Композиция на основе интерферирующей дцРНК для защиты растений от фитофтороза Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 A01N25/10 A01P3/00 

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, фитопатологии и сельского хозяйства и направлено на разработку эффективного средства биологической защиты растений от инфекции оомицетом Phytophthora infestans по механизму РНК интерференции (РНКи), приводящей к снижению/выключению экспрессии целевого гена. Интерференция основана на использовании дцРНК, комплементарных генам домашнего хозяйства и генам, ассоциированных с патогенезом (эффекторные гены) Phytophthora infestans. В соответствии с настоящим изобретением определены 12 генов домашнего хозяйства, существенных для жизненного цикла/жизнедеятельности фитофторы и 12 генов, кодирующих белки-эффекторы, ответственные за патогенность и вирулентность оомицета. Выбранные 24 фрагмента генов-мишеней, т.е. целевых генов, объединены в блоки, включающие по три сегмента в каждой кассете из восьми генетических конструкций, и могут быть использованы для синтеза дцРНК как in vitro, так и in vivo (Escherichia coli, Pseudomonas syringae, Saccharomyces cerevisiae) для последующей обработки растений картофеля и других сельскохозяйственных культур с целью их защиты от Phytophthora infestans.

Описание чертежей

Фигура 1. Схема плазмиды, несущей последовательности генов alpha-tubulin, 60S ribosomal protein L4 и cytochrome L5 (конструкция Hr1) P. infestans (штамм T30-4). Конструкции Hr2-Нг8 отличаются только последовательностями генов, входящих в клонированный фрагмент, и перечислены в Табл. 1.

Фигура 2. Электрофорез дцРНК фитофторы, синтезированной in vitro в неденатурирующем геле агарозы.

1-8 - конструкции Hr1, Hr2, Hr3, Hr4, Hr5, Hr6, Hr7, Hr8, соответственно. Маркер мол. массы - 100 пн ladder (Evrogen).

Фигура 3. Ингибирование фитофторы препаратами дцРНК конструкций Hr1, Hr2, Hr3, Hr4, Hr5, Hr6, Hr7, Hr8 на 5, 6 и 7 день после инфицирования (дпи) листьев восприимчивого к фитофторозу сортообразца 12-12-8 (селекция ООО «ДГТ»). Степень поражения листа патогеном (площадь некротических пятен) представлены в виде средних значений 3-х биологических повторностей (±SE). В каждом варианте каждого эксперимента тестировалось по 13-15 листьев. Значимые отличия (между контролем и вариантами обозначены «*» (р<0,05) (ANOVA with Tukey's HSD pos-hoc test).

Фигура 4. Развитие некротических пятен (на 7 дпи) после обработки зараженных фитофторой листьев картофеля препаратами дцРНК различных конструкций (Hr1, Hr2, Hr3, Hr4, Hr5, Hr6, Hr7, Hr8).

Фитофтороз, вызываемый оомицетом Phytophthora infestans (Mont.) de Вагу - самое вредоносное и экономически важное заболевание картофеля и томата в большинстве стран мира. Несмотря на то, что были обнаружены устойчивые к фитофторозу дикие мексиканские виды картофеля и разработаны методы их скрещивания с культурным картофелем, не удалось создать устойчивые сорта с постоянной устойчивостью к возбудителю, так как новые гены устойчивости из дикого мексиканского картофеля стали быстро терять эффективность. Кроме того, использование наиболее эффективных химических препаратов контактного действия содержащих фениламиды не позволил эффективно бороться с фитофторозом, так как их применение привело к накоплению резистентных к фениламидам штаммов. Возросший эпифитотиологический потенциал Р. infestans стал причиной снижения эффективности селекционных, химических и традиционных методов защиты картофеля. В связи с этим актуальной остается разработка экологически чистых средств защиты биологической растений, которые используют новые подходы для придания растениям устойчивости/резистентности против патогенов. Это может быть достигнуто как стимуляцией общих естественных механизмов иммунитета растений, так и посредством индукции специфического защитного ответа растения против индивидуального патогена или группы близкородственных патогенов.

Недавние исследования показали, что растения способны успешно экспрессировать искусственные гены, ответственные за синтез дцРНК и шпилечных двуспиральных РНК (шдцРНК), а также процессировать экзогенные дцРНК и шдцРНК для подавления экспрессии целевых генов патогенов (Морозов и др., 2019). Экзогенные дцРНК как и эндогенные дцРНК процессируются в растениях с образованием миРНК, которые распространяются по растению локально и системно и индуцируют резистентность растений к патогенам на основе механизма РНКи. Эта целенаправленная и экологически чистая стратегия защиты растений гораздо более приемлема, учитывая распространяемое давление общественного мнения, чем, например, химические обработки. Таким образом, механизм РНК-интерференции может быть использован в практическом плане для повышения устойчивости сельскохозяйственных растений к патогену P. Infestans, существенно расширяя арсенал узконаправленных и безопасных средств защиты растений.

Задача настоящего изобретения состояла в определении генов-мишеней P. infestans для получения серии специфических препаратов дцРНК для защиты растений от P. infestans на основе механизма РНК-интерференции.

Ключевые для потребителя характеристики, по которым у продукта/технологии есть преимущества над аналогами: возможность прямой защиты растений (картофеля, томатов) от заражения Р infestans при частичном отказе, или сокращении объемов, от трудозатратных профилактических мероприятий по фитопрочистке и выбраковке посадок.

Оомицет Phytophthora infestans поражает многие виды сельскохозяйственных культур Solanaceae, включая картофель (Solanum tuberosum) и томаты (Solanum lycopersicum). P. infestans - гемибиотроф, имеющий две стадии инфекционного процесса: начальную бессимптомную биотрофную и последующую некротрофическую. Во время биотрофной стадии P. infestans последовательно формирует аппрессории, первичные и вторичные гифы и, наконец, специализированные структуры, называемые гаусториями, через которые белки и небольшие молекулы, называемые эффекторами, доставляются в апопласт и клетки растения (Dou et al., 2008). Последующая некротрофическая стадия характеризуется разветвлением гиф и лизисом клеток-хозяина (van Кап, 2006). Особая опасность P. infestans как патогена обусловлена его эффективным размножением как бесполым, так и половым путем. В идеальных условиях жизненный цикл может быть завершен примерно за пять дней, причем одно поражение/заражение может генерировать до сотен тысяч новых спорангиев (Fry, 2008).

Разнообразие процессов, регулирующих каждую стадию инфекционного процесса, и молекулярные механизмы, запускающие переход от биотрофии к некротрофии (Lee and Rose, 2010), изучены недостаточно. Современные омиксные технологии (транскриптомный и протеомный анализы) позволили выявить гены патогенности и экспрессию эффекторов Р. infestans на разных стадиях развития инфекции (Zuluaga et al., 2016, Resjo et al., 2017).

Как и в случае с другими патогенами растений, патогенность и вирулентность определяются эффекторными генами (Lo Presti et al., 2015, Wang and Jiao, 2019). Считается, что белки-эффекторы позволяют патогенам регулировать метаболизм и подавлять защитные механизмы растения-хозяина (Abramovitch and Martin, 2004; Restrepo et al., 2005; Tian et al., 2007). Белки-эффекторы P. infestans принадлежат, в основном, к двум группам, которые нацелены на разные компартменты растения-хозяина. Апопластные эффекторы секретируются во внеклеточное пространство, тогда как цитоплазматические эффекторы перемещаются внутрь растительной клетки и взаимодействуют с различными субклеточными компартментами/структурами (Kamoun, 2006; Whisson et al., 2007).

