Область техники
Изобретение относится к области техники отделения клеток. Более конкретно, оно относится к способу отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин.
Уровень техники
Трехуровневая система предбеременной, пренатальной и неонатальной профилактики и контроля является одним из важных средств снижения врожденных дефектов и улучшения качества населения, среди которых наиболее сложным и трудным звеном является пренатальный скрининг и диагностика.
На данный момент амниоцентез или пункция пупочной вены, используемые для пренатальной диагностики, а также неинвазивные способы пренатального скрининга, такие как бесклеточное секвенирование нуклеиновых кислот плода, имеют различные недостатки; амниоцентез или пункция пупочной вены создают высокий риск инфекции и выкидыша, время анализа длительное, элементы и объем обнаружения ограничены, а время диагностики ограничивается вторым и третьим триместром беременности, приемлемость у беременных женщин низкая, что не способствует клиническому лечению. Диапазон обнаружения технологии бесклеточного секвенирования нуклеиновых кислот плода является чрезвычайно ограниченным, и можно обнаружить только 3-5 определенных хромосомных плоидий. Неизбежны ложноположительные и ложноотрицательные результаты. Возможности выявления распространенных мутаций недостаточны, а также существуют такие проблемы, как индивидуальные различия в содержании свободных нуклеиновых кислот плода в материнской крови.
Патентная заявка заявителя CN111304153A раскрывает способ отделения клеток трофобласта. В этом способе клетки плацентарного трофобласта отделяют и очищают из клеточной суспензии образца плацентарного трофобласта путем определения специфических антигенов, экспрессируемых на поверхности клеток трофобласта, и с использованием технологии иммуномагнитных шариков с соответствующими специфическими антителами. По сравнению с традиционным амниоцентезом и пункцией ворсин хориона данный способ имеет преимущества неинвазивности, более раннего времени взятия пробы, более низкого риска инфекции и выкидыша, а результаты теста имеют аналогичную надежность. С другой стороны, есть еще возможности для совершенствования этой технологии. Описанные применимые комбинации антител ограничены, и необходимо улучшить точность и специфичность. Группа заявителей постоянно проводит исследования и разработки в рамках данного проекта.
Сущность изобретения
Целью настоящего изобретения является создание способа отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин, основанного на разделении проточной цитометрией или микрофлюидной технологии, который не только преодолевает проблемы и недостатки традиционных способов, но также одновременно реализует мечение, идентификацию и сортировку большего количества антигенов и характерных флуоресцентных сигналов, что значительно повышает точность, а специфичность лучше, чем у предыдущего способа иммуномагнитных шариков. Кроме того, способ имеет преимущество, заключающееся в том, что учитывается количество и качество клеток. Можно получить большое количество клеток с хорошей специфичностью и чувствительностью.
Вышеупомянутая цель настоящего изобретения достигается за счет следующих технических решений:
Способ отделения клеток трофобласта, включающий следующие этапы:
(1) Приготовить образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца;
(2) Добавить специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации;
Специфическое антитело представляет собой комбинацию антител, соответствующую специфическим антигенам, экспрессированным на поверхности клеток трофобласта или внутриклеточно; предпочтительно комбинация специфических антител представляет собой HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β-HCG, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31+CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G или HLA-G+CDH5+CD31;
(3) Использовать проточный цитометр для сортировки клеточной ресуспендированной жидкости, инкубированной на этапе (2), для получения отделенных и очищенных клеток плацентарного трофобласта;
либо с помощью микрожидкостного сортировочного чипа клеточную ресуспендированную жидкость, инкубированную на этапе (2), подвергнуть сортировке микрожидкостных клеток с флуоресцентным мечением, чтобы получить отделенные и очищенные клетки плацентарного трофобласта.
Предпочтительно структура микрожидкостного сортировочного чипа, используемого на этапе (3), является следующей: включает подложку и прикрепленную к ней крышку; выбран, помимо прочего, акрил, в качестве основного материала, изготавливаемого по технологии литья под давлением;
Одна сторона подложки снабжена основным каналом, боковым каналом А и боковым каналом В, при этом два боковых канала соответствуют левому и правому концам вблизи основного канала соответственно;
Другая сторона подложки снабжена входом C, входом S, выходом N и выходом T; все четыре отверстия проходят через другую сторону подложки и соединяются с каналами; при этом положение входа C соответствует левому концу основного канала, положение входа S соответствует концу бокового канала A, положение выхода N соответствует правому концу основного канала, а положение выхода T соответствует концу бокового канала B;
В основном канале, в месте стыка выхода Н и выхода Т, также расположено устройство отклоняющего электрода.
Предпочтительно ширина всех основных каналов, боковых каналов А и боковых каналов В составляет не более 1000 мкм, а глубина – не более чем 500 мкм.
Более предпочтительно, чтобы ширина всех основных каналов, бокового канала А и бокового канала В составляла 500-1000 мкм.
Более предпочтительно, чтобы ширина всех основных каналов, боковых каналов А и боковых каналов В составляла 1000 мкм.
В микрожидкостном сортировочном чипе вход C может быть направлен к образцу смешанных клеток для сортировки, вход S может быть направлен к буферному раствору, выход T предназначен для сбора целевых клеток, а выход N — для сбора нецелевых клеток.
В процессе сортировки смешанный образец, содержащий целевые клетки, поступает в основной канал чипа от входа C, а буферный раствор поступает в канал со стороны чипа на входе S. После смешивания на пересечении каналов оба продолжают течь в одном направлении вдоль основного канала. Когда смешанные клетки проходят через устройство отклоняющего электрода, канал, в который собираются поступать клетки, выбирается путем контролирования открытия и закрытия электродов; целевые клетки сортируются и достигают выхода T, в то время как нецелевые клетки продолжают достигать выхода N по основному каналу, и сортировка завершается.
