[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США №62/874306, поданной 15 июля 2019 года, описание которой полностью включено в настоящий документ посредством ссылки.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] В течение последних четырех десятилетий исследователи пытаются выделять клетки плода из организмов беременных женщин для разработки инструментов пренатальной диагностики. В начале 1970 гг.впервые была разработана процедура амниоцентеза, а затем в 1980 гг. разработали методику пробоотбора ворсинок хориона (CVS). Амниоцентез и пробоотбор ворсинок хориона (CVS) представляют собой два инвазивных способа, применяемых в повседневной клинической практике для диагностики хромосомных аберраций, например, обычной анеуплоидии у плода (дополнительной копии хромосомы), например, трисомии по хромосомам 13, 18 и 21 (приводящей к синдрому Дауна).
[0003] Возможность выделения клеток плода и ДНК плода из крови матери во время беременности открыла широкие возможности для улучшенного неинвазивного пренатального тестирования. Недавно в рамках неинвазивного пренатального тестирования ((НИПТ) введен скрининг на основе бесклеточной ДНК (бкДНК), считающийся хорошим средством для прогнозирования трисомии 21. Однако эффективность этого скрининга ниже эффективности инвазивных диагностических инструментов, и по-прежнему необходимо выполнять подтверждающие тесты. Кроме того, согласно данным профессиональных обществ, НИПТ не позволяет прогнозировать варианты количества копий (CNV) или микроделеции/дупликации (Practice bulletin nl63 Obstet Gynecol. 2016; 127(5) 979-981). Таким образом, современное бесклеточное НИПТ пока не позволяет обнаруживать субхромосомные делеции и дупликации с высокой чувствительностью, специфичностью и прогностической ценностью положительного результата.
[0004] Прямой анализ клеток плода из кровотока матери до сих пор является сложной процедурой с учетом небольшого количества клеток плода в крови матери. Протестировано большое количество различных способов обогащения, включая фильтры, градиенты плотности, сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS), микрожидкостные технологии и иммуномагнитные гранулы. Несмотря на возможность выделения клеток плода, эти способы характеризуются недостаточной стабильностью и воспроизводимостью. Это обусловлено крайне небольшим количеством циркулирующих клеток плода (0,1-10 клеток на 1 мл крови матери, содержащий приблизительно 1-5 миллионов клеток), что в настоящее время препятствует разработке воспроизводимых протоколов. Сложность состоит в удалении всех посторонних ядрос о держащих клеток крови без потери крайне небольшого количества циркулирующих клеток плода в первом триместре беременности.
[0005] С учетом этих ограничений и того, что амниоцентез и пробоотбор ворсинок хориона (CVS) представляют собой процедуры, связанные с риском потери беременности, существует потребность в разработке новых процедур НИПД (неинвазивной пренатальной диагностики) на основе клеток для отбора клеток плода из крови беременных женщин в целях скрининга на предмет врожденных пороков и наследственных заболеваний.
[0006] Известно, что в кровотоке матери присутствуют ядросодержащие эритроциты плода (nRBC) и клетки трофобласта, однако разработка надежной цитогенетической формы НИПТ на основе клеток является сложной задачей. В последнее время предложена возможность разработки формы НИПТ на основе клеток с обнаружением аномалий, точность которой аналогична точности, получаемой в настоящее время при использовании амниоцентеза и CVS (Amy М. Breman, et at., Prenatal Diagnosis, 2016, 36(11): 1009-1019).
[0007] В настоящем документе описаны маркеры клеток плода и агенты, связывающие их. Кроме того, в настоящем документе описаны композиции, наборы и способы выделения, обнаружения и анализа клеток плода на основе маркеров клеток плода.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] В настоящем документе описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с первым антителом, причем указанный образец содержит множество клеток; (b) выделение клеток, связанных с первым антителом, с получением обогащенного образца; (с) приведение обогащенного образца в контакт со вторым антителом; и (d) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, как клетки плода, причем указанное первое антитело или указанное второе антитело: (i) представляет собой антитело, связывающееся с белком аналога-2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2); или (ii) содержит антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2.
[0009] В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой ядросодержащий эритроцит плода (fnRBC). В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой клетку трофобласта.
[0010] В некоторых вариантах реализации первое антитело конъюгировано с одной или более магнитными частицами. В некоторых вариантах реализации указанные магнитные частицы представляют собой коллоидные магнитные частицы. В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой магнитные частицы ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации магнитные частицы присоединены к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0011] В некоторых вариантах реализации этап (а) включает добавление второго EAEF для индукции агрегации магнитных частиц, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
[0012] В некоторых вариантах реализации этап (b) включает воздействие магнитным полем на образец.
[0013] В некоторых вариантах реализации этап (b) включает добавление члена специфично связывающейся пары к обогащенному образцу с целью устранения агрегации магнитных частиц в обогащенном образце.
[0014] В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (а) дополнительно включает добавление к образцу по меньшей мере одного агента, ингибирующего агрегацию, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана. В некоторых вариантах реализации агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент. В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА).
[0015] В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком TREML2, или содержит антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации белок TREML2 содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации белок TREML2 содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID No. 2-5.
[0016] В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (d) дополнительно включает выделение одиночных клеток плода.
[0017] В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют, выделяя одиночные клетки плода, связанные со вторым антителом.
[0018] В некоторых вариантах реализации второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина.
[0019] В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют с использованием DEPArray.
[0020] В некоторых вариантах реализации этап (d) включает выполнение анализа на основе секвенирования. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0021] В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает анализ клеток плода. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение геномного или генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода.
[0022] В некоторых вариантах реализации указанное первое антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком TREML2, или содержит антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации белок TREML2 содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах реализации белок TREML2 содержит, состоит из или по существу состоит из аминокислотной последовательности, приведенной в любой из SEQ ID No. 2-5.
[0023] В некоторых вариантах реализации указанное антитело, связывающееся с белком TREML2, или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2, содержит один или более CDR, выбранных из: (i) определяющего комплементарность участка (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (ii) CDR2 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (iii) CDR3 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8); (iv) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (v) CDR2 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (vi) CDR3 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации указанное антитело, связывающееся с белком TREML2, или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2, содержит 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (i)-(vi).
[0024] В некоторых вариантах реализации антитело, связывающееся с белком TREML2 представляет собой антитело против TREML2. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_P050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABPN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0025] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с магнитным реагентом, причем указанный образец содержит множество клеток, а магнитный реагент содержит магнитную частицу, конъюгированную с первым антителом, причем указанное первое антитело связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71; (b) приведение образца в контакт с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом; и (с) идентификацию клетки, связанной с антителом против TREML2, как клетки плода.
[0026] В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (с) дополнительно включает выделение клеток, связанных с первым антителом. В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает воздействие на образец магнитным полем для обогащения образца клетками, связанными с первым антителом.
[0027] В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0028] В некоторых вариантах реализации магнитная частица присоединена к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0029] В некоторых вариантах реализации указанный способ во время этапа (а) включает добавление второго EAEF для усиления агрегации частиц, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
[0030] В некоторых вариантах указанный способ дополнительно включает добавление члена специфично связывающейся пары (третьего EAEF) к обогащенному образцу с целью устранения агрегации магнитного реагента в образце, что облегчает идентификацию клетки.
[0031] В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (а) дополнительно включает добавление к образцу по меньшей мере одного агента, ингибирующего агрегацию, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента, диаминобутана. В некоторых вариантах реализации агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент.В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
[0032] В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (с) дополнительно включает выделение клеток с использованием антитела против TREML2 или второго антитела. В некоторых вариантах реализации второе антитело выбрано из антитела против цитокератина и антитела против HLAG.
[0033] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина.
[0034] В некоторых вариантах реализации выделение клетки основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клетки выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клетки выполняют с использованием DEP Array.
[0035] В некоторых вариантах реализации идентификация клетки включает выполнение анализа на основе секвенирования.
[0036] В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0037] В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает анализ клеток плода. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение геномного или генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода.
[0038] В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой эритробласт плода или клетку трофобласта плода.
[0039] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит один или более из определяющих комплементарность участков (CDR), выбранных из: (i) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (ii) CDR2 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; (iii) CDR3 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8); (iv) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (v) CDR2 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (vi) CDR3 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0040] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_P050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0041] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с первым антителом, причем указанный образец содержит множество клеток, а первое антитело связывается с белком аналога 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2) (антитело против TREML2), или его антиген-связывающим фрагментом; и (b) идентификацию клетки, связанной с первым антителом, как клетки плода.
[0042] В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой ядросодержащий эритроцит плода (fnRBC).
[0043] В некоторых вариантах реализации первое антитело конъюгировано с одной или более магнитными частицами. В некоторых вариантах реализации указанные магнитные частицы представляют собой коллоидные магнитные частицы. В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой магнитные частицы ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0044] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает воздействие магнитным полем на образец.
[0045] В некоторых вариантах реализации магнитные частицы присоединены к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0046] В некоторых вариантах реализации указанный способ до этапа (b) дополнительно включает добавление второго EAEF для усиления агрегации магнитных частиц, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
[0047] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает выделение клеток, связанных с первым антителом, с получением обогащенного образца.
[0048] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает добавление третьего EAEF к обогащенному образцу в целях устранения агрегации магнитных частиц в обогащенном образце, причем указанный третий EAEF способен связываться с первым EAEF или вторым EAEF. В некоторых вариантах реализации третий EAEF является членом специфично связывающейся пары.
[0049] В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (а) дополнительно включает добавление к образцу по меньшей мере одного агента, ингибирующего агрегацию, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана. В некоторых вариантах реализации агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент.В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
[0050] В некоторых вариантах реализации первое антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина.
[0051] В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (b) дополнительно включает выделение клеток, связанных с первым антителом, причем указанное выделение клеток основано на и мму но флуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с первым антителом, выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с первым антителом, выполняют с использованием DEP Array.
[0052] В некоторых вариантах реализации этап (b) включает выполнение анализа на основе секвенирования. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП). В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает анализ клеток плода. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение геномного или генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода.
[0053] В некоторых вариантах реализации первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одной или более CDR, выбранных из: (a) CDR1 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) CDR1 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) CDR2 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (a)-(f).
[0054] В некоторых вариантах реализации первое антитело выбрано из sc-109096, ARP49877_P050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0055] В настоящем документе также описан способ генетического тестирования плода на основе клеток, включающий: (а) приведение образца, полученного от беременного субъекта, в контакт с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанный образец содержит множество клеток; (b) выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом; (с) анализ одной или более из молекул нуклеиновой кислоты из клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом; и (d) формирование отчета на основе анализа указанной одной или более из молекул нуклеиновой кислоты, причем в указанном отчете представлена вероятность наличия одной или более из генетических аномалий у плода.
[0056] В некоторых вариантах реализации клетки, связанные с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, представляют собой клетки плода.
[0057] В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой эритробласты плода. В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой клетки трофобласта плода.
[0058] В некоторых вариантах реализации анализ указанных одной или более из молекул нуклеиновой кислоты включает выполнение анализа кариотипа.
[0059] В некоторых вариантах реализации анализ указанных одной или более молекул нуклеиновой кислоты включает выполнение анализа на основе секвенирования. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0060] В некоторых вариантах реализации указанные одна или более из генетических аномалий выбраны из трисомии, аномалии половых хромосом и структурной аномалии. В некоторых вариантах реализации трисомия выбрана из трисомии 3, трисомии 4, трисомии 6, трисомии 7, трисомии 8, трисомии 9, трисомии 10, трисомии 11, трисомии 12, трисомии 13, трисомии 16, трисомии 17, трисомии 18, трисомии 20, трисомии 21 и трисомии 22. В некоторых вариантах реализации аномалия половых хромосом выбрана из моносомии X, трисомии X и синдрома Клайнфельтера. В некоторых вариантах реализации структурная аномалия является вариацией количества копий (CNV). В некоторых вариантах реализации структурная аномалия является делецией CNV или дупликацией CNV.
[0061] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 конъюгировано с магнитной частицей. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости.
[0062] В некоторых вариантах реализации этап (b) включает воздействие магнитным полем на образец.
[0063] В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (а) дополнительно включает приведение образца в контакт с первым антителом, причем указанное первое антитело связывает белок, выбранный из ЕрСАМ, CD105 и CD71.
[0064] В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (а) дополнительно включает выделение клеток, связанных с первым антителом.
[0065] В некоторых вариантах реализации первое антитело конъюгировано с магнитной частицей. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0066] В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с первым антителом, выполняют, подвергая образец воздействию магнитного поля. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой.
[0067] В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют с помощью DEPArray.
[0068] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает приведение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, в контакт со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом.
[0069] В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело представляет собой антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент. В некоторых вариантах реализации второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой.
[0070] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют с помощью DEPArray.
[0071] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_Р050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0072] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одной или более из CDR, выбранных из: (a) CDR1 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) CDR1 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) CDR2 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (i)-(vi).
[0073] В настоящем документе также описан способ получения образца клеток плода из образца, полученного от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца, полученного из организма матери и содержащего клетки плода и клетки матери, в контакт с конъюгатом первого антитела, причем указанный конъюгат первого антитела содержит (i) первое антитело; и (ii) коллоидную магнитную частицу, причем указанное первое антитело конъюгировано с указанной коллоидной магнитной частицей, и (b) выделение клеток, связанных с указанным конъюгатом первого антитела, посредством воздействия на образец, полученный из организма матери, магнитным полем, что позволяет получить образец клеток плода.
[0074] В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0075] В некоторых вариантах реализации магнитная частица присоединена к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0076] В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает добавление второго EAEF к образцу, полученному из организма матери, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
[0077] В некоторых вариантах реализации первое антитело является антителом против TREML2.
[0078] В некоторых вариантах реализации первое антитело является антителом против CD71.
[0079] В некоторых вариантах реализации первое антитело связывается с белком, выбранным из EpCAM и CD105.
[0080] В некоторых вариантах реализации получение образца клеток плода дополнительно включает приведение клеток, выделенных из образца, полученного из организма матери, в контакт со вторым антителом.
[0081] В некоторых вариантах реализации второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой.
[0082] В некоторых вариантах реализации получение образца клеток плода дополнительно включает выделение клеток, связанных со вторым антителом.
[0083] В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом, основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом, выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом, выполняют с использованием DEP Array.
[0084] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с конъюгатом первого антитела, причем указанный образец содержит множество клеток, а указанное первое антитело содержит первое антитело, конъюгированное с коллоидной магнитной частицей; (b) выделение клеток, связанных с первым антителом, посредством воздействия на образец магнитным полем, что позволяет получить обогащенный образец; (с) приведение обогащенного образца в контакт со вторым антителом, причем указанное второе антитело связывается с маркером на поверхности клетки плода; и (d) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, как клетки плода.
[0085] В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой ядросодержащий эритроцит плода (fnRBC). В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой клетку трофобласта плода.
[0086] В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой магнитные частицы ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0087] В некоторых вариантах реализации магнитные частицы присоединены к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0088] В некоторых вариантах реализации этап (а) включает добавление второго EAEF для усиления агрегации магнитных частиц, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
[0089] В некоторых вариантах реализации этап (b) включает добавление члена специфично связывающейся пары к обогащенному образцу с целью устранения агрегации магнитных частиц в обогащенном образце.
[0090] В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (а) дополнительно включает добавление к образцу по меньшей мере одного агента, ингибирующего агрегацию, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана. В некоторых вариантах реализации агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент.В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
[0091] В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком TREML2, или содержит антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2.
