СПОСОБ СОЗДАНИЯ СТАНДАРТНЫХ КАЛИБРОВОЧНЫХ ОБРАЗЦОВ ХИМИЧЕСКИХ ЭЛЕМЕНТОВ В ВИДЕ СУХИХ ПЛЕНОК ДЛЯ ЛАЗЕРНОЙ СПЕКТРОМЕТРИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ Российский патент 2023 года по МПК G01N1/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, экспресс-диагностике при оценке элементного статуса живого организма с определением содержания химических элементов в биосубстратах человека, созданию стандартных образцов химических элементов для калибровки спектрометра перед проведением лазерной искровой эмиссионной спектрометрии (LIBS).

Уровень техники

Состав биологических тканей и жидкостей может быть определен с использованием различных аналитических методов, одним из которых является LIBS.

Для проведения точного анализа, требующего предварительного построения калибровочных кривых, необходимо наличие стандарта с известным элементным составом. Такой стандарт обеспечивается государственным стандартным образцом состава материала (вещества) - ГСО, по действующему ГОСТу. Так, например, существует ГОСТ 8.315-2019 ГСО состава вещества, Электронный ресурс: https://files.stroyinf.ru/Data2/1/4293725/4293725748.pdf. Существует также Каталог ГСО-2023 «Стандартные образцы утвержденных типов, допущенные к выпуску и применению на территории Российской Федерации», Екатеринбург, 2023. Однако для целей исследования могут быть использованы любые подходящие ГСО, выпускаемые соответствующими предприятиями (см., например, http://lpcma.tsu.ru/ru/post/rossiyskie-proizvoditel). Согласно упомянутому ГОСТ 8.315-2019 ГСО состава вещества (с.2, п. 3.5) государственный стандартный образец (ГСО), национальный стандартный образец, стандартный образец утвержденного типа - это сертифицированный стандартный образец, тип которого утвержден (признан) национальным органом по метрологии, применяемый во всех областях национальной экономики страны, включая сферы законодательной метрологии. Для целей исследования также применяют определенные наборы или комплекты ГСО (ГОСТ 8.315-2019, с. 3, п. 3.12), где комплектом стандартных образцов является совокупность экземпляров стандартных образцов, поставляемых и применяемых совместно, имеющих разные значения свойства (одной и той же величины), упорядоченные в пределах определенного диапазона значений, поставляемых потребителю с сопроводительным документом СО, причем СО, входящие в состав комплекта, как правило, применяют совместно. Набором стандартных образцов (с.4, п. 3.13 упомянутого ГОСТа) считают совокупность нескольких экземпляров СО разных типов, скомплектованных с учетом удобства их применения для выполнения конкретных метрологических работ и поставляемых потребителям в одном или нескольких вариантах комплектации. Причем каждый СО, входящий в набор, может применяться независимо от других СО, составляющих набор, а СО утвержденных типов в виде набора могут сопровождаться одним документом об утверждении типа СО с одним описанием типа, описывающим весь набор СО.

Элементный состав исследуемого с помощью LIBS биологического образца может быть определен в соответствии с построенной калибровочной кривой, показывающей отношение спектральной интенсивности в исследуемом образце к известной концентрации химического элемента в соответствующем стандартном образце.

В предшествующем уровне техники достижению точности при построении калибровочных кривых препятствовали различные факторы, в частности - особенности получения стандартных калибровочных образцов (СКО) с содержанием химических элементов для калибровки лазерного спектрометра, характер используемой подложки, эффект «кофейного пятна» (неоднородности распределения химического элемента по поверхности подложки), нестойкость калибровочных образцов во внешней среде и др.

Так, известен способ приготовления стандартного образца для анализа содержания микроэлементов в субстрате с использованием фильтровальной бумаги [1]. В этом способе используют лист бумаги размером ~20x20 мм, который размещают на металлической подложке и на него наносят определенное количество водного раствора химического элемента с его известной концентрацией с последующим высушиванием образца при температуре 70°С в течение 5 минут. После этого фильтровальную бумагу убирают и металлическую фольгу с высохшей тонкой пленкой, содержащей искомые химические элементы, анализируют с помощью лазерно-индуцируемой эмиссионной спектроскопии (LIBS).

В этом способе имеются следующие недостатки. Часть содержания химического элемента теряется, оставаясь на фильтровальной бумаге. Кроме того, даже при использовании в данном известном способе фильтровальной бумаги средней скорости фильтрации, содержание химических элементов в приготовленном таким образом образце не будет достаточно однородным, что может привести к дополнительным случайным погрешностям при последующих измерениях с использованием данного образца.

