, в агробиофотонике и в технологиях получения оздоровленного безвирусного посадочного материала.

Известна универсальная модифицированная питательная среда M-S для клонирования микрорастений земляники сорта Ирма, Елизавета в условиях in vitro, представляющая собой способ создания универсальной оптимизированной питательной среды, при котором в питательной среде Мурасиге-Скуга снижается концентрация 6-БАП с 0,5 мл/л до 0,35 мл/л с последующим стимулированием продуцирования цитокининов растениями, содержанием индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,2 мг/л при одновременном снижении концентрации углеводного компонента (сахарозы) до 25 г/л. Предлагаемая универсальная модифицированная питательная среда для использования в условиях in vitro на этапе мультипликации земляники (сорта Ирма, Елизавета) позволила повысить коэффициент размножения на 34,05 (RU 2747781, МПК A01H 1/00).

Недостатком данного способа является невозможность его использования для других видов растений, например, ежевики или малины, так как известно, что каждое растение требует своих индивидуально подобранных определенных составов питательных сред и регуляторов роста для выращивания растений регенерантов. А также в технологии невозможно получить оздоровленный и проверенный на отсутствие вирусов посадочный материал.

Известен способ выращивания растений земляники с использованием метода in vitro заключается в том, что у укорененных микрорастений в период с начала августа по февраль месяц, с периодичностью 1-1,5 месяца полностью удаляют сформировавшиеся и начинающие отмирать корни и листья, а их в виде вегетирующих почек высаживают повторно и дифференцированно на питательные среды, содержащие ауксин, учитывая при этом диаметр почки. Это позволяет полностью исключить потери материала в неблагоприятный для адаптации период и существенно выровнять параметры развития растений к моменту посадки нестерильные условия. Высадку накопленного таким образом материала производят, начиная с апреля в условиях теплицы при использовании верхнего мелкодисперсного полива или временного пленочного укрытия для поддержания высокой влажности. В качестве субстрата используют предварительно увлажненный торф или торфо-песчаную смесь без какой-либо температурной обработки (RU 2762979, МПК A01H 4/00)

Известен способ интенсификации проращивания семян редиса при импульсном освещении, который включает импульсное освещение. На 7-й день проращивания в темноте семян редиса проводят подкормку проростков минеральным раствором состава (мг/л): N-NН₄ - 0,5; P - 4,1; K - 27,5; Ca - 10,0; Mg - 2,4; S - 3,0; Fe - 0,094; Mn - 0,014; B - 0,016; Cu - 0,003; Zn - 0,013; Mo - 0,003. Далее облучают светодиодными светильниками при интенсивности генерируемых фотонов 140 мкмоль/м²с при длительности импульсов 1 с освещение и 3 с паузы темноты, с характеристиками полихромного спектра: ультрафиолет 380 нм - 1,5%, синий 440 нм - 23,8%, зеленый 520-530 нм - 6%, красный 640 нм - 61,5%, дальний красный 740 нм - 7,2% с 7-го по 14-й день круглосуточного освещения проростков до получения микрозелени (RU 2735868, МПК A01C 1/00; A01G 7/04; A01C 21/00)

Недостатком данного способа является использование разработанного состава спектрального диапазона только для стимуляции прорастания семян редиса, а не для активного наращивания биомассы и фотосинтеза, и как известно, каждое растение и на каждой фазе фенологического развития требует своих индивидуально подобранных спектральных условий выращивания.

В статье Л. А. Гудь, Е. А. Калашникова, И. Г. Тараканов (интернет ссылка: http://dx.doi.org/10.24419/LHI.2304-3083.2019.2.09 Гудь, Л. А., Е. А. Калашникова, И. Г. Тараканов Влияние света разного спектрального диапазона на морфогенез ежевики и малины in vitro // Лесохоз. информ. : электрон. сетевой журн. - 2019. - № 2. - С. 97-102. URL: http://lhi.vniilm.ru/) авторами изучено влияние света разного спектрального диапазона на морфогенез ежевики и малины in vitro. Установлено, что микропобеги малины и ежевики с целью увеличения роста побегов целесообразно культивировать в условиях in vitro под светодиодными лампами синего спектра (СД-С) или чипом белым с люминофором (СД-ЧЛБ).

Но данные условия освещения оказывают положительное влияние на коэффициент размножения, но только у ежевики. Недостатком является так же то, что изучено было культивирование растений только на отдельных спектрах, а не комбинированных на одной полке, что ускоряет рост и развитии растений, при правильном подборе комбинации спектров.

Следовательно, есть потребность в разработке ускоренного способа получения оздоровленного безвирусного посадочного материала ягодных культур (ежевики, малины) в лабораторных условиях in vitro с использованием молекулярных методов диагностики на отсутствие вирусов и современных методов агробиофотоники с использованием комбинированных спектров светодиодного освещения, позволяющих повысить коэффициент размножения растений при проведении микроклонального размножения растений.