[0092] В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (d) дополнительно включает выделение одиночных клеток плода. В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют, выделяя одиночные клетки плода, связанные со вторым антителом.
[0093] В некоторых вариантах реализации второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантахреализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ГГХ) и биотина.
[0094] В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют с использованием DEP Array.
[0095] В некоторых вариантах реализации этап (d) включает выполнение анализа на основе секвенирования. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0096] В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает анализ клеток плода. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение геномного или генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода.
[0097] В некоторых вариантах реализации указанное первое антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком TREML2, или содержит антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2.
[0098] В некоторых вариантах реализации указанное антитело, связывающееся с белком TREML2, или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2, содержит, состоит из или по существу состоит из одного или более из CDR, выбранных из: (i) определяющего комплементарность участка (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (ii) CDR2 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (iii) CDR3 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8); (iv) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (v) CDR2 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (vi) CDR3 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации указанное антитело, связывающееся с белком TREML2, или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2, содержит 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (i)-(vi). В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0099] В некоторых вариантах антитело, связывающееся с белком TREML2, выбрано из sc-109096, ARP49877_Р050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul HBD563661.
[0100] В настоящем документе также описаны антитела против TREML2. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одной или более из CDR, выбранных из: (a) CDR1 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) CDR1 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит две или более из CDR, выбранных из (a)-(f). В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит три или более из CDR, выбранных из (а)-(f) В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит четыре или более из CDR, выбранных из (a)-(f) В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит пять или более из CDR, выбранных из (a)-(f). В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит все CDR согласно (a)-(f).
[0101] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина.
[0102] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с магнитной частицей. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0103] В некоторых вариантах реализации магнитная частица присоединена к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0104] В настоящем документе описан конъюгат антитела против TREML2, содержащий (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) магнитную частицу, причем указанная магнитная частица конъюгирована с антителом против TREML2.
[0105] В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 80-200 нм В некоторых вариантах реализации размер коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 90-150 нм В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет по меньшей мере 60%. В некоторых вариантах реализации магнитная масса указанной коллоидной магнитной частицы составляет приблизительно 70-90%. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица содержит кристаллическое ядро из суперпарамагнитного материала, окруженное молекулами покрытия.
[0106] В некоторых вариантах реализации магнитная частица присоединена к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0107] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одной или более из CDR, выбранных из: (a) CDR1 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) CDR1 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) CDR2 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из двух или более из CDR, выбранных из (a)-(f). В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из трех или более из CDR, выбранных из (а)-(f). В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из четырех или более из CDR, выбранных из (a)-(f). В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из пяти или более из CDR, выбранных из (a)-(f). В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из всех CDR согласно (a)-(f)
[0108] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_P050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0109] Кроме того, в настоящем документе описаны наборы для выделения, обнаружения и анализа клеток плода. В некоторых вариантах реализации набор содержит, состоит из или по существу состоит из (а) антитела, связывающегося с белком аналога 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2) (антитела против TREML2), или его антиген-связывающего фрагмента; и (b) магнитного реагента, содержащего коллоидные магнитные частицы.
[ОНО] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_Р050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0111] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одного или более участков, определяющих комплементарность (CDR), выбранных из: (a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0112] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с меткой с образованием конъюгированного антитела. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина.
[0113] В некоторых вариантах реализации размер коллоидных магнитных частиц составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой частицы ферромагнитной жидкости.
[0114] В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы конъюгированы с антителом или его антиген-связывающим фрагментом.
[0115] В некоторых вариантах реализации указанное антитело является антителом против TREML2. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одной или более из CDR, выбранных из: (a) CDR1 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) CDR1 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) CDR2 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (i)-(vi).
[0116] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_Р050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0117] В некоторых вариантах реализации набор дополнительно содержит, состоит из или по существу состоит из ингибирующего агента, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента, диаминобутана. В некоторых вариантах реализации набор дополнительно содержит, состоит из или по существу состоит из хелатирующего агента. В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
[0118] В некоторых вариантах реализации набор дополнительно содержит, состоит из или по существу состоит из экзогенного фактора, усиливающего агрегацию (EAEF). В некоторых вариантах реализации указанный EAEF содержит, состоит из или по существу состоит из одного члена специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0119] Кроме того, в настоящем документе описан набор, содержащий (а) первое антитело, способное связываться с белком, экспрессируемым на поверхности клетки плода, причем указанное первое антитело связано с коллоидными магнитными частицами; и (b) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент.
[0120] В некоторых вариантах реализации первое антитело связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71.
[0121] В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой частицы ферромагнитной жидкости
[0122] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одной или более из CDR, выбранных из (a) CDR1 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; (d) CDR1 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9; (e) CDR2 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0123] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_P050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
[0124] В некоторых вариантах реализации набор дополнительно содержит, состоит из или по существу состоит из ингибирующего агента, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента, диаминобутана. В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
[0125] В некоторых вариантах реализации указанный набор дополнительно содержит, состоит из или по существу состоит из экзогенного фактора, усиливающего агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит, состоит из или главным образом состоит из одного члена специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0126] На фиг.1 изображен типичный способ выделения, обнаружения и анализа редких клеток.
[0127] На фиг.2 изображена типичная структура ферромагнитной жидкости.
[0128] На фиг.3 изображен типичный способ обнаружения редких клеток.
[0129] На фиг.4 изображен типичный способ выделения и обнаружения редких клеток.
[0130] На фиг.5А-Е изображено гейтирование клеток с помощью прибора FACS.
[0131] На фиг.6 изображен типичный способ выделения, обнаружения и анализа редких клеток.
[0132] На фиг.7 изображена схема агрегации ферромагнитной жидкости за счет контролируемой агрегации.
[0133] Фиг. 8: Схема процесса обогащения клеток плода: Клетки плода из цельной крови беременных женщин обогащают и красят.Чистые одиночные клетки выделяют с помощью DEPArray™ для полногеномной амплификации и анализа генома.
[0134] Фиг. 9 Стратегия гейтирования эритробластов, выделенных из образца крови плода: (1) FSC-A/SSC-A для гейтирования основной популяции клеток (2) гейтирование живых клеток, отрицательных по Sytox Green (3) FSC-H/W для исключения двойных клеток (4) гейтирование клеток, дважды положительных по GPA/Hoechst (5) гейтирование CD71+/CD45- клеток(б) гейтирование по TLS1/TREML2 и наложение изотипического контроля для определения % ТКЕМЬ2-положительных клеток.
[0135] Фиг. 10 Стратегия гейтирования эритробластов, выделенных из образца костного мозга: (1) FSC-A/SSC-A для гейтирования основной популяции клеток (2) гейтирование живых клеток, отрицательных по Sytox Green (3) FSC-H/W для исключения двойных клеток (4) гейтирование клеток, дважды положительных по GPA/Hoechst (5) гейтирование CD71+/CD45- клеток(б) гейтирование по TLS1/TREML2 и наложение изотипического контроля для определения % ТКЕМЬ2-положительных клеток.
[0136]
[0137] На фиг.11A-11J показана экспрессия TLS1/TREML2 на эритробластах плода, выделенных из различных образцов крови плода (FB) различных клонов.
[0138] На Фиг. 12A-12L показана экспрессия TLS1/TREML2 на эритробластах взрослых, выделенных из различных образцов костного мозга (ВМ) различных клонов.
[0139] На фиг.13 показан анализ диаграммы разброса TLSl/TREML-2-положительных клеток трофобласта, идентифицированных с использованием DEPArrayl™ после добавления и обогащения с помощью CD105-FF и EpCAM-FF.
[0140] На фиг.14 показана галерея изображений CellBrowser®: Клетки трофобласта демонстрируют положительное окрашивание антителом TREML-2-PE, CK-АРС и при окрашивании ядер.
[0141] На фиг.15А показан анализ диаграммы разброса Draq5/Hoechst-положительных эритробластов, добавленных в кровь здоровых доноров и обогащенных с использованием CD71-FF. На фиг.15 В показана галерея изображений CellBrowser®: эритробласты демонстрируют положительное окрашивание антителом CD71-PE, при окрашивании ядер Draq5 и Hoechst, и отрицательное окрашивание антителом CD45-FITC.
[0142] На фиг.16А показан анализ диаграммы разброса Draq5/Hoechst-положительных эритробластов, добавленных в кровь здоровых доноров и обогащенных с использованием TLS1/TREML-2-FF. На фиг.16 В показана галерея изображений CellBrowser®: эритробласты демонстрируют положительное окрашивание антителом CD71-PE, при окрашивании ядер Draq5 и Hoechst, и отрицательное окрашивание антителом CD45-FITC.
[0143] На фиг.17 показан анализ КТП в одиночных клетках плода, выделенных из крови матери.
[0144] На фиг.18 показаны результаты анализа CNV в одиночных клетках плода.
[0145] На фиг.19 показаны результаты анализа CNV в одиночных клетках здорового донора.
[0146] На фиг.20 изображен типичный способ выделения и обнаружения редких клеток.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0147] В настоящем документе описаны композиции, наборы и способы выделения, обнаружения и анализа редких клеток в образце. В общем случае композиции, наборы и способы, описанные в настоящем документе, включают агенты, связывающиеся с белком аналога 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2) (этот белок также фигурирует в тексте настоящей заявки под названием TLS1). В качестве альтернативы или дополнения композиции, наборы и способы, описанные в настоящем документе, включают конъюгаты антител. Конъюгаты антител содержат антитело, конъюгированное с коллоидной магнитной частицей. Редкая клетка может являться клеткой плода. Образец может представлять собой образец, выделенный из организма беременного субъекта.
[0148] Способы выделения, обнаружения и/или исследования характеристик редких клеток
[0149] В настоящем документе описаны способы выделения, обнаружения и/или исследования характеристик редких клеток. В некоторых вариантах реализации редкие клетки представляют собой клетки плода. В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой ядросодержащие эритроциты плода (fnRBC). В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой клетки трофобласта. В общем случае указанные способы включают применение антитела против TREML2 или его антиген-связывающего фрагмента для идентификации клетки как клетки плода. В качестве альтернативы или дополнения указанные способы включают применение антитела, конъюгированного с коллоидной магнитной частицей, для выделения клетки плода.
[0150] В настоящем документе описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанный образец содержит множество клеток; и (b) идентификацию клеток, связанных с антителом против TREML2, как клеток плода.
[0151] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанный образец содержит множество клеток; (b) выделение клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, с получением обогащенного образца; (с) приведение обогащенного образца в контакт со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и (d) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, как клетки плода, причем указанное первое антитело или указанное второе антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком аналога 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2).
[0152] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт антитело или его антиген-связывающий фрагмент с магнитным реагентом, причем указанный образец содержит множество клеток, а магнитный реагент содержит магнитную частицу, конъюгированную с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанное первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71; (b) приведение образца в контакт с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом; и (с) идентификацию клетки, связанной с антителом против TREML2, как клетки плода.
[0153] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с магнитным реагентом, причем указанный образец содержит множество клеток, а магнитный реагент содержит коллоидную магнитную частицу, конъюгированную с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанное первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD 105 и CD71; (b) приведение образца в контакт со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и (с) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, как клетки плода.
[0154] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с магнитным реагентом и вторым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию (EAEF), причем указанный образец содержит множество клеток, а магнитный реагент содержит коллоидную магнитную частицу, конъюгированную с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанная коллоидная магнитная частица конъюгирована с EAEF, а первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71; (b) приведение образца в контакт со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и (с) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, как клетки плода. В некоторых вариантах реализации первый EAEF содержит первый член специфично связывающейся пары, а второй EAEF содержит второй член специфично связывающейся пары, причем указанная специфично связывающаяся пара выбрана из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0155] В настоящем документе также описан способ обнаружения клеток плода в образце, полученном от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца в контакт с конъюгатом первого антитела, причем указанный образец содержит множество клеток, а указанное первое антитело содержит первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент, конъюгированные с коллоидной магнитной частицей; (b) выделение клеток, связанных с первым антителом, посредством воздействия на образец магнитным полем, что позволяет получить обогащенный образец; (с) приведение обогащенного образца в контакт со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанное второе антитело связывается с маркером на поверхности клетки плода; и (d) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, как клетки плода.
[0156] В настоящем документе также описан способ получения образца клеток плода из образца, полученного от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца, полученного из организма матери и содержащего клетки плода и клетки матери, в контакт с конъюгатом первого антитела, причем указанный конъюгат первого антитела содержит (i) первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент; и (ii) коллоидную магнитную частицу, причем указанное первое антитело конъюгировано с указанной коллоидной магнитной частицей, и (b) выделение клеток, связанных с указанным конъюгатом первого антитела, посредством воздействия на образец, полученный из организма матери, магнитным полем, что позволяет получить образец клеток плода.
[0157] В настоящем документе также описан способ получения образца клеток плода из образца, полученного от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца, полученного из организма матери и содержащего клетки плода и клетки матери, в контакт с конъюгатом первого антитела и вторым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию (EAEF), причем указанный конъюгат первого антитела содержит (i) первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент; (ii) коллоидную магнитную частицу и (iii) первый EAEF, причем указанное первое антитело конъюгировано с указанной коллоидной магнитной частицей, и указанный первый EAEF конъюгирован с указанной коллоидной магнитной частицей, и (b) выделение клеток, связанных с указанным конъюгатом первого антитела, посредством воздействия на образец, полученный из организма матери, магнитным полем, что позволяет получить образец клеток плода. В некоторых вариантах реализации первый EAEF содержит первый член специфично связывающейся пары, а второй EAEF содержит второй член специфично связывающейся пары, причем указанная специфично связывающаяся пара выбрана из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0158] В настоящем документе также описан способ получения образца клеток плода из образца, полученного от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца, полученного из организма матери и содержащего клетки плода и клетки матери, в контакт с конъюгатом первого антитела, причем указанный конъюгат первого антитела содержит (i) первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент; и (ii) коллоидную магнитную частицу, причем указанное первое антитело конъюгировано с указанной коллоидной магнитной частицей и указанное первое антитело представляет собой антитело против TREML2, и (b) выделение клеток, связанных с указанным конъюгатом первого антитела, посредством воздействия на образец, полученный из организма матери, магнитным полем, что позволяет получить образец клеток плода.
[0159] В настоящем документе также описан способ получения образца клеток плода из образца, полученного от беременного субъекта, включающий: (а) приведение образца, полученного из организма матери и содержащего клетки плода и клетки матери, в контакт с конъюгатом первого антитела и вторым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию (EAEF), причем указанный конъюгат первого антитела содержит (i) первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент; и (ii) коллоидную магнитную частицу, причем указанное первое антитело конъюгировано с указанной коллоидной магнитной частицей и указанная коллоидная магнитная частица конъюгирована с указанным первым EAEF, и (b) выделение клеток, связанных с указанным конъюгатом первого антитела, посредством воздействия на образец, полученный из организма матери, магнитным полем, что позволяет получить образец клеток плода. В некоторых вариантах реализации первый EAEF содержит первый член специфично связывающейся пары, а второй EAEF содержит второй член специфично связывающейся пары, причем указанная специфично связывающаяся пара выбрана из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0160] В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой ядросодержащий эритроцит плода (fnRBC). В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой эритробласт.В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой клетку трофобласта.
[0161] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или с первым антителом, причем выделение клеток происходит перед идентификацией клеток.