Также известен способ SENLIBS [2], в котором водный раствор, содержащий химические элементы, наносят на металлическую или кремниевую мишень, используя ее далее в качестве подложки для повышения точности анализа LIBS. Данный способ имеет название - LIBS с улучшенной поверхностью (SENLIBS).

Однако в данном известном способе трудно ограничить жидкие образцы в области осаждения на поверхности полированной мишени. При этом возможно осаждение только малых объемов жидкости, что приводит к неоднородному распределению химических элементов в получаемых стандартных образцах (эффект «кофейного пятна») и, соответственно, к погрешностям при измерениях.

Известен способ калибровки спектрометра, при котором создают кератиновую пленку [3], получаемую при выдержке такого биологического образца, как волос, в растворе 2.6 М тиомочевины с добавлением 5М мочевины и 5% раствора 2-меркаптоэтанола при температуре 50°С. Далее проводят денатурацию белка волос (кератина) трихлоруксусной кислотой с внесением в раствор определенных концентраций свинца с последующей сушкой. Полученный материал используют как стандартный образец для калибровки лазерного спектрометра. Недостатком данного метода можно считать длительность и сложность приготовления биологического образца (пробоподготовку) перед исследованием.

В качестве ближайшего аналога изобретения можно рассмотреть известный способ создания стандартных градуировочных образцов с использованием ГСО (Определение химических соединений и элементов в биологических средах: Сборник методических указаний. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015. 168 с. Электронный ресурс: https://ohranatruda.ru/upload/iblock/385/4293757318.pdf, с. 113-121). В данном известном способе перед выполнением измерений подготовку проб, в частности, крови проводят способом кислотного растворения или разложением проб в микроволновой системе подготовки проб. Пробы мочи готовят методом разбавления 1%-м раствором азотной кислоты. Подготовку проб проводят в вытяжном шкафу. Готовят холостую и контрольную (проверочную) пробы. В качестве контрольной пробы служат пробы крови и мочи с известной концентрацией или пробы с добавкой известного количества определяемого элемента.

Для каждой серии измерений готовят не менее двух холостых проб, повторяя процедуру подготовки проб, содержащих все компоненты, кроме исследуемой пробы крови или мочи. Для этого используют посуду из той же партии, которая используется для анализа, и добавляют реактивы, что и в анализируемых пробах.

Для учета погрешностей пробоподготовки, разбавления, транспортных помех, улучшения прецизионности при подготовке к пробам добавляют элемент сравнения (внутренний стандарт). В качестве внутреннего стандарта рекомендуется использовать комплексный раствор с содержанием элементов сравнения (Bi, Ge, In, Li6, Sc, Tb, Y) 10 мг/дм3. Массовая концентрация внутреннего стандарта должна быть одинаковой в градуировочных растворах, анализируемых и холостых пробах.

Подготовленные растворы используют для измерений массовых концентраций элементов.

Для разбавления проб мочи в пробирки автоматического пробоотборника с помощью дозатора вносят 0,5 см3 мочи, добавляют 4,45 мл 1%-й азотной кислоты, дозатором добавляют 0,05 см3 комплексного раствора внутреннего стандарта с массовой концентрацией элемента сравнения 100 мкг/дм3.

Пробы мочи с осадком перед разбавлением центрифугируют или фильтруют через мембранные фильтры с порами 0,45 микрона. Разбавленные пробы накрывают герметизирующей лабораторной пленкой, перемешивают. Подготовленные растворы используют для измерений массовых концентраций элементов.

Перед началом измерения подготовленных проб измеряют 1-2 градуировочных раствора, соответствующих концентрации анализируемого элемента в пробе. Для выявления и учета возможных изменений чувствительности прибора повторные измерения растворов стандартного образца и контрольных (проверочных) проб (пп.9.4, 10.2.1) проводят через 10-15 образцов. Замер проводят с учетом внесенного внутреннего стандарта, используя программное обеспечение масс-спектрометра.

Измеряют раствор 1%-й азотной кислоты с внесенным раствором внутреннего стандарта для определения предела обнаружения.

При измерении свинца и таллия в качестве элемента сравнения рекомендуется использовать тербий, при определении кадмия - индий, при определении остальных элементов - германий.

При измерении растворов проб с массовой концентрацией выше 25 мкг/дм3 для таллия и свинца и 50 мкг/дм3 для остальных элементов рекомендуется провести дополнительное разбавление пробы, учитывая данное разбавление при вычислении результатов (коэффициент К).

Далее по определенным формулам, с учетом коэффициента разбавления, производят вычисление результатов измерений - массовой концентрации определяемого элемента в крови или моче.

