ЭКСПРЕСС ТЕСТ-СИСТЕМА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЁМКОСТИ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И КОМПОЗИЦИОННЫХ СОСТАВОВ Российский патент 2024 года по МПК G01N21/29 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области химии, а именно фармацевтической химии, биологической химии, и химии природных соединений, а также к области экспресс тест-систем. Оно может быть использовано для полуколичественного определения антиоксидантной активности индивидуальных соединений и композиционных составов, а также биологических жидкостей, в том числе плазмы крови, мочи, слюны и т.д.

Следует отметить, что антиоксиданты имеют широкий спектр применения в пищевой, косметической и фармацевтической отраслях промышленности, а также играют важную роль в биохимических процессах в организме, в частности защите биологических молекул от оксидативного стресса. В настоящее время происходит постоянный поиск потенциальных антиоксидантов и разработка средств для профилактики и лечения болезней оксидативного стресса. В условиях скрининговых исследований возникает необходимость мониторинга большого количества образцов, что в настоящее время является трудоемким процессом, требующим соответствующего лабораторного оборудования и квалифицированных специалистов. В то же время проведение таких исследований может быть необходимо специалистам в абсолютно разных областях - ученым, инженерам, клиническим специалистам, диетологам, потребителям. Таким образом, возникает необходимость в создании простых экспрессных тест-систем для мониторинга антиоксидантных свойств, причем процесс проведения и результаты анализа должны быть понятны и легко интерпретируемы для всех заинтересованных лиц.

Уровень техники

Из уровня техники известен способ определения окислительно-восстановительного потенциала биологического образца, включающий в себя тест-полоски и считывающее устройство (Патент CN104737014B, Measure and use the method and system of the oxidation-reduction potential of biological sample, R. Ba-OD. Ba-OLT Rael, 2018). Используемая в данном способе методика отличается сложностью дополнительного оборудования, используемого для интерпретации результатов исследования.

Другим аналогом является способ, позволяющий проводить мониторинг биомаркеров воспаления, измерять общее количество метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов), определять уровень малонового диальдегида, как показателя оксидативного стресса, и анализировать антиоксидантную активность (CUPRAC) (US10161928B2, Wellness panel, Dahl А.А., Callewaert D.M., 2018). Этот способ ограничен технологическими сложностями, дороговизной, излишним количеством методов тестирования, что затрудняет его применение для скрининговых исследований.

Один из подходов заключался в мониторинге изменения кинетических параметров, в результате оказываемого тестируемым образцом влияния на протекающую модельную люминесцентную реакцию (ЕР0533764 В1, Antioxidant assay, Thorpe G.H.G.H., Whitehead T.P., 1997). Ряд способов основан на определения уровня антиоксидантов с помощью титрования, например, пероксидными радикалами (US4155713A, Assay of antioxidant concentration by titration with peroxy radicals, Mahoney L.R., 1979). Все эти способы объединяет то, что они трудоемки в исполнении из-за высоких требований к квалификационным навыкам персонала, а также необходимости использования дополнительного сложного оборудования для проведения исследования.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ определения уровня оксидативного стресса, основанный на том, что малоновый диальдегид, содержащийся в моче, вызывает изменение цвета индикатора - 1,3-диметил-2-тиобарбитуровой кислоты. (патент US 9194806 В2, публ. 2015-11-24).

В изобретении анализ проводится путем погружения тест-полоски в мочу. Приготовление тест-полоски проводят следующим образом. Погружают тестовую бумагу в первичный раствор, приготовленный путем смешивания 20-30% тринатрий цитрата с дистиллированной водой, высушивания в течение 20-30 минут при температуре примерно 50-60°С. Тестовую бумагу погружают во вторичный раствор, приготовленный путем смешивания 2-3% 1,3-диметил-2-тиобарбитуровой кислоты и 2-5% полимера поливинилпирролидона, а затем высушивают. К недостаткам данного способа можно отнести: невозможность определения непосредственно антиоксидантной емкости крови, опосредованная оценка процесса пероксидного окисления липидов, невозможность определения антиоксидантных свойств других объектов, кроме мочи, невозможность использования способа как скринингового при анализе различных природных индивидуальных соединений и их композиций, существенная зависимость от присутствия ионов металлов, которые сильно влияют на протекание реакции, лежащей в основе этого метода экспресс-тестирования. Также важно принимать во внимание, что несколько типов соединений, отличных от малонового диальдегида, дают ложноположительные результаты, что может сказаться на точности проводимого анализа, так как невозможно предугадать, содержатся ли в анализируемой пробе мешающие соединения, а если содержатся, то в каком количестве, чтобы была возможность учесть их влияние на ход исследования [2-4].