Цитоплазматические эффекторы могут переходить в ядро, где они модулируют передачу сигналов и иммунные/защитные ответы растений (Dou et al., 2008; Schornack et al., 2010). Геном P. infestans является одним из крупнейших среди оомицетов (240 МБ) и содержит огромное количество мобильных элементов (ТЕ) (Haas et al., 2009, Vetukuri et al., 2013). Существуют сотни предсказанных генов, кодирующих белки-эффекторы, способствующие развитию инфекции, преимущественно локализованные в богатых ТЕ геномных областях, которые совместно управляют процессом диверсификации, что приводит к исключительно высокому потенциалу адаптации P. infestans к новым стратегиям защиты растений от этого патогена (Zuluaga et al., 2016).

Селекционная работа по созданию новых сортов с улучшенной устойчивостью к Р. infestans продолжается более 100 лет.Использование генов устойчивости диких видов Solanum началось с S. demissum и продолжается до сих пор (Vleeshouwers et al., 2011). Помимо пирамидирования доминантных генов устойчивости акцент был сделан на введении количественных признаков устойчивости. Тем не менее, поиск комбинаций генов устойчивости без негативного влияния признаков от видов-доноров, таких как, например, позднее созревание, остается сложно решаемой проблемой.

Впервые идея использования участков РНК, комплементарных определенной области мРНК целевого гена, для угнетения экспрессии этого гена была описана в 1984 году. Термин РНК-интерференция (РНКи) был введен в 1998 году, когда Tabara и соавт.(ТаЬага et al., 1998) показали, что процесс ингибирования экспрессии гена может быть инициирован инкубацией нематод в растворе ген-специфичных двуспиральных фрагментов РНК. Однако к тому времени на трансгенных растениях и грибах уже были получены явные указания на роль комплементарных РНК в регуляции экспрессии эндогенных эукариотических генов (Jorgensen, 1990; Grierson et al., 1991; Romano and Macino, 1992). В течение 1990-2000-х годов появилось множество работ, посвященных РНКи во многих эукариотических организмах, включая грибы, животные и растения. РНКи или РНК-сайленсинг, сиквенс-специфический механизм посттранскрипционного умолкания генов, опосредованный малыми интерферирующими РНК (миРНК) или микроРНК, выполняет важную роль в защите от вирусной инфекции, развитии и поддержании целостности генома (Ding, 2000; Vance and Vaucheret, 2001; Baulcombe, 2004; Chen, 2012). В растениях в процесс РНК-интерференции вовлечены несколько ключевых семейств белков, включая Dicer-подобные белки (DCL), Аргонавты (AGO) и РНК-зависимые РНК полимеразы (RDR). DCL белки являются РНКазами типа III, который процессируют дцРНК или РНК со шпилечными структурами с образованием миРНК или микроРНК, соответственно, длиной 20-24 нуклеотидов. AGO белки являются эндонуклеазами, которые формируют индуцированный РНК комплекс сайленсинга (RISC) с миРНК или микроРНК. RISC может связываться с целевой/таргетной мРНК или некодирующей РНК по принципу комплементарности через включенные в комплекс миРНК/микроРНК. Умолкание (выключение) экспрессии целевого гена осуществляется путем разрезания и деградации целевой мРНК (РНК-интерференция) или путем привлечения кофакторов и ингибирования трансляции этой мРНК или за счет модификации гистонов (метилирования) и ингибирования транскрипции целевого гена (траскрипционный сайленсинг). Белки RDR транскрибируют одноцепочечную РНК с образованием дцРНК, которая в дальнейшем процессируется с образованием миРНК при участии белков DCL. Поскольку образование дцРНК является общей особенностью механизмов сайленсинга, искусственно синтезированные дцРНК могут имитировать РНК сайленсинг в растениях, регулируя экспрессию генов и тем самым обеспечивая подход для улучшения свойств сельскохозяйственных культур (подавление функционирования клеточного гена), а также ингибируя размножение или вирулентность патогенов (Dalakouras et al., 2020). Существенно, что сигнал сайленсинга (дц миРНК) перемещается по растению в течение нескольких дней после инициации и, как правило, направлен от фотосинтетических источников (т.е. листьев) к корням и точкам роста (Lough and Lucas, 2006; Voinnet et al., 1998). Различают межклеточный транспорт миРНК через плазмодесмы и системный транспорт через проводящую ткань флоэмы (Wang and Dean, 2020).

С использованием трансгенных растений, экспрессирующих дцРНК против генов патогена, очевидный эффект показан у злаковых, зараженных возбудителем мучнистой росы Blumeria graminis (Nowara et al., 2010). Подавление генов метаболизма жирных кислот с помощью стратегии сайленсинга генов, индуцированной хозяином (host-induced gene silencing, HIGS) выявило эффективность этого метода для создания толерантности к болезням и у ряда других культурных растений. HIGS-опосредованное подавление гена OsSSI2 риса привело к повышению устойчивости к грибу Magnaporthe grisea и бактерии листовой гнили Xanthomonas oryzae (Jiang et al., 2009). Повышенная устойчивость растений риса к М. grisea была достигнута путем подавления двух генов, а именно OsFAD7 и OsFAD8, которые кодируют белки Ω-3-десатуразы жирных кислот (Yara et al., 2007). Более того, подавление генов, контролирующих производство лигнина, привело к повышению устойчивости растений сои к фитопатогену Sclerotinia sclerotiorum (Peltier et al., 2009). Обнаружено снижение симптомов мучнистой росы у растений ячменя или пшеницы при HIGS-опосредованном подавлении гена белка-эффектора Avra10 и уменьшение количества функциональных гаусторий внутри клеток эпидермиса.

В работах Whisson et al., 2005 и Grenville-Briggs et al., 2008 описывается первое применение синтезированной in vitro дцРНК для запуска сайленсинга генов P. infestans при ее доставке в протопласты патогена. В исследованиях были использованы дцРНК к генам infl и cdcl4 (Whisson et al., 2005) и CesA (Grenville-Briggs et al., 2008). INF1 представляет собой секретируемый предполагаемый белок-носитель стерола с мол массой 10 кДа. Белок Cdcl4 необходим для споруляции патогена P. infestans. После воздействия специфических дцРНК наблюдали снижение продукции INF1 и экспрессии гена cdcl4, что дало ожидаемое уменьшение количества спорангиев (Whisson et al., 2005; Grenville-Briggs et al., 2008). Гены CesA активируются во время прорастания цист и последующего образования аппрессорий. Сайлесинг генов CesA 1-4 значительно снижает количество целлюлозы в аппрессорной клеточной стенке, что приводит к уменьшению образования аппрессорий. Позднее проведенные исследования гомолога гена Cdcl4 P. infestans в возбудителе гнили корней сои P. sojae - PsCdcl4 - показали, что количество мРНК PsCdcl4 после обработки протопластов P. sojae синтезированной in vitro дцРНК PsCdcl4 резко снижается, что приводит к низкому уровню формирования спорангиев (Zhao et al., 2011). В отличие от приведенных данных, HIGS-опосредованный сайленсинг генов оомицета Pparasitica не инициировал развитие столь явной защитной реакции у трансгенных растений арабидопсиса, экспрессирующих дцРНК на основе последовательности гена PnPMAl (Zhang et al., 2011). Однако другие примеры указывают на возможность успешного применения HIGS и в случае оомицетов. Так, в одной из работ показано, что в трансгенных растениях табака, экспрессирующих дцРНК гена глутатион-8-трансферазы, развивается заметная устойчивость к табачному штамму фитофторы (Hernandez et al., 2009).