Недостатком ближайшего аналога можно считать необходимость довольно объемной по времени и затрачиваемым средствам получения и подготовки образцов.

Раскрытие изобретения

Техническая проблема, решаемая предлагаемым изобретением -создание однородного стандартного калибровочного - эталонного образца (СКО) с известной концентрацией химического элемента для заданных в необходимом диапазоне исследуемых его концентраций (от 50-100 ppm до 1000 ppm) для измерения в биосубстратах. Следует пояснить, что эти концентрации на порядок отличны от обычно используемых для калибровки в лазерной искровой эмиссионной спектрометрии. Поэтому важным условием являлось создание СКО, содержащих химические элементы, необходимые для измерения их концентраций именно в биосубстратах, имеющих соответствующую органическую матрицу. При этом СКО исследуемого химического элемента для измерения их концентраций именно в биосубстратах должен быть приготовлен предсказуемым образом с предсказуемой поверхностью, которая должна быть устойчива к окружающей среде в течение нескольких месяцев, обеспечивая аналитическую лабораторию внутренним стандартом для калибровки лазерного спектрометра.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение при создании СКО однородного распределения химического элемента и устойчивого к условиям окружающей среды в определенном диапазоне его концентраций, свойственных именно для биообъектов (сыворотка крови и волосы человека), с учетом самого исследуемого химического элемента (50-100 ppm, в целом - до 1000 ppm). Как следствие, однородность образца способствует более точному определению концентраций исследуемых химических элементов, в связи с чем такие СКО (внутренние СКО, или СКО для внутреннего использования в лаборатории) и предназначены для калибровки ручного портативного лазерного искрового эмиссионного спектрометра (например, модели SciAps Z-300).

Технический результат достигается за счет того, что в раствор ГСО исследуемого химического элемента заданной концентрации из данного диапазона добавляют гидроколлоид из группы камедей в концентрации 0,01-0,1% от массы получаемой смеси в виде геля (конечной смеси), слой которого толщиной 2-3 мм затем наносят шпателем на алюминиевую подложку и сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания.

В качестве гидроколлоида используют гуаровую камедь или камедь тары.

В предлагаемом способе в жидкий аналит - ГСО, имеющий заданную концентрацию химического элемента из исследуемого диапазона, вносят гидроколлоид, в качестве которого используют, например, гуаровую камедь или камедь тары. Гидроколлоид вносят в концентрации 0,01-0,1% по массе получаемой конечной смеси, смешивая с ГСО химического элемента с получением в результате продукта (смеси) в виде геля.

Затем каплю полученного геля наносят на подложку из металла, спектр эмиссионного излучения которого под воздействием лазерного облучения известен (используем алюминиевую подложку), и, таким образом, его спектральные линии не накладываются на линии искомых элементов. При нанесении капли получают слой геля на подложке толщиной 2-3 мм. В случае большей толщины слоя это не позволит правильно фиксировать образец его держателем в позиционере.

Внесение в ГСО гидроколлоида в количестве 0,01-0,1% от массы конечного продукта необходимо для создания этого продукта в консистенции геля и, таким образом, для снижения миграции атомов исследуемых химических элементов. Это исключает образование «эффекта кофейного пятна», затрудняя диффузию элементов аналита (ГСО) от центра капли к ее периферии. Таким образом, в результате мы получаем СКО на подложке, в котором исследуемый химический элемент в данной концентрации распределен по подложке равномерно.

Далее полученный слой на подложке сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания.

Так может быть получен набор или комплект разных последовательных концентраций конкретного химического элемента в заданном диапазоне концентраций (например, от 50 до 400 мкг/г), с определенным - заданным, требуемым для исследования конкретного элемента шагом измерения концентраций (например, для исследования калия - это 0; 100; 200; 300; 400 мкг/г). То есть диапазон измерения концентраций конкретного химического элемента задают с учетом диапазона его нормальных концентраций в соответствующем биосубстрате, а шаг их измерения задают в зависимости от требуемой точности измерений в данном диапазоне (например, каждые 10, 50 или более мкг/г).

На основе полученных СКО химического элемента строят калибровочные кривые для разных заданных его концентраций, что в последующем облегчает получение более точных измерений концентраций химических элементов в исследуемых биологических образцах.

Устойчивость, неизменность полученных таким образом СКО к окружающей среде обеспечивает лаборатории возможность их использования для калибровки спектрометра в течение нескольких месяцев.

