Рекомбинантная плазмида L4440, обеспечивающая синтез двуцепочечной РНК, комплементарной фрагменту матричной РНК гена inf4 Phytophthora infestans Российский патент 2024 года по МПК C12N15/09 C12N15/80 

Изобретение относится к биотехнологической области, в частности к генетической инженерии, и предназначено для биосинтеза двуцепочечной рибонуклеиновой кислоты (дцРНК), комплементарной фрагменту гена-элиситина inf4 фитофторы Phytophthora infestans. Полученная дцРНК способна посредством РНК-интерференции вызывать сайленсинг этого гена, что приводит к снижению патогенности фитофторы и, как следствие, снижению заболеваемости сельскохозяйственных растений фитофторозом. Ген inf4 отвечает за наработку белка, который активно секретируется гаусторией фитофторы в процессе колонизации пасленовых, и, по-видимому, отвечает за транспорт стеролов из растения-хозяина [1]. Так как самостоятельный синтез стеролов у фитофторы отсутствует, выключение этого способа получения стерола приводит к ингибированию колонизации растения и, как следствие, снижению патогенности.

Методы РНК-интерференции являются мощным инструментом для защиты сельскохозяйственных растений от патогенов, причем дцРНК может быть как эндогенного происхождения, так и синтезироваться экзогенно. Преимуществом первого способа является относительная дешевизна и скорость - достаточно один раз получить трансгенное растение, несущее фрагмент, комплементарный гену-мишени, и полученная из него линия будет устойчива к патогену. Однако с учетом законодательства РФ такие линии запрещены для продовольственных целей. Методы защиты растений с использованием экзогенно синтезированной дцРНК разрешены с законодательной точки зрения, но дороже, так как требуют постоянного производства больших количеств дцРНК и регулярных обработок растений.

Получение экзогенной дцРНК для сайленсинга генов с помощью РНК-интерференции возможно с помощью специальных приборов и в системе in vivo, которая включает в себя вектор L4440, содержащий все необходимые элементы для синтеза дцРНК, а также штамм E. coli HT115, который является дефицитным по РНКазе III и, таким образом, позволяет накапливать синтезированную в бактериальной клетке дцРНК.

Так, на основе этой системы разработан подход для защиты растений табака (Nicotiana tabacum) от насекомого-вредителя хлопковой совки (Helicoverpa armigera) [1], который является прототипом к настоящему изобретению. Была получена рекомбинантная плазмида L4440, содержащая фрагмент, комплементарный участку одного из генов совки, HaHR3, ответственного за линьку. Трансформация штамма E. coli HT115 этой рекомбинантной плазмидой позволила получить большие количества соответствующей дцРНК, которой обрабатывали растения. Гусеницы совки потребляли экзогенную дцРНК вместе с растительными тканями, вследствие чего посредством механизма РНК-интерференции фрагменты дцРНК выключали ген HaHR3. Показан существенный защитный эффект предлагаемого метода защиты табака от хлопковой совки.

В настоящее время не описано ни одного способа защиты сельскохозяйственных растений от грибковых заболеваний, в частности, от фитофтороза, с помощью подходов на основе РНК-интерференции в целом и экзогенно синтезированной дцРНК в частности. Все имеющиеся работы относятся к защите растений от насекомых-фитофагов. Задачей настоящего изобретения является синтез экзогенной дцРНК, комплементарной фрагменту гена-элиситина inf4 фитофторы, которая посредством РНК-интерференции избирательно приведет к сайленсингу данного гена, не влияя на экспрессию генов, в том числе, генов растений. Ген inf4 отвечает за наработку белка, который активно секретируется гаусторией фитофторы в процессе колонизации пасленовых, и, по-видимому, отвечает за транспорт стеролов из растения-хозяина. Так как самостоятельный синтез стеролов у фитофторы отсутствует, выключение этого способа получения стерола приводит к ингибированию колонизации растения и, как следствие, снижению патогенности.

Техническим результатом, достигаемым за счет реализации настоящего изобретения, является защита сельскохозяйственных растений семейства пасленовые (картофель, томат, баклажан, перец, табак) от фитофтороза.

Технический результат достигается созданием рекомбинантной плазмиды L4440, обеспечивающей синтез двуцепочечной РНК, комплементарной фрагменту матричной РНК гена inf4 Phytophthora infestans SEQ ID NO: 1, имеющей размер 3182 п.о. и состоящей из следующих элементов:

а) T7 promotor - последовательность позднего промотора бактериофага T7: 1 - 19 п.о.;

б) Inf4 - участок ДНК, комплементарный матричной РНК гена inf4 P. infestans: 108-518 п.о.;

в) T7 promotor - последовательность, комплементарная позднему промотору бактериофага T7: 586 - 604 п.о.;

г) f1 ori - точка начала репликации бактериофага f1: 772-1227;

д) Amp(R) - ген Amp, обеспечивающий устойчивость к ампициллину: 1253-2218 п.о.;

е) ori - бактериальная точка начала репликации pUC: 2389-2997 п.о.