Кроме того, предпочтительные условия инкубации первичных антител на этапе (2): реакция при 4°C в течение 30-90 мин, предпочтительно 4°C, 60 мин, а условия инкубации комплекса вторичных антител-флуоресцентных меток: реакция при 2°С-8°С в течение 20 мин.
Предпочтительно конкретный способ этапа (2) заключается в следующем: посредством инкубации комплекс первичных антител, вторичных антител-флуоресцентных меток последовательно специфически связывается с целевым антигеном, во избежание перекрестного загрязнения используются промежуточные способы промывки и центрифугирования.
Предпочтительно конкретный способ этапа (3) заключается в следующем: инкубированную клеточную ресуспендированную жидкость пропускают через вход С микрожидкостного сортировочного чипа и пропускают в буферный раствор через вход S; затем помещают микрожидкостный сортировочный чип в сортировщик клеток и запускают программу сортировки. После завершения программы собирают образцы из выхода Т для получения отсортированных клеток трофобласта.
Предпочтительно жидкофазная система для сортировки клеток на этапе (3) представляет собой 0,2%-0,4% Triton-X-100, предпочтительно 0,3% Triton-X-100. Более предпочтительно с использованием PBS.
Предпочтительно условия для сортировки с помощью проточного цитометра на этапе (3): регулирование скорости загрузки образца на уровне 1000-2000 событий/секунда и коэффициента сбора – 5,0.
Предпочтительно оптимальной системой клеточной суспензии на этапе (1) является 1xPBS, содержащий 0,2%-0,4% FBS, предпочтительно 1xPBS, содержащий 0,3% FBS.
Кроме того, способ используется в конструировании продуктов для идентификации STR человека, обнаружения плоидности хромосом человека, обнаружения гена талассемии, обнаружения гена глухоты, секвенирования всего экзомного гена, обнаружения микроделеций/дупликаций хромосом (способ высокопроизводительного секвенирования) или обнаружения структурных вариаций хромосом (способ чипов высокой плотности), а также должен подпадать под объем защиты настоящего изобретения.
Настоящее изобретение имеет следующие положительные эффекты:
По сравнению с традиционным амниоцентезом и пункцией ворсин хориона способ отделения клеток плацентарного трофобласта, основанный на проточной цитометрии или микрофлюидной технологии, предлагаемый настоящим изобретением, имеет преимущества неинвазивного сбора образцов, более раннего времени взятия пробы, низкого риска инфицирования и выкидыша, а результаты тестирования, в свою очередь, имеют более высокую надежность и более широкий охват. С помощью данного типа образцов можно получить полный образец нуклеиновой кислоты генома плода, что позволяет обнаруживать и анализировать все наследственные заболевания и, в основном, реализовать охват обнаружения генетических заболеваний (от хромосомной плоидности, структурных вариаций хромосом CNV, митохондрий, микроделеций/дупликаций, мутаций одного гена, теста генетических характеристик SNP/STR и т. д.).
Способ по настоящему изобретению позволяет получить значительное количество клеток (тысячи клеток, а минимальный стандарт контроля качества составляет >2000 положительных клеток) и реализовать использование обычной технологии молекулярного тестирования для контроля образцов без специальных операций. Требования к техническим специалистам и лабораторному оборудованию не высоки, что снижает технический порог и стоимость использования, его можно проводить в большем количестве медицинских учреждений и широко распространять.
В то же время способ, предлагаемый изобретением, представляет собой схему скрининга, которая может быть основана на параллельном использовании нескольких меток, что позволяет реализовать синхронное мечение большего количества антигенов, а также распознавание и сортировку характерных флуоресцентных сигналов одновременно, при этом точность значительно повышается. По сравнению с существующим методом магнитных шариков и другими технологиями способ имеет преимущество, заключающееся в том, что учитывается количество и качество клеток. Полученные клетки не только многочисленны, но также имеют мало клеточных повреждений. Полученные клетки имеют отличное качество, хорошую специфичность обнаружения и чувствительность.
Описание чертежей
Фиг. 1 представляет собой схематическую диаграмму структуры подложки микрожидкостного сортировочного чипа, на фиг.(a) и (b) показаны две стороны подложки соответственно.
На фиг. 2 показана популяция клеток с положительной флуоресцентной меткой, выбранная при сортировке с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 3 показана популяция клеток с двойной флуоресцентной меткой, выбранная при сортировке с помощью проточной цитометрии.
На фиг. 4 показан канал 1, отмеченный FAM, «822-» – оставшиеся образцы после сортировки, «822+» – отсортированные образцы, а «822» – образцы до сортировки.
На фиг. 5 показан канал 2 с маркировкой HEX.
На рис. 6 показан канал 3 с маркировкой TAMRA.
На рис. 7 показан канал 4 с маркировкой ROX.
Фиг. 8 представляет собой схематическую диаграмму результатов обнаружения Y-STR на образцах, содержащих Y-хромосомы в отсортированных клетках синцитиотрофобласта.
На фиг. 9 представлены результаты обнаружения гена глухоты отсортированных образцов.
На фиг. 10 представлены результаты обнаружения гена талассемии отсортированных образцов.
На фиг. 11 представлена родословная карта выявления носителей патогенных мутаций в семьях.
Фиг. 12 представляет собой схематическую диаграмму всех хромосом.
Фиг. 13 представляет собой схематическую диаграмму аномальных хромосом.
Фиг.14 представляет собой фотографию положительных клеток, отсортированных по способу настоящего изобретения.