Подготовку лабораторной посуды, масс-спектрометра, основных растворов и других необходимых составляющих проводят в соответствии с принятыми лабораторными правилами (см., например, Определение химических соединений и элементов в биологических средах: Сборник методических указаний. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015. 168 с, см. с. 107-113. Электронный ресурс: https://ohranatruda.ru/upload/iblock/385/4293757318.pdf).

Для контроля точности результатов измерений (например, как показано в упомянутой публикации: Определение химических соединений и элементов в биологических средах: Сборник методических указаний. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2015. 168 с. Электронный ресурс: https://ohranatruda.ru/upload/iblock/385/4293757318.pdf, см. п. 13.1), обеспечения достоверности измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях повторяемости, внутрилабораторной прецизионности, воспроизводимости, оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-6.

Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях внутрилабораторной прецизионности (в пределах одной лаборатории, разными операторами, в разное время), проводят по результатам измерений массовой концентрации определяемого элемента в образцах крови или мочи с одинаковым содержанием элемента (см. там же - п. 13.2).

Примеры осуществления способа.

Пример 1. Готовят СКО цинка из его ГСО 7256-96 (ООО "УЗХП"), в массовых концентрациях 0; 50; 100; 150; 200; 250; 300 мкг/г (ppm). Данный диапазон и шаг концентраций выбраны в связи с тем, что готовят СКО цинка для калибровки спектрометра для определения концентрации цинка в образце волос человека, где концентрация цинка в норме составляет 155-278 ppm.

В ГСО каждой из концентраций данного исследуемого диапазона вносят гуаровую камедь в концентрации 0,1% от массы получаемого геля.

Полученный гель наносят шпателем на подложку из алюминия так, чтобы получить слой толщиной 2 мм. Далее данный препарат сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. На основе полученных СКО каждой из концентраций строят калибровочную кривую.

СКО хранили и проводили с ним b повторный анализ через 3, 6 и 12 месяцев после его получения. СКО хранились при обычных условиях (вне специальной среды). Показатель достоверности линейной аппроксимации калибровочной функции не изменился и составил r2≥0,99.

Это говорит о стабильности, устойчивости получаемых СКО и сохранении точности калибровки в случае динамического мониторинга результатов исследования.

Пример 2. Готовят СКО натрия из его ГСО 8062-94(17К-1) (ООО «ЦСОВВ»), в массовых концентрациях 0; 100; 200; 400; 600; 800; 1000 ppm. Для этого в ГСО каждой из концентраций данного исследуемого диапазона вносят гуаровую камедь в концентрации 0,01% от массы получаемого геля.

Данный диапазон и шаг концентраций ГСО выбраны в связи с тем, что готовят СКО натрия для калибровки спектрометра для определения концентрации натрия в образце волос человека, где концентрация натрия в норме составляет 76-837 ppm.

Полученный гель наносят шпателем на подложку из алюминия так, чтобы получить слой толщиной 3 мм. Далее препарат сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. На основе полученных СКО каждой из концентраций строят калибровочную кривую.

СКО хранили и проводили повторный анализ с периодичностью - на 3-й, 6-й и 12-й мес.после получения. СКО хранились при обычных условиях (вне специальной среды). Показатель достоверности линейной аппроксимации калибровочной функции не изменился и составил r2≥0,99. Это говорит о стабильности, устойчивости получаемых СКО и сохранении точности калибровки в случае динамического мониторинга результатов исследования.

Пример 3. Готовят СКО магния из его ГСО 7190-95 (ООО «ЦСОВВ»), в массовых концентрациях 0; 50; 100; 150; 200; 250 ppm. Данный диапазон и шаг концентраций выбраны в связи с тем, что готовят СКО магния для калибровки спектрометра для определения концентрации магния в образце волос человека, где она в норме составляет 48-213 ppm.

В ГСО каждой из концентраций данного исследуемого диапазона вносят камедь тары в концентрации 0,05% от массы получаемого геля.

Полученный гель наносят шпателем на подложку из алюминия так, чтобы получить слой толщиной 3 мм. Далее данный препарат сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. На основе полученных СКО каждой из концентраций строят калибровочную кривую.

СКО хранили и проводили повторный анализ через 3, 6 и 12 месяцев. СКО хранились при обычных условиях (вне специальной среды). Показатель достоверности линейной аппроксимации калибровочной функции не изменился и составил r2≥0,99. Это говорит о стабильности, устойчивости получаемых СКО и сохранении точности калибровки в случае динамического мониторинга результатов исследования.

Пример 4. Готовят СКО фосфора из его ГСО 7241-96 ООО «ЦСОВВ», в массовых концентрациях 0; 50; 100; 150; 200; 250 ppm. Данный диапазон и шаг концентраций выбраны в связи с тем, что готовят СКО фосфора для калибровки спектрометра для определения концентрации фосфора в биообразце, в котором она в норме составляет 144-210 ppm.