В других работах был исследован эффект ингибирования экспрессии различных эффекторных генов. Например, у P. infestans был описан супрессор РНКи PSR2 (Phytophthora супрессор сайленсинга РНК 2). PSR2 является консервативным белком-эффектором, одним из немногих присутствующих у большинства видов Phytophthora. Наибольший уровень экспрессии гена наблюдается в биотрофной фазе патогена, что позволяет предположить, что PSR2 важен на ранней стадии заражения. Показано, что PSR2 увеличивает вирулентность фитофторы, что делает его перспективной мишенью для борьбы с патогеном (Xiong et al., 2014; Sophie de Vries et al., 2017). Другие два эффектора PsAvhl8 и PsAvhl46, которые экспрессируются в P. sojae во время заражения сои, ингибируют биогенез малых РНК. Эктопическая экспрессия этих супрессоров салейсинга РНК увеличивает восприимчивость растений к фитофторе, показывая, что некоторые патогены содержат белки вирулентности, которые нацелены на процессы подавления биогенеза РНК растения-хозяина, чтобы способствовать развитию инфекции (Qiao et al., 2013).

В настоящее время очевидно, что РНК-интерференция может эффективно использоваться для достижения желаемой резистентности сельскохозяйственных культур к патогенам путем манипулирования экспрессией генов вирусов, бактерий, грибов, нематод и насекомых (Koch and Kogel, 2014; Kamthan et al., 2015; Морозов и др. 2019). Для синтеза искусственных дцРНК в растениях обычно используют трансгенные растения. Однако использование трансгенных растений попадает под правила, регулирующие работы с генно-модифицированными организмами (ГМО). Многообещающим методом применения дцРНК является опрыскивание растений - спрей-индуцированный сайленсинг генов (spray-induced gene silencing (SIGS)). дцРНК могут либо непосредственно поглощаться патогеном, либо сначала переноситься в растительные клетки, а затем переходить в клетки патогена (Dubrovina and Kiselev, 2019, Морозов и др., 2019).

Сведения по использованию дцРНК в качестве средства профилактики и лечения фитофтороза растений в литературе отсутствуют.

Среди известных препаратов нуклеиновых кислот в нашей стране близким аналогом к заявленному изобретнию, основанному на механизме действия дцРНК, является препарат для борьбы с личинками металловидки серой на основе нуклеиновой кислоты, с использованием короткого (18-ти членного) одноцепочечного антисмыслового фрагмента генома бакуловируса из консервативного домена RING гена IAP вируса ядерного полиэдроза металловидки серой 5'-CGACATGACCGCAAGGTA-3'. При наружной обработке личинок насекомого раствором данного фрагмента проявляется достоверное инсектицидное действие (Оберемок В.В. RU 2645258).

Аналогичным действием обладают дцРНК, комплементарные участкам отдельных генов патогена, в частности, участку гена HXTI ржавчинных грибов сои. ДцРНК, в данном случае, представляет собой нуклеотидную последовательность, идентичную последовательности мРНК длиной 18 нуклеотидов, транскрибируемой с гена HXTI. Для борьбы с ржавчиной сои дцРНК наносится на почву, где растут или способны расти растения, на листья и/или плоды/семена растений сои. (Байер Кю A., RU 2018106970). ДцРНК также используется для ингибирования экспрессии одного или более генов-мишеней у жесткокрылого паразита Diabrotica spp., что приводит к ингибированию его роста (Монсанто текнолоджи ЛЛС (US), RU2478710 С2).

Наиболее близким аналогом к раскрытому решению является изобретение по патенту ЕА 028662, где приводится группа изобретений, связанный с приданием растению устойчивости к оомицетам путем ингибирования гена сахаропиндегидрогинезы. Отличие раскрытого решения состоит в использовании иных генов в составе экспрессирующих кассет, соответственно продуцирующих дцРНК иной последовательности. В уровне техники практически отсутствуют какие-либо обобщенные сведения, позволяющие предсказать эффективные комбинации генов-мишеней, условия обработки и возможную величину эффекта. Применение дцРНК к комплексу генов, ответственных как за разные патогенетические свойства фитофторы, так и непосредственно к генам домашнего хозяйства, для защиты растений от P. Infestans, неизвестно из уровня техники и не применялось ранее для создания защитных композиций. Эффективность использованных в раскрытом решении комбинаций дцРНК различной направленности не публиковалась в открытых источниках. Эспериментальным путем были подобраны наиболее эффективные комбинации последовательностей интерферирующих дцРНК и показано защитное действие композиций на их основе, таким образом, подтвержден новый технический результат.Выбор длины вводимых в клетку дц РНК обусловлен тем фактом, что наиболее эффективными в индукции РНК интерференции являются специфические дцРНК длиной от 300 до 1000 пар нуклеотидов (п.н.) (Dubrovina, Kiselev, Int. J. Mol. Sci. 2019, 20, 2282; doi:10.3390/ijms20092282). Попадая в клетку, такие дцРНК узнаются компонентами системы РНК интерференции растения, в результате чего образуется набор разнообразных коротких миРНК, комплементарных РНК-мишени, что полностью воспроизводит процесс, происходящий в естественных условиях. Вероятность наличия в подобном наборе высокоэффективных миРНК существенно выше, чем при использовании искусственно синтезированных миРНК. D В целевой клетке растения процесс РНК-интерференции начинается с действия фермента Dicer-Like (DCL), который разрезает длинные молекулы вирусной или клеточной двуцепочечной РНК на короткие фрагменты порядка 21-25 нуклеотидов, которые традиционно называют также siRNA (small interfering RNA). Одну из двух цепочек каждого фрагмента называют «направляющей», т.к. эта одноцепочечная РНК далее включается в состав комплекса RISC. В результате активности этого белкового комплекса короткий одноцепочечный фрагмент РНК образует водородные связи с комплементарной последовательностью молекулы информационной РНК (геномной РНК вируса или клеточной мРНК) и вызывает разрезание последней белком комплекса RISC, который назван Argonaute (AGO). Таким образом, обеспечивается высокая специфичность разрезания. Таким образом, введение в растительную клетку синтезированной дцРНК по изобретению приводит к целому каскаду событий, результатом которых и является подавление (сайленсинг) работы соотвествующих генов P. Infestans. Авторы изобретения провели биоинформационный анализ генома P. Infestans. И проведели отбор генов P. infestans для создания эксперессирующих конструкций.

Критериями отбора были выбраны (1) наличие данных о необходимости кодируемого геном белка для жизненного цикла, инфекционности и патогенности P. infestans и (2) наличие экспериментальных данных о снижении инфекционности/патогенности Р. infestans при снижении уровня экспрессии данного гена. Отобраны консервативные гены патогена, необходимые для его роста или вирулентности, что снижает вероятность мутаций в этих важных генах, необходимых для сохранения жизненно важных функций патогена. На основании результатов анализа в качестве целевых мишеней выбраны 12 генов домашнего хозяйства, при нарушении работы которых фитофтора погибает или останавливается в развитии, и 12 генов, кодирующих эффекторы патогенности P. infestans, участвующие в различных стадиях развития гриба и угнетение экспрессии которых замедляет развитие фитофторы (Таблица 1).