Фиг.15 представляет собой сравнительную фотографию положительных и отрицательных клеток до и после сортировки по способу настоящего изобретения.
Фиг. 16 представляет собой фотографию положительных клеток, отсортированных способом контрольных магнитных шариков.
Конкретные способы осуществления
Изобретение дополнительно описано ниже в сочетании с конкретными вариантами осуществления, однако варианты осуществления ни в какой форме не ограничивают настоящее изобретение. Если не указано иное, реагенты, способы и оборудование, используемые в настоящем изобретении, являются обычными реагентами, способами и оборудованием в области техники.
Если не указано иное, реагенты и материалы, используемые в следующих примерах, являются коммерчески доступными.
Пример осуществления 1. Конструкция микрожидкостного сортировочного чипа.
Схематическая диаграмма микрожидкостного сортировочного чипа, используемого для отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин, показана на фиг. 1.
Конструктивный дизайн микрожидкостного сортировочного чипа описывается следующим образом: в качестве основного материала чипа, помимо прочего, выбран акрил, а форма трубы, представленная на фиг. 1, формируется на одной стороне подложки с помощью технологии литья под давлением. Ширина трубы не должна превышать 1000 мкм, а глубина не должна быть более 500 мкм, при этом другая сторона подложки должна использоваться для склеивания, чтобы сформировать цельный чип.
В частности, микрожидкостный сортировочный чип включает в себя подложку и прикрепленную к ней крышку;
Как показано на фиг. 1, одна сторона подложки снабжена основным каналом, боковым каналом А и боковым каналом В, при этом два боковых канала расположены вблизи левого и правого конца основного канала соответственно; ширина всех каналов составляет 1000 мкм;
Другая сторона подложки снабжена входом C (входное отверстие для образца клеток), входом S (входное отверстие буферного раствора), выходом N (отверстие для хранения нецелевых клеток) и выходом T (отверстие для хранения целевых клеток). Все четыре отверстия проходят через другую сторону подложки и соединяются с каналами, при этом положение входа С соответствует левому концу основного канала, положение входа S соответствует концу А бокового канала, положение выхода N соответствует правому концу основного канала, а положение выхода T соответствует концу бокового канала B;
Вход C может быть направлен к образцу смешанных клеток для сортировки, вход S может быть направлен к буферному раствору, выход T предназначен для сбора целевых клеток, а выход N — для сбора нецелевых клеток.
Кроме того, основной канал также снабжен устройством отклоняющего электрода для сортировки клеток, а конкретное положение устройства отклоняющего электрода находится в месте стыка выхода N и выхода T; электроды можно включать и выключать в зависимости от наличия или отсутствия сигналов проточной кюветы. Отрицательно заряженные клетки отклоняются в электромагнитном поле, создаваемом электродами, и попадают в обозначенные каналы, ведущие либо к выходу N, либо к выходу T.
В процессе сортировки смешанный образец, содержащий целевые клетки, поступает в основной канал чипа от входа C, а буферный раствор поступает в канал со стороны чипа на входе S. После смешивания на пересечении каналов оба продолжают течь в одном направлении вдоль основного канала. Когда смешанные клетки проходят через устройство отклоняющего электрода, канал, в который собираются поступать клетки, выбирается путем контролирования открытия и закрытия электродов; целевые клетки сортируются и достигают выхода T, в то время как нецелевые клетки продолжают достигать выхода N по основному каналу, и сортировка завершается.
После сортировки чип сразу выбрасывается. Перед каждой сортировкой чип необходимо заменять, чтобы убедиться, что среда сортировки чистая, контролируемая и свободная от перекрестного загрязнения.
Пример осуществления 2. Отделение и скрининг клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин на основе микрожидкостных сортирующих чипов.
1. Способ сортировки клеток трофобласта включает следующие этапы:
1. Приготовить образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца, конкретные способы включают (1)-(5) ниже;
2. Добавить специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации; конкретные способы включают (6)-(14) ниже;
3. С помощью микрожидкостного сортировочного чипа из примера осуществления 1, клеточную ресуспендированную жидкость, инкубированную на этапе 2, подвергнуть сортировке микрожидкостных клеток с флуоресцентным мечением, конкретные способы включают (15)-(18) ниже.