[0162] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает применение первого антитела. В некоторых вариантах реализации первое антитело конъюгировано с одной или более магнитными частицами. В некоторых вариантах реализации указанные магнитные частицы представляют собой коллоидные магнитные частицы. В некоторых вариантах реализации указанные магнитные частицы представляют собой магнитные частицы ферромагнитной жидкости.
[0163] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает выделение клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает воздействие магнитным полем на образец.
[0164] В некоторых вариантах реализации магнитные частицы присоединены к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0165] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает добавление второго EAEF для индукции агрегации магнитных частиц, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
[0166] В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, включает, состоит из или по существу состоит из добавления члена специфично связывающейся пары к обогащенному образцу с целью устранения агрегации магнитных частиц в обогащенном образце.
[0167] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает добавление к образцу по меньшей мере одного агента, ингибирующего агрегацию, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана. В некоторых вариантах реализации агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент.В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА. Восстанавливающий агент может представлять собой меркаптоэтансульфоновую кислоту. Ингибитор агрегации может представлять собой бычий сывороточный альбумин (БСА).
[0168] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, использует второе антитело. В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком TREML2, или содержит, состоит из или по существу состоит из антиген-связывающего фрагмента, связывающегося с белком TREML2.
[0169] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает выделение одиночных клеток плода. В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют, выделяя одиночные клетки плода, связанные со вторым антителом.
[0170] В некоторых вариантах реализации второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение одиночных клеток плода выполняют с использованием DEPArray.
[0171] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает выполнение анализа на основе секвенирования одной или более молекул нуклеиновой кислоты, выделенных из клетки плода. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0172] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает анализ клетки плода. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение геномного или генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода.
[0173] В некоторых вариантах реализации указанное первое антитело представляет собой антитело, связывающееся с белком TREML2, или содержит антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2.
[0174] В некоторых вариантах реализации антитело, связывающееся с белком TREML2, или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с белком TREML2, содержит 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (а) определяющего комплементарность участка (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из замен, добавлений или делеций.
[0175] В некоторых вариантах антитело против TREML2 конъюгировано с одной или более магнитными частицами. В некоторых вариантах реализации указанные магнитные частицы представляют собой коллоидные магнитные частицы. В некоторых вариантах реализации указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой магнитные частицы ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает помещение клеток в магнитный сепаратор. В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает воздействие магнитным полем на образец.
[0176] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает проточную цитометрию. В некоторых вариантах реализации проточная цитометрия представляет собой сортировку клеток с активацией флуоресценции (FACS).
[0177] В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает выполнение DEP Array.
[0178] В некоторых вариантах реализации идентификация клеток включает выполнение реакции секвенирования.
[0179] В некоторых вариантах реализации образец представляет собой образец, обогащенный клетками плода до приведения образца в контакт с антителом против TREML2. В некоторых вариантах реализации образец обогащают клетками плода посредством приведения образца в контакт с реагентом на основе ферромагнитной жидкости, причем указанная ферромагнитная жидкость содержит антитело, присоединенное к ферромагнитной жидкости.
[0180] В некоторых вариантах реализации антитело связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD 105 и CD71.
[0181] В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают выделение клеток, связанных с антителом, присоединенным к ферромагнитной жидкости, что позволяет получить образец, обогащенный клетками плода.
[0182] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, включает анализ на основе секвенирования. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0183] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает анализ клетки плода. В некоторых вариантах реализации анализ клетки плода включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более аномалий. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение геномного анализа. В некоторых вариантах реализации анализ клеток плода включает выполнение генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия хромосомной аберрации в клетке плода. В некоторых вариантах реализации хромосомная аберрация представляет собой трисомию 21, трисомию 18 или трисомию 13.
[0184] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает выполнение генетического тестирования клетки плода. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического тестирования клетки плода включает обнаружение наличия или отсутствия одного или более пороков плода. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического тестирования клетки плода включает выполнение геномного анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического тестирования клетки плода включает выполнение генетического анализа. В некоторых вариантах реализации выполнение генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия хромосомной аберрации в клетке плода. В некоторых вариантах реализации хромосомная аберрация представляет собой трисомию 21, трисомию 18 или трисомию 13.
[0185] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает предоставление рекомендаций по лечению на основании результатов анализа клетки плода. В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает предоставление рекомендаций по лечению на основании результатов генетического тестирования клетки плода.
[0186] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает введение терапевтического средства субъекту на основании результатов анализа клетки плода. В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает введение терапевтического средства субъекту на основании результатов генетического тестирования клетки плода.
[0187] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает рекомендации дополнительного мониторинга субъекта или плода на основании результатов анализа клетки плода. В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает рекомендации дополнительного мониторинга субъекта или плода на основании генетического тестирования клетки плода.
[0188] На фиг.1 изображен типичный способ выделения, обнаружения и/или анализа редких клеток. Способы, описанные в настоящем документе, могут включать, состоять из или по существу состоять из одного или более этапов, показанных на фиг.1. В некоторых вариантах реализации указанный способ включает, состоит из или по существу состоит из (а) получения от субъекта образца, содержащего множество клеток (101); и (b) выделения редких клеток (110). В некоторых вариантах реализации указанный способ включает, состоит из или по существу состоит из (а) получения от субъекта образца, содержащего множество клеток (101); (b) выделения редких клеток (110); и (с) анализа редких клеток (120). В некоторых вариантах реализации указанный способ включает, состоит из или по существу состоит из (а) получения от субъекта образца, содержащего множество клеток (101); (b) выделения редких клеток (110); (с) анализа редких клеток (120); и (d) формирования одного или более отчетов на основании анализа редких клеток (106).
[0189] Как показано на фиг.1, в некоторых вариантах реализации указанный способ включает, состоит из или по существу состоит из (а) получения от субъекта образца, содержащего множество клеток (101); (b) выделения редких клеток (110) посредством (i) извлечения нередких клеток из образца с получением обогащенного редкими клетками образца (102); и (ii) выделения редких клеток из обогащенного редкими клетками образца (103); (с) анализа редких клеток (120) посредством (i) очистки молекул нуклеиновой кислоты из редких клеток (104); и (ii) секвенирования одной или более молекул нуклеиновой кислоты (105); и (f) формирования одного или более отчетов (106). В некоторых вариантах реализации редкие клетки представляют собой клетки плода. В некоторых вариантах реализации обогащение редкими клетками (102) включает, состоит из или по существу состоит из приведения образца в контакт с ферромагнитной жидкостью, причем указанная ферромагнитная жидкость содержит антитело, присоединенное к магнитной частице, а указанное антитело связывается с маркером на редких клетках. В некоторых вариантах реализации маркер на редких клетках представляет собой любой из маркеров, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации маркер на редких клетках является белком TREML2. В некоторых вариантах реализации указанное антитело представляет собой любое из антител, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации указанное антитело является антителом против TREML2. В некоторых вариантах реализации указанное антитело представляет собой любое из антител против TREML2, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации ферромагнитная жидкость содержит, состоит из или по существу состоит из структуры ферромагнитной жидкости, изображенной на фиг.2. В некоторых вариантах реализации обогащение редкими клетками (102) дополнительно включает, состоит из или по существу состоит из использования внешнего градиентного магнитного сепаратора по отношению к образцу для удаления клеток, не связанных с ферромагнитной жидкостью. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает, состоит из или по существу состоит из приведения редких клеток в контакт с одним или более из дополнительных антител, причем указанные одно или более из дополнительных антител конъюгированы с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации редкие клетки приводят в контакт с одним или более из дополнительных антител перед выделением редких клеток (103). В некоторых вариантах реализации выделение редких клеток (103) включает, состоит из или по существу состоит из отбора одиночных клеток, связанных с антителом, связывающимся с маркером на редких клетках. В некоторых вариантах реализации указанное антитело является антителом против TREML2. В некоторых вариантах реализации указанное антитело против TREML2 представляет собой любое из антител против TREML2, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 содержит (а) определяющий комплементарность участок (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащий, состоящий из или по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащий, состоящий из или по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащий, состоящий из или по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащий, состоящий из или по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащий, состоящий из или по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащий, состоящий из или по существу состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации выделение редких клеток (103) включает, состоит из или по существу состоит из сортировки редких клеток из обогащенного образца клеток. В некоторых вариантах реализации выделение редких клеток (103) включает, состоит из или главным образом состоит из выполнения сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение редких клеток (103) включает, состоит из или главным образом состоит из выполнения DEPArray. В некоторых вариантах реализации очистка молекул нуклеиновой кислоты из редких клеток (104) включает, состоит из или главным образом состоит из выполнения амплификации нуклеиновых кислот.В некоторых вариантах реализации очистка молекул нуклеиновой кислоты из редких клеток (104) включает, состоит из или главным образом состоит из получения библиотеки нуклеиновых кислот.
[0190] На фиг.3 изображен типичный способ обнаружения редких клеток (например, клеток плода). В некоторых вариантах реализации указанный способ включает, состоит из или по существу состоит из (а) приведения образца (301), содержащего множество клеток (302, 303), в контакте первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом (304); и (b) идентификации клеток (303), связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом (304), как клеток плода. В некоторых вариантах реализации первое антитело (304) является антителом, связывающимся с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации антиген-связывающий фрагмент (304) связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из одного или более из антител против TREML2, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. Первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент может быть присоединен к магнитной частице. Например, первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент может находиться в форме ферромагнитной жидкости. В качестве альтернативы, первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент может быть конъюгирован с меткой. Метка может представлять собой любую из меток, описанных в настоящем документе. Например, первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент может быть конъюгирован с флуоресцентной меткой. Клетки можно идентифицировать посредством любой из методик идентификации, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации идентификация клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом включает выделение клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом. Выделение клеток может включать собой любую из методик выделения клеток, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации выделение клеток включает магнитное разделение. В некоторых вариантах реализации идентификация клеток может включать применение микроскопа. Выделение клеток может включать флуоресцентную микроскопию. В некоторых вариантах реализации идентификация клеток включает FACS или основана на ней. В качестве альтернативы или дополнения идентификация клеток включает DEP Array или основана на нем.
[0191] На фиг.4 изображен типичный способ выделения и обнаружения редких клеток. В некоторых вариантах реализации способ обнаружения редких клеток включает, состоит из или главным образом состоит из (а) приведения образца (401), содержащего множество клеток (402, 403), в контакт с конъюгатом антитела (406), причем указанный конъюгат антитела (406) содержит первое антитело или антиген-связывающий фрагмент (404), присоединенный к магнитной частице (405); (b) обогащения редкими клетками (403) посредством воздействия магнитным полем на образец (407) и удаления клеток (402), не связанных с конъюгатом антитела, что позволяет получить обогащенный редкими клетками образец (411); (с) приведение указанного обогащенного редкими клетками образца (411) в контакт с конъюгатом антитела (410), причем указанный конъюгат антитела (410) содержит второе антитело или антиген-связывающий фрагмент (408), конъюгированный с меткой (409); и (d) идентификацию клетки, связанной с конъюгатом антитела, как редкой клетки (403). В некоторых вариантах реализации редкая клетка представляют собой клетку плода.
В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой ядросодержащий эритроцит плода (fhRBC). В некоторых вариантах реализации обогащенный редкими клетками образец (411) содержит редкую клетку (403), связанную с конъюгатом антитела (406), причем указанный конъюгат антитела содержит первое антитело (404) или его антиген-связывающий фрагмент (404), конъюгированный с магнитной частицей (405). В качестве альтернативы или дополнения обогащенные редкими клетками образец (411) дополнительно обрабатывают для отсоединения редких клеток (403) от конъюгата антитела (406). В некоторых вариантах реализации первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации первое второе антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации как указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент, так и указанное второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связываются с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) первое антитело или антиген-связывающий фрагмент или (b) второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71, а (b) указанное второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с ЕрСАМ, а (b) указанное второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с CD 105, а (b) второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с CD71, а (b) второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации антитело или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с TREML2, представляет собой любое из антител или антиген-связывающих фрагментов против TREML2, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации второе антитело является антителом, связывающимся с первым антителом. Например, если первое антитело является IgG-антителом козы, второе антитело может представлять собой антитело мыши против IgG козы. В некоторых вариантах реализации метка представляет собой любую из меток, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации магнитная частица дополнительно конъюгирована с первым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию (EAEF). В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (А) дополнительно включает приведение образца (401) в контакт со вторым EAEF, способным связываться с первым EAEF. В некоторых вариантах реализации добавление второго EAEF индуцирует агрегацию конъюгата антитела (406). В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает добавление третьего EAEF, способного связываться с первым или вторым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию. В некоторых вариантах реализации добавление третьего EAEF устраняет агрегацию первого EAEF. В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (а) дополнительно включает добавление к образцу агента, ингибирующего агрегацию. Клетки можно идентифицировать посредством любой из методик идентификации, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации идентификация клетки может включать применение микроскопа. Идентификация клетки может включать флуоресцентную микроскопию. В некоторых вариантах реализации идентификация клетки включает FACS или основана на ней. В качестве альтернативы или дополнения, идентификация клетки включает DEP Array или основана на нем.
[0192] На фиг.20 изображен еще один типичный способ выделения и обнаружения редких клеток. Как показано на фиг.20, в некоторых вариантах реализации способ обнаружения редких клеток включает, состоит из или главным образом состоит из этапа (А1): приведения образца (2001), содержащего множество клеток (2002, 2003), в контакт с конъюгатом первого антитела (2006) и вторым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию (EAEF) (2011), причем указанный конъюгат первого антитела (2006) содержит первое антитело или антиген-связывающий фрагмент (2004), присоединенный к магнитной частице (2005), причем указанная магнитная частица (2005) дополнительно конъюгирована с первым EAEF (2012); и этап (В1) обогащения редких клеток (2003) посредством воздействия магнитным полем на образец (2007) и удаления клеток (2002), не связанных с комплексом конъюгат антитела (2006)-второй EAEF (2011), что позволяет получить обогащенный редкими клетками образец (2011). Как показано на этапе (А2), добавление второго EAEF (2011) индуцирует агрегацию первого конъюгата антитела (2006). В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (В2) дополнительно включает добавление третьего EAEF (2013) к обогащенному редкими клетками образцу (2011). Как показано на этапе (ВЗ), добавление третьего EAEF (2013) устраняет агрегацию конъюгата первого антитела (2006). В некоторых вариантах реализации способ дополнительно включает этап (С) приведения обогащенного редкими клетками образца (2011) в контакт с конъюгатом второго антитела (2010), причем указанный конъюгат второго антитела содержит второе антитело или антиген-связывающий фрагмент (2008), конъюгированный с меткой (2009). В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (D) дополнительно включает идентификацию клетки, связанной с конъюгатом первого антитела (2006), как редкой клетки (2003). В некоторых вариантах реализации указанный способ перед этапом (D) дополнительно включает идентификацию клетки, связанной с конъюгатом второго антитела (2010), как редкой клетки (2003). В некоторых вариантах реализации редкая клетка представляют собой клетку плода. В некоторых вариантах реализации клетка плода представляет собой я дрос о держащий эритроцит плода (fnRBC). В некоторых вариантах реализации обогащенный редкими клетками образец (2011) содержит редкую клетку (2003), связанную с конъюгатом первого антитела (2006), причем указанный конъюгат первого антитела содержит первое антитело (2004) или его антиген-связывающий фрагмент (2004), конъюгированный с магнитной частицей (2005), причем указанная магнитная частица (2005) дополнительно конъюгирована с первым EAEF (2012). В качестве альтернативы или дополнения обогащенные редкими клетками образец (2011) дополнительно обрабатывают для отсоединения редких клеток (2003) от конъюгата антитела (2006). В некоторых вариантах реализации первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации первое второе антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации как указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент, так и указанное второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связываются с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) первое антитело или антиген-связывающий фрагмент или (b) второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71, а (b) указанное второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с ЕрСАМ, а (b) указанное второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с CD105, а (b) второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации (а) первое антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с CD71, а (b) второе антитело или антиген-связывающий фрагмент связывается с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации антитело или антиген-связывающий фрагмент, связывающийся с TREML2, представляет собой любое из антител или антиген-связывающих фрагментов против TREML2, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ГО NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации второе антитело является антителом, связывающимся с первым антителом. Например, если первое антитело является IgG-антителом козы, второе антитело может представлять собой антитело мыши против IgG козы. В некоторых вариантах реализации метка представляет собой любую из меток, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации указанная коллоидная магнитная частица представляет собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации способ перед этапом (А1) дополнительно включает добавление к образцу агента, ингибирующего агрегацию. В некоторых вариантах реализации первый EAEF (2012) представляет собой детиобиотин. В некоторых вариантах реализации второй EAEF (2011) представляет собой стрептавидин. В некоторых вариантах реализации третий EAEF (2013) представляет собой биотин. Клетки можно идентифицировать посредством любой из методик идентификации, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации идентификация клетки может включать применение микроскопа. Идентификация клетки может включать флуоресцентную микроскопию. В некоторых вариантах реализации идентификация клетки включает FACS или основана на ней. В качестве альтернативы или дополнения, идентификация клетки включает DEP Array или основана на нем. В некоторых вариантах реализации идентификация клетки включает иммуноанализ или основана на нем.