В результате удачного выбора 12 генов домашнего хозяйства, существенных для жизненного цикла фитофторы, и 12 генов, кодирующих белки-эффекторы, ответственные за патогенность и вирулентность (эффекторные гены) P. Infestans, был получен основной технический результат, обеспечиваемый изобретением, а именно ингибирование развития патогена P. infestans на листьях растений картофеля в течение не менее 7 дней после обработки вводной композицией, содержащей одну из экспериируемых искусственными конструкциями коплексных дцРНК, где дцРНК выбран из группы транскриптов: SEQ ID 9 -SEQ ID 16.

Для осуществления способа по изобретению необходимо проделать следующие операции: получить генетические конструкции, представляющие собой объединенные группами по три 24 фрагмента генов-мишеней, в составе 8 экспрессирующих кассет; с использованием данных генетических конструкций синтезировать in vitro препараты восьми дцРНК, так называемых коктейлей, или комплексных дцРНК, которые будут введены в состав водных композиций для защиты растения от фитофтороза; поверхности листа растения и водного раствора дцРНК привести в контакт друг с другом посредством опрыскивания растения водной композицией, вследствие чего дцРНК будут поглощены непосредственно патогеном P. infestans или опосредованно через клетки растений, в которые доставляется дцРНК

Ингибирование развития патогена P. infestans на листьях растений достигнуто за счет подбора серии эффективных генов-мишеней двух типов, а именно генов домашнего хозяйства, существенных для жизненного цикла фитофторы, и генов, ответственных за патогенность и вирулентность (гены белков-эффекторов), клонирования фрагментов отобранных генов в составе единой последовательности/кассеты по три фрагмента для каждого типа генов, синтеза специфических дцРНК in vitro и опрыскивания полученными препаратами с подобранными концентрациями листьев растений, зараженных P. infestans.

Опрыскивание листьев растений картофеля линии 12-12-8 водным раствором дцРНК в количестве 100 мкл препарата с концентрацией 100 нг/мкл на 1 лист приводит к ингибированию развития патогена P. infestans, предварительно нанесенного на лист, которое оценивалось по площади поражения листьев в диапазоне от 2,0 до 10 раз по сравнению с контрольными листьями. Значение 100 нг/мкл является заведомо избыточным, минимально необходимая концентрация дцРНК в композиции может варьировать в зависимости от направленности дцРНК, при этом минимальное значение для сохранения эффективности может быть достигнуто путем простого титрования композиции с оценкой ее эффективности.

Методы осуществления.

1. Получение генетических конструкций, содержащих фрагменты генов P. infestans.

Всего было получено восемь конструкций, включающих кассеты, которые содержат слитые фрагменты ДНК трех различных генов-мишеней P. infestans (Таблица 1). Последовательности фрагментов трех генов P. infestans были синтезированы и клонированы в вектор pAL2-T (фиг. 1). Для подтверждения соответствия клонированной последовательности специфическая вставка в полученной конструкции была секвенирована.

2. Синтез дцРНК in vitro.

На первом этапе, используя вектор pAL2-T с целевой вставкой, проводили две отдельные полимеразные цепные реакции с праймерами несущими Т7 промотеры: M15_T7_F TAATACGACTCACTATAGGCATGGCGGCCGCG, M15_R TCGACCTGCAGGTCGAATTC и M15_F CATGGCGGCCGCG, M15_T7_R TAATACGACTCACTATAGGTCGACCTGCAGGTCGAATTC. Полученные ПЦР-продукты разделяли в агарозном геле методом электрофореза и очищали.

На следующем этапе проводили две отдельные реакции транскрипции на синтезированных ПЦР-продуктах в качестве матрицы с помощью набора производства New England Biolab - HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit в соответствии с протоколом производителя, в результате которых были получены две одноцепочечные РНК (оцРНК). Транскрипционную смесь, содержащую следующие компоненты: реакционный буфер, четыре рибонуклеотида в концентрациях по 10 мМ, Т7 РНК полимеразу и специфическую ДНК, инкубировали в течение 16 часов. После окончания реакции в реакционную смесь вносили ДНКазу I (DNase I, RNase-free 1000 Unit, Thermo Scientific) для того, чтобы избавиться от ДНК в реакционной смеси, инкубировали при 37°С в течение 15 мин. и инактивировали ДНКазу экстракцией фенолом/хлороформом (или нагреванием до 70°С в течение 10 мин). Полученные транскрипты (оцРНК) очищали путем переосаждения этанолом в присутствии ацетата натрия. После осаждения РНК, промывания и высушивания осадка РНК на воздухе, его растворяли в соответствующем объеме воды, свободной от нуклеаз.

Растворы соответствующих комплементарных оцРНК смешивали, нагревали до 95°С в течение 10 мин на водяной бане и охлаждали до комнатной температуры пассивным способом. Во время охлаждения происходит процесс "отжига" комплементарных оцРНК друг на друга с получением дцРНК. Концентрацию полученной дцРНК измеряли с помощью спектрофотометра Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Приготовлены 8 препаратов, содержащие дцРНК для салейсинга 24 генов фитофторы (фиг. 2).

Пример 1. Влияние дцРНК на развитие инфекции фитофторы на листьях восприимчивой линии картофеля.

Ингибирующее действие дцРНК испытывали на отделенных листьях восприимчивой к фитофторозу селекционной линии картофеля 12-12-8 (селекция ООО «ДГТ»). Стерильные пробирочные растения линии 12-12-8 высаживались в почву, где подращивались до стадии 6-8 настоящих листьев. Для проведения тестирования листья 3-4-го яруса отделялись от растения, помещались во влажный бокс в термостат при температуре 11°С, где они охлаждались в течение 2-3 часов, после чего их инокулировали суспензией фитофторы (на 1 лист растения наносили 100 мкл суспензии фитофторы концентрацией 10^4-5 зооспорангиев/мл). Зараженные фитофторой листья инкубировали во влажном боксе одни сутки при 11°С, после чего листья обрабатывали препаратами дцРНК (на 1 лист наносили 100 мкл препарата концентрацией 100 нг/мкл). Обработанные препаратами дцРНК листья картофеля инкубировались во влажном боксе при комнатной температуре до появления симптомов заражения. Ингибирующий эффект дцРНК оценивался визуально и с помощью количественного анализа цифровых изображения листьев программой Leaf Doctor https://apsiournals.apsnet.org/doi/pdfplus/10.1094/PDIS-03-15-0319-RE в динамике по площади некротических пятен, развивающихся на поверхности листьев картофеля на 5,6 и 7 день после инфицирования (дпи), выраженной в процентах от общей площади листьев. В каждом варианте было протестировано 13-15 листьев. Было проведено три независимых эксперимента (3 биологические повторности). На фигуре 3 показаны результаты эксперимента (средние значения 3-х биологических повторности). Статистически достоверное снижение площади поражения листьев фитофторозом по сравнению с контролем было выявлено во всех вариантах, где листья были обработаны конструкциями дцРНК. Фигура 4 иллюстрирует внешний вид листьев на 7-ой день эксперимента.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Общество с ограниченной ответственностью "международная лаборатория "Резистом"