Среди них комбинация специфических антител представлена в таблице 1:
Таблица 1: Комбинации антигенов и антител, экспрессированных на клетках трофобласта
LIR2/ILT4,
p49/KIR2DL4,
BY55
2. В частности, способ сортировки клеток трофобласта включает следующие этапы:
(1) Смешать клеточный консервационный раствор (отслоившиеся клетки шейки матки) в шейкере в течение 5 минут;
(2) Извлечь консервационный раствор и поместить его в центрифужную пробирку на 15 мл, добавить 3 мл 1×PBS во флакон с консервационным раствором, встряхнуть и хорошо перемешать, извлечь и поместить в центрифужную пробирку на 15 мл;
(3) Центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 мин, удалить супернатант;
(4) Добавить 1 мл 1×PBST, хорошо перемешать и перенести в пробирку на 1,5 мл EP, центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут и удалить супернатант;
(5) Повторить этап 4 дважды, чтобы приготовить клеточную суспензию;
(6) Добавить 200 мкл 0,3% Triton X-100, хорошо перемешать и дать пермеабилизироваться при комнатной температуре в течение 20 минут;
(7) Повторить этап 4 три раза;
(8) Добавить первичные антитела: добавить мышиное моноклональное антитело против человеческого CK7, мышиное моноклональное антитело против человеческого CK18, мышиное моноклональное антитело против человеческого β-HCG, мышиное моноклональное антитело против человеческого MMP9, мышиное моноклональное антитело против человеческого CDH5, мышиное моноклональное антитело против человеческого P, мышиное моноклональное антитело против человеческого hPL, кроличье моноклональное антитело против человеческого HLA-G, кроличье моноклональное антитело против человеческого CD31 (компания abcam) 200 мкл, разведенные в соответствии с пропорцией, хорошо перемешать, инкубация 60 мин при 4°С;
(9) Повторить этап 4 три раза;
(10) Добавить комплекс вторичное антитело-флуоресцентная метка: добавить 200 мкл козьих антикроличьих и козьих антимышиных антител, разведенных в пропорции, после смешивания, инкубация 60 мин при 37°С;
(11) Повторить этап 4 три раза и ресуспендировать с 200 мкл буферного раствора (DPBS + 0,1% BSA + 2 мМ EDTA);
(12) 20-минутная реакция при 2°C-8°C;
(13) Добавить 1 мл 1×PBST, хорошо перемешать и перенести в пробирку на 1,5 мл EP, центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут и удалить супернатант;
(14) Повторить этап (13) два-три раза, добавить 200 мкл 1×PBST для ресуспендирования и получить клеточную ресуспендированную жидкость;
(15) Пропустить полученную клеточную ресуспендированную жидкость через вход C микрожидкостного сортировочного чипа из Примера 1 и пропустить 1×PBST через вход S;
(16) Поместить микрожидкостный чип на платформу сортировщика клеток, чтобы зафиксировать его, включить питание, установить указанную программу и запустить;
(17) После процедуры собрать образцы из выхода Т для получения отсортированных клеток трофобласта.
(18) Собрать образцы из выхода N, которые представляют собой оставшиеся клетки отслоившихся клеток шейки матки после удаления клеток трофобласта.
Пример осуществления 3 Способ отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин на основе проточной цитометрии
Способ сортировки клеток трофобласта включает следующие этапы:
1. Приготовить образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца, конкретный способ показан в (1)-(5) примера осуществления 2;
2. Добавить специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации, конкретный способ показан в (6)-(14) примера осуществления 2; комбинация специфических антител представлена в Таблице 1 выше;
3. С помощью проточного цитометрического сортировщика (BDFACSAria II, США) выполнить сортировку клеток, ресуспендированных после инкубации на этапе 2, путем флуоресцентного мечения, включая следующие этапы:
1) Включить проточный цитометр и следовать инструкциям по ежедневному запуску;
2) Отрегулировать поток жидкости прибора так, чтобы точка излома потока жидкости находилась в средней и верхней части окна;
3) Отрегулировать путь сортировочной жидкости, подтвердить задержку капель и отрегулировать скорость загрузки образца до 1000-2000 событий/сек;
4) Выбрать проточную трубку объемом 5 мл в качестве устройства для сбора, выбрать 3000 для количества отсортированных клеток, направление слева, добавить популяцию клеток для сортировки, по очереди установить затворы и поместить в пробирку для сбора;
5) Поместить инкубированную клеточную суспензию в камеру для образцов, установить скорость сбора на 5,0 и загрузить образец;
6) Отрегулировать напряжение в диапазоне 300-500В, чтобы минимизировать компенсацию между флуоресцентными красителями, отрегулировать положение затворов так, чтобы положительные ячейки находились в центре, собрать ячейки в затворах; клетки в пробирке для сбора являются выбранными целевыми клетками.
Популяции целевых клеток получают в соответствии с заданной комбинацией маркеров, как показано на фиг. 2 и фиг. 3. Фиг. 2 представляет собой результат сортировки одинарных флуоресцентных меток, а фиг. 3 — результат сортировки двойных флуоресцентных меток.
Пример осуществления 4. Пример применения способа: идентификация STR человека.
1. В соответствии со способом примера 2 выше клетки трофобласта сортируют и отделяют для образца (отслоившиеся клетки шейки матки).
2. ДНК извлекают из отделенных клеток трофобласта и отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин:
1) Отсортированные клетки трофобласта (клетки трофобласта, полученные на этапе 17 сортировки клеток по способу примера осуществления 2) и клетки, полученные на этапе 18 сортировки клеток по способу примера осуществления 2 (оставшиеся клетки трофобласта, удаленные из отслоившихся клеток шейки матки) отделяют и центрифугируют при 12000 об/мин в течение 3 мин.
2) Удалить супернатант и добавить 200 мкл раствора P, чтобы ресуспендировать осадок.
3) Добавить 20 мкл протеиназы К и 200 мкл раствора L и хорошо перемешать.
4) Инкубировать при 56°С в течение 20 мин, перевернуть и перемешать.
5) Добавить 200 мкл абсолютного этанола, хорошо перемешать, перенести на адсорбционную колонну, центрифугировать при 10 000 об/мин в течение 1 мин и слить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
6) Добавить 500 мкл W1, центрифугировать при 10000 об/мин в течение 1 мин и слить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
7) Добавить 500 мкл W2, центрифугировать при 10000 об/мин в течение 1 мин и слить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
8) Добавить 500 мкл W2, центрифугировать при 10000 об/мин в течение 1 мин и удалить отработанную жидкость в пробирку для сбора.
9) Центрифугировать пустую пробирку при 12000 об/мин в течение 3 минут и выбросить пробирку для сбора.
10) Поместить адсорбционную колонну в новую центрифужную пробирку на 1,5 мл, откыть крышку и дать постоять 2 минуты, добавить 50 мкл ТЕ и после отстаивания в течение 5 минут центрифугировать при 12000 об/мин в течение 2 минут и выбросить колонну.