В ГСО каждой из концентраций данного исследуемого диапазона вносят гуаровую камедь в концентрации 0,07% от массы получаемого геля.

Полученный гель наносят шпателем на подложку из алюминия так, чтобы получить слой толщиной 2 мм. Далее данный препарат сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. На основе полученных СКО каждой из концентраций строят калибровочную кривую.

СКО хранили и проводили повторный анализ через 3, 6 и 12 месяцев после получения СКО, которые хранились при обычных условиях (вне специальной среды). Показатель достоверности линейной аппроксимации калибровочной функции не изменился и составил r2≥0,99. Это говорит о стабильности, устойчивости получаемых СКО и сохранении точности калибровки в случае динамического мониторинга результатов исследования.

Пример 5. Готовят СКО калия из его ГСО 7771-2000 ООО «Экрос-Аналитика», в массовых концентрациях 0; 100; 200; 300; 400 ppm.

Данный диапазон и шаг концентраций выбраны в связи с тем, что готовят СКО калия для калибровки спектрометра для определения концентрации калия в биообразце, в котором она в норме составляет 54-398 ppm.

В ГСО каждой из концентраций данного исследуемого диапазона вносят гуаровую камедь в концентрации 0,1% от массы получаемого геля.

Полученный гель наносят шпателем на подложку из алюминия так, чтобы получить слой толщиной 2 мм. Далее данный препарат сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. На основе полученных СКО каждой из концентраций строят калибровочную кривую.

СКО хранили и проводили повторный анализ через 3, 6 и 12 месяцев. СКО хранились при обычных условиях (вне специальной среды). Показатель достоверности линейной аппроксимации калибровочной функции не изменился и составил r2≥0,99. Это говорит о стабильности, устойчивости получаемых СКО и сохранении точности калибровки в случае динамического мониторинга результатов исследования.

Источники информации

1. Xiu J., Gao Q., Liu S., Qin H. Quantitative analysis of trace metals in aqueous solutions by laser induced breakdown spectroscopy combined with filter paper assisted analyte enrichment. Zhurnal Prikladnoii Spektroskopii. 2020; 87(4):570-577.

2. M.A. Aguirre, S. Legnaioli, F. Almodóvar, M. Hidalgo, V. Palleschi, A. Canals, Elemental analysis by surface-enhanced Laser-Induced Breakdown Spectroscopy combined with liquid-liquid microextraction, Spectrochimica Acta Part B: Atomic Spectroscopy, Volumes 79-80, 2013, pp. 88-93.

3. Pracha Cheajesadagul, Winai Wananukul, Atitaya Siripinyanonda Juwadee Shiowatana Metal doped keratin film standard for LA-ICP-MS determination of lead in hair samples. J. Anal. At. Spectrom., 2011, 26, pp. 493-498.

Изобретение относится к медицине и экспресс-диагностике. Раскрыт способ создания стандартного калибровочного образца (СКО) химического элемента для определения его содержания в биологических образцах путем лазерной искровой эмиссионной спектрометрии. При этом используют подходящий государственный стандартный образец исследуемого химического элемента (ГСО) в виде его раствора в диапазоне заданных его концентраций через заданные их промежутки, в раствор ГСО исследуемого химического элемента заданной концентрации из данного диапазона добавляют гидроколлоид из группы камедей в концентрации 0,01-0,1% от массы получаемой смеси в виде геля, слой которого толщиной 2-3 мм затем наносят шпателем на алюминиевую подложку и сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания. Изобретение обеспечивает получение при создании СКО однородного распределения химического элемента и устойчивого к условиям окружающей среды в определенном диапазоне его концентраций, свойственных именно для биообъектов. 1 з.п. ф-лы, 5 пр.

1. Способ создания стандартного калибровочного образца (СКО) химического элемента для определения его содержания в биологических образцах путем лазерной искровой эмиссионной спектрометрии, отличающийся тем, что используют подходящий государственный стандартный образец исследуемого химического элемента (ГСО) в виде его раствора в диапазоне заданных его концентраций через заданные их промежутки, в раствор ГСО исследуемого химического элемента заданной концентрации из данного диапазона добавляют гидроколлоид из группы камедей в концентрации 0,01-0,1% от массы получаемой смеси в виде геля, слой которого толщиной 2-3 мм затем наносят шпателем на алюминиевую подложку и сушат в сушильном шкафу при температуре 60 градусов Цельсия до полного высыхания.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве гидроколлоида используют гуаровую камедь или камедь тары.