<120> Интерферирующая дцРНК для защиты растений от фитофтороза

<140> RUPCT/2021/05044

<141> 2021-12-21

<150> PCT/RU2021/050444

<151> 2021-12-21

<150> RU2020143919

<151> 2020-12-30

<160> 16

<170> BiSSAP 1.3.6

<210> 1

<211> 919

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 1

tcgaggatta cgaggaggtg agtgcggaga ccgccgaggg cgagggtgag gaggaggagc 60

tgggcgagga gtactaggca tactcatttt ctcagtacag gcatccactc tttcaatgat 120

gctagctaaa agcttgtgtt ggaagaatga aacactgtag ttccatcttc tttctcaatg 180

aggtcgccta cctttgtcaa gcttctacta cctgtttacc gcccctcagt agccaaacgt 240

tgttgcaagt cagctaaaga agggaggcga tcaacttgtt caacatctcc aataacagac 300

aacggatcca agaagtcggc ctccaaggct ggctaccagc tgccgcgcca ccagatgaac 360

aacgccaacc tgggccgtct gattagctct gacgagatcc agtcggttgt gcgtgccggc 420

aagtaccaga agcaccgtcg cttccagaag aagaacccgc ttcgcaacct gggtgccatg 480

gtcaagctca acccgtacac gctggtggcc cgtcgcgctg agcttcgtgc tgaggccctt 540

cgtgccgaga agaaggcggc tgtggtcggc aagaaccgca agaacacgtg caagacggac 600

cccaagcaga tctggagtcc gcaaggtata tgacgtcact gccttcctgg acgaccaccc 660

gggcggcccg gagattatgg tggacgtggc tggtcaggac gccaccgacg agttcgaaga 720

catcggccac tcgaacgacg cacgtgcgca acttaagcag ttcgagatcg gcaagatcaa 780

gggcgatgcc aagaaggagg caaccgctac gaccagcgct ggtggctcta aggtctcggc 840

tagcgggcga caggatatta gcggtgacaa cggtccgctc tacgccgtac tggcggctgc 900

ggtggtcttc acctctaga 919

<210> 2

<211> 920

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 2

ctcgagtgtg aaggtcaaga ggctgcttcg cgcgctcacg acgataaaga cgctcgcgac 60

catgcacgtt ggtgctttca gcaagcgatc cgctgcttca gtatctgtct atccaacttt 120

ttcttggaga ggaagcacag acattcgctg tctgagaagg agttggagca gttcatttac 180

gacgtcgtgg ggctgttgaa ggagacggtg cctcgtggtc attacgatca gttgctgggc 240

ttcttgtgga ctgtggctac gcaggcattg agtcacttgg cgcatcatga cggcgggcaa 300

agcttcggat ccatcgcccc gcgtccggcc gctggtctac tgcgccccgc tgtgcactgc 360

cccacgatta agtacggctc gaaggtccgt gctggcaggg gtttcaccct ggaggagctg 420

aaggaggctg gcattaaccg caagcaggcc atcagcatcg gcattgccgt cgacttccgc 480

cgcaccaaca agtcggttga gtcgcttcag gccaacgtgc accgcctcaa ggcctacaag 540

gctaagcttg tggtgttccc gcgcaagagc aacaagccca agaacggcga tgcccccgct 600

gaggacgtga gatctaaatt accggtggcc cttggtacaa tgagcaggag ttcgatcacg 660

tatttattga cacactcagc acgttcgtgt acgaagtgat caaggcctcg ggaatgagca 720

cgttgaacgc gattacagac aaggtgcatg cctcgggtat ttccaaggtg gcgctgggtc 780

cagaagagat ccgttccatc atccagacgc tcatgtacga cggtcgcgtc gaggaagttc 840

gctctgtgcg tctcacgcct ggtgcatctc acgaggtcaa gtacaaagtt tcgcagcaga 900

tcacgacctt taactctaga 920

<210> 3

<211> 917

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 3

ctcgagctca ttctctcggc tgctcgcaag gctgaggctc gtggtcgtcc gcatgatgcg 60

ttcgctctat tgaagagcgc aggcgacatt gaaggcgtta ttttgctgct gaactcgcag 120

ctcagctcga cgttgtcagc cacacgacca gagcgtgagg aatggttccg tgaggccaag 180

gagtttgccg agaagtggat gcgcttccct tgggtccaga cgattgccaa ccgacatgcg 240

cgtacagctg cgattgcctt ccagacactc ctgaacatca gtatcttcct ggagattttc 300

gaggatccgc gtattgtgtc gctgtatgct gagaagaacg acctgcagtt cgctgtccct 360

ggtggactga tcggtgtagg aacgcacatt gaccccacat tgacgcgttc ggatcgtctg 420

gtgggtcagg tgctgggtct caagggcagt ctgccgcacg tgtttacgga gctggaaatc 480

aacttctacc tgcttaagcg tctgctcggt gtcaagactc aggaaggtag caaggcctcc 540

aaggtgcaga agctgtcgaa ggccgaggtg ctcatggtga acattggctc cacagccacc 600

ggtggcagat ctggcatcca cgtgcacgag ctcgaattcc ccgacggcga atcacccgac 660

ccggagatcc tggatcaatg gctcgatcta gtcgagacgt gctttaaaga caactctatt 720

gactccaaga acaataagtc gattgcggtg cattgtgtgg caggacttgg ccgagcccct 780

gttcttgtag ccatcgcgtt gatcgagtac ggactggacc ccatcaatgc cgtagagcat 840

atccgcaagt ttcgccgtgg ggccatcaac ctgcgccagc tcaagtatct ggagaagtac 900

caacctcggc gtctaga 917

<210> 4

<211> 923

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 4

ctcgagtgat cgacgtggag ggcgctggtc tgagtgacat ggtctttgac atgtgcatga 60

aggcagacat cgatctacgc acggagttct tcaagaacgt cgtgctgtct ggtggttcca 120

gcatgtaccc gggtctgccc agtcgtctgg agaaggatat taagcaaaga tacctcacgg 180

atgtgctcaa gggcgacaag agtcgactga gcaagttccg cttgcgcatt aacgacccac 240

ctcgtcgcaa acatctggtc ttccagggtg gcagtgtctt ggctgatgtc atgaaggaca 300

acgacggatc cattgccacg cccgatgtga tgcccttggt gggtcgcgtt gctcgaattc 360

ttggccctcg cggcttgatg cccaacccga agttggggac ggtgacgcag gaggttggtg 420

acgccatcgc ggcggcgcgt ggtggccagg tggagtttcg tgctgagaag aagggtatca 480

ttcacgccgg cgtgggcaag atgagcttct cggaggaggc actactggag aacgtgcgtg 540

ctttcatggt cgcactcagc gatgccaagc cggaaggcgc aaagggcaag tacattaagg 600

ctgctcacct gagatctgct ggacctttgt gtgatgaacc ggtatggggc gtcgcgttca 660

tcgttgaaga cgtcgttttc catgagaaaa gcgacgatgt gtcagatgaa gaggcgagca 720

agtacggacc gcttagcgga caggtaatct ccactatgcg gaccacttgc ctcatgtcct 780

ttgtgaagca gcctgtgcgg ttagtagagg ccgtgtatga gtgcacagtg cagtgtcaag 840

ccgagcagct cggcaagttg tacagtgtca tctcgaagcg acgaggcgat atctactcgg 900

aagagttgtc cgatgggtct aga 923

<210> 5

<211> 916

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 5

ctcgagtgtg gctggtccgt cactctacca tttcggtatt attgatttct tgcagcagtg 60

gtacgacgtt ggagaagaag atggagcgct tctacagacc ttcttcaagc gcaaagaccc 120

cgaagcgtct ctgcgtttgc cgccgaagcc gtataagttc cgattccagc agaagatgtc 180

acgcatcttt gcgctgtcga cccacactcg cgccgagaat gacacggcat tcaacccaca 240

attacccagc gctgatcgat gtgctcgacc agggcaattt cgatacccaa cgccacaaca 300