Раскрытие изобретения

Проблема, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является невозможность экспрессного определения антиоксидантной емкости широкого набора различных объектов, а именно водных и спиртовых растворов, растительных экстрактов, биологических жидкости и т.п. с помощью одной портативной переносной тест-системы.

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является возможность исполнения теста антиоксидантной емкости, обладающего портативностью, длительностью одного измерения не более 4-6 минут, а также универсальностью, то есть способностью тестировать широкий набор различных объектов, а именно как водные, так и спиртовые растворы, растительные экстракты, биологические жидкости и т.п.

Технический результат достигается за счет того, что берут тест-полоску, отличающуюся тем, что тестирующий слот тест-полоски (слот) представляет собой впитывающий материал, закрепленный на невпитывающей подложке для предотвращения взаимодействия с соседними слотами и пропитанный окрашенным реагентом - раствором радикалов 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), в количестве, эквивалентом определяемому диапазону ТЕАС, причем измерение представляет собой нанесение 4-6 мкл воды очищенной или воды дистиллированной с последующим добавлением 4-6 мкл исследуемого вещества и считается оконченным по истечению 4-6 минут либо после полного обесцвечивания слота, а вывод о соответствии антиоксидантной емкости испытуемого образца одному из эталонных диапазонов ТЕАС делается на основании визуального сравнения использованных обесцвеченных слотов со слотом сравнения и определением слотов, эквивалентного большему ТЕАС и следующего после него по величине ТЕАС.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется чертежами, где на фиг.1 представлена схема проведения исследования антиоксидантной емкости анализируемого образца, на фиг.2 представлена формула основного реагента, обуславливающего проведение анализа антиоксидантной емкости отбираемых проб.

Осуществление изобретения

Принцип реализации способа заключается в обесцвечивании составами, обладающими антирадикальными свойствами, слотов из впитывающего материала (например, хлопчатобумажного, синтетического или иного), нанесенного и закрепленного на невпитывающую подложку (например, из парафинированной бумаги, пластика или иного), пропитанного окрашенным реагентом - раствором радикалов 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты). Принципиальная схема проведения исследования антиоксидантной емкости анализируемого образца представлена на рисунке 1, структура окрашенного реагента, радикала 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты) представлена на рисунке 2.

Для получения основного реагента, радикалов 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), водные растворы 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты) диаммониевой соли и калия пероксидисульфата смешивали в концентрациях 7 мМ и 2,5 мМ соответственно. После этого полученный раствор оставляли в темном, сухом месте с поддержанием комнатной температуры воздуха в течение не менее 8 часов. Впоследствии полученные радикалы использовали в течение суток.

Для оценки результатов тестирования использовали характеристику антиоксидантной активности ТЕАС (trolox equivalent antioxidant capacity), который является эквивалентом антиоксидантной емкости раствора исследуемого вещества с концентрацией 1 ммоль/л в пересчете на тролокс, активность которого принимают за 1,0.