[0193] Хотя способы, описанные в настоящем документе, могут снижать применение антитела против TREML2 или его антиген-связывающего фрагмента или конъюгатов антител, содержащих антитело против TREML2, любой из указанных способов можно выполнять с применением любого агента, способного связываться с белком TREML2, или конъюгатов, содержащих агент, способный связываться с белком TREML2. Соответственно, способы, описанные в настоящем документе, не ограничиваются применением антитела против TREML2 или его антиген-связывающего фрагмента или конъюгатов антител, содержащих антитело против TREML2.
[0194] Способы генетического тестирования плода на основе клеток
[0195] Выявление нового маркера клеток плода, например, TREML-2, позволяет выделять и/или обнаруживать клетки плода, а затем анализировать такие клетки. Соответственно, в настоящем документе описаны способы генетического тестирования плода на основе клеток. В некоторых вариантах реализации указанные способы включают (а) применение антитела против TREML2 для выделения клеток плода из образца, полученного от беременного субъекта; и (b) анализ одной или более молекул нуклеиновой кислоты из клеток плода для определения вероятности наличия одной или более генетических аномалий у плода. В качестве альтернативы, указанные способы включают выделение клеток плода с помощью любого из способов выделения или обнаружения клеток плода, описанных в настоящем документе; и анализ одной или более молекул нуклеиновой кислоты из выделенных или обнаруженных клеток плода для определения вероятности наличия одной или более генетических аномалий у плода. В некоторых вариантах реализации указанные способы включают анализ клеток плода, выделенных и/или обнаруженных любым из способов, описанных в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации указанные способы включают анализ клеток плода, полученных любым из способов, описанных в настоящем документе.
[0196] В настоящем документе описан способ генетического тестирования плода на основе клеток, включающий: (а) приведение образца, полученного от беременного субъекта, в контакт с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанный образец содержит множество клеток; (b) выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом; (с) анализ одной или более из молекул нуклеиновой кислоты из клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом; и (d) формирование отчета на основе анализа указанной одной или более из молекул нуклеиновой кислоты, причем в указанном отчете представлена вероятность наличия одной или более из генетических аномалий у плода.
[0197] В настоящем документе описан способ генетического тестирования плода на основе клеток, включающий: (а) приведение образца, полученного от беременного субъекта, в контакт с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанный образец содержит множество клеток, указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент конъюгирован с коллиодной магнитной частицей, и указанное первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с маркером на клетке плода; (b) выделение клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; (с) анализ одной или более из молекул нуклеиновой кислоты из клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и (d) формирование отчета на основании анализа указанной одной или более из молекул нуклеиновой кислоты, причем в указанном отчете представлена вероятность наличия одной или более из генетических аномалий у плода.
[0198] В настоящем документе описан способ генетического тестирования плода на основе клеток, включающий: (а) приведение образца, полученного от беременного субъекта, в контакт с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом и вторым экзогенным фактором, усиливающим агрегацию (EAEF), причем указанный образец содержит множество клеток, указанное первое антитело или антиген-связывающий фрагмент конъюгирован с коллоидной магнитной частицей, указанная коллоидная магнитная частица конъюгирована с первым EAEF, и первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с маркером на клетке плода; (b) выделение клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; (с) анализ одной или более из молекул нуклеиновой кислоты из клеток, связанных с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом; и (d) формирование отчета на основании анализа указанной одной или более из молекул нуклеиновой кислоты, причем в указанном отчете представлена вероятность наличия одной или более из генетических аномалий у плода. В некоторых вариантах реализации первый EAEF содержит первый член специфично связывающейся пары, а второй EAEF содержит второй член специфично связывающейся пары, причем указанная специфично связывающаяся пара выбрана из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0199] В некоторых вариантах реализации первое антитело является антителом против TREML2. В некоторых вариантах реализации первое антитело является антителом против CD71. В некоторых вариантах реализации первое антитело является антителом против ЕрСАМ. В некоторых вариантах реализации первое антитело является антителом против CD105. В некоторых вариантах реализации, если первое антитело является антителом против ЕСАМ или антителом против CD105, указанный способ дополнительно включает контакт выделенных клеток со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, причем указанное второе антитело связывается с маркером на клетках плода. В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело является антителом против TREML2. В некоторых вариантах реализации указанное второе антитело является антителом против CD71. В некоторых вариантах реализации второе антитело или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает выделение клеток, связанных со вторым антителом. В некоторых вариантах реализации указанный способ дополнительно включает анализ молекул нуклеиновой кислоты клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом.
[0200] В некоторых вариантах реализации клетки, связанные с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, представляют собой клетки плода. В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой эритробласты плода. В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой ядросодержащие эритроциты плода (fnRBC). В некоторых вариантах реализации клетки плода представляют собой клетки трофобласта плода.
[0201] В некоторых вариантах реализации анализ указанных одной или более из молекул нуклеиновой кислоты включает выполнение анализа кариотипа. Анализ кариотипа можно выполнять с применением любой методики, известной в данной области техники.
[0202] В некоторых вариантах реализации анализ указанных одной или более молекул нуклеиновой кислоты включает выполнение анализа на основе секвенирования. Анализ на основе секвенирования можно выполнять с применением любой методики, известной в данной области техники. В некоторых вариантах реализации анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
[0203] В некоторых вариантах реализации анализ указанных одной или более молекул нуклеиновой кислоты включает выполнение одной или более реакций амплификации. Амплификацию нуклеиновой кислоты можно выполнять посредством любой методики, известной в данной области техники. В некоторых вариантах реализации амплификацию нуклеиновой кислоты выполняют посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР).
[0204] В некоторых вариантах реализации указанные одна или более из генетических аномалий выбраны из трисомии, аномалии половых хромосом и структурной аномалии. В некоторых вариантах реализации генетическая аномалия представляет собой трисомию. В некоторых вариантах реализации трисомия выбрана из трисомии 3, трисомии 4, трисомии 6, трисомии 7, трисомии 8, трисомии 9, трисомии 10, трисомии 11, трисомии 12, трисомии 13, трисомии 16, трисомии 17, трисомии 18, трисомии 20, трисомии 21 и трисомии 22. В некоторых вариантах реализации генетическая аномалия представляет собой аномалию половых хромосом. В некоторых вариантах реализации аномалия половых хромосом выбрана из моносомии X, трисомии X и синдрома Клайнфельтера. В некоторых вариантах реализации генетическая аномалия представляет собой структурную аномалию. В некоторых вариантах реализации структурная аномалия является вариацией количества копий (CNV). В некоторых вариантах реализации структурная аномалия является делецией CNV или дупликацией CNV.
[0205] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с магнитной частицей. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу.
[0206] В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют посредством воздействия магнитным полем на образец.
[0207] В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, перед приведением образца в контакт с антителом против TREML2 дополнительно включают приведение образца в контакт с первым антителом, причем указанное первое антитело связывается с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105 и CD71. В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, перед приведением образца в контакт с антителом против TREML2 дополнительно включают выделение клеток, связанных с первым антителом. В некоторых вариантах реализации первое антитело конъюгировано с магнитной частицей. В некоторых вариантах реализации указанная магнитная частица представляет собой коллоидную магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с первым антителом, выполняют, подвергая образец воздействию магнитного поля.
[0208] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгированы с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют с помощью DEP Array.
[0209] В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включает приведение клеток, связанных с антителом против TREML2 или его антиген-связывающим фрагментом, в контакт со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации второе антитело представляет собой антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент.В некоторых вариантах реализации второе антитело конъюгировано с меткой. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной меткой. В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включает выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, основано на иммунофлуоресцентной технологии. В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). В некоторых вариантах реализации выделение клеток, связанных со вторым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, выполняют с помощью DEP Array.
[0210] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 выбрано из sc-109096, ARP49877_Р050, ОАСА04996, AF3259, МА5-30973, РА5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABFN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661. В качестве альтернативы или дополнения, антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит две или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0211] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает предоставление рекомендаций по лечению на основании результатов генетического тестирования клетки плода.
[0212] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает введение терапевтического средства субъекту на основании результатов генетического тестирования клетки плода.
[0213] В некоторых вариантах реализации любой из способов, описанных в настоящем документе, дополнительно включает рекомендации дополнительного мониторинга субъекта или плода на основании генетического тестирования клетки плода.
[0214] Хотя способы, описанные в настоящем документе, могут снижать применение антитела против TREML2 или его антиген-связывающего фрагмента или конъюгатов антител, содержащих антитело против TREML2, любой из указанных способов можно выполнять с применением любого агента, способного связываться с белком TREML2, или конъюгатов, содержащих агент, способный связываться с белком TREML2. Соответственно^ способы, описанные в настоящем документе, не ограничиваются применением антитела против TREML2 или его антиген-связывающего фрагмента или конъюгатов антител, содержащих антитело против TREML2.
[0215] Агенты, связывающие маркер редких клеток
[0216] В настоящем документе описаны агенты, связывающие маркер редких клеток. В настоящем документе «маркер редких клеток» представляет собой маркер (т.е. белок клеточной поверхности) на редкой клетке (например, клетке плода). Маркер редких клеток может представлять собой белок клеточной поверхности, более интенсивно экспрессируемый на редкой клетке по сравнению с клетками другого типа в образце. Маркер редких клеток может представлять собой белок аналога 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2). Маркер редких клеток может представлять собой белок TREML2 человека. Белок TREML2 человека может обладать аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 1. В качестве альтернативы, маркер редких клеток может представлять собой CD71. В некоторых вариантах реализации маркер редких клеток не является CD71.
[0217] В настоящем документе термины «TREML2» и «TLS1» относятся к одному и тому же белку и используются взаимозаменяемо). TLS1 и TREML2 относятся к одному и тому же маркеру, обладают идентичными последовательностями, соответствующим аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1, и содержат домены и фрагменты, обладающие аминокислотными последовательностями SEQ ID No:: 2-5.
[0218] В настоящем документе «редкая клетка» относится к клетке, присутствующей в образце, полученном от субъекта, в концентрации менее 10% от общей популяции клеток, причем указанный образец представляет собой неочищенный или необогащенный образец. В некоторых вариантах реализации редкая клетка присутствует в образце в концентрации менее 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% от общей популяции клеток. В некоторых вариантах реализации редкая клетка присутствует в образце в концентрации менее 1% от общей популяции клеток В некоторых вариантах реализации редкая клетка представляет собой клетку плода, а образец получен от беременного субъекта.
[0219] В настоящем документе термин «неочищенный образец» или «необогащенный образец» могут использоваться взаимозаменяемо и относятся к образцу, полученному от субъекта и не обработанному с целью удаления или выделения клеток из образца. В качестве альтернативы или дополнения, неочищенный образец или необогащенный образец относится к образцу, полученному от субъекта и не обедненному по одной или более клеткам. В качестве альтернативы или дополнения, неочищенный образец или необогащенный образец относится к образцу, полученному от субъекта и содержащему множество клеток различных типов.
[0220] В некоторых вариантах реализации агент, связывающийся с маркером редких клеток, выбран из антитела, фрагмента антитела, рецептора и лиганда. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела содержит антиген-связывающий домен антитела. В некоторых вариантах реализации фрагмент антитела выбран из одновалентного антиген-связывающего фрагмента (Fab или Fab'), двухвалентного антиген-связывающего фрагмента ((Fab)2 или (Fab')2), вариабельного фрагмента (Fv), одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), двухвалентного антитела, триатела, тетратела, миниантитела и биспецифичного scFv (бис-scFv).
[0221] В общем случае одновалентные фрагменты Fab содержат один антиген-связывающий сайт, в то время как двухвалентные фрагменты (Fab)2 содержат две антиген-связывающие области, соединенные дисульфидными связями. Fab-фрагменты состоят из вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL) и константных областей 1 тяжелой (CH1) и легкой цепей (CL1) антитела. Fv-фрагменты содержат антиген-связывающий сайт, состоящий из вариабельных областей тяжелой (VH) и легкой цепей (VL), но не содержат константных областей Fab (CH1 и CL). VH и VL соединены в Fv-фрагментаху-фрагментах посредством нековалентных взаимодействий. Fab может представлять собой димер (Fab2) или тример (Fab3), что позволяет связывать 2 или 3 различных антигена, соответственно.
[0222] Ориентация V-доменов и линкера может варьировать, что приводит к созданию различных форм Fv-молекул. В общем случае, если длина линкера составляет по меньшей мере 12 остатков, scFv-фрагменты являются в основном мономерными. Линкеры длиной 3-11 остатков позволяют получать scFv-молекулы, неспособные укладываться в функциональный Fv-домен. Эти молекулы ассоциируют со второй scFv-молекулой, что приводит к созданию двухвалентного диатела. Триатела или тетратела могут образовываться при длине линкера менее трех остатков. Миниантитела представляют собой гибридные белки scFv-CH3, собирающиеся в двухвалентные димеры. Бис-scFv-фрагменты состоят из scFv-фрагментов с двумя различными вариабельными доменами и способны одновременно связывать два различных эпитопа.
[0223] Антитело может являться поликлональным антителом. В качестве альтернативы или дополнения, антитело может являться моноклональным антителом. Антитело может являться иммуноглобулином гамма (IgG-антителом). IgG-антитело может являться IgG1-антителом. IgG-антитело может являться IgG2-антителом. IgG-антитело может являться IgG3-антителом. IgG-антитело может являться IgG4-антителом. Антитело может являться иммуноглобулином мю (IgM-антителом). Антитело может являться иммуноглобулином эпсилон (IgE-антителом). Антитело может являться иммуноглобулином дельта (IgD-антителом). Антитело может являться иммуноглобулином альфа (IgA-антителом). IgGA-антитело может являться IgGA1-антителом. В качестве альтернативы, IgG-антитело является IgGA2-антителом
[0224] В некоторых вариантах реализации агент представляет собой антитело или фрагмент антитела, связывающийся с белком TREML2. В некоторых вариантах реализации антитело или фрагмент антитела связывается с внеклеточным доменом белка TREML2. В некоторых вариантах реализации внеклеточный домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В качестве альтернативы, антитело или фрагмент антитела может связываться с фрагментом внеклеточного домена TREML2. Фрагмент внеклеточного домена содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3-4. Антитело или фрагмент антитела может связываться с N-концевым доменом белка TREML2.