Задача, стоящая перед автором, состоит в разработке способа ускоренного получения оздоровленного посадочного материала ягодных культур с использованием биотехнологических методов микроклонального размножения, молекулярно-генетической диагностики (ПЦР тестирование или с использованием полимеразной цепной реакции) молекулярной диагностики (virus free) и методов агробиофотоники.

Задача решается предложенным способом получения оздоровленных растений на основе использования методов клеточных биотехнологий растений, молекулярно-генетических методов диагностики растительного материала на отсутствие вирусов и использования методов агробиофотоники для увеличения скорости роста и развития мини-растений в процессе микроклонального размножения и культивирования в лабораторных условиях in vitro.

Сущностью заявляемого способа является, использование комбинированного спектрального диапазона светодиодного освещения для ускорения процессов наращивания биомассы и увеличения коэффициента размножения и соответственно получения большего количества микрорастьениц от одного материнского образца за счет улучшения качества искусственного освещения при выращивании растений, а также концентрация подобранных фитогормонов, для стадии микроклонального размножения и ризогенеза, разработанные режимы стерилизации растительный эксплантов при введении ягодных культур в условия in vitro, включение в технологию молекулярных методов диагностики ОТ-ПЦР в режиме реального времени для точного подтверждения отсутствия вирусов и отбор безвирусных (virus free) мини-растений перед массовым микроклональным размножением растений ягодных культур в условиях in vitro.

Осуществление способа

В качестве растительных эксплантов используют почки с апикальными меристемами растений, которые дезинфицируют ступенчатой стерилизацией. Для этого первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают несколько раз дистиллированной водой, помещают в раствор фундазола на 30-60 мин, далее в ламинарном боксе помещают в 70% спирт на 1 минуту, а затем в основной стерилизующий раствор, которым выступает или белизна 100% при воздействии в течение 5 минут или сулема 0,1% при воздействии в течение не более 3-5 минут или лизоформин 3000 5% в течение 5 минут. Далее растительные экспланты отмывают автоклавированной дистиллированной водой в трехкратной повторности по 15 минут и выделяют меристемы с использованием стереомикроскопа в стерильных условиях в ламинарном боксе, затем помещают меристемы на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга, с использованием фитогормонов для активации роста растений из меристемы с добавлением 6-БАП (6-бензиламинопурин) в количестве от 0,5 до 1 мг/л, культивируют в световой комнате при температуре 24°С с фотопериодом 16 часов день 8 часов ночь. Полученные в стерильных условиях растения далее тестируют с помощью молекулярных методов диагностики на отсутствие вирусов и отбирают чистые растения, которые не содержат вирусов только после того как будет доказано, что растения здоровые и безвирусные их используют для последующего массового микроклонального размножения с дополнительным выборочным тестированием некоторых растений после микроклонирования. Для этого используют ПЦР анализ с обратной транскрипции, проводят данный анализ с применением ПЦР-системы в реальном времени (real-time). Для этого первоначально выделяют РНК из растительного материала с помощью набора для выделения, согласно приложенному протоколу: из полученных в культуре in vitro растений отрезают в стерильных условиях нижние листья массой около 50-70 мг и растирают в ступке пестиком вместе с 400 мкл лизирующего раствора. Далее полученный гомогенат переносят в предварительно маркированные пластиковые пробирки (один образец в одну пробирку) и термостатируют при температуре 65°С в течении 20 минут, затем центрифугируют 10 минут при 2000 об/мин и полученную надосадочную жидкость переносят в чистую пластиковую пробирку. В эту же пробирку добавляют реагент для преципитации в равном объеме и перемешивают на вортексе, снова центрифугируют пробирку в течении 15 минут при 13000 об/мин. Отдельным наконечником для каждой пробирки-образца удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют 500 мкл промывочного буфера №1 и встряхивают на вортексе. Центрифугируют пробирки в течении 5 минут при 13000 об/мин, надосадочную жидкость вновь удаляют по такому же принципу и добавляют в каждую пробирку по 300 мкл промывочного буфера №2, встряхивают на вортексе. И далее центрифугируют пробирки в течении 5 минут при 13000 об/мин, удаляли надосадочную жидкость, а полученный осадок высушивают, открыв крышку пробирки в течении 5 минут при температуре 65°С. К высушенному осадку добавляют 50 мкл буфера для растворения выделенной РНК, встряхивают пробирке на вортексе в течении 5 секунд, затем термостатируют в течении 5 минут при температуре 65°С и встряхивают пробирки на вортексе в течение 5 сек. Выделенная из образцов листьев РНК готова для дальнейшей работы по проведению обратной транскрипции, которая включала приготовление предварительной общей смеси. Для этого в отдельной пробирке готовят смесь для постановки обратной транскрипции: к 2 мкл ОТ-буфера добавляют 1 мкл суммы праймеров, идущих в наборе и 0,5 мкл обратной транскриптазы, тщательно перемешивают на вортексе. Все дальнейшие работы проводят в чистой зоне. Маркируют чистые пластиковые пробирки для каждого образца и вносят в каждую по 3,5 мкл смеси для проведения обратной транскрипции, затем в каждую добавляют образец РНК и встряхивают смесь в пробирке на вортексе в течение 5 секунд, осаждают капли кратковременным центрифугированием. Инкубируют пробирки в термостате при температуре 40°C в течение 40 минут, а затем инактивируют обратную транскриптазу прогреванием при температуре 95°C в течение 10 минут. Во все пробирки добавляют по 80 мкл буфера для разведения кДНК, перемешивают пробирки на вортексе и осаждают капли со стенок пробирок кратковременным центрифугированием. Препарат кДНК готов и затем его используют для постановки ПЦР-амплификации. Либо препарат кДНК помещают в морозильную камеру при -20°C и используют позднее.