cggatccatg atggctacct gagctgttgc cgattcgtcg acgaagcgaa cattgtcact 360

agctcggggg actccaactg catcttgtgg gacgtcgaaa gtggcgaagt aaagaccaca 420

ttccgcgaac attcgggcga cgtcatgtcc gtgagcatta acccacataa ccccagtatg 480

tttatttcgg gctcgtgtga ttcgaccgcc aaggtctggg atatcagaac gggcaagacc 540

acgcacacgt tccagggcca cgagtcggat attaactcgg tcgatttctt cccgagtggc 600

aacgcagatc tccaagattg cgtatgagga cgagcagtgc ctcgcatttc acgacgtgaa 660

cccgcaagcg cccgtgcaca ttctgcttat ccccaagaag cgcgacggac ttacgcagct 720

cgcgcacgcc gaggagcgcc acgaatccat cctgggccat ctgctctaca ctgccaaaca 780

ggtcgctaac cagcagaact tagacaaggg tttccgtatc gttattaacg atggggcgga 840

cggctgccag tcggtattcc acctacattt gcaccttctt ggagggcgca agttgggctg 900

gccccctggg tctaga 916

<210> 6

<211> 920

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 6

ctcgagacaa gaagcgtgaa tcacttgcat ccaagatcga tgaggtagct cgcaaccaga 60

tttggcgcga gcagctcaag accgagtatg agatggaaag tgcactgaca ccgttccagc 120

tcaacccgaa gacactaagc tcgatcactc taaagccaac ccagactcac ccagaagact 180

ttggtaaagt acaagatgac cagggaacac gagatctcgc tgcaaagctg cgtgaagtga 240

ccaagagacc cacagaaaaa caagccctac cgatgacaga agctcagcgt gtcgggtggc 300

ttcaggatcc agtgaaggcg acaaggagct cgcccttgag gccacccacg acgtcgtgac 360

cgagttcccc tcgacctacg agttccatta tggtcttttg accctgtccg acgatggcag 420

tgaacccaag atgaatgcca aacaggacat cgtgtcctac aacggtgtgt cggtggaggc 480

tgactcctcg tccgatgttt ccacggagac tactgaggcc ccgaccacgc agaacgagac 540

ccctgccacc cagaacgaga ttcccgccac caagacgggc atcgtcaaga gctcagatgg 600

tggctgcgag atctggagtg ttacaccgtg acttgaagcc aagtaatcta ctcatcaatt 660

cagactgtca actcaagatt tgtgatcttg gactggcacg ttccaaggaa gcagacgacg 720

tggggatgac ggaatatgtg gtgacacgat ggtaccgtgc gcccgagctg ttgttaggta 780

gtgcgtatgg cgacggagtg gatctctggg ctgcaggatg cattttcgcc gagatgctgg 840

gacgcaaacc tttgtttccg ggtgagacgt atgtgcacca actgcaactc attatgaacg 900

tgttgggtgt accgtctaga 920

<210> 7

<211> 918

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 7

ctcgagaagt ggcatatcgg ctgtccggac tgctgggacg ctcagaaaat cgcctccgca 60

ctgaatgact ttgtcatctg cgtcgagatg ctgggctttg ccattgccca ccactacgcc 120

ttcgcgattg aagacttttt gtcgccgtca ggtacggcag gtgttagtgt gccgtcttcg 180

aacgtcaagg caccactgct ggccaatttt atggacgcta tcaacgtgac ggacgtgtcg 240

acagacctca agaactcccg gaacgagatt ctcaccaaga aacaggcgct ggctgccaag 300

ttcggatccc ggctacaacg gtgacacggg cgtcattaac atcggcgtgg acgcgaaagc 360

cattttcaag acgcaaaaca acttccgtcg ctccgagttg gtgcagaaca ttgcggccaa 420

caccaagggc accacatttt ttcgcaccag cgtcatgaag gaggaggcgt tcttgaaccc 480

ttatgcttgg cagatgatct tcccggagtc gcacatcttc gagatccgtg tggatgcctc 540

ggctagtccc gctaagatta tctacctgaa caacggcact tgggacgcca agtgggagac 600

tgagttcaga tctgacactc caaggactaa accgccctag gggtaactta acgacattcg 660

ctgcggacgc ttgtgtcgtg aacatgggta tcattgatat tttgaccccc tggtctttca 720

agaaaagcct tgaacgctgg gtgcgagtgc gactacagtg tcgtgacgcg aaggggattt 780

cgtgcatgaa acccattccg tatgcagacc gcttccgtcg taatgtgatt gatactgtca 840

tttttggtcg tcggctaggc tctaagagac gtcatccgga aaagcagcaa gaagagtcga 900

ttatggtgga tttctaga 918

<210> 8

<211> 911

<212> DNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 8

ctcgagaagc gcaacgtcac attggtagtg cgtctcaatg acaaacagta cgacgagaag 60

aagttcctgt cggcgggcat cgatcacatt gacttgatct acccggacgg cacaaatgcg 120

cctatgccga tcttaatgaa gttcattgaa gcttgcgaga agactcccgg agccgtggcg 180

gtgcactgca aagctgggct tggacgcaca ggtacctgta tcggcgcata catgatgaag 240

caccacttgt tctcggctca cgagctcatc gggtggctgc gtctgtgccg accgggtagt 300

gtcaggatcc gttcgagaaa atcgtcctgg cgccgaccga agacacggag gatgctgctg 360

ccgtgctggc tagtgatatt cgtgtggaca gtcacgacca gtggctggaa aagctggaga 420

aggccgccgg cgctggtctg gaagagctgc agaagcaaag tattgaagcc ggcaagaagg 480

cggagcaggc agcagtcgcg cgtcgcgctg ccgctgatcg ccgtaaacgt gaagagaagg 540

acgtgagctc caagcacctg cagaacttct tcaacaacct gctcagccgg cctgagaaga 600

ccagatctat gttcgcagat tcgcctccag acgctctgga tttactgcag aagatgctgg 660

tgattgaccc gaataagcgg attagtgtgg acgaggcgct ggcccatccg tacttggctg 720

cgatccggaa tgtggaggac gagacgaccg ccacttcgag cttcgatttt gactttgaga 780

acgagaaatt gacgaaaccc gtgctgcaga gactgatctg ggacgagatg aggcatttcc 840

accctgaagt gggcgacgag acagcgacgg agggagatga cagcagtgtc gctaccacgc 900

aggcttctag a 911

<210> 9

<211> 919

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 9

ucgaggauua cgaggaggug agugcggaga ccgccgaggg cgagggugag gaggaggagc 60

ugggcgagga guacuaggca uacucauuuu cucaguacag gcauccacuc uuucaaugau 120

gcuagcuaaa agcuuguguu ggaagaauga aacacuguag uuccaucuuc uuucucaaug 180

aggucgccua ccuuugucaa gcuucuacua ccuguuuacc gccccucagu agccaaacgu 240

uguugcaagu cagcuaaaga agggaggcga ucaacuuguu caacaucucc aauaacagac 300

aacggaucca agaagucggc cuccaaggcu ggcuaccagc ugccgcgcca ccagaugaac 360

aacgccaacc ugggccgucu gauuagcucu gacgagaucc agucgguugu gcgugccggc 420

aaguaccaga agcaccgucg cuuccagaag aagaacccgc uucgcaaccu gggugccaug 480

gucaagcuca acccguacac gcugguggcc cgucgcgcug agcuucgugc ugaggcccuu 540

cgugccgaga agaaggcggc uguggucggc aagaaccgca agaacacgug caagacggac 600

cccaagcaga ucuggagucc gcaagguaua ugacgucacu gccuuccugg acgaccaccc 660

gggcggcccg gagauuaugg uggacguggc uggucaggac gccaccgacg aguucgaaga 720

caucggccac ucgaacgacg cacgugcgca acuuaagcag uucgagaucg gcaagaucaa 780

gggcgaugcc aagaaggagg caaccgcuac gaccagcgcu gguggcucua aggucucggc 840

uagcgggcga caggauauua gcggugacaa cgguccgcuc uacgccguac uggcggcugc 900