[0225] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 является поликлональным антителом. Поликлональное антитело может быть выбрано из антитела против TREML2, выбранного из sc-109096 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), ARP49877 P050 (Aviva Systems Biology), OACA04996 (Aviva Systems Biology), AF3259 (R&D Systems), PA5-47471 (Thermo Fisher), ABIN634968 (Antibodies-online.com), ABIN928294 (Antibodies-online.com), 30-552 (ProSci), ABIN2463297 (antibodies-online.com), ABIN749888 (antibodies-online.com), bs-2737r (Bioss), ABIN1999045 (antibodies-online.com), 11655-rp02 (Sino Biological), ABIN293207 (antibodies-online.com), ABIN2387613 (antibodies-online.com), t8282-40 (USBio), ABIN4249314 (antibodies-online.com) и nbpl-70737-20ul (Novus Biologicals).
[0226] Антитело против TREML2 может являться моноклональным антителом. Моноклональное антитело может быть выбрано из МА5-30973 (Thermo Fisher), ABIN19999041 (antibodies-online.com), 11655-r001 (Sino Biological) и BD563661 (Fisher Scientific).
[0227] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 CDR, выбранных из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
[0228] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 1, 2 или 3 CDR, выбранных из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; и (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
[0229] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из 1, 2 или 3 CDR, выбранных из (а) участка, определяющего комплементарность CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (b) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (с) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
[0230] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит, состоит из или по существу состоит из (а) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (b) CDR2 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; (с) CDR3 HCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); (d) CDR1 вариабельной области легкой цепи (LCVR), содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; и (е) CDR2 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (f) CDR3 LCVR, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
[0231] В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну, две или три или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации SEQ ID NO: 6 содержит одну, две или три или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации SEQ ID NO: 7 содержит одну, две или три или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации SEQ ID NO: 8 содержит одну, две или три или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации SEQ ID NO: 9 содержит одну, две или три или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций. В некоторых вариантах реализации SEQ ID NO: 10 содержит одну аминокислотную замену, добавление или делецию. В некоторых вариантах реализации SEQ ID NO: 11 содержит одну, две или три или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0232] В некоторых вариантах реализации антитело против TREML2 конъюгировано с меткой с образованием конъюгированного антитела. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из флуоресцентной метки, радионуклида, ферментативной метки, хемилюминесцентной метки и гаптена. В некоторых вариантах реализации обнаружимая метка представляет собой гаптен. В некоторых вариантах реализации гаптен выбран из DCC, биотина, нитропиразола, тиазолсульфонамида, бензофуразана и 2-гидроксихиноксалина. В некоторых вариантах реализации обнаружимая метка представляет собой биотин. В некоторых вариантах реализации метка является флуоресцентной молекулой. В некоторых вариантах реализации флуоресцентная молекула выбрана из флуорофора, цианинового красителя и красителя для ближней инфракрасной (БИК) области спектра. В некоторых вариантах реализации флуоресцентная молекула представляет собой флуоресцеин. В некоторых вариантах реализации флуоресцентная молекула представляет собой флуоресцеинизотиоцианат (FITC). В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина. В некоторых вариантах реализации конъюгированное антитело выбрано из ABIN6070559 (antibodies-online.com), abx307664 (Abbexa polyclonal), ABIN6070561 (antibodies-online.com), abx307665 (Abbexa, polyclonal), ABIN2662892 (antibodies-online.com), bld-351203 (BioLegend), ABIN2662891 (antibodies-online.com), bld-351204 (BioLegend), ABIN2662890 (antibodies-online.com, monoclonal) и bld-351104 (BioLegend).
[0233] Магнитные частицы
[0234] Способы, композиции и наборы, описанные в настоящем документе, могут включать или использовать магнитные частицы. Например, любое из антител (или, в более общем случае, любые агенты, связывающие маркер редких клеток), описанных в настоящем документе, может быть конъюгировано с магнитной частицей. В некоторых вариантах реализации агент, связывающийся с маркером редких клеток (например, TREML2), конъюгирован с магнитной частицей. Магнитные частицы могут представлять собой коллоидные магнитные частицы. Коллоидные магнитные частицы могут представлять собой ферромагнитную жидкость.
[0235] В настоящем документе термин "магнитная частица" относится к частице, которой можно манипулировать с помощью магнитного поля. Магнитная частица содержит металл. Примеры металлов включают железо, никель, кобальт и медь, но не ограничиваются ими. [0236] В настоящем документе термин "коллоидная магнитная частица" относится к магнитной частице, покрытой немагнитным материалом. Примером немагнитной частицы является бычий сывороточный альбумин (БСА).
[0237] В настоящем документе термин "магнитная частица ферромагнитной жидкости" относится к коллоидной магнитной частице, содержащей железо.
[0238] В некоторых вариантах реализации указанные магнитные частицы характеризуются размером менее микрона. В некоторых вариантах реализации диаметр частиц в общем случае составляет менее приблизительно 300 нанометров (нм), 275 нм, 250 нм, 225 нм, 200 нм, 190 нм, 180 нм, 170 нм, 160 нм, 150 нм, 140 нм, 130 нм, 120 нм, 110 нм или 100 нм. В некоторых вариантах реализации диаметр частиц в общем случае составляет по меньшей мере 10 нм, 20 нм, 30 нм, 40 нм, 50 нм, 60 нм, 70 нм, 80 нм, 90 нм, 100 нм, 110 нм или 120 нм или более. В некоторых вариантах воплощения диаметр частиц находится между приблизительно 40 нм и 250 нм, 40 нм и 200 нм, 50 нм и 200 нм, 50 нм и 190nm 50 нм и 180 нм, 50 нм и 170 нм, 60 нм и 200 нм, 70 нм и 200 нм, 80 нм и 200 нм, 90 нм и 200 нм, 90 нм и 175 нм или 90 нм и 150 нм.
[0239] В некоторых вариантах реализации магнитная масса частицы составляет по меньшей мере 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 97% или более. В некоторых вариантах реализации магнитная масса частицы находится между приблизительно 40% и 95%, 45% и 95%, 50% и 90%, 55% и 90%, 60% и 90% или 70% и 90%.
[0240] В некоторых вариантах реализации можно применять частицы в диапазоне от 90-150 нм и с магнитной массой от 70 до 90%.
[0241] В некоторых вариантах реализации частицы характеризуются устойчивостью к гравитационному отделению от раствора. Частицы могут быть устойчивы к гравитационному отделению в течение продолжительного времени. Частицы могут быть устойчивы к гравитационному отделению в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105 или 120 или более минут.Частицы могут быть устойчивы к гравитационному отделению в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105 или 120 или более часов. Частицы могут быть устойчивы к гравитационному отделению в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 75, 90, 105 или 120 или более суток. [0242] В некоторых вариантах реализации магнитные частицы состоят из кристаллического ядра из суперпарамагнитного материала, окруженного молекулами покрытия, связанными с магнитным ядром, например, физически адсорбированными или ковалентно присоединенными, которые придают ей стабилизирующие коллоидные свойства. Материал покрытия можно наносить в количестве, эффективно предотвращающем неспецифичные взаимодействия между биологическими макромолекулами, находящимися в образце, и магнитными ядрами. Такие биологические макромолекулы могут включать остатки сиаловой кислоты на поверхности неспецифичных клеток, лектины, гликопротеины и другие мембранные компоненты. Кроме того, материал покрытия может обеспечивать максимально возможное отношение магнитная масса/наночастица. Размер магнитных кристаллов, составляющих ядро, достаточно мал, и они не содержат полного магнитного домена. Размер наночастиц таков, что их броуновская энергия превышает их магнитный момент.Как следствие, выравнивание северного и южного полюсов и последующее взаимное притяжение/отталкивание этих коллоидных магнитных частиц, по-видимому, не происходит даже в магнитном поле умеренной силы, что вносит вклад в стабильность их раствора.
[0243] Магнитные частицы можно отделять в сепараторах со значительным градиентом внешнего магнитного поля. Указанные характеристики облегчают работу с образцом и обеспечивают экономические преимущества по сравнению с более сложными колонками с внутренним градиентом, загруженными ферромагнитными гранулами или стальной ватой.
[0244] Магнитные частицы можно получать путем модификации материала основы, как описано в ЕР 0842042, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.
[0245] Магнитные частицы могут быть покрыты Ат (или, в более общем случае, любыми агентами), способными распознавать дифференциально экспрессирующиеся белки, соответствующие наиболее перспективным кандидатам, выявленным в примере 1. В некоторых вариантах реализации магнитные частицы могут быть покрыты агентом, связывающимся с маркером редких клеток (например, TREML2). Магнитные частицы могут быть покрыты любым из антител или агентов, описанных в настоящем документе.
[0246] Покрытие на магнитные частицы можно нанести любым способом, известным в данной области техники. Например, магнитные частицы могут быть покрыты антителом, описанным в US 6365362 B1, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.
[0247] На фиг.2 изображена типичная структура магнитной частицы ферромагнитной жидкости. Магнитная частица ферромагнитной жидкости, описанная в настоящем документе, может включать, состоять из или по существу состоять из структуры магнитной частицы ферромагнитной жидкости, показанной на фиг.2. В некоторых вариантах реализации магнитная частица ферромагнитной жидкости, описанная в настоящем документе, обладает структурой магнитной частицы ферромагнитной жидкости, показанной на фиг.2. Как показано на фиг.2, типичная структура магнитной частицы ферромагнитной жидкости включает, состоит из или по существу состоит из атома железа, окруженного бычьим сывороточным альбумином (БСА). БСА присоединен к стрептавидину (SA), который присоединен к биотину (ВТ). ВТ может быть присоединен к еще одной молекуле БСА, которая присоединена к экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (например, детиобиотину (Dt-BT)). ВТ также может быть присоединен к антителу (Y), связывающемуся с маркером на редкой клетке. В некоторых вариантах реализации редкая клетка представляют собой клетку плода. В некоторых вариантах реализации маркер представляет собой TREML2. В качестве альтернативы маркер представляет собой ЕрСАМ, CD105 или CD71.
[0248] На фиг.7 изображена схема агрегации магнитных частиц за счет контролируемой агрегации. Как показано на фиг.7, магнитная частица, например, магнитная частица ферромагнитной жидкости, изображенная на фиг.2, присоединена к экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (например, детиобиотину (Dt-BT)). Добавление второго EAEF (например, стрептавидина (SA)), способного связываться с первым EAEF, стимулирует агрегацию конъюгатов антитело-магнитная частица. В некоторых вариантах реализации агрегацию конъюгатов антитело-магнитная частица устраняют путем добавления третьего EAEF, причем указанный третий EAEF способен связываться с первым EAEF или вторым EAEF. В некоторых вариантах реализации третий EAEF идентичен первому EAEF. В качестве альтернативы, третий EAEF идентичен второму EAEF. В еще одном варианте реализации третий EAEF является партнером по связыванию первого EAEF или второго EAEF (например, биотина).
[0249] Композиции и наборы
[0250] В настоящем документе описаны композиции и наборы, содержащие любое из антител против TREML2, описанных в настоящем документе, или его антиген-связывающий фрагмент.Композиции и наборы могут дополнительно содержать один или более компонентов, выбранных из магнитного реагента, одного или более дополнительных антител, ингибитора агрегации и фактора агрегации.
[0251] В некоторых вариантах реализации набор содержит (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) магнитный реагент.
[0252] В некоторых вариантах реализации набор содержит (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) коллоидную магнитную частицу.
[0253] В некоторых вариантах реализации набор содержит (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) одно или более дополнительное антитело или его антиген-связывающий фрагмент.
[0254] Кроме того, в настоящем документе описан набор, содержащий (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) второе антитело или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанное второе антитело связывается с белком, экспрессируемым на поверхности ядросодержащего эритроцита плода (fhRBC).
[0255] Кроме того, в настоящем документе описан набор, содержащий (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) второе антитело или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанное второе антитело конъюгировано с меткой.
[0256] Кроме того, в настоящем документе описан набор, содержащий (а) первое антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанное первое антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент конъюгирован с магнитной частицей; и (b) второе антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанное второе антитело против TREML2 конъюгировано с меткой.
[0257] В некоторых вариантах реализации композиция или набор содержит антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент, причем указанное антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент содержит (а) вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую, состоящую из или по существу состоящую из (i) участка, определяющего комплементарность (CDR) 1, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6; (ii) CDR2, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 7; и (iii) CDR3, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8); и (b) вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую, состоящую из или по существу состоящую из (i) CDR1, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9; (ii) CDR2, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10; и (iii) CDR3, содержащего, состоящего из или по существу состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах реализации любая из SEQ ID No: 6-11 независимо содержит одну или более из аминокислотных замен, добавлений или делеций.
[0258] В некоторых вариантах реализации набор содержит (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) буфер, содержащий ингибитор агрегации.
[0259] В некоторых вариантах реализации набор содержит (а) антитело против TREML2 или его антиген-связывающий фрагмент; и (b) экзогенный фактор, усиливающий агрегацию.
[0260] Любая из композиций, наборов или способов, описанных в настоящем документе, может включать один или более магнитных реагентов. Магнитный реагент может содержать одну или более магнитные частицы. Магнитный реагент может содержать одну ферромагнитную частицу, супрапарамагнитную частицу. Магнитный реагент может содержать реагент ферромагнитной жидкости.
[0261] В настоящем документе термин "частица ферромагнитной жидкости" относится к частице, которую можно намагнитить, придать ей свойства постоянного магнита.
[0262] Магнитный реагент может содержать супрапарамагнитную частицу. В настоящем документе термин "супрапарамагнитная частица" может относиться к частице, реагирующей на магнитное поле. Супрапарамагнитная частица представляет собой частицу, демонстрирующую магнитные свойства только при воздействии магнитного поля. В некоторых вариантах реализации коллоидная магнитная частица представляет собой супрапарамагнитную частицу.
[0263] В некоторых вариантах реализации указанный магнитный реагент содержит магнитную частицу. В некоторых вариантах реализации размер магнитной частицы составляет от приблизительно 1,5 до приблизительно 50 микрон, 0,7-1,5 микрон или менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации размер магнитной частицы составляет менее 200 нм. В некоторых вариантах реализации магнитный реагент содержит магнитную частицу, конъюгированную с антителом. В некоторых вариантах реализации такое антитело, конъюгированное с магнитными частицами, представляет собой антитело, связывающееся с белком, выбранным из молекулы адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ) и эндоглина (CD105). В качестве альтернативы, такое антитело, конъюгированное с магнитными частицами, связывается с CD147. В дополнительном варианте реализации такое антитело, конъюгированное с магнитными частицами, связывается с CD45. В еще одном варианте реализации такое антитело, конъюгированное с магнитными частицами, связывается с белком, экспрессируемым на поверхности клетки плода.
