СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ ЯИЦ ГЕЛЬМИНТОВ В ПРОБАХ ПОЧВЫ Российский патент 2015 года по МПК G01N33/24 

Изобретение относится к области профилактической медицины и санитарной паразитологии, экологии человека и может быть использовано как экспресс-способ для обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы.

Геогельминты - гельминты, передающиеся через почву, являются наиболее распространенными паразитами в мире. Заболеваемость геогельминтозами, по оценкам Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), более одного миллиарда жителей нашей планеты (Acceleratingworktoovercometheg-lobalimpactofneglectedtropicaldiseases. A roadmap for implementation. Executive summary. \\WorldHealthOrganization, 2012, p. 12). Геогельминты -Ascaris lumbricoides, Ascaris suum, Toxocara canis встречаются практически повсеместно не только в местностях, характеризующихся плохими санитарными условиями, но и очень часто в благополучных мегаполисах в песке на детских площадках и в песочницах. Наиболее подверженная группа риска заражения геогельминтами - дети. В современных условиях необходимы быстрые - экспресс способы обнаружения яиц геогельминтов для проведения профилактических мероприятий и постоянного мониторинга за очагами геогельминтозов и факторами риска распространения инвазий и эпидемиологически значимыми объектами мегаполисов, растениеводческих хозяйств и пищевой промышленности, а также за объектами питьевого и хозяйственного водоснабжения (SingerBH, CastroMC (2007) Bridgestosustainabletropicalhealth. \\ProcNatlAcadSciUSA 104: 16038-16043).

Существующие на сегодняшний день способы санитарно-гельминтологического исследования почвы трудоемки и требуют значительного времени (3-3,5 часа, включая пробоподготовку) для проведения исследований, кроме того, проведение таких исследований возможно только в специализированных лабораториях.

Все известные способы основаны на применении различных флотационных растворов. Для обнаружения яиц гельминтов в почве используется комбинированный способ Романенко, где в качестве флотационного раствора используется насыщенный раствор нитрата натрия (Романенко НА., Падченко И.К., Чебышев Н.В. Санитарная паразитология. - М.: Медицина, 2000, стр. 231 -275). Для исследования по способу Романенко отбирают 25 г почвы, помещают в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и заливают 150 мл воды. Смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин или с помощью электромешалки 1 мин.

Всплывшие крупные частицы сразу же удаляют. После центрифугирования в течение 3 мин при 800-1000 об/мин воду сливают, а в пробирки добавляют 150 мл насыщенного раствора нитрата натрия. Перемешивают палочкой и вновь центрифугируют 3 мин.

Пробирки устанавливают в штатив, доливают тем же раствором до образования выпуклого мениска, накрывают обезжиренным предметным стеклом так, чтобы оно касалось слоя жидкости. Через 15 мин предметное стекло снимают, на влажную поверхность добавляют несколько капель 50% водного раствора глицерина и микроскопируют. С целью повышения эффективности выявления яиц рекомендуется снятие препарата повторить 2-3 раза.

Основными недостатками данного метода являются:

- насыщенный раствор нитрата натрия, а также другие альтернативные растворы, такие как растворы тиосульфата натрия и натриевой селитры, очень быстро кристаллизуются, что затрудняет просмотр проб и снижает вероятность выявление яиц гельминтов;

- применение нескольких последовательных промывок приводит к потери исследуемого материала, что в свою очередь влияет на точность определения количества яиц геогельминтов в пробе почвы;

- значительное время на подготовку флотационного раствора и проведение исследования образца почвы на наличие гельминтов 3-3,5 часа.

Прототипом данного способа является «Способ выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы» (патент РФ №2466388):

Способ выявления яиц гельминтов, клещей и ооцист простейших в пробах почвы заключается в том, что пробу почвы весом 25 г помещают в центрифужную пробирку вместимостью 250 мл и заливают 150 мл воды, смесь тщательно размешивают стеклянной палочкой в течение 5 мин или с помощью электромешалки 1 мин и центрифугируют в течение 3 мин при 800-1000 об/мин, воду сливают, а в пробирки добавляют 150 мл трехкомпонентной флотационной системы, состоящей из насыщенных растворов цинка хлорида (2 кг ZnCl₂ на 1 л), натрия хлорида (0,42 кг NaCl на 1 л) и глицерина, взятых в соотношении 1:1:1, в пробирку доливают тот же раствор до образования выпуклого мениска, пробирку накрывают обезжиренным предметным стеклом так, чтобы оно касалось слоя жидкости, через 20-30 мин стекло снимают и микроскопируют, снятие препарата рекомендуется повторить 2-3 раза.

Основными недостатками данного способа являются:

- использование сложного флотационного раствора;

- быстрая кристаллизация флотационного раствора;

- потеря исследуемого материала при центрифугировании и удаления раствора;

- значительное (2-2,5 часа) время на исследование.

Задача изобретения - повышение точности определения яиц гельминтов в пробах почвы (за счет избавления от кристаллизации флотационного раствора и уменьшения потери исследуемого материала путем исключения последовательных промывок), снижение трудоемкости процесса и значительное уменьшение (до 30-35 мин) времени обнаружения яиц гельминтов в исследуемых образцах почвы.