Для достижения технического результата необходимо трансформировать штамм E. coli HT115, предлагаемой рекомбинантной плазмидой на основе вектора L4440 SEQ ID NO: 1, а затем индуцировать синтез дцРНК в бактериальных клетках. Далее суспензия бактерий лизируется и производится выделение сначала суммарной фракции нуклеиновых кислот, а затем выделение целевой дцРНК. Полученный препарат дцРНК разводится до требуемой концентрации и затем наносится на нижние листья растений картофеля, так как именно они являются наиболее уязвимыми для фитофторы. Спустя 5 суток проявляется достоверный защитный эффект против фитофтороза.

Пример 1

Для наработки ночной культуры уколом производился посев бактерий E. coli HT115, содержащих рекомбинантную плазмиду L4440 с фрагментом гена-элистина inf4, в 5 мл питательной среды LB. Спустя 16 ч инкубации при температуре 37 °C свежую ночную культуру перенесли в 50 мл среды LB с ампициллином (100 мкг/мл) и тетрациклином (10 мкг/мл) и инкубировали при 37 °C и непрерывном перемешивании 200 об/мин до OD600 = 0.5. Для индукции наработки дцРНК в культуру на данном этапе добавлялся IPTG до концентрации 0,6 мМ, после чего суспензию оставляли расти при тех же условиях на 4 ч.

Затем 50 мл культуры бактерий осадили на центрифуге (5 мин, 5000 g) и ресуспендировали в 5 мл смеси 1:1 1 М ацетата аммония и 10 мМ изоамилацетата. К суспензии добавили 5 мл смеси 25:24:1 фенола, хлороформа, изоамилацетата, после чего инкубировали 30 мин при 65 °C, время от времени перемешивая. Далее смесь центрифугировали 20 мин при 4 °C и 12000 g, водную фазу отбирали, добавляли эквивалентный объем изопропанола и оставляли на ночь при температуре -20 °C. На следующий день смесь центрифугировали 10 мин при 4 °C 12000 g, и дважды проводили отмывку полученного осадка 70% этанолом с последующим центрифугированием в течением 2,5 мин при 4 °C 12000 g. Осадок сушили при 37 °C до полного удаления спирта и растворяли в 100 мкл воды, очищенной от РНКаз. Далее производилась обработка ДНКазой (Thermo Fisher, USA) и затем РНКазой А (Sigma, Germany). Обработка ДНКазой производилась по инструкции производителя, РНКазой А - в 0.3 М р-ре NaCl, чтобы исключить гидролиз дцРНК. Из реакционной смеси дцРНК экстрагировалась смесью фенол/хлороформ/изоамилацетат с последующим переосаждением изопропанолом и двукратной отмывкой этанолом по стандартному протоколу.

Растения картофеля сорта Никулинский возрастом 1 месяц обрабатывались очищенной дцРНК концентрацией 100 нг/мкл. Нанесение производилось микропипеткой по 5 мкг на растение. ДцРНК распределялась по нижним листьям (по 5 мкл на лист, 10 листьев на растение) или вносилась в питательную среду (50 мкл по 100 нг/мкл). В качестве контроля использовалась дистиллированная вода. Через сутки после обработки растений дцРНК производилось заражение зооспорами фитофторой. Оценка поражения производилась спустя 5 суток.

Для статистической обработки каждому листу был присвоен ранг в зависимости от площади поражения, где 9 - полностью здоровый, а 1 - целиком пораженный лист.

Результаты, подтверждающие защитный эффект предлагаемого способа против фитофтороза, представлены на рис. 1 и рис. 2.

На рис. 1 представлены визуальные различия между обработанными (вода или дцРНК) и здоровыми растениями.

Рис. 2 демонстрирует эффективность защиты картофеля от фитофтороза при обработке дцРНК. Над столбцами указано p-value теста Стьюдента при сравнении с водой. Погрешность - стандартная ошибка среднего. Статистическая обработка выполнена на 10 листьях одного растения.

Таким образом, можно сделать вывод о том, что продукт в виде дцРНК, полученный с помощью описанного технического решения - рекомбинантной плазмиды, достоверно снижает патогенность фитофторы для растений картофеля сорта Никулинский.