[0264] В некоторых вариантах реализации указанный магнитный реагент содержит реагент ферромагнитной жидкости. В настоящем документе термин "реагент ферромагнитной жидкости" относится к жидкой суспензии, содержащей магнитные частицы. В некоторых вариантах реализации реагент ферромагнитной жидкости содержит жидкую суспензию, содержащую магнитную частицу, конъюгированную с антителом против TREML2. В качестве альтернативы, реагент ферромагнитной жидкости содержит жидкую суспензию, содержащую магнитную частицу, конъюгированную с одним или более антителами, описанными в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации реагент ферромагнитной жидкости содержит жидкую суспензию, содержащую магнитную частицу, конъюгированную с антителом против ЕрСАМ. В некоторых вариантах реализации реагент ферромагнитной жидкости содержит жидкую суспензию, содержащую магнитную частицу, конъюгированную с антителом против CD105. В некоторых вариантах реализации реагент ферромагнитной жидкости содержит жидкую суспензию, содержащую магнитную частицу, конъюгированную с антителом, связывающимся с белком, экспрессируемым на поверхности клетки плода. В некоторых вариантах реализации реагент ферромагнитной жидкости содержит жидкую суспензию, содержащую магнитную частицу, конъюгированную с антителом против CD147.
[0265] В некоторых вариантах реализации наборы дополнительно содержат один или более из красящих реагентов. В некоторых вариантах реализации один или более из красящих реагентов содержит один или более из конъюгатов антител. В некоторых вариантах реализации конъюгат антитела из одного или более конъюгатов антител представляет собой антитело, конъюгированное с меткой. В некоторых вариантах реализации антитело связывает белок, выбранный из CD71, гликофорина A (GPA) и CD45.
[0266] В некоторых вариантах реализации любое из антител, описанных в настоящем документе (например, антитело против TREML2 или одно или более из дополнительных антител), дополнительно содержит метку. В некоторых вариантах реализации метка конъюгирована с антителом. В некоторых вариантах реализации метка выбрана из фикоэритрина (РЕ), аллофикоцианина (АРС), пероксидазы хрена (ПХ) и биотина.
[0267] Любой из наборов, описанных в настоящем документе, может включать одно или более антител или их фрагментов. Указанные одно или более антител могут связываться с белком, экспрессируемым на поверхности клетки плода. В качестве альтернативы или дополнения, указанные одно или более антител могут связываться с белком, экспрессируемым на поверхности клетки матери. Указанные одно или более антител могут связываться с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105, CD147, CD15, CD71, GPA и CD45. Указанные одно или более антител могут связываться с белком, выбранным из CD15, CD71, GPAhCD45.
[0268] Любой из наборов, описанных в настоящем документе, может включать одно или более антител или их фрагментов, причем указанные одно или более антител связываются с белком, экспрессируемым на поверхности ядросодержащего эритроцита плода (fnRBC) или клеток трофобласта. Указанное антитело может связываться с белком, выбранным из ЕрСАМ, CD105, CD71 и CD45.
[0269] Любой из наборов, описанных в настоящем документе, может включать один или более ингибиторов агрегации. Наборы, описанные в настоящем документе, могут включать 1, 2, 3, 4 или 5 или более ингибиторов агрегации. Ингибитор агрегации может ингибировать эндогенные факторы агрегации ферромагнитной жидкости. В некоторых вариантах реализации ингибитор агрегации выбран из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана. Восстанавливающий агент может представлять собой меркаптоэтансульфоновую кислоту. Ингибитор агрегации может представлять собой бычий сывороточный альбумин (БСА). Хелатирующий агент может представлять собой ЭДТА.
[0270] Ингибитор агрегации может содержать антитело или его фрагмент, причем указанное антитело относится к тому же изотипу, что и антитело против TREML2. Указанное антитело может являться неспецифическим антителом. В некоторых вариантах реализации антитело представляет собой антитело мыши.
[0271] Любой из наборов, описанных в настоящем документе, может содержать антитело против TREML2, причем указанное антитело против TREML2 может быть присоединено к ферромагнитной жидкости. Любой из наборов, описанных в настоящем документе, может содержать антитело против TREML2, причем указанное антитело против TREML2 конъюгировано с магнитной частицей. Магнитная частица может представлять собой коллоидную магнитную частицу. Магнитная частица может представлять собой магнитную частицу ферромагнитной жидкости.
[0272] Любой из наборов, описанных в настоящем документе, может включать экзогенный фактор, усиливающий агрегацию (EAEF). В некоторых вариантах реализации наборы, описанные в настоящем документе, включают 1, 2, 3, 4 или 5 или более EAEF. В некоторых вариантах реализации магнитные частицы, описанные в настоящем документе, присоединены к одному или более EAEF. В некоторых вариантах реализации указанный EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
[0273] В некоторых вариантах реализации наборы, описанные в настоящем документе, включают два или более EAEF. В некоторых вариантах реализации первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок A-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин, а второй EAEF содержит другой член указанной специфично связывающейся пары.
[0274] В некоторых вариантах реализации наборы, описанные в настоящем документе, включает третий EAEF. В некоторых вариантах реализации третий EAEF идентичен первому EAEF. В качестве альтернативы, третий EAEF идентичен второму EAEF. В некоторых вариантах реализации третий EAEF способен взаимодействовать с первым EAEF. В некоторых вариантах реализации третий EAEF способен взаимодействовать со вторым EAEF. При наличии третьего EAEF, идентичного первому или второму EAEF или способного взаимодействовать с первым или вторым EAEF, добавление третьего EAEF приводит к устранению агрегации магнитных частиц.
[0275] В некоторых вариантах реализации наборы, описанные в настоящем документе, включают два или более агента, ингибирующих агрегацию. В некоторых вариантах агент, ингибирующий агрегацию, выбран из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана. В некоторых вариантах реализации агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент.В некоторых вариантах реализации хелатирующий агент представляет собой ЭДТА. Восстанавливающий агент может представлять собой меркаптоэтансульфоновую кислоту. Ингибитор агрегации может представлять собой бычий сывороточный альбумин (БСА).
[0276] Примеры
[0277] Пример 1: Идентификация новых маркеров клеток плода
[0278] В данном примере описана идентификация новых маркеров клеток плода.
[0279] Получение ядросодержащих эритроцитов (nRBC)
[0280] Цельную кровь плода (n=5) получали посредством процедур под контролем УЗИ от беременных женщин (на 10+0 15+6 неделе беременности) с плановым хирургическим прерыванием беременности.
[0281] 20 мл периферической крови брали у беременных женщин при родах (n=2) или перед хирургическим прерыванием беременности (n=1).
[0282] После сбора кровь плода и матери разбавляли равным объемом физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS) и медленно наслаивали на градиент Percoll. Образцы центрифугировали при 1800 об/мин в течение 10 минут при комнатной температуре. Слой, содержащий эритробласты плода или взрослого в интерфазе, собирали и дважды промывали PBS.
[0283] Для крови матери выполняли этап обеднения в отношении CD45/CD15-положительных клеток посредством мечения клеток гранулами с антителом против CD45 и антителом против CD15 (Miltenyi Biotec) с использованием колонки LD Column (Miltenyi Biotec).
[0284] Для удаления посторонних эритроцитов из крови матери и ее обогащения эритробластами взрослых также использовали микрожидкостное устройство.
[0285] Обогащение и сортировка клеток посредством проточной цитометрии
[0286] Для получения образцов для FACS-сортировки обогащенные клетки крови плода и матери окрашивали антителом против CD71 (Miltenyi Biotec), антителом против GPA (BD Bioscience), антителом против CD45 (Miltenyi Biotec), Hoechst (окрашивание ядер) и Sytox Green dye (живые/мертвые клетки) при комнатной температуре в течение 30 минут.
[0287] FACS-сортировка
[0288] Эритробласты гейтировали и сортировали, как показано на фиг.5А-5Е. Фиг. 5В: гейт FSC-H/W и исключение двойных клеток. Фиг. 5С: гейт Sytox Green-отрицательных живых клеток. Фиг. 5D: гейт дважды положительных по GPA/Hoechst. Фиг. 5Е: гейт CD71+/CD45-клеток.
[0289] Для образцов крови плода сортировали менее 200000 целевых эритробластов.
[0290] Для образцов крови матери количество эритробластов матери никогда не превышало 1000.
[0291] Выделение РНК из отсортированной популяции
[0292] Обработанные отсортированные клетки использовали для выделения общей РНК.
[0293] Общую РНК выделяли из отсортированных клеток с использованием набора для выделения РНК Picopure RNA Isolation Kit (Applied Biosystems), количественно оценивали с использованием набора для анализа РНК Quant-iT RiboGreen RNA Assay Kit (Thermo Fisher) и анализировали ее качество с использованием набора RNA 6000 Pico на Agilent 2100 Bio analyzer.
[0294] Подготовка к секвенирвоанию РНК и получение библиотеки
[0295] Библиотеку кДНК получали при секвенировании Illumina (приложение А; протокол секвенирования РНК). Секвенирование выполняли на HiSeq 2000 при 20 миллионах прочтений/образец.
[0296] Секвенирование
[0297] Прочтения, полученные при секвенировании нового поколения (Illumina), вначале проверяли на предмет качества с помощью стандартных процедур с использованием протокола FastQC, затем сопоставляли с эталонным геномом и количественно оценивали с использованием программного обеспечения STAR версии 2.5. Полученные матрицы количества прочтений (т.е. таблицы количества прочтений для всех обнаруженных признаков - кодирующих или некодирующих РНК в каждом образце) уплотняли на этапе сокращения данных, сохраняя только гены с по меньшей мере единичным значением в одиночном образце.
[0298] Анализ данных с использованием инструментов для биоинформатики
[0299] В дальнейшем полученные данные обрабатывали с использованием пакета DESeq2 R/Biocondutor для дифференциальной экспрессии с целью поиска генов, экспрессия которых значительно повышена или понижена в образцах двух сравниваемых типов.
[0300] Анализ дифференциальной экспрессии DESeq2 по умолчанию состоял из следующих этапов: оценки факторов размера в каждом образце с использованием "способа с отношением медиан" (Anders and Huber, 2010), для каждого гена находили расчетную дисперсию с использованием процедуры аппроксимации, оптимизирующей дисперсию данных, соответствующих отрицательному биномиальному распределению, и, наконец, полученные расчетные значения факторов размера и дисперсии использовали для анализа значимости коэффициентов аппроксимированного распределения.
[0301] Из полученной при DESeq2-анализе таблицы в конечном итоге извлекали основные средние значения для образцов, log2-кратные изменения, значения стандартной ошибки, статистические критерии, значения р и скорректированные значения р для 20205 признаков (генов) с ненулевым общим количеством прочтений. Дифференциально экспрессируемые гены фильтровали в соответствии со скорректированным значением р (способ Беньямини-Хохберга/FDR) с пороговым значением 0,01 и 2-кратным пороговым изменением экспрессии. При этих параметрах отобрали 3233 гена, считавшихся дифференциально экспрессируемыми, причем экспрессия большинства из них (2961) усиливалась (независимо от порогового кратного изменения) в крови плода.
[0302] Полученную таблицу генов дополняли аннотациями и функциональными описаниями, извлеченными из базы данных Ensembl. Гены, ассоциированные с аннотацией "плазматическая мембрана" в соответствии с термином онтологии генов GO:0005886, отмечали флажком и дополнительным тегом "тренсмембранный", получая данные из базы данных Uniprot. Среди них 366 гена являлись дифференциально экспрессируемыми, причем экспрессия большинства из них (336) усиливалась (независимо от порогового кратного изменения) в клетках плода.
[0303] Параллельно анализу дифференциальной экспрессии количество прочтений нормировали и трансформировали с использованием DESeq2 с целью отбора по более жестким критериям экспрессии: первый отдор выполняли, начиная со списка генов, экспрессировавшихся исключительно в образцах плода, т.е. генов с нулевым количеством прочтений во всех трех образцах материя (12187 генов, список "ВСЕ ДАННЫЕ"), в соответствии со следующими критериями: 1) отбор генов, обнаруженных (т.е. экспрессируемых) во всех образцах плода; 2) отбор генов с отношением среднее значение/СО экспрессии более 1; 3) отбор генов, ассоциированных как с тегом GO «плазматическая мембрана», так и с тегом «прогнозируемый трансмембранный» согласно базе данных Uniprot. См. схему отбора ниже. Затем полученные 77 генов ранжировали по убыванию средней экспрессии у плода (список "РАНЖИРОВАННЫЕ"). Окончательный отбор с ручным курированием выполняли с учетом известной биологической функции, стабильности уровня экспрессии во всех образцах и грубой оценки абсолютного уровня экспрессии (сравнение прочтений с длиной гена), доступности антител и других биологических соображений (16 генов, список «Отобранные»).
[0304] Схема отбора
[0305] Ниже приведена схема отбора, использованная для выявления потенциальных новых маркеров клеток плода:
[0306] 1) гены, НЕ экспрессируемые ни в одном образце матери: 12187
[0307] 2) гены, экспрессируемые во ВСЕХ образцах плода, и только в них: 2079
[0308] 2.1) гены, аннотированные как ассоциированные с термином GO «Плазматическая мембрана»: 213
[0309] 2.2) гены, прогнозируемые как транс мембранные на основании UniProt: 305
[0310] 3) гены, ассоциированные с термином GO «Плазматическая мембрана» и прогнозируемые как транс мембранные: 89
[0311] 4) гены с отношением среднее значение/СО более 1:77
[0312] Ранжирование дифференциально экспрессируемых генов из списка генов
[0313] Дальнейший окончательный курируемый вручную отбор и процедуру ранжирования выполняли с учетом длины транскрипта, количества прочтений и других биологически значимых критериев, получив следующие кандидаты с максимальным соответствием:
[0314] Выявление антител, специфичных по отношению к отобранным молекулам-мишеням
[0315] Тестирование Am-кандидатов по отношению к эритробластам посредством FACS-анализа
[0316] Для определения влияния дифференциальной экспрессии уровня РНК на уровень соответствующих белков выполняли иммунологическое окрашивание доступными для приобретения антителами (n=13) для проточной цитометрии и анализа DEPArray.
[0317] В качестве отрицательного контроля использовали изотипически аналогичные Ат, конъюгированные с теми же флуорохромами и присутствующие в тех же концентрациях, что и доступные для приобретения антитела.
[0318] Все 13 антител, показанных в таблице 2, вначале тестировали на замороженной крови плода.
[0319] Только антитела, положительно экспрессируемые на эритробластах плода, тестировали на образцах замороженной крови матери.
[0320] Кроме специфичных антител, подлежащих тестированию, или изотипического контроля, антитела, использованные для окрашивания, включали Ат против CD71 (Miltenyi Biotec), Ат против GPA (BD Bioscience), At против CD45 (Miltenyi Biotec), Hoechst, для выявления эритробластов. Вкратце, клетки (2,5 - 5×105) инкубировали с Ат в присутствии FcR-блокирующего реагента (Miltenyi Biotec) при комнатной температуре в течение 30 минут.После отмывки несвязанных Ат осадок клеток ресуспендировали с электродным буфером AutoMACS (Miltenyi) с красителем Sytox Green.
[0321] Таблица 2: Результаты FACS-анализа
[0322] Ат 1 против TLT2 использовали для TREML2 (этот белок в настоящем документе также фигурирует под названием TLS-1)
[0323] Пример 2: Технология на основе ферромагнитной жидкости для захвата и отбора клеток
[0324] В данном примере отобранные антитела против маркеров, экспрессируемых исключительно на клетках плода, использовали для конъюгирования с ферромагнитной жидкостью. TREML2-FF (также называемый TLS1-FF) относится к антителу, способному связывать белок, экспрессируемый геном TLS1, и конъюгированному с ферромагнитной жидкостью
[0325] Размер FF-Ат проверяли с использованием анализатора размера частиц NanoBrook Zeta Plus, а концентрацию - с использованием спектрофотометра.