11) Определить концентрацию и чистоту извлеченной ДНК.
3. После извлечения ДНК из отделенных клеток трофобласта и отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин проводят ПЦР-амплификацию с помощью набора для идентификации человека STR Юэвэй D-21, продукты ПЦР анализируют методом капиллярного электрофореза с использованием секвенатора 3500xL, а для выполнения калибровки флуоресценции на приборе используют G5-Matrix Standard, в то же время были скомпилированы соответствующие файлы Panels и bins, а для анализа результатов используется программное обеспечение GeneMapper ID версии 3.0.
4. Выполнить обнаружение STR
1) ПЦР-амплификация, система амплификации, как показано в таблице 2:
Таблица 2: Система амплификации ПЦР
Программа реакции ПЦР: 50°С, 10 мин, 96°С, 4 мин, (94°С, 5 с, 60°С, 1 мин 10 с)×27 циклов, 60°С, 30 мин, 15°С, хранение.
2) Результаты теста STR
В соответствии с инструкциями смешивали 8,7 мкл Hidi и 0,3 мкл внутреннего стандарта, добавили 1 мл амплифицированного продукта, с помощью секвенатора 3500xL провели анализ продукта ПЦР методом капиллярного электрофореза и с помощью G5-Matrix Standard выполнили калибровку флуоресценции на приборе, записали соответствующие файлы Panels и bins и использовали программное обеспечение GeneMapper ID версии 3.0 для анализа результатов. Результаты представлены на фиг. 4-7. Результаты показывают, что в дополнение к ДНК беременной женщины в образце действительно присутствует другая независимая индивидуальная информация о ДНК, и она имеет сильное родство с самой беременной женщиной.
3) Обнаружение Y-STR
Y-хромосома была обнаружена в образце STR с использованием набора Read Micro 40Y для обнаружения Y-STR. Результаты показаны на фиг. 8. Результаты показали, что в образце присутствует мужская ДНК.
Пример осуществления 5. Пример применения способа --- обнаружение гена предрасположенности к глухоте
Отслоившиеся клетки шейки матки беременных женщин с использованием способа, описанного в примере осуществления 2, и коммерческого набора реактивов (набор для обнаружения гена предрасположенности к глухоте (ПЦР + метод проточной гибридизации), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., одобрение государственной аппаратуры 20153401698) подвергались тестированию на гены предрасположенности к глухоте, (источник образцов: Медицинская лаборатория Гуанчжоу Кайпу), в частности, было проведено обнаружение для 9 мутационных участков (GJB2, GJB3, SLC26A4 и mtDNA) генов, связанных с глухотой (mtDNA1494, mtDNA1555, SLC26A4-IVS7(-2), SLC26A4-2168, GJB2-35, GJB2-176, GJB2-235, GJB2-299, GJB3-538).
ДНК из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин в примере осуществления 4 экстрагировали способом, описанным выше, после чего проводили последующие испытания с помощью коммерческого набора реактивов (набор для обнаружения генов предрасположенности к глухоте (ПЦР + метод управляемой гибридизации), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., одобрение государственной аппаратуры 20153401698). См. инструкции для конкретных операций. Исходные результаты представлены на фиг. 9, а анализ результатов приведен в таблице 3.
Таблица 3 Анализ результатов глухоты
Результаты показали, что результаты испытаний соответствовали результатам клинических испытаний.
Пример осуществления 6. Пример применения способа --- обнаружение генов, связанных с талассемией.
Используя метод, описанный в примере 2, и коммерческий набор (набор для обнаружения генов α- и β-талассемии (ПЦР+мембранная гибридизация), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., государственное управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (стандарт) 2012 г. №3400399) проводилось выявление гена предрасположенности к глухоте на отслоившихся клетках шейки матки беременных женщин (источник образцов: оставшиеся образцы нуклеиновых кислот образцов человеческого происхождения, обнаруженные медицинской лабораторией Кайпу), в частности, было проведено обнаружение для 3 распространенных типов делеции α-талассемии (--SEA, -α3.7, -α4.2), 2 типов мутации α-талассемии (CS, QS) и 11 типов мутации β-талассемии (CD14-15, CD17, CD27-28, CD41-42, CD43, CD71-72, -28, -29, IVS-I-1, IVS-II-654, β EN)
ДНК из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин в примере осуществления 4 экстрагировали способом, описанным выше, после чего проводили последующие испытания с помощью коммерческого набора реактивов (набор для обнаружения генов α- и β-талассемии (метод ПЦР+мембранная гибридизация), Чаочжоу Кайпу Биокемикал Ко., Лтд., государственное управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (стандарт) 2012 г. №3400399). См. инструкции для конкретных операций. Исходные результаты представлены на фиг. 10, а анализ результатов приведен в таблице 4.
Таблица 4 Анализ результатов талассемии
Результаты показали, что результаты испытаний соответствовали результатам клинических испытаний.
Пример осуществления 7. Пример применения способа --- полное генетическое секвенирование экзома
1. В глухой семье (отец, мать (16 недель беременности)), старший сын (глухой ребенок), младший сын (глухой ребенок), согласно способу, описанному в примере осуществления 2, получают образцы отслоившихся клеток шейки матки и образцы амниотической жидкости у беременных женщин, а также образцы цельной крови, взятые у самих беременных женщин и других членов семьи, и экстрагируют ДНК (образцы отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин получают согласно способу экстракции, описанному в примере осуществления 4, а образцы амниотической жидкости и цельной крови извлекают с использованием набора для выделения геномной ДНК цельной крови человека (Кайпу Биокемикал, Китай) (источник образцов: образцы человеческого происхождения, обнаруженные медицинской лабораторией Кайпу), полученную геномную ДНК человека подвергают полному секвенированию экзома (WES) с помощью набора для полного обнаружения экзома человека (Айцзи Тайкан Биотекнолоджи (Пекин) Ко., Лтд., артикул № T086V4).