Далее проводят амплификацию. Маркируют на боковой стороне пробирки, идущие в наборе для диагностики, не задевая слой парафина, и добавляют в каждую по 10 мкл Taq-полимеразы и затем по 20 мкл минерального масла. Дальнейшую работу проводят в стерильной чистой зоне. Добавляют в пробирки, не задевая слой парафина, по 5 мкл ДНК из ранее выделенных растительных образцов, кроме пробирок с отрицательным и положительным контролем. В пробирку с отрицательным контролем добавляют 5 мкл отрицательного контрольного образца, прошедшего этап выделения ДНК, в пробирку с положительным контролем вносят столько же мкл положительного контрольного образца, идущего в наборе. Пробирки центрифугируют при 1000 об/мин в течение 3-5 с для осаждения всех компонентов смеси на дно пробирки. Далее помещают пробирки в амплификатор для проведения реакции ПЦР в реальном времени.

По результатам ОТ-ПЦР диагностики отбирают чистые безвирусные растения и их микроклонально размножают для гарантии получения массово качественного элитного посадочного материала. Помещают мини-растения на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга для микроклонального размножения с добавлением фитогормонов 0,5-1 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП) и 0,1 мг/л ИМК (индолил-масляная кислота) для индукции образования микрорастеньиц. Через 30-45 дней получают от одного культивируемого мини-растения от 3 до 30 новых микрорастеньиц.

Для достижения такого высокого коэффициента размножения культивирование проводят на специальных стеллажах с регулируемым комбинированный спектральным диапазоном светодиодного освещения, который имеет программируемый контроллер, позволяющий регулировать на каждой полке спектральный диапазон и одновременно использовать на одной полке все спектры, регулируя и подбирая на каждой полке одновременно различную комбинацию синего, красного и белого (зеленого) в спектральном составе для роста и развития растений. Это имеет огромное преимущества для усовершенствования технологии ускоренного микроклонального размножения по сравнению с использованием люминисцентных ламп или использования фитоламп только одного спектра, без возможности их регулирования.

Культивирование мини-растений проводили на стеллаже с комбинированным спектральным диапазоном светодиодного освещения по соотношению на одной полке в спектре красного, белого и синего: 79 %, 1%, 20%. Контролем в эксперименте служили люминесцентные лампы. При выращивании на данном комбинированном спектральном диапазоне получали максимальные по развитию биомассы и коэффициенту размножения растения малины и ежевики.

Далее разделяли в ламинарном боксе полученные конгломераты микрорастеньиц и пассировали их на новые модифицированные питательные среды Мурасиге и Скуга для индукции ризогенеза или корнеобразования с добавлением 1 мг/л индолил-масляной кислоты (ИМК) или 1 мг/л индолил-уксусной кислоты (ИУК). После 6-8 недель культивирования, растения с хорошо развитой корневой системой и надземной биомассой пересаживали в почвенный субстрат и доращивали со стабильными условиями: температурой 20-22ºС, относительной влажностью 70-80%, при фотопериоде 16 ч. Мини-растения пикировали в предварительно подготовленные емкости-горшочки объемом 0,25 л со смесью торфа (рН 5,0-5,6) и перлита в соотношении 2:1. Мини-растения осторожно с помощью пинцета аккуратно, не повредив растение и корневую систему, вынимали из культуральной баночки. Растение-регенерат очищали от питательной среды и переносили пинцетом в углубление почвогрунта в горшочке, при этом заранее увлажняли почвенную смесь. После этого корни слегка присыпали почвой, но корневую шейку растения-регенеранта оставляли на уровне почвенной смеси в горшочке. Высаженные растения накрывали прозрачным колпаком, изготовленным из оргстекла, ставили во внутрь емкость с водой для поддержания влажности и лучшей приживаемости растений. Культивирование проводили в течение 14 дней. Далее постепенно открывали колпак сначала на несколько минут, последующие дни - на несколько часов, и далее доращивали растения без колпака еще в течении 14 дней.