[0326] Контролируемое обогащение
[0327] Образец крови предварительно инкубировали с буфером, содержащим один или более ингибиторов для ингибирования эндогенных факторов агрегации ферромагнитной жидкости (описанных в ЕР 1311820, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки) перед добавлением ферромагнитной жидкости к крови. Один из ингибиторов может представлять собой восстанавливающий агент, например, меркаптоэтансульфоновую кислоту, в концентрации 100 мМ, которая может подавлять IgM-индуцированную агрегацию, не влияя на лиганды, используемые для мечения клеток. Восстанавливающий агент можно добавлять к крови в качестве единственного реагента. Второй ингибитор может представлять собой бычий сывороточный альбумин, который можно включить в буфер в концентрации 10 мг/мл, и он нейтрализует любой НАВАА. Третий ингибитор может представлять собой неспецифичное антитело мыши, в частности, соответствующего изотипа, совпадающего с изотипом антитела в ферромагнитной жидкости. Его можно включать в буфер в концентрации 0,5-5 мг/мл для нейтрализации даже наиболее сильных НАМА. Четвертый ингибитор может представлять собой стрептавидин, который при необходимости следует включать в буфер для нейтрализации любого антитела против стрептавидина, присутствующего в плазме. Предобработка крови вышеуказанным буфером и восстанавливающим агентом могла занимать от 15 до 30 минут для нейтрализации всех эндогенных факторов агрегации. После нейтрализации всех эндогенных факторов агрегации к образцу добавляли экзогенный фактор агрегации ферромагнитной жидкости, а затем ферромагнитную жидкость. Ферромагнитную жидкость присоединяли к антителу, специфичному по отношению к мишеням, а также к другому лиганду, специфичному по отношению к экзогенному фактору агрегации. После оптимального мечения клеток-мишеней ферромагнитной жидкостью и индукции агрегации ферромагнитной жидкости экзогенным фактором агрегации образец подвергали магнитному разделению для обогащения мишеней.
[0328] Образец помещали в магнитный сепаратор (Immunicon, номер в каталоге QS-012) на 10 минут. Образец извлекали из магнита, перемешивали на вортексе и помещали обратно в магнитный сепаратор на 10 минут для сбора клеток с магнитной меткой. Несобранный образец аспирировали, а клетки, собранные магнитом, ресуспендировали в 0,75 мл буфера для отмывки-разбавления и повторно отделяли в магнитном сепараторе в течение 10 минут. Несобранный образец выбрасывали, а собранные клетки ресуспендировали после извлечения пробирки из магнитного сепаратора. После удаления всех неспецифичных компонентов мишени с магнитной меткой и свободную ферромагнитную жидкость ресуспендировали в буфере. На всякий случай следовало устранить агрегацию ферромагнитной жидкости, опосредованную экзогенным фактором. Это можно осуществить, ресуспендируя готовый образец в буфере, содержащем фактор дезагрегации, связывающийся с экзогенным фактором агрегации. Фактор дезагрегации вызывал дезагрегацию всех агрегатов ферромагнитной жидкости, оставляя клетки для дальнейшего анализа.
[0329] Пример 3: Обнаружение и анализ клеток плода
[0330] В данном примере описано выделение и анализ одиночных клеток плода. DEPArray можно выполнить, как описано в ЕР 0842042, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.
[0331] Беременные женщины и здоровые добровольцы
[0332] Образцы периферической крови 14 беременных женщин на 12 - 17+2 неделе беременности собирали посредством венепункции в 10 мл пробирки с консервантом CellSave Preservative Tubes (Menarini Silicon Biosystems, Хантингтон-Вэлли, штат Пенсильвания, CUIA). Для экспериментов по обогащению собирали периферическую кровь здоровых доноров. Все доноры предоставили письменное информированное согласие, протокол исследования был одобрен комитетом по медицинской этике больницы Сан-Герардо, Монца (Италия). Все образцы обрабатывали через 1-4 суток.
[0333] Антитела против антигена адгезии эпителиальных клеток (ЕрСАМ), маркера эндотелия сосудов (CD105) и/или TREML 2, присоединенные к ферромагнитной жидкости, использовали для обогащения клеток трофобласта плода по сравнению с посторонними клетками. Обогащенные клетки метили моноклональным антителом (мАт) против TREML2, меченым фикоэритрином (РЕ). Обогащенные клетки также метили флуоресцентной меткой, мАт С11 против цитокератина, меченым аллофикоцианином (АРС), мАт против HLA-G, меченым АРС, и мАт против CD45, меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) для распознавания лейкоцитов.
[0334] Эти процедуры обогащения клеток-мишеней (например, клеток трофобласта) являлись необходимыми, поскольку известно, что частота таких клеток в крови матери крайне низка и составляет лишь 1-10 клеток в 1 мл цельной крови (который содержит более миллиарда клеток).
[0335] CVS и пуповинная кровь для обогащения
[0336] В цельную кровь здоровых добровольцев добавляли клетки трофобласта плода, полученные при отборе ворсинок хориона (CVS), или эритробласты плода, полученные из пуповинной крови.
[0337] Культуру CVS выбирали по экспрессии CD105/EpCAM. Клетки выращивали при 37°С и 5% СО2 В RPMI1640 (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco), 1% пенициллина-стрептомицина (Gibco) и L-глутамина (Gibco). Перед добавлением клетки отделяли от колбы, ресуспендировали в 10 мл PBS (Gibco) и помещали в пробирку с консервантом CellSave Preservative Tube по меньшей мере на 1 сутки.
[0338] Образцы пуповинной крови, полученные в больнице Сан-Герардо, собирали в пробирку с консервантом CellSave Preservative Tube.
[0339] Эксперименты по добавлению выполняли с целью демонстрации специфичности процедуры отбора при использовании антител, конъюгированных с ферромагнитной жидкостью, для захвата клеток плода.
[0340] Образцы крови плода и костного мозга
[0341] Цельную кровь плода (n=3) получали посредством процедур под контролем УЗИ от беременных женщин (на 10+0 15+6 неделе беременности) с плановым хирургическим прерыванием беременности.
[0342] Все доноры предоставили письменное информированное согласие, протокол исследования был одобрен комитетом по медицинской этике женской и детской больницы КК, Сингапур.
[0343] После сбора кровь плода разбавляли равным объемом PBS и медленно наслаивали на градиент Percoll. Образцы центрифугировали при 1800 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре. Слой, содержащий эритробласты плода в интерфазе, собирали и дважды промывали PBS.
[0344] Приобрели замороженные с использованием криотехнологии мононуклеарные клетки костного мозга, содержащие эритробласты взрослых (Lonza, №в каталоге 2М-125С). Клетки размораживали, обрабатывали ДНКазой I и промывали в соответствии с инструкциями производителя. Затем клетки выдерживали в среде RPMI с добавлением 10% FBS, пенициллина-стрептомицина, L-глутамина при 37 градусах в течение 1 часа и использовали в качестве отрицательного контроля (протестировали 3 различных доноров). [0345] Четыре клона доступных для приобретения антител против TREML2 протестировали в образцах с помощью проточной цитометрии.
[0346] Изотипически аналогичные Ат, конъюгированные с теми же флуорохромами, что и доступные для приобретения антитела против TREML2, использовали в тех же концентрациях. Кроме Ат против TREML2 или изотипического контроля, Ат, использованные для окрашивания, включали Ат против CD71 (Miltenyi Biotec), Ат против GPA (BD Bioscience), Ат против CD45 (Miltenyi Biotec), Hoechst. Вкратце, клетки (2,5 -5×105) инкубировали с Атв присутствии FcR-блокирующих реагентов (Miltenyi Biotec) при комнатной температуре в течение 30 мин. После отмывки несвязанных Ат осадок клеток ресуспендировали с электродным буфером с красителем Sytox Green для гейтирования живых клеток при FACS-анализе.
[0347] Получение антител с детиобиотином и ферромагнитной жидкостью для контролируемой агрегации
[0348] В некоторых вариантах реализации ферромагнитные жидкости при осуществлении настоящего изобретения представляли собой частицы, которые вели себя как коллоиды. Такие частицы характеризовались субмикронным размером, в общем случае составлявшим менее 200 нанометров (нм), и устойчивостью к гравитационному отделению от раствора в течение продолжительного времени. Использовали частицы в диапазоне от 90-150 нм и с магнитной массой от 70 до 90%. Подходящие магнитные частицы состояли из кристаллического ядра из суперпарамагнитного материала, окруженного молекулами покрытия, связанными с магнитным ядром, например, физически адсорбированными или ковалентно присоединенными, которые придают ей стабилизирующие коллоидные свойства. Материал покрытия предпочтительно следовало наносить в количестве, эффективно предотвращающем неспецифичные взаимодействия между биологическими макромолекулами, находящимися в образце, и магнитными ядрами. Такие биологические макромолекулы могут включать остатки сиаловой кислоты на поверхности неспецифичных клеток, лектины, гликопротеины и другие мембранные компоненты. Кроме того, материал покрытия должен обеспечивать максимально возможное отношение магнитная масса/наночастица. Размер магнитных кристаллов, составляющих ядро, достаточно мал, и они не содержат полного магнитного домена. Размер наночастиц таков, что их броуновская энергия превышает их магнитный момент.Как следствие, выравнивание северного и южного полюсов и последующее взаимное притяжение/отталкивание этих коллоидных магнитных частиц, по-видимому, не происходит даже в магнитном поле умеренной силы, что вносит вклад в стабильность их раствора. Наконец, магнитные частицы следует отделять в сепараторах со значительным градиентом внешнего магнитного поля. Указанные характеристики облегчают работу с образцом и обеспечивают экономические преимущества по сравнению с более сложными колонками с внутренним градиентом, загруженными ферромагнитными гранулами или стальной ватой. Магнитные частицы с вышеописанными свойствами можно получать путем модификации материалов основы, описанных в ЕР 842042. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения магнитные частицы, покрытые антителом против CD105, получали согласно описанию в US 6365362 В1, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки.
[0349] Рекомбинантное антитело человека против антигена CD105 получали из гибридомы номер 166707 (R&D Systems) и конъюгировали с материалом основы с использованием стандартных химических реакций присоединения, описанных в публикации патента США № 09/248388. Затем Ат против Cd105-ферромагнтную жидкость ресуспендировали в 20 мМ HEPES, рН 7,5 для конъюгирования с детиобиотином с использованием N-гидроксисукцинимид-DL-детиобиотина(NHS-детиобиотина) (Sigma, № в каталоге Н-2134). Базовый раствор NHS-детиобиотина получали в ДМСО в концентрации 1 мг/мл. NHS-детиобиотин (5 мг) добавляли к 1 мг Ат против CD105-ферромагнитной жидкости и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Непрореагировавший NHS детиобиотин удаляли трехкратной промывкой 20 мМ HEPES, рН 7,5, содержавшим 1 мг/мл БСА, 0,05% Proclin 300 с использованием магнита с высоким градиентом поля. После конечной промывки детиобиотин/Ат против CD105-ферромагнитную жидкость ресуспендировали в смеси вода/БСА/Proclin 300 и фильтровали через 0,2-мкм шприцевой фильтр. Концентрацию железа в Ат против СВ105-ферромагнитной жидкости определяли с помощью спектрофотометрического анализа и доводили до 0,22 мг/мл. Определение размера частиц выполняли с помощью анализатора размера частиц NanoBrook 90Plus (Brookhaven Instruments Corporation).
[0350] Антитела против CD71, против TREML2 и против ЕрСАМ конъюгировали с ферромагнитной жидкостью с использованием аналогичного способа.
[0351] Обработка крови
[0352] Аликвоты крови по 7,5 мл разбавляли 6,5 мл буфера для разбавления (Menarini Silicon Biosystems).
[0353] Образец крови (аликвоты по 7,5 мл) предварительно инкубировали с 6,5 мл буфера для разбавления (Menarini Silicon Biosystems), содержащим один или более ингибиторов для ингибирования эндогенных факторов агрегации ферромагнитной жидкости (описанных в ЕР 1311820, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки) перед добавлением ферромагнитной жидкости к крови. Один из ингибиторов может представлять собой восстанавливающий агент, например, меркаптоэтансульфоновую кислоту, в концентрации 100 мМ, которая может подавлять IgM-индуцированную агрегацию, не влияя на лиганды, используемые для мечения клеток. Восстанавливающий агент можно добавлять к крови в качестве единственного реагента. Второй ингибитор может представлять собой бычий сывороточный альбумин, который можно включить в буфер в концентрации 10 мг/мл, и он нейтрализует любой НАВАА. Третий ингибитор может представлять собой неспецифичное антитело мыши, в частности, соответствующего изотипа, совпадающего с изотипом антитела в ферромагнитной жидкости. Его можно включать в буфер в концентрации 0,5-5 мг/мл для нейтрализации даже наиболее сильных НАМА. Четвертый ингибитор может представлять собой стрептавидин, который при необходимости следует включать в буфер для нейтрализации любого антитела против стрептавидина, присутствующего в плазме. Предобработка крови вышеуказанным буфером и восстанавливающим агентом могла занимать от 15 до 30 минут для нейтрализации всех эндогенных факторов агрегации. Во время этого инкубирования разбавленную кровь центрифугировали при 800 g в течение 10 мин без торможения при комнатной температуре для удаления плазмы.
[0354] После нейтрализации всех эндогенных факторов агрегации к образцу добавляли экзогенный фактор агрегации ферромагнитной жидкости (стрептавидин), а затем ферромагнитную жидкость. Ферромагнитную жидкость присоединяли к антителу, специфичному по отношению к мишеням, а также к другому лиганду, специфичному по отношению к экзогенному фактору агрегации, например, детиобиотину (связывающаяся пара детиобиотин-стрептавидин).
[0355] Для обогащения клетками трофобласта плода использовали антитело против CD105-ферромагнитную жидкость, антитело против ЕрСАМ-ферромагнитную жидкость и/или антитело против TREML2-ферромагнитную жидкость. Для обогащения эритробластами плода использовали антитело против CD71-ферромагнитную жидкость и/или антитело против TREML2-ферромагнитную жидкость. После оптимального мечения клеток-мишеней ферромагнитной жидкостью и индукции агрегации ферромагнитной жидкости экзогенным фактором агрегации образец подвергали магнитному разделению для обогащения мишеней.
[0356] Образец помещали в магнитный сепаратор (Immunicon, номер в каталоге QS-012) на 10 минут. Образец извлекали из магнита, перемешивали на вортексе и помещали обратно в магнитный сепаратор еще на 10 минут. Образец извлекали из магнита, повторно перемешивали и помещали обратно в магнитный сепаратор еще на 20 минут для сбора клеток с магнитной меткой. Несобранный образец аспирировали, а клетки, собранные магнитом, ресуспендировали в 3 мл буфера для отмывки-разбавления и повторно отделяли в магнитном сепараторе в течение 10 минут.Несобранный образец выбрасывали, а собранные клетки ресуспендировали после извлечения пробирки из магнитного сепаратора. После удаления всех неспецифичных компонентов мишени с магнитной меткой и свободные ферромагнитные жидкости ресуспендировали в буфере. В некоторых случаях устраняли агрегацию ферромагнитной жидкости, опосредованную экзогенным фактором. Устранение агрегации можно осуществить путем ресуспендирования готового образца в буфере, содержащем фактор дезагрегации, связывающийся с экзогенным фактором агрегации (в случае связывающейся пары детиобиотин-стрептавидин экзогенный агент, устраняющий агрегацию, может представлять собой биотин). Безотносительно к теоретическим представлениям, фактор дезагрегации вызывал дезагрегацию всех агрегатов ферромагнитной жидкости, оставляя клетки для дальнейшего анализа.