Слоты готовили следующим образом. В качестве носителя основного регента - радикалов 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), использовалась фильтровальная бумага высокой степени чистоты с содержанием золы в пределах меньше 0,15%, содержанием α-целлюлозы больше 95%, плотностью 65-85 г/м² и толщиной 0,14-0,28 мм, из которой вырезались слоты диаметром 9,5 мм. Для размещения слотов применялась парафинированная бумага, обеспечивающая изолирование слотов друг от друга, а также протекание реакции основного реагента с исследуемым образцом в рамках одного слота. На слоты наносился пипеткой водный раствор ABTS^⋅+ в количестве, соответствующему определяемой величине антиоксидантной активности слотом - 3 мкл, 6 мкл, 16 мкл, 25 мкл, 32 мкл, 40 мкл, 48 мкл, 56 мкл, 64 мкл, 72 мкл и 80 мкл соответственно для ТЕАС 0,5, ТЕАС 1, ТЕАС 2, ТЕАС 3, ТЕАС 4, ТЕАС 5, ТЕАС 6, ТЕАС 7, ТЕАС 8, ТЕАС 9 и ТЕАС 10 соответственно. Шаг исследования можно уменьшить с ТЕАС 1 до ТЕАС 0,5, тогда для достижения слота с эквивалентом ТЕАС Х+0,5, при X≥1, необходимо добавить объем основного реагента к слоту в объеме, соответствующему ТЕАС X увеличенному на 4 мкл. Слоты подвергались лиофильной сушке, или сушке в сушильном шкафу при температуре 20-40°С после чего могли быть использованы в тестировании.

Тест-ряд состоит из 5 (15) слотов, по 1 (3) слоту на определяемую величину антиоксидантной активности - 1 ТЕАС, 2 ТЕАС и т.д.

Проведение эксперимента включает в себя нанесение 4-6 мкл воды очищенной с последующим добавлением 4-6 мкл исследуемого вещества. Для надлежащего исполнения тестирования наличие жидкой фазы обязательно. Исследование считается завершенным через 5 минут после нанесения образца, либо полного обесцвечивания слота. Полученные результаты сравнивают с эталонным слотом - слотом соответствия, чтобы определить полноту обесцвечивания слота.

Положительным результатом является степень обесцвечивания испытуемого слота эквивалентная слоту соответствия.

Полученный результат становится основанием для оценки количественной характеристики антиоксидантной активности испытуемого образца. Обесцвеченный слот, эквивалентный большему ТЕАС, из обесцвеченных слотов, является нижней целочисленной границей антиоксидантной активности - ТЕАС 0,5/1/2/3/4/5/6/7/8/9. В случае, если не обесцветился слот с низшей концентрацией следует считать, что антиоксидантная активность испытуемого образца ниже ТЕАС 0,5. Если обесцветился слот, эквивалентный ТЕАС 10, то вывод делается о том, что антиоксидантная активность испытуемого образца выше ТЕАС 10.

Пример реализации изобретения

Пример 1. Слоты для тестирования были приготовлены с помощью лиофильной сушки. Для анализа был взят водный раствор аскорбиновой кислоты с известной концентрацией 1 ммоль/л. Известный ТЕАС из литературы для аскорбиновой кислоты в данной концентрации равен 0,71±0,01. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 5 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 5 мкл. Тест-система была оставлена на 6 минут до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали полное обесцвечивание слота, соответствующего ТЕАС 0,5. Данный вывод был сделан на основе сравнения обесцвеченных слотов с эталонным слотом, предназначенным для оценки полноты обесцвечивания. Слоты, соответствующие ТЕАС 0,5 - ТЕАС 10, частично сохранили нативную окраску, что говорит о том, антиоксидантная емкость исследуемого образца лежит в диапазоне ТЕАС 0,5-1.

Пример 2. Слоты для тестирования были приготовлены с помощью лиофильной сушки. Для анализа был взят водный раствор аскорбиновой кислоты с известной концентрацией 1,25 ммоль/л. Известный ТЕАС из литературы для аскорбиновой кислоты в данной концентрации равен 0,71±0,01. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 6 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 4 мкл. Тест-система была оставлена на 5 минут до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали полное обесцвечивание слота, соответствующего ТЕАС 0,5. Данный вывод был сделан на основе сравнения обесцвеченных слотов с эталонным слотом, предназначенным для оценки полноты обесцвечивания. Слоты, соответствующие ТЕАС 0,5 - ТЕАС 10, частично сохранили нативную окраску, что говорит о том, антиоксидантная емкость исследуемого образца лежит в диапазоне ТЕАС 0,5-1.