Список литературы

1. Wang, S., Welsh, L., Thorpe, P., Whisson, S.C., Boevink, P.C., & Birch, P. R. J. (2018). The Phytophthora infestans Haustorium Is a Site for Secretion of Diverse Classes of Infection-Associated Proteins. https://doi.org/10.1128/mBio.01216-18

--->

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="L4440 + inf4.xml"

softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"

productionDate="2023-08-30">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>1</ApplicationNumberText>

<FilingDate></FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">Федеральное государственное

бюджетное научное учреждение «Федеральный исследовательский центр

Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской

академии наук» (ИЦиГ СО РАН)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>Institute of Cytology and Genetics, Siberian

Branch of Russian Academy of Sciences</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Рекомбинантная плазмида для

снижения патогенности Phytophthora infestans через сайленсинга гена

inf4</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>1</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>3182</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..3182</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>Escherichia coli</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>taatacgactcactatagggagaccggcagatctgatatcatcgatgaa

ttcgagctccaccgcggtggcggccgctctagaactagtggatccaccggttccatggtatgggattgca

gacatgccgagcttaaagcctcttacagtcagaagagaaatcgtgcgccattttgtagacgttggtctta

aggccgctcgtgggaacagttagtgtgcagttcggtgggttgagagcgatgatcttcttgatcatggact

tgcaagaggaggacttgcacatggccttcttctccttgggccgtggtagcgttttggacgtgatcatcga

gtagcccgaatccttggagcacgtggagaatgaggcttcggatagaaggctcacgagtgtattgtaagca

gcagtttgttgttttgccgtgcacgctgcggcgttagtggatccaacgagaacggcgacggtgacagcga

tcagggcaacgaagttcatgttaagaatgtgctggatgaagtggttgtctgcaggaattcgatatcaagc

ttatcgataccgtcgacctcgagggggggcccggtacccaattcgccctatagtgagtcgtattacgcgc

gctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgc

agcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttg

cgcagcctgaatggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgc

gcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgc

cacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgcttta

cggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacgg

tttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacact

caaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaat

gagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgcttacaatttaggtggcacttt

tcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatg

agacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtg

tcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagt

aaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatc

cttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcgg

tattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggt

tgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgcc

ataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccg

cttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccat

accaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggc

gaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccac

ttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcg

cggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagt

caggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaac

tgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatcta

ggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtca

gaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaa

caaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggt

aactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttc

aagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcg

ataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaac

ggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgag

ctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaa

caggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgcca

cctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaac

gcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgc

gttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccga

acgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcaacctggcttatcgaaat</INSDSeq_sequenc

e>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к генетической инженерии, и представляет собой рекомбинантную плазмиду L4440, обеспечивающую синтез двуцепочечной РНК, комплементарной фрагменту матричной РНК гена inf4 Phytophthora infestans SEQ ID NO: 1, имеющей размер 3182 п.о., и состоящую из следующих элементов: а) T7 promotor - последовательность позднего промотора бактериофага T7: 1-19 п.о.; б) Inf4 - участок ДНК, комплементарный матричной РНК гена inf4 P. infestans: 108-518 п.о.; в) T7 promotor - последовательность, комплементарная позднему промотору бактериофага T7: 586-604 п.о.; г) f1 ori - точка начала репликации бактериофага f1: 772-1227; д) Amp(R) - ген Amp, обеспечивающий устойчивость к ампициллину: 1253-2218 п.о.; е) ori - бактериальная точка начала репликации pUC: 2389-2997 п.о. Изобретение обеспечивает защиту сельскохозяйственных растений семейства пасленовые от фитофтороза. 2 ил., 1 пр.

Рекомбинантная плазмида L4440, обеспечивающая синтез двуцепочечной РНК, комплементарной фрагменту матричной РНК гена inf4 Phytophthora infestans SEQ ID NO: 1, имеющая размер 3182 п.о. и состоящая из следующих элементов:

а) T7 promotor - последовательность позднего промотора бактериофага T7: 1-19 п.о.;

б) Inf4 - участок ДНК, комплементарный матричной РНК гена inf4 P. infestans: 108-518 п.о.;

в) T7 promotor - последовательность, комплементарная позднему промотору бактериофага T7: 586-604 п.о.;

г) f1 ori - точка начала репликации бактериофага f1: 772-1227;

д) Amp(R) - ген Amp, обеспечивающий устойчивость к ампициллину: 1253-2218 п.о.;

е) ori - бактериальная точка начала репликации pUC: 2389-2997 п.о.