[0357] В случае клеток трофобласта обогащенные клетки метили флуоресцентной меткой -моноклональным антителом (мАт) против TREML2, меченым фикоэритрином (РЕ). В случае клеток трофобласта обогащенные клетки также метили флуоресцентной меткой -касителем для нуклеиновых кислот (Hoechst 33342) для окрашивания ДНК, мАт C11 против цитокератина, меченым аллофикоцианином (АРС), мАт против HLA-G, меченым АРС, и/или мАт против CD45, меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) для распознавания лейкоцитов.
[0358] В случае эритробластов обогащенные клетки метили флуоресцентной меткой -моноклональным антителом (мАт) против TREML2, меченым фикоэритрином (РЕ). В случае эритробластов обогащенные клетки также метили флуоресцентной меткой - красителем для нуклеиновых кислот (Hoechst 33342) для окрашивания ДНК, моноклональным антителом (мАт) против CD71, меченым фикоэритрином (РЕ) и/или мАт против CD45, меченым флуоресцеинизотиоцианатом (FITC).
[0359] Окрашенные клетки фиксировали 2% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут при комнатной температуре, затем промывали и ресуспендировали в надлежащем объеме буфера для системы DEPArray™ NxT (Menarini Silicon Biosystems) или FACS-анализа.
[0360] DEPArray-анализ
[0361] DEPArray™ NxT - это полупроводниковая технология для точного выделения чистых одиночных клеток. Она состоит из блока управления DEPArray™ и одноразового картриджа, в котором использованы современные микрожидкостные технологии и технология кремниевых биочипов для аккуратного манипулирования каждой одиночной клеткой-мишенью в обогащенном образце.
[0362] Явление, позволяющее манипулировать клетками внутри чипа, называется «диэлектрофорез» и основано на возможности поляризации частицы в жидкой суспензионной среде за счет действия электрических полей. Поляризация создает силовое поле, которое можно использовать для захвата каждой отдельно взятой частицы в ряд потенциальных лунок, что позволяет позиционировать частицы, подлежащие контролю. Каждой потенциальной лункой можно управлять, меняя программу чипа с целью перемещения одной или более частиц из начального положения в конечное место назначения для их выделения.
[0363] DEP Array™ позволяет отбирать и выделять редкие клетки с крайне высоким разрешением (вплоть до одиночной клетки) и крайне высокой чистотой, причем отбор клеток происходит посредством многопараметрического анализа флуоресцентных сигналов и морфологических характеристик, полученных при обработке изображений в светлом поле или флуоресцентных изображений.
[0364] Эту технологию уже использовали для выделения и отбора одиночных циркулирующих опухолевых клеток в крови пациентов с опухолями (как описано в ЕР 1311820, полностью включенном в настоящий документ посредством ссылки).
[0365] В образцы цельной крови здоровых добровольцев добавляли культуру ворсинок хориона, содержавшую клетки трофобласта плода с трисомией 21. Образцы обогащали и окрашивали, как описано ранее.
[0366] Клетки трофобласта анализировали на системе DEPArray™ NxT. Клетки трофобласта демонстрировали положительное по TREML2 окрашивание. Кроме того, клетки, демонстрировавшие положительное окрашивание по общему цитокератину (CK), необнаружимую метку CD45 и положительное окрашивание ядер, классифицировали как клетки трофобласта плода и выделяли в виде одиночных клеток.
[0367] В образцы цельной крови здоровых добровольцев добавляли пуповинную кровь, содержавшую эритробласты плода, заранее меченые красителем Draq5 для ядер. Образцы обогащали с использованием Ат против CD71-ферромагнитной жидкости и Ат против TREML2-ферромагнитной жидкости и окрашивали, как описано ранее. Обогащенные эритробласты анализировали на системе DEPArray™ NxT. Клетки, демонстрировавшие положительное окрашивание по CD71, необнаружимую метку CD45 и положительное окрашивание ядер Hoechst/Draq5, классифицировали как эритробласты плода.
[0368] Демонстрация происхождения клеток плода посредством анализа коротких тандемных повторов (КТП)
[0369] Выделенные клетки лизировали с использованием набора DEPArray™ LysePrep (MSB, Италия) в соответствии с инструкциями производителя.
[0370] ДНК одиночных клеток амплифицировали посредством ПНР с использованием набора для амплификации ДНК человека PowerPlex Fusion 6 с (Promega TMD045), состоявшего из мультиплексного набора праймеров, мишенями которых являлись 27 локусов генома человека.
[0371] Геномную ДНК также выделяли из 200 мкл цельной крови матери с использованием набора QIAgen DSP Blood Mini Kit (QIAgen) для использования в качестве контроля. При ее наличии, также анализировали геномную ДНК плода, полученную непосредственно из ткани CVS или ее культуры или амниотической жидкости.
[0372] Анализ КТП выполняли в соответствии с рекомендациями производителя, анализ фрагментов выполняли на генетическом анализаторе ThermoFisher Scientific 3500 Genetic Analyzer (POP-4 и 36-см линейка капилляров); последующий программный анализ выполняли с использованием GeneMapper® ID-X версии 1.4. Затем картину аллелей в выделенных одиночных клетках сравнивали с картиной геномной ДНК плода и родителей для оценки выпадения аллелей и ожидаемой картины наследования.
[0373] РОС: клиническое исследование с участием 20 беременных женщин в первом триместре беременности
[0374] 20 мл образцов периферической крови 14 беременных женщин на 12 - 17+2 неделе беременности собирали посредством венепункции в 10 мл пробирки с консервантом CellSave Preservative Tubes (Menarini Silicon Biosystems, Хантингтон-Вэлли, штат Пенсильвания, CIIIA). Все образцы обрабатывали через 1-4 суток. Клетки трофобласта плода успешно выделили у 14 беременных (таб. X). У 14 положительных беременных женщин выделили в среднем 1,4 клетки трофобласта плода.
[0375] Анализ вариантов количества копий (CNV)
[0376] В образцы цельной крови здоровых добровольцев добавляли культуру ворсинок хориона, содержавшую клетки трофобласта плода. Образцы обогащали и окрашивали, как описано ранее.
[0377] Выполняли полногеномную амплификацию (Amplil WGA, Menarini Silicon Biosystems) одиночных клеток трофобласта плода, выделенных с помощью DEPArray™ NxT.
[0378] 5 мкл продукта Ampli1™ WGA очищали с использованием гранул 1,8Х SPRIselect Beads (Beckman Coulter) в соответствии с инструкциями производителя и элюировали в 12,5 мкл ТЕ-буфера для получения библиотеки с использованием набора Ampl1™ Low pass kit (Menarini Silicon Biosystems).
[0379] Файлы FASTQ, полученные с использованием 13 библиотек Ampli1™ LowPass, выравнивали по эталонному геному hgl9 с использованием BWA. Профили количества копий рассчитывали с использованием Control-FREEC, без контрольных образцов и с нормировкой GC. Грфики количества копий получали с использованием пользовательских сценариев Python. [0380] Результаты
[0381] На фиг.8 показана схема рабочего процесса обогащения клеток плода. Как показано на фиг.8, рабочий процесс состоит из 3 отдельных этапов: 1. сбор образцов и захват клеток-мишеней с использованием антител, конъюгированных с фкрромагнитной жидкостью, позволявших специфично отбирать клетки-мишени. 2. Клетки-мишени метили выбранными антителами и загружали в картридж DEPArray для скрининга и отбора. Затем отобранные одиночные клетки сортировали с использованием прибора DEPArray. 3. Отсортированные одиночные клетки анализировали с использованием технологий анализа КТП (коротких тандемных повторов) для демонстрации их происхождения от клеток плода.
[0382] В данном примере клетки плода обогащали и окрашивали из цельной крови беременных женщин. Чистые одиночные клетки выделяли с помощью DEPArray™ для полногеномной амплификации и анализа генома.
[0383] На фиг.9-10 продемонстрирована специфичность нового антитела против TREML2 согласно проточно-цитометрическому анализу экспрессии TREML2 (т.е. TLS) на эритробластах, выделенных из образцов крови плода (FB) (фиг.9) и костного мозга (КМ) (фиг.10). Как показано на фиг.9-10, эритробласты, выделенные из образцов крови плода или костного мозга, гейтировали посредством (1) FSC-A/SSC-A для гейтирования основной популяции клеток, (2) гейтирования живых клеток, отрицательных по Sytox Green, (3) FSC-H/W для исключения двойных клеток, (4) гейтирования клеток, дважды положительных по GPA/Hoechst, (5) гейтирования CD71+/CD45- клеток и (6) гейтирования по TLS1 и наложения изотипического контроля для определения % TREML2-положительных клеток.
[0384] На фиг.11А-11J показана экспрессия TLS1 на эритробластах плода, выделенных из различных образцов крови плода (FB) различных клонов. На фиг.12A-12L показана экспрессия TLS1 на эритробластах, выделенных из образцов костного мозга (ВМ) различных клонов. Как показано на фиг.11A-11J, эритробласты плода из крови плода демонстрировали положительное окрашивание антителом против TREML2, хотя для эритробластов взрослых, выделенных из костного мозга, экспрессия не обнаруживалась (фиг.12A-12L).
[0385] Таблица 3. Измерение размера Ат-ферромагнитной жидкости. Средний диаметр (нм) CD105-FF составлял 128,70 нм
[0386] Таблица 4: Измерение размера Ат-ферромагнитной жидкости. Средний диаметр (нм) TREML-2-FF составлял 189,57. Оба размера находились в диапазоне, характерном для коллоидных частиц.
[0387] Клетки трофобласта, происходящие от культур CVS, использовали для демонстрации специфичности захвата и обогащения CD105-FF иЕрСАМ-FF.
[0388] На фиг.13 показан анализ диаграммы разброса TREML-2-положительных клеток трофобласта, идентифицированных с использованием DEPArray™ после добавления и обогащения с помощью CD105-FF и EpCAM-FF. На фиг.14 показана галерея изображений CellBrowser®: Клетки трофобласта демонстрировали положительное окрашивание антителом TREML-2-PE, CK-АРС и при окрашивании ядер.
[0389] Клетки трофобласта, происходящие из пуповинной крови, использовали для демонстрации специфичности захвата и обогащения CD71 или TREML-2.
[0390] На фиг.15А показан анализ диаграммы разброса Draq5/Hoechst-положительных эритробластов, добавленных в кровь здоровых доноров и обогащенных с использованием CD71-FF. На фиг.15В показана галерея изображений CellBrowser®: эритробласты демонстрируют положительное окрашивание антителом CD71-PE, при окрашивании ядер Draq5 и Hoechst, и отрицательное окрашивание антителом CD45-FITC.
[0391] На фиг.16А показан анализ диаграммы разброса Draq5/Hoechst-положительных эритробластов, добавленных в кровь здоровых доноров и обогащенных с использованием TREML-2-FF. На фиг.16В показана галерея изображений CellBrowser®: эритробласты демонстрируют положительное окрашивание антителом CD71-PE, при окрашивании ядер Draq5 и Hoechst, и отрицательное окрашивание антителом CD45-FITC.
[0392] Отсортированные одиночные клетки анализировали с использованием технологии анализа КТП (коротких тандемных повторов) для демонстрации их происхождения от клеток плода (по сравнению с ДНК матери, а также с анализом ЛНК плода, полученной при процедуре амниоцентеза). Обнаружили идентичные профили локусов. На фиг.17 показан анализ КТП в одиночных клетках плода.
[0393] В поисковое клиническое исследование зачислили 14 беременных женщин на различных сроках беременности; клетки плода, полученные из образцов крови этих беременных женщин, обнаруживались по положительным результатам КТП-анализа.
[0394] Таблица 5. Показаны сводные результаты КТП-анализа
[0395] Для демонстрации возможности обнаружения трисомии 21 хромосомы при извлечении одиночных клетках плода из образцов ворсинок хориона (VK) авторы изобретения выполнили анализ вариации количества копий (CNV)
[0396] На фиг.18 показаны результаты анализа CNV в клетках плода. Как показано на фиг.18, извлечение одиночных клеток (например, при извлечении 1 (R1), извлечении 3 (R3), и извлечении 6 (R6)) при DEPArray подтвердило наличие трисомии 21 хромосомы в библиотеке из образцов ворсинок хориона (VK).
[0397] На фиг.19 показаны результаты анализа CNV здорового донора. Как показано на фиг.19, здоровый донор (HD) демонстрировал плоский профиль количества копий, аналогичный профилям, полученным из одиночных МПК, выделенных с помощью DEP Array.
[0398] Пример 4: Процедуры рабочего процесса отбора nRBC из крови матери
[0399] В данном примере описан один способ отбора ядросодержащих эритроцитов (nRBC) из образца крови беременного субъекта. Как показано на фиг.6, получали образец крови беременного субъекта (601). Указанный образец крови собирали в пробирки CellSave (601). nRBC можно обогащать посредством магнитного разделения (602, например, обогащение с использованием ферромагнитной жидкости). В качестве альтернативы или дополнения, образец можно обработать с использованием системы CELLTRACKS® AUTOPREP® (603). Одиночные клетки можно визуализировать и выделить с использованием технологии на основе изображений блока управления DEPArray™ NxT (604). После выделения клеток из выделенных клеток получали очищенные нуклеиновые кислоты (605). Выполняли геномный и/или генетический анализ (606). Например, молекулы нуклеиновых кислот секвенировали для обнаружения хромосомных аберраций.
[0400] Пример 5: Протокол секвенирования РНК
[0401] Из редких клеток (например, клеток плода) можно выделять молекулы нуклеиновых кислот, например, РНК. В данном примере приведен типичный способ секвенирования РНК клеток плода.
[0402] SMART-Seq V2
[0403] Для ОТ-ПЦР адаптировали Smartseq версии 2 с некоторыми модификациями. [0404] Для эритробластов плода (ЕВ) на входе обратно-транскриптазной реакции использовали 2 нг общей РНК. Из-за ограниченного количества ЕВ матери, которые можно сортировать, всю РНК ЕВ матери концентрировали и использовали для обратно-транскриптазной реакции.
[0405] (1) Обратная транскрипция
[0406] Добавляли 1 мкл праймера олиго-dT 30VN (10 мкМ) и 1 мкл смеси dNTP (по 10 мМ) в пробирки с образцами.
[0407] Инкубировали образцы при 72°С в течение 3 мин и немедленно помещали их на лед.
[0408] Готовили смесь для обратной транскрипции на льду, как указано ниже, и добавляли по 5,7 мкл к каждому образцу.
[0409] Реакционную смесь инкубировали в термоциклере следующим образом:
[0410] (2) Перед ПЦР-амплификацией
[0411] Готовили смесь для ПЦР на льду, как указано ниже, и добавляли по 15 мкл к каждому образцу.
[0412] Образцы помещали в термоциклер и запускали следующую программу.
[0413] Количество циклов ПЦР зависело от типа клеток и могло увеличиваться (для клеток с небольшим количеством РНК) или уменьшаться (для клеток с большим количеством РНК).
[0414] (3) Очистка продуктов ПЦР
[0415] Амплифицированные кДНК-продукты дважды очищали с использованием гранул ПЦР AMPure ХР (Beckman Coulter) в количестве 0,5 X объем реакционной смеси. Очищенную кДНК количественно оценивали с использованием набора High Sensitivity DNA Kit на Agilent 2100 Bioanalyzer.
[0416] (4) Подготовка образцов ДНК для