Геномную ДНК обрабатывают транспозазой Tn5 с получением фрагмента размером 300 п.н. для создания библиотеки ДНК, добавляют линкеры P5, P7, index1, 2 с обоих концов, фрагменты ДНК подходящей длины отбирают, амплифицируют и очищают, проводят гибридизацию с библиотекой экзоновых зондов с биотином; используя сильную связывающую способность биотина и стрептавидина, магнитные шарики со стрептавидином объединяют с зондами, которые связаны с целевой библиотекой; адсорбируют магнитные шарики, удаляют супернатант, элюируют ДНК на магнитных шариках и амплифицируют библиотеку с помощью ПЦР, после чего определяется качество библиотеки и выполняется секвенирование на компьютере.
2. Результаты полного секвенирования экзома
Технология высокопроизводительного секвенирования использовалась для полного обнаружения экзома, а секвенирование по Сэнгеру использовалось для проверки обнаруженных патогенных или подозреваемых патогенных участков. Образцы, представленные для исследования, представляли собой образцы амниотической жидкости на 16-й неделе беременности. Два брата были глухими и немыми, а их родители были без особенностей. В образце обнаружена гетерозиготная мутация гена CDH23 c.8363T>C (p.Leu2788Pro) и гетерозиготная мутация гена GJB2 c.109G>A (p.Val27Ile). Карта семьи представлена на фиг. 11.
Результаты показали, что с помощью отобранных образцов отслоившихся клеток можно эффективно выявлять патогенные мутации, что полностью соответствует образцам амниотической жидкости. По результатам анализов можно выяснить патогенную причину и носительство патогенной мутации в семье.
Пример осуществления 8. Пример применения способа --- обнаружение полногеномной вариации числа копий ДНК (CNV)
1. Полногеномная вариация числа копий ДНК была обнаружена в соответствии с принципом сравнительной геномной гибридизации (aCGH) с использованием хромосомного чипа CytoOneArray и вспомогательного набора для обнаружения Phalanx Biotech:
Клетки трофобласта, отсортированные по способу в примере осуществления 2, экстрагировали способом отделения ДНК в отслоившихся клетках шейки матки беременных женщин по примеру осуществления 4. Полученную геномную ДНК человека подвергали фрагментации, преамплификационной обработке, амплификации и очищали продуктами ПЦР, после чего метили двумя разными флуоресцентными красителями (нормальные образцы отмечены Cy3 зеленым цветом, а образцы пациентов отмечены Cy5 красным цветом);
Флуоресцентный продукт очищают и вводят в чип, после чего чип очищают и сканируют для получения результатов.
2. Результаты обнаружения полногеномной вариации числа копий ДНК (CNV)
Схематическая диаграмма всей хромосомы показана на фиг. 12, а схематическая диаграмма аномальной хромосомы показана на фиг. 13. На фиг. 13 горизонтальная ось представляет собой схематическую диаграмму хромосомной полосы, а вертикальная ось представляет собой отношение сигналов (выраженное log2 ratio) между образцом и стандартным образцом. Когда есть существенные различия в количестве копий хромосом, они выражаются разными цветами. Область хромосомной амплификации (Достижение) показана синим цветом, а область хромосомной делеции (Потеря) показана красным. Длина и значение черной линии на рисунке представляют размер каждого сегмента (Сегмент) и среднее значение сигнала соответственно.
В образце была обнаружена одна аномалия, представляющая собой делецию 22q11.21, начально-конечное положение аномального фрагмента [UCSC hg19] – arr22q11.21 (19006943 21461068)x1, а размер аномального фрагмента – 2,454 Mb. Соответствующая область заболевания является патогенной (патогенность, классификация ACMG), и эта аномалия охватывает 106 генов ISCA, таких как TBX1, CRKL, GP1BB, SLC25A1, DGCR10, TSSK1A, GSC2 и CLTCL1. Аномалия в этой области расположена в рекуррентной области 22q11.2 (DGS/VCFS) (включает TBX1). Делеция проксимальной (AD) области 22q11.2 связана с синдромом Ди Джорджи/велокардиофациального синдрома (DGS/VCFS), обычно с врожденным пороком сердца, сердечными аномалиями, характерными чертами лица, DD/ID, поведенческими проблемами, иммунодефицитом и гипокальциемией (PMID 25217958). Аномалия этой области находится в рекуррентной области 22q11.2 (центральная, B/C-D) (включает CRKL). К клиническим фенотипам, которые могут быть вызваны делецией этой области, относятся: аномальные черты лица, ограничение роста/низкий рост, аномалии центральной нервной системы/судороги, задержка роста, умственная отсталость, аномалии скелета, сердечно-сосудистые дефекты, аномалии мочеполовой системы и иммунодефицит/рецидивирующие инфекции (PMID 25123976).
Результаты показали, что отобранные образцы клеток могут эффективно обнаруживать структурные вариации хромосом и выявлять соответствующие мутации.
Пример осуществления 9. Сравнение способа отделения и скрининга клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин на основе микрожидкостного сортировочного чипа и способа магнитных шариков
(1) Экспериментальные образцы:
Были взяты два образца цервикальной отслоившейся клеточной жидкости из образцов человека, протестированных в медицинской лаборатории Кайпу.
(2) В качестве контрольного эксперимента для сравнения различий в эффектах двух способов использовался способ магнитных шариков.
Способ по настоящему изобретению такой же, как в примере осуществления 2.