Поставленная задача решается способом обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы, включающим смешивание исследуемого образца почвы с флотационным раствором и последующее микроскопирование, отличающимся тем, что в качестве флотационного раствора используют 25 мл 1,4-1,6% раствора перекиси водорода на 25 г пробы почвы.

Практически способ осуществляют следующим образом. К 25 г образца почвы, помещенного в большую центрифужную пробирку, добавляют 25 мл 1,4-1,6% перекиси водорода. Содержимое перемешивают маленькими стеклянными палочками и отстаивают в течение 4-6 минут. Перемешивание повторяют дважды. Затем пробирку оставляют отстаиваться на 20-25 минут. В процессе реагирования почвы и перекиси водорода почва поднимается выше уровня жидкости и оседает на стенках пробирки. Ее смывают небольшим количеством раствора перекиси водорода, также смывают частички почвы с палочки, которую используют для перемешивания образца, с целью недопущения возможных потерь в пробе. В процессе отстаивания на линии соприкосновения перекиси водорода с верхней границей образца почвы формируется зона, отличающаяся по цвету от основной массы исследуемого образца, из которой пипеткой забирается материал для микроскопирования на предметном стекле. Для обнаружения яиц геогельминтов, которые могут находиться в образце, необходимо микроскопировать не более трех предметных стекол. Полученные препараты просматривают под увеличением ×40, для удобства просмотра можно добавить раствор Люголя.

Предлагаемый способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы позволяет в 98% случаев в 2-2,5 раза быстрее по сравнению с используемыми на сегодняшний день способами обнаружить яйца геогельминтов.

Основой предлагаемого способа является способность перекиси водорода в определенной концентрации взаимодействовать с частичками почвы исследуемого образца и поднимать вверх яйца гельминтов. Подбор концентрации раствора перекиси водорода был определен экспериментальным способом. Его результаты представлены в табл. 1.

Таблица 1 Концентрация перекиси водорода Недостатки Преимущества 3-4% Слишком активное взаимодействие с почвой, отчего появляется много пузырьков воздуха, мешающих просмотру образца под микроскопом Очень быстро поднимает частички почвы и яйца гельминтов к поверхности 1,4-1,6% Не выявлено Оптимальная концентрация для просмотра препаратов почвы с яйцами геогельминтов 1,0-1,4% Недостаточная концентрация для подъема яиц геогельминтов над основным пластом почвы Отсутствуют 0,5-1,0% Недостаточная концентрация для подъема яиц геогельминтов над основным пластом почвы Отсутствуют

Были проведены по 100 испытаний с образцами почвы и песка. Авторами проведены сравнительные исследования заявленного способа со способом Романенко (табл. 2).

Таблица 2   Способ Романенко Патентуемый способ Время пробоподготовки и проведения исследований 180-210 минут 30-35 минут Необходимые реагенты Гидроксид натрия (NaOH), Нитрат натрия (NaNO₃) Перекись водорода (Н₂O₂) Среднее количество выявляемых яиц (в 100 опытах) 4,4 8,6

Пример 1. Проба песка общей массой 300 г. Забор пробы осуществлялся в соответствии со способом Романенко.

При исследовании способом Романенко яиц гельминтов не было выявлено.

Применение заявленного способа позволило выявить яйца Тохосаrasp.и Trichuristrichiura.

Пример 2. Проба почвы общей массой 200 г. Забор пробы осуществлялся в соответствии со способом Романенко.

При исследовании методом Романенко яиц гельминтов не выявлено.

По предлагаемому способу при исследования почвы выявлено яйцо Toxocarasp.

Таблица 3 Сравнительная эффективность выявления яиц геогельминтов в пробах почвы   Определение числа яиц геогельминтов в пробе № пробы почвы Способ Романенко Способ, представленный в патенте РФ №2466388 Патентуемый способ 1 2 5 7 2 3 6 9 3 2 3 6 4 3 2 5 5 1 7 12 6 2 3 6 7 3 4 7 8 2 3 5 9 1 3 4 10 2 5 4

Из представленных данных следует, что предлагаемый способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы позволяет повысить точность определения яиц гельминтов в пробах почвы, снизить трудоёмкость процесса и значительно уменьшить (до 30-35 мин) время обнаружения яиц гельминтов в исследуемых образцах почвы.

Это позволяет использовать предлагаемый способ как для проведения санитарно-паразитологических исследований, так и для проведения научных исследований.

Изобретение относится к области профилактической медицины и может быть использовано для экспресс-обнаружения яиц геогельминтов в пробах почвы. Для этого 25 г пробы исследуемой почвы смешивают с 25 мл 1,4-1,6% раствора перекиси водорода. Содержимое отстаивают после перемешивания, в результате чего на линии соприкосновения раствора с верхней границей почвы формируется зона, отличная по цвету от исследуемого образца. Из этой зоны пипеткой отбирают материал для микроскопирования и просматривают под увеличением ×40. Изобретение обеспечивает быстрый и точный способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы при санитарно-паразитологическом исследовании. 3 табл., 2 пр.

Способ обнаружения яиц гельминтов в пробах почвы, включающий смешивание исследуемого образца почвы с флотационным раствором и последующее микроскопирование, отличающийся тем, что в качестве флотационного раствора используют 25 мл 1,4-1,6% раствора перекиси водорода на 25 г пробы почвы.