Таким образом, растения ягодных культур virus free, свободные от вирусов и болезней, станут более эффективным и экономически выгодным посадочным материалом. Дополнительным положительным преимуществом данной разработки является возможность экономии электроэнергии за счет использования светодиодного стеллажа.

Изобретение относится к области биотехнологии. Сущностью заявляемого способа является использование комбинированного спектрального диапазона светодиодного освещения для ускорения процессов наращивания биомассы и увеличения коэффициента размножения и соответственно получения большего количества микрорастеньиц от одного материнского образца за счет улучшения качества искусственного освещения при выращивании растений, а также концентрация подобранных фитогормонов, для стадии микроклонального размножения и ризогенеза, разработанные режимы стерилизации растительный эксплантов при введении ягодных культур в условия in vitro, включение в технологию молекулярных методов диагностики ОТ-ПЦР в режиме реального времени для точного подтверждения отсутствия вирусов и отбор безвирусных (virus free) мини-растений перед массовым микроклональным размножением растений ягодных культур в условиях in vitro.

Способ получения оздоровленных безвирусных растений ягодных культур in vitro, заключающийся в том, что в качестве растительных эксплантов используют почки с апикальными меристемами растений, которые дезинфицируют ступенчатой стерилизацией, для этого первоначально обрабатывают растительные экспланты в мыльном растворе, затем отмывают дистиллированной водой, помещают в стерилизующий раствор, далее растительные экспланты отмывают автоклавированной дистиллированной водой и выделяют меристемы с использованием стереомикроскопа в стерильных условиях в ламинарном боксе, затем помещают меристемы на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга, с использованием фитогормонов для активации роста растений из меристемы с добавлением 6-БАП и культивируют в световой комнате, полученные в стерильных условиях растения тестируют с помощью молекулярно-генетических методов диагностики на отсутствие вирусов и отбирают чистые растения virus free, и используют их для последующего массового микроклонального размножения, при этом диагностику на отсутствие вирусов проводят с применением ПЦР-анализа в реальном времени, для этого из полученных в культуре in vitro растений отрезают в стерильных условиях листья и растирают с лизирующим раствором в пробирки и термостатируют, затем центрифугируют, а полученную надосадочную жидкость переносят в пробирку, куда добавляют реагент для преципитации в равном объеме и перемешивают, снова центрифугируют и удаляют надосадочную жидкость, а к осадку добавляют промывочный буфер и встряхивают на вортексе, далее центрифугируют и надосадочную жидкость вновь удаляют по такому же принципу и снова добавляют промывочный буфер, встряхивают и далее центрифугируют пробирки, удаляют надосадочную жидкость, а полученный осадок высушивают, открыв крышку пробирки, к высушенному осадку добавляют буфер для растворения выделенной РНК, потом встряхивают, затем термостатируют и снова встряхивают, выделенная из образцов листьев РНК далее проходит этап обратной транскрипции, для этого готовят смесь для постановки обратной транскрипции, включающую ОТ-буфер, праймеры, и обратную транскриптазу, далее перемешивают, после чего вносят в каждую пустую пробирку смесь для проведения обратной транскрипции, и добавляют образец РНК и встряхивают смесь, после чего инкубируют, а затем инактивируют обратную транскриптазу прогреванием, при этом во все пробирки добавляют буфер для разведения и перемешивают содержимое пробирки, далее проводят амплификацию, для этого, не задевая слой парафина, в каждую пробирку добавляют Taq-полимеразу и минеральное масло и ДНК из ранее выделенных растительных образцов, пробирки центрифугируют и помещают в амплификатор для проведения реакции ПЦР в реальном времени, полученные результаты регистрируют автоматически с помощью программного обеспечения, идущего в комплекте с детектирующим аплификатором, по результатам ОТ-ПЦР диагностики отбирают чистые безвирусные растения virus free и их микроклонально размножают, для этого помещают мини-растения на модифицированную питательную среду Мурасиге и Скуга с добавлением фитогормонов 6-бензиламинопурина и индолил-масляной кислоты для индукции образования микрорастеньиц, которые культивируют на стеллаже с комбинированным спектральным диапазоном светодиодного освещения, включающим на одной полке красный, белый и синий спектры, далее разделяют в ламинарном боксе полученные конгломераты микрорастеньиц и пассируют их на новые модифицированные питательные среды Мурасиге и Скуга для индукции ризогенеза с добавлением индолил-масляной кислоты или индолил-уксусной кислоты, после этого растения с хорошо развитой корневой системой и надземной биомассой пересаживают в почвенный субстрат и доращивают.