gguggucuuc accucuaga 919

<210> 10

<211> 920

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 10

cucgagugug aaggucaaga ggcugcuucg cgcgcucacg acgauaaaga cgcucgcgac 60

caugcacguu ggugcuuuca gcaagcgauc cgcugcuuca guaucugucu auccaacuuu 120

uucuuggaga ggaagcacag acauucgcug ucugagaagg aguuggagca guucauuuac 180

gacgucgugg ggcuguugaa ggagacggug ccucgugguc auuacgauca guugcugggc 240

uucuugugga cuguggcuac gcaggcauug agucacuugg cgcaucauga cggcgggcaa 300

agcuucggau ccaucgcccc gcguccggcc gcuggucuac ugcgccccgc ugugcacugc 360

cccacgauua aguacggcuc gaagguccgu gcuggcaggg guuucacccu ggaggagcug 420

aaggaggcug gcauuaaccg caagcaggcc aucagcaucg gcauugccgu cgacuuccgc 480

cgcaccaaca agucgguuga gucgcuucag gccaacgugc accgccucaa ggccuacaag 540

gcuaagcuug ugguguuccc gcgcaagagc aacaagccca agaacggcga ugcccccgcu 600

gaggacguga gaucuaaauu accgguggcc cuugguacaa ugagcaggag uucgaucacg 660

uauuuauuga cacacucagc acguucgugu acgaagugau caaggccucg ggaaugagca 720

cguugaacgc gauuacagac aaggugcaug ccucggguau uuccaaggug gcgcuggguc 780

cagaagagau ccguuccauc auccagacgc ucauguacga cggucgcguc gaggaaguuc 840

gcucugugcg ucucacgccu ggugcaucuc acgaggucaa guacaaaguu ucgcagcaga 900

ucacgaccuu uaacucuaga 920

<210> 11

<211> 917

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 11

cucgagcuca uucucucggc ugcucgcaag gcugaggcuc guggucgucc gcaugaugcg 60

uucgcucuau ugaagagcgc aggcgacauu gaaggcguua uuuugcugcu gaacucgcag 120

cucagcucga cguugucagc cacacgacca gagcgugagg aaugguuccg ugaggccaag 180

gaguuugccg agaaguggau gcgcuucccu uggguccaga cgauugccaa ccgacaugcg 240

cguacagcug cgauugccuu ccagacacuc cugaacauca guaucuuccu ggagauuuuc 300

gaggauccgc guauuguguc gcuguaugcu gagaagaacg accugcaguu cgcugucccu 360

gguggacuga ucgguguagg aacgcacauu gaccccacau ugacgcguuc ggaucgucug 420

gugggucagg ugcugggucu caagggcagu cugccgcacg uguuuacgga gcuggaaauc 480

aacuucuacc ugcuuaagcg ucugcucggu gucaagacuc aggaagguag caaggccucc 540

aaggugcaga agcugucgaa ggccgaggug cucaugguga acauuggcuc cacagccacc 600

gguggcagau cuggcaucca cgugcacgag cucgaauucc ccgacggcga aucacccgac 660

ccggagaucc uggaucaaug gcucgaucua gucgagacgu gcuuuaaaga caacucuauu 720

gacuccaaga acaauaaguc gauugcggug cauugugugg caggacuugg ccgagccccu 780

guucuuguag ccaucgcguu gaucgaguac ggacuggacc ccaucaaugc cguagagcau 840

auccgcaagu uucgccgugg ggccaucaac cugcgccagc ucaaguaucu ggagaaguac 900

caaccucggc gucuaga 917

<210> 12

<211> 923

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 12

cucgagugau cgacguggag ggcgcugguc ugagugacau ggucuuugac augugcauga 60

aggcagacau cgaucuacgc acggaguucu ucaagaacgu cgugcugucu ggugguucca 120

gcauguaccc gggucugccc agucgucugg agaaggauau uaagcaaaga uaccucacgg 180

augugcucaa gggcgacaag agucgacuga gcaaguuccg cuugcgcauu aacgacccac 240

cucgucgcaa acaucugguc uuccagggug gcagugucuu ggcugauguc augaaggaca 300

acgacggauc cauugccacg cccgauguga ugcccuuggu gggucgcguu gcucgaauuc 360

uuggcccucg cggcuugaug cccaacccga aguuggggac ggugacgcag gagguuggug 420

acgccaucgc ggcggcgcgu gguggccagg uggaguuucg ugcugagaag aaggguauca 480

uucacgccgg cgugggcaag augagcuucu cggaggaggc acuacuggag aacgugcgug 540

cuuucauggu cgcacucagc gaugccaagc cggaaggcgc aaagggcaag uacauuaagg 600

cugcucaccu gagaucugcu ggaccuuugu gugaugaacc gguauggggc gucgcguuca 660

ucguugaaga cgucguuuuc caugagaaaa gcgacgaugu gucagaugaa gaggcgagca 720

aguacggacc gcuuagcgga cagguaaucu ccacuaugcg gaccacuugc cucauguccu 780

uugugaagca gccugugcgg uuaguagagg ccguguauga gugcacagug cagugucaag 840

ccgagcagcu cggcaaguug uacaguguca ucucgaagcg acgaggcgau aucuacucgg 900

aagaguuguc cgaugggucu aga 923

<210> 13

<211> 916

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 13

cucgagugug gcugguccgu cacucuacca uuucgguauu auugauuucu ugcagcagug 60

guacgacguu ggagaagaag auggagcgcu ucuacagacc uucuucaagc gcaaagaccc 120

cgaagcgucu cugcguuugc cgccgaagcc guauaaguuc cgauuccagc agaagauguc 180

acgcaucuuu gcgcugucga cccacacucg cgccgagaau gacacggcau ucaacccaca 240

auuacccagc gcugaucgau gugcucgacc agggcaauuu cgauacccaa cgccacaaca 300

cggauccaug auggcuaccu gagcuguugc cgauucgucg acgaagcgaa cauugucacu 360

agcucggggg acuccaacug caucuugugg gacgucgaaa guggcgaagu aaagaccaca 420

uuccgcgaac auucgggcga cgucaugucc gugagcauua acccacauaa ccccaguaug 480

uuuauuucgg gcucguguga uucgaccgcc aaggucuggg auaucagaac gggcaagacc 540

acgcacacgu uccagggcca cgagucggau auuaacucgg ucgauuucuu cccgaguggc 600

aacgcagauc uccaagauug cguaugagga cgagcagugc cucgcauuuc acgacgugaa 660

cccgcaagcg cccgugcaca uucugcuuau ccccaagaag cgcgacggac uuacgcagcu 720

cgcgcacgcc gaggagcgcc acgaauccau ccugggccau cugcucuaca cugccaaaca 780

ggucgcuaac cagcagaacu uagacaaggg uuuccguauc guuauuaacg auggggcgga 840

cggcugccag ucgguauucc accuacauuu gcaccuucuu ggagggcgca aguugggcug 900

gcccccuggg ucuaga 916

<210> 14

<211> 920

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 14

cucgagacaa gaagcgugaa ucacuugcau ccaagaucga ugagguagcu cgcaaccaga 60

uuuggcgcga gcagcucaag accgaguaug agauggaaag ugcacugaca ccguuccagc 120

ucaacccgaa gacacuaagc ucgaucacuc uaaagccaac ccagacucac ccagaagacu 180

uugguaaagu acaagaugac cagggaacac gagaucucgc ugcaaagcug cgugaaguga 240

ccaagagacc cacagaaaaa caagcccuac cgaugacaga agcucagcgu gucggguggc 300

uucaggaucc agugaaggcg acaaggagcu cgcccuugag gccacccacg acgucgugac 360

cgaguucccc ucgaccuacg aguuccauua uggucuuuug acccuguccg acgauggcag 420

ugaacccaag augaaugcca aacaggacau cguguccuac aacggugugu cgguggaggc 480