Пример 3. Слоты для тестирования были приготовлены с применением сушильного шкафа. Для анализа был взят спиртовой раствор кверцетина с известной концентрацией 1 ммоль/л. Известный ТЕАС из литературы для кверцетина в данной концентрации равен 5,07±0,06. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 5 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 5 мкл. Тест-система была оставлена на 5 минут до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали полное обесцвечивание слотов, соответствующих ТЕАС 1 - ТЕАС 5. Данный вывод был сделан на основе сравнения обесцвеченных слотов с эталонным слотом, предназначенным для оценки полноты обесцвечивания. Слоты, соответствующие ТЕАС 6 - ТЕАС 10, частично сохранили нативную окраску, что говорит о том, антиоксидантная емкость исследуемого образца лежит в диапазоне ТЕАС 5-6.

Пример 4. Слоты для тестирования были приготовлены с применением сушильного шкафа. Для анализа был взят спиртовой раствор кверцетина с известной концентрацией 0,83 ммоль/л. Известный ТЕАС из литературы для кверцетина в данной концентрации равен 5,07±0,06. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 4 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 6 мкл. Тест-система была оставлена на 5 минут до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали полное обесцвечивание слотов, соответствующих ТЕАС 1 - ТЕАС 5. Данный вывод был сделан на основе сравнения обесцвеченных слотов с эталонным слотом, предназначенным для оценки полноты обесцвечивания. Слоты, соответствующие ТЕАС 6 - ТЕАС 10, частично сохранили нативную окраску, что говорит о том, антиоксидантная емкость исследуемого образца лежит в диапазоне ТЕАС 5-6.

Пример 5. Слоты для тестирования были приготовлены с применением сушильного шкафа. Для анализа был взят спиртовой раствор рутина с известной концентрацией 1 ммоль/л. Известный ТЕАС из литературы для рутина в данной концентрации равен 2,76±0,12. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 5 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 5 мкл. Тест-система была оставлена на 5 минут до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали полное обесцвечивание слотов, соответствующих ТЕАС 1 - ТЕАС 2. Данный вывод был сделан на основе сравнения обесцвеченных слотов с эталонным слотом, предназначенным для оценки полноты обесцвечивания. Слоты, соответствующие ТЕАС 3 - ТЕАС 10, частично сохранили нативную окраску, что говорит о том, что антиоксидантная емкость исследуемого образца лежит в диапазоне ТЕАС 2-3.

Пример 6. Слоты для тестирования были приготовлены с применением сушильного шкафа. Для анализа был взят спиртовой раствор флавоноидного экстракта древесины лиственницы сибирской, содержащий, согласно данным ВЭЖХ анализа 90,23±0,32% дигидрокверцетина, 0,67±0,05% дигидрокемпферола, 0,28±0,03% нарингенина и 2,21±0,11% кверцетина, концентрация раствора экстракта в пересчете на основной компонент -дигидрокверцетин, составила 1 ммоль/л. Исходя из состава экстракта ТЕАС был рассчитан в пересчете на основной компонент - дигидрокверцетин. Известный ТЕАС из литературы для дигидрокверцетина составляет около 2,3. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 5 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 5 мкл. Тест-система была оставлена на 4 минуты до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали полное обесцвечивание слотов, соответствующих ТЕАС 1 - ТЕАС 2. Данный вывод был сделан на основе сравнения обесцвеченных слотов с эталонным слотом, предназначенным для оценки полноты обесцвечивания. Слоты, соответствующие ТЕАС 3 - ТЕАС 10, частично сохранили нативную окраску, что говорит о том, что антиоксидантная емкость исследуемого образца лежит в диапазоне ТЕАС 2-3).

Пример 7. Слоты для тестирования были приготовлены с помощью лиофильной сушки. Для анализа был взят спиртовой раствор α-липоевой кислоты с известной концентрацией 1 ммоль/л. Из литературы известно, что α-липоевая кислота не проявляет антирадикальной активности. На сухие слоты тест-системы было нанесено по 5 мкл воды очищенной, после чего во влажные слоты нанесли исследуемый образец в объеме 5 мкл. Тест-система была оставлена на 5 минут до полного высыхания слотов с последующей оценкой результата. Результаты тестирования показали сохранение окраски слотов, соответствующих ТЕАС 0,5 - ТЕАС 10, что говорит о том, что исследуемый образец не обладает антиоксидантной активностью.

