СПОСОБ СБОРА ОБРАЗЦОВ ПОЧВ ДЛЯ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ Российский патент 2023 года по МПК G01N1/04 G01N1/38 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к биологии, а именно к микробиологии, и может быть использовано для сбора образцов почв для микробиологического исследования и оценки видового разнообразия почвенной микробиоты культуромным методом.

Уровень техники

Известны способы взятия образцов почв для анализа, включающие определение места, частоты, длительности отбора проб почвы на площадках по координатной сетке; известен способ сбора образцов почв для анализа, при котором в каждом узле координатной сетки или ее части закладывают площадку отбора проб почвы симметричной формы с симметрично расположенными относительно границ этой площадки рядами точек взятия проб почвы; известен способ сбора проб почв для микробиологического контроля.

Известен способ отбора проб почвы для агрохимического или иного анализа по международным стандартам, включающий определение места, частоты, длительности отбора проб почвы на исследуемой территории, а для этого намечают площадки отбора по координатной сетке, указывая их номера и координаты (Фомин Г.С., Фомин А.Г. ПОЧВА. Контроль качества и экологической безопасности по международным стандартам. Справочник. - М., Издательство «Протектор», 2001. - 304 с., с.57-58).

Недостатком данного способа является отсутствие точных координат места сбора проб, нет данных о возможности использования указанного способа для сохранения в пробах максимально возможного видового разнообразия микроорганизмов при микробиологическом анализе.

Известен способ сбора образцов почв для анализа, при котором в каждом узле координатной сетки или ее части закладывают площадку отбора проб почвы симметричной формы с симметрично расположенными относительно границ этой площадки рядами точек взятия проб почвы. (Патент на изобретение РФ 2485499).

Недостатком данного способа является отсутствие точных координат места сбора проб, нет данных о возможности использования указанного способа для сохранения в пробах максимально возможного видового разнообразия микроорганизмов при микробиологическом анализе.

Известен способ отбора проб почв для микробиологического исследования, который включает сбор образцов с соблюдением правил асептики на площадке размером от 0,1 до 0,5 га для однородного почвенного покрова и 0,1 га для неоднородного почвенного покрова в количестве 10 объединенных проб, состоящих из трех точечных проб каждая. Точечные пробы отбирают на пробной площадке из одного или нескольких слоев, или горизонтов методом конверта, по диагонали либо любым другим способом с таким расчетом, чтобы каждая проба представляла собой часть почвы, типичной для генетических горизонтов или слоев данного типа почвы. В целях предотвращения вторичного загрязнения проб следует отбирать их с соблюдением условий асептики: отбирают стерильным инструментом, перемешивают на стерильной поверхности, помещают в стерильную тару. Пробы упаковывают в сумки-холодильники и сразу доставляют в лабораторию на анализ. При невозможности проведения анализа в течение одного дня пробы почвы хранят в холодильнике при температуре от 4°C до 5°C не более 24 ч. (ГОСТ 17.4.3.01-2017, ГОСТ 17.4.4.02-2017)

Далее отобранные пробы с одного участка высыпают на стерильный плотный лист бумаги, тщательно перемешивают стерильным шпателем, отбрасывают примеси (прочие твердые предметы, неперегнившую растительную массу). Если проба однородна, допускается тщательное перемешивание почвы в банке. Затем пробу распределяют на листе ровным тонким слоем в форме квадрата. Данный квадрат почвы делят 2 диагоналями на 4 треугольника. Почву из 2 противоположных треугольников удаляют Оставшуюся часть почвы перемешивают, распределяют тонким слоем и повторяют процедуру деления и удаления до тех пор, пока не останется примерно 0,5 кг пробы. Образец почвы тщательно перемешивают и из него отбирают навески, величины которых выбираются исходя из предполагаемых определений. Почву торфяную, содержащую большое количество органических веществ, предварительно растирают в ступке.

Далее проводят ряд разведений почвенной суспензии, перед которыми применяется предварительная обработка почвы в зависимости от типа и вида учитываемого микроорганизма. Основная цель предварительной обработки почвы заключается в том, чтобы извлечь клетки микроорганизмов из почвенных агрегатов, что достигается разрушением последних и десорбцией микроорганизмов с поверхности почвенных частиц. Основными приемами предварительной обработки почвы является вертикальное перемешивание (механическое или ручное) почвенной суспензии первого разведения: 10 минут при навеске почвы 1 г; 3 минуты при навеске почвы более 1 г. (МУК 4.2.3695-21)

Недостатком метода является отсутствие точных данных о месте сбора проб, при длительной подготовке образцов почв для микробиологического исследования возможна гибель части микробной популяции за счет активной аэрации образцов во время распределения проб на листе, разделения проб, перемешивания. Также во время подготовки образцов за счет удаления твердых и неперегнивших остатков растительной массы возможна потеря части значимой микробиоты. Данный способ принимается за прототип.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является улучшение качества сохранения микроорганизмов в образцах почвы, собранных для микробиологического исследования путем сбора 1 грамма почвы в жидкую транспортную среду. Технический результат изобретения заключается в том, что заявленный способ сбора материала позволяет повысить вероятность выделения микроорганизмов из различных групп по типу дыхания: аэробные, микроаэрофильные и облигатно анаэробные.