ugacuccucg uccgauguuu ccacggagac uacugaggcc ccgaccacgc agaacgagac 540

cccugccacc cagaacgaga uucccgccac caagacgggc aucgucaaga gcucagaugg 600

uggcugcgag aucuggagug uuacaccgug acuugaagcc aaguaaucua cucaucaauu 660

cagacuguca acucaagauu ugugaucuug gacuggcacg uuccaaggaa gcagacgacg 720

uggggaugac ggaauaugug gugacacgau gguaccgugc gcccgagcug uuguuaggua 780

gugcguaugg cgacggagug gaucucuggg cugcaggaug cauuuucgcc gagaugcugg 840

gacgcaaacc uuuguuuccg ggugagacgu augugcacca acugcaacuc auuaugaacg 900

uguugggugu accgucuaga 920

<210> 15

<211> 918

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 15

cucgagaagu ggcauaucgg cuguccggac ugcugggacg cucagaaaau cgccuccgca 60

cugaaugacu uugucaucug cgucgagaug cugggcuuug ccauugccca ccacuacgcc 120

uucgcgauug aagacuuuuu gucgccguca gguacggcag guguuagugu gccgucuucg 180

aacgucaagg caccacugcu ggccaauuuu auggacgcua ucaacgugac ggacgugucg 240

acagaccuca agaacucccg gaacgagauu cucaccaaga aacaggcgcu ggcugccaag 300

uucggauccc ggcuacaacg gugacacggg cgucauuaac aucggcgugg acgcgaaagc 360

cauuuucaag acgcaaaaca acuuccgucg cuccgaguug gugcagaaca uugcggccaa 420

caccaagggc accacauuuu uucgcaccag cgucaugaag gaggaggcgu ucuugaaccc 480

uuaugcuugg cagaugaucu ucccggaguc gcacaucuuc gagauccgug uggaugccuc 540

ggcuaguccc gcuaagauua ucuaccugaa caacggcacu ugggacgcca agugggagac 600

ugaguucaga ucugacacuc caaggacuaa accgcccuag ggguaacuua acgacauucg 660

cugcggacgc uugugucgug aacaugggua ucauugauau uuugaccccc uggucuuuca 720

agaaaagccu ugaacgcugg gugcgagugc gacuacagug ucgugacgcg aaggggauuu 780

cgugcaugaa acccauuccg uaugcagacc gcuuccgucg uaaugugauu gauacuguca 840

uuuuuggucg ucggcuaggc ucuaagagac gucauccgga aaagcagcaa gaagagucga 900

uuauggugga uuucuaga 918

<210> 16

<211> 911

<212> RNA

<213> Phytophthora infestans

<220>

<221> source

<222> 1..10

<400> 16

cucgagaagc gcaacgucac auugguagug cgucucaaug acaaacagua cgacgagaag 60

aaguuccugu cggcgggcau cgaucacauu gacuugaucu acccggacgg cacaaaugcg 120

ccuaugccga ucuuaaugaa guucauugaa gcuugcgaga agacucccgg agccguggcg 180

gugcacugca aagcugggcu uggacgcaca gguaccugua ucggcgcaua caugaugaag 240

caccacuugu ucucggcuca cgagcucauc ggguggcugc gucugugccg accggguagu 300

gucaggaucc guucgagaaa aucguccugg cgccgaccga agacacggag gaugcugcug 360

ccgugcuggc uagugauauu cguguggaca gucacgacca guggcuggaa aagcuggaga 420

aggccgccgg cgcuggucug gaagagcugc agaagcaaag uauugaagcc ggcaagaagg 480

cggagcaggc agcagucgcg cgucgcgcug ccgcugaucg ccguaaacgu gaagagaagg 540

acgugagcuc caagcaccug cagaacuucu ucaacaaccu gcucagccgg ccugagaaga 600

ccagaucuau guucgcagau ucgccuccag acgcucugga uuuacugcag aagaugcugg 660

ugauugaccc gaauaagcgg auuagugugg acgaggcgcu ggcccauccg uacuuggcug 720

cgauccggaa uguggaggac gagacgaccg ccacuucgag cuucgauuuu gacuuugaga 780

acgagaaauu gacgaaaccc gugcugcaga gacugaucug ggacgagaug aggcauuucc 840

acccugaagu gggcgacgag acagcgacgg agggagauga cagcaguguc gcuaccacgc 900

aggcuucuag a 911

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярной биологии, фитопатологии и сельского хозяйства и направлено на разработку эффективного средства биологической защиты растений от инфекции оомицетом Phytophthora infestans по механизму РНК интерференции (РНКи). В заявленном изобретении раскрыт комплекс 24 генов-мишеней: 12 генов домашнего хозяйства и 12 генов белков-эффекторов Phytophthora infestans, которые могут быть использованы в качестве мишеней для ингибирования экспрессии по механизму РНКи, на основе скомбинированных последовательностей которых in vitro синтезированы 8 вариантов дцРНК. Опрыскивание листьев растений картофеля водным раствором композиции, содержащей комплекс синтезированных дцРНК, приводит к ингибированию размножения Phytophthora infestans. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Синтезированная молекула дцРНК для сайленсинга по меньшей мере одного гена Phytophtora infestans путем PHK-интерференции, отличающаяся тем, что является фрагментом длиной 300-1000 п.н. от полноразмерной дцРНК, последовательность которой выбрана из списка SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 16.

2. Способ защиты растений от Phytophtora infestans путем РНК-интерференции, включающий приведение поверхности листа растения и водного раствора дцРНК в контакт друг с другом посредством опрыскивания, отличающийся тем, что дцРНК имеет длину приблизительно 300-1000 п.н. и является фрагментом полноразмерной дцРНК, последовательность которой выбрана из списка SEQ ID NO: 9 - SEQ ID NO: 16.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что включает следующие операции:

а) получение по меньшей мере одной экспрессирующей конструкции, в состав которой включена ДНК, кодирующая фрагменты последовательностей генов, выбранных из одной из следующих групп:

PITG_07996, PITG_06995, PITG_08082;

PITG_18244, PITG_04843, PITG_00051;

PITG_00262, PITG_11110, PITG_05251;

PITG_09284, PITG_12193, PITG_05058;

PITG_00460, PITG_06376, PITG_21011;

PITG_03162, PITG_01132, PITG_07274;

PITG_08393, PITG_01131, PITG_05519;

PITG_18578, PITG_01997, PITG_10447;

б) получение с использованием указанной конструкции in vitro препарата дцРНК;

в) приведение поверхности листа растения и водного раствора указанной дцРНК в контакт друг с другом посредством опрыскивания растения.

4. Способ по п. 2, отличающийся тем, что последовательность ДНК в составе экспрессирующей конструкции выбрана из списка SEQ ID NO: 1 - SEQ ID NO: 8.