Процесс сортировки клеток трофобласта способом магнитных шариков выглядит следующим образом:
(1) Встряхнуть и перемешать собранные образцы раствора для консервации отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин в течение 5 минут.
(2) Извлечь раствор для консервации и поместить его в центрифужную пробирку на 15 мл, добавить 3 мл раствора для разделения клеток во флакон с раствором для консервации, встряхнуть и хорошо перемешать, затем извлечь и поместить в центрифужную пробирку на 15 мл.
(3) Центрифугировать при 3000 об/мин в течение 10 мин и удалить супернатант.
(4) Добавить 1 мл 1×PBST, хорошо перемешать, перенести в 1,5-мл пробирку EP, центрифугировать при 3000 об/мин в течение 5 минут и удалить супернатант.
(5) Повторить этап 4 дважды.
(6) Добавить 200 мкл 0,5% Triton X-100, хорошо перемешать и дать пермеабилизироваться при комнатной температуре в течение 20 минут.
(7) Повторить этап 4 три раза.
(8) Добавить 200 мкл первичных антител, хорошо перемешать и оставить на ночь при 4°C.
(9) Повторить этап 4 три раза.
(10) Добавить 200 мкл вторичных антител, хорошо перемешать и провести реакцию при 37°C в течение 1 часа.
(11) Повторить шаг 4 три раза и ресуспендировать с 200 мкл буферного раствора (DPBS+0,1%BSA+2 мМ EDTA).
(12) Тщательно перемешать 25 мкл гранул и 50 мкл буферного раствора, отцентрифугировать при 600 g в течение 10 минут, удалить супернатант, ресуспендировать с 25 мкл буферного раствора и добавить его к смеси на этапе (11).
(13) 20-минутная реакция при 2°C-8°C.
(14) Добавить 1 мл буферного раствора и хорошо перемешать. После стояния на магнитной подставке в течение 2 минут удалить супернатант (оставить 200 мкл для сравнения).
(15) Повторить этап (14) два-три раза.
(16) Добавить 200 мкл предварительно нагретого до 37°C буферного раствора для ресуспендирования, добавить 4 мкл высвобождающего буферного раствора и хорошо перемешать.
(17) Через 15 минут при комнатной температуре пипетировать 5-10 раз с помощью пистолета для образцов, дать ему постоять на магнитной подставке в течение 2 минут и собрать супернатант.
(18) Добавить 200 мкл буферного раствора, пипетировать 5-10 раз, дать ему постоять на магнитной подставке в течение 2 минут и собрать супернатант.
(19) Повторить шаг (18) три раза, чтобы окончательно получить клетки трофобласта.
(3) Результаты
Положительные клетки, полученные в результате сортировки, были сфотографированы с помощью флуоресцентного микроскопа Sunny RX50, как показано на фиг. 14-16: фиг. 14 представляет собой фотографию положительных клеток, отсортированных по способу настоящего изобретения, а фиг. 15 представляет собой положительные клетки до и после сортировки по способу настоящего изобретения. Рисунок 16 представляет собой фотографию положительных клеток, полученных методом магнитной сортировки. Из сравнения ясно видно, что количество клеток, отсортированных двумя способами, значительно различается по порядку величины. Способ по настоящему изобретению значительно лучше, чем способ магнитных шариков. Статистические данные показывают, что количество отсортированных положительных клеток по способу настоящего изобретения может достигать примерно 3000-13000 кл.
Вышеупомянутые варианты осуществления представляют собой лишь несколько вариантов осуществления настоящего изобретения, и их описания являются более конкретными и подробными, однако их не следует рассматривать как ограничение объема патента на изобретение. Следует отметить, что для специалистов в данной области, не отступая от концепции настоящего изобретения, могут быть сделаны несколько модификаций и улучшений, которые входят в объем защиты настоящего изобретения. Таким образом, объем защиты патента на изобретение регулируется прилагаемой формулой изобретения.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПОПУЛЯЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ШЕЙКИ МАТКИ ЧЕЛОВЕКА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2014 |
|
RU2679500C2 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ NK-КЛЕТОК | 2016 |
|
RU2632109C1 |
| СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МУЛЬТИ-АНАЛИЗОВ РЕДКИХ КЛЕТОК, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЛИ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ФИЛЬТРАЦИЕЙ | 2013 |
|
RU2641595C2 |
| СПОСОБ ПРОВЕДЕНИЯ МУЛЬТИ-АНАЛИЗОВ РЕДКИХ КЛЕТОК, ЭКСТРАГИРОВАННЫХ ИЛИ ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ФИЛЬТРАЦИЕЙ | 2013 |
|
RU2765808C2 |
| ОБНАРУЖЕНИЕ КЛЕТОК, ПОЛУЧЕННЫХ ИЗ ТКАНИ ПУПОВИНЫ ЧЕЛОВЕКА | 2012 |
|
RU2636220C2 |
| ДОСТАВКА БИОМОЛЕКУЛ В КЛЕТКИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ | 2015 |
|
RU2739794C2 |
| Способ выявления антиотцовских антител после иммунизации женщин с идиопатическим привычным выкидышем лимфоцитами полового партнера | 2016 |
|
RU2614729C1 |
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЛОДНЫХ КЛЕТОК | 1997 |
|
RU2178703C2 |
| МУЛЬТИПОТЕНТНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ ЖИРОВОЙ ТКАНИ ЧЕЛОВЕКА, И СОДЕРЖАЩИЕ ИХ КЛЕТОЧНЫЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ АГЕНТЫ | 2005 |
|
RU2409665C2 |
| ГЕНЫ РЕЦЕПТОРОВ АНТИГЕНСПЕЦИФИЧНЫХ ХЕЛПЕРНЫХ Т-КЛЕТОК | 2013 |
|
RU2680588C2 |
Изобретение относится к биотехнологии, медицине и диагностике. Предложен способ отделения клеток плацентарного трофобласта от отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин с помощью микрожидкостного сортировочного чипа для получения отделенных и очищенных клеток плацентарного трофобласта. Способ имеет преимущества неинвазивного получения образцов и хорошей специфичности, позволяет брать образцы в ранние сроки, что приводит к низкому риску инфицирования и выкидыша, позволяет одновременно синхронно маркировать несколько антигенов, а также распознавать и сортировать характерные флуоресцентные сигналы, что значительно повышает точность, а результаты обнаружения имеют более высокую надежность и более широкий охват. Кроме того, данный способ имеет преимущество, заключающееся в учете количества и качества клеток. Способ можно применять для различных целей обнаружения и сценариев применения. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 9 пр.