Это достигается тем, что в отличие от известных способов сбора образцов почв для микробиологического исследования, производится сбор 1 грамма образца почвы непосредственно на месте отбора, с последующим помещением его в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10% содержанием глицерина, при этом место сбора отмечается по GPS навигации.

Осуществление изобретения

Сущность предложенного способа заключается в следующем: образцы почвы отбираются с помощью стерильного инструмента (шпатель, шурф) в количестве 1 грамм непосредственно на месте сбора проб, с последующим перемещением навески образца в 9 мл жидкой тиогликолевой среды, содержащей 10% глицерина, разлитой во флаконы объемом до 50 мл с последующим перемешиванием питательной среды с образцом в течение 1 минуты для его гомогенизации и равномерного распределения образца в жидкой питательной среде, флаконы маркируются с указанием информации о месте и глубине отбора пробы, при этом место сбора отмечается по GPS навигации.

Предлагаемый способ позволяет получать более точные качественные и количественные характеристики состояния микробиоты почв при проведении микробиологического метода исследования, а также сохранения в образцах облигатно анаэробных и микроаэрофильных микроорганизмов.

Это может быть необходимо для проведения регулярного микробиологического мониторинга почв и выделения различных групп микроорганизмов.

В предложенном способе сбора образцов почв для микробиологического исследования предусмотрены следующие отличия: внесение стандартизированного образца почвы по массе в транспортную среду непосредственно после сбора позволяет сохранять при транспортировке в лабораторию значительного количества микроорганизмов, зависящих от условий атмосферы, в том числе микроаэрофильных и анаэробных микроорганизмов, участвующих в микроэкологических и обменных процессах, контроль которых необходим для оценки состояния микробиоты почв, также данный способ подходит для выделения микроорганизмов, имеющих медицинское, ветеринарное и сельскохозяйственное значение, в том числе для выделения патогенных микроорганизмов.

Предлагаемый нами способ был апробирован на 10 образцах почв собранных на территории Самарской области. В результате проведенного исследования были получены следующие результаты (табл. 1):

Таблица 1 Номер пробы Количество видов микроорганизмов предлагаемым способом, выросших в следующих условиях Количество видов микроорганизмов в соответствии с МУК 4.2.3695-21, выросших в следующих условиях Аэробные Микроаэрофильные Анаэробные Аэробные Микроаэрофильные Анаэробные 1 18 16 12 12 9 4 2 16 17 14 7 7 5 3 17 17 19 7 9 9 4 20 23 16 10 11 6 5 19 21 11 8 9 6 6 18 18 14 8 12 5 7 17 22 18 11 13 7 8 20 24 17 13 11 9 9 16 21 13 11 14 8 10 21 26 19 13 8 4

Из представленной таблицы видно, что использование предлагаемого нами способа повышает вероятность выявления более широкого перечня микроорганизмов, растущих в микроаэрофильных и облигатно анаэробных условиях из образцов почв, что способствует улучшению качества проведения культуромных исследований для оценки микробиоты почв.

Таким образом, использование предлагаемого нами способа сбора образцов почв для микробиологического исследования позволяет повысить вероятность выявления значительного числа микроорганизмов.

Изобретение относится к микробиологии. Раскрыт способ сбора образцов почв для микробиологического исследования, в котором производится сбор одного грамма образца почвы непосредственно на месте отбора с последующим помещением его в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10%-ным содержанием глицерина, при этом место сбора отмечается по GPS навигации. Изобретение обеспечивает повышение вероятности выделения микроорганизмов из различных групп по типу дыхания: аэробные, микроаэрофильные и облигатно-анаэробные. 1 табл.

Способ сбора образцов почв для микробиологического исследования, отличающийся тем, что производится сбор одного грамма образца почвы непосредственно на месте отбора с последующим помещением его в 9 мл жидкой тиогликолевой среды с 10%-ным содержанием глицерина, при этом место сбора отмечается по GPS навигации.