Библиографический список

1. Wills E.D. The effect of inorganic iron on the thiobarbituric acid method for the determination of lipid peroxides // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Specialized Section on Lipids and Related Subjects. 1964. Vol.84, №4. P. 475-477.

2. Baumgartner W.A. et al. Novel interference in thiobarbituric acid assay for lipid peroxidation // Lipids. 1975. Vol.10, №5. P. 309-311.

3. Porter N.A., Nixon J., Isaac R. Cyclic peroxides and the thiobarbituric assay // Biochim Biophys Acta. 1976. Vol.441, №3. P. 506-512.

4. Marcuse R., Johansson L. Studies on the TBA test for rancidity grading. II. TBA reactivity of different aldehyde classes // J Am Oil Chem Soc. 1973. Vol.50, №10. P. 387-391.

5. et al. Means for detecting reactive oxygen species in human: pat. KR101370613B1 USA. 2014.

6. Measure and use the method and system of the oxidation-reduction potential of biological sample: pat. CN104737014B USA. 2018.

7. Dahl A.A., Callewaert D.M. Wellness panel: pat. US10161928B2 USA. 2018.

8. et al. Antioxidant sensor, detection method and composition: pat. JP5552670B2 USA. 2014.

9. Systems and methods for high accuracy analyte measurement: pat. KR101749045B1 USA. 2017.

10. Thorpe G.H.G.H., Whitehead T.P. Antioxidant assay: pat. EP0533764B1 USA. 1997.

11. Mahoney L.R. Assay of antioxidant concentration by titration with peroxy radicals: pat. US4155713A USA. 1979.

Изобретение относится к области химии. Раскрыт способ экспресс анализа антиоксидантной емкости индивидуальных соединений и композиционных составов, а также биологических жидкостей с помощью тест-системы, включающей тест-полоски. При этом тестирующий слот тест-полоски представляет собой впитывающий материал, закрепленный на невпитывающей подложке для предотвращения взаимодействия с соседними слотами и пропитанный окрашенным реагентом - раствором радикалов 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), в количестве, эквивалентном определяемому диапазону эквивалента антиоксидантной емкости по тролоксу, Trolox equivalent antioxidant capacity, далее - ТЕАС, причем измерение представляет собой нанесение 4-6 мкл воды очищенной или воды дистиллированной с последующим добавлением 4-6 мкл исследуемого вещества и считается оконченным по истечению 4-6 минут либо после полного обесцвечивания слота, а вывод о соответствии антиоксидантной емкости испытуемого образца одному из эталонных диапазонов ТЕАС делается на основании визуального сравнения использованных обесцвеченных слотов со слотом сравнения и определением слота, эквивалентного большему значению ТЕАС и следующего после него слота, соответствующего меньшему по величине значению ТЕАС. Изобретение обеспечивает возможность исполнения теста, обладающего портативностью, длительностью теста не более 4-6 мин и универсальностью. 2 ил., 7 пр.

Способ экспресс анализа антиоксидантной емкости индивидуальных соединений и композиционных составов, а также биологических жидкостей с помощью тест-системы, включающей тест-полоски, отличающийся тем, что тестирующий слот тест-полоски представляет собой впитывающий материал, закрепленный на невпитывающей подложке для предотвращения взаимодействия с соседними слотами и пропитанный окрашенным реагентом - раствором радикалов 2,2'-азинобис-(3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты), в количестве, эквивалентном определяемому диапазону эквивалента антиоксидантной емкости по тролоксу, Trolox equivalent antioxidant capacity, далее - ТЕАС, причем измерение представляет собой нанесение 4-6 мкл воды очищенной или воды дистиллированной с последующим добавлением 4-6 мкл исследуемого вещества и считается оконченным по истечению 4-6 минут либо после полного обесцвечивания слота, а вывод о соответствии антиоксидантной емкости испытуемого образца одному из эталонных диапазонов ТЕАС делается на основании визуального сравнения использованных обесцвеченных слотов со слотом сравнения и определением слота, эквивалентного большему значению ТЕАС и следующего после него слота, соответствующего меньшему по величине значению ТЕАС.