1. Микрожидкостный сортировочный чип для отделения клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин, включает подложку и прикрепленную к ней крышку; при этом
одна сторона подложки снабжена основным каналом, боковым каналом А и боковым каналом В, при этом два боковых канала расположены вблизи левого и правого конца основного канала соответственно и соединяются с ним; при этом ширина всех каналов составляет не более чем 1000 мкм, а глубина – не более чем 500 мкм; при этом
другая сторона подложки снабжена входным отверстием для образца клеток (входом C), входным отверстием буферного раствора (входом S), отверстием для хранения нецелевых клеток (выходом N) и отверстием для хранения целевых клеток (выходом T), при этом
все четыре отверстия проходят через другую сторону подложки и соединяются с каналами, при этом
положение входа С соответствует левому концу основного канала, положение входа S соответствует концу А бокового канала, положение выхода N соответствует правому концу основного канала, а положение выхода T соответствует концу бокового канала B, при этом
основной канал снабжен устройством отклоняющего электрода для сортировки клеток, а положение устройства отклоняющего электрода находится в месте стыка выхода N и выхода T; при этом
электроды выполнены с возможностью включения и выключения в зависимости от наличия или отсутствия сигналов проточной кюветы.
2. Способ отделения клеток трофобласта из отслоившихся клеток шейки матки беременных женщин посредством микрожидкостного сортировочного чипа по п. 1, который включает следующие этапы:
(1) приготавливают образец жидкости отслоившихся клеток шейки матки в виде клеточной суспензии образца; при этом системой клеточной суспензии является 1xPBS, содержащий 0,2%-0,4% FBS;
(2) добавляют специфические антитела к клеточной суспензии образца для выполнения инкубации; условия инкубации первичного антитела: реакция в течение 30-90 минут при 4°C; условия инкубации комплекса вторичных антител-флуоресцентных меток: реакция в течение 20 минут при 2°С - 8°С;
при этом специфические антитела представляют собой комбинацию: HLA-G+CK7, HLA-G+CK18, HLA-G+β -ХГЧ, CD31+HPL, MMP9+CD31, HLA-G+HPL, HLA-G+MMP9, HLA-G+CD31, HLA-G+P, CD31+P, HLA-G+CDH5, CD31+CDH5, CD31 +CK7+HLA-G, HLA-G+CK18+CD31, HLA-G+β-HCG+CD31, CD31+HPL+HLA-G, MMP9+CD31+HLA-G, CD31+P+HLA-G или HLA -G+CDH5+CD31; и
(3) с помощью микрожидкостного сортировочного чипа клеточную ресуспендированную жидкость, инкубированную на этапе (2), подвергают сортировке микрожидкостных клеток с флуоресцентным мечением для получения отделенных и очищенных клеток плацентарного трофобласта;
при этом жидкофазная система для сортировки клеток представляет собой 0,2%-0,4% Triton-X-100.
3. Способ по п.2, в котором на этапе (2): посредством инкубации указанный комплекс первичных антител, указанный комплекс вторичных антител-флуоресцентных меток последовательно специфически связывается с целевым антигеном, при этом во избежание перекрестного загрязнения используют промежуточные способы промывки и центрифугирования.
4. Способ по п.3, в котором на этапе (3): инкубированную клеточную ресуспендированную жидкость пропускают через вход С микрожидкостного сортировочного чипа и пропускают в буферный раствор через вход S; затем помещают микрожидкостный сортировочный чип в сортировщик клеток и запускают программу сортировки, после завершения программы собирают образцы из выхода Т для получения отсортированных клеток трофобласта.
5. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для идентификации коротких тандемных поворотов (short tandem repeats; STR) человека.
6. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для обнаружения плоидности хромосом человека.
7. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для тестирования гена талассемии.
8. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для тестирования гена глухоты.
9. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для секвенирования всего экзомного гена.
10. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для обнаружения микроделеций/дупликаций хромосом.
11. Применение способа по любому из пп. 2-4 в конструировании продуктов для обнаружения структурных вариаций хромосом.
| CN 111304153 A, 19.06.2020 | |||
| US 2016090631 A1, 31.03.2016 | |||
| STROMBERG K | |||
| et al | |||
| Isolation of functional human trophoblast cells and their partial characterization in primary cell culture, In Vitro, 1978, vol | |||
| Паровоз для отопления неспекающейся каменноугольной мелочью | 1916 |
|
SU14A1 |
| НАСАДКА ДЛЯ КАМЕР РЕГЕНЕРАТОРОВ | 1923 |
|
SU631A1 |
| MOSER G | |||
| et al | |||
| Trophoblast retrieval and isolation from the cervix: origins of cervical trophoblasts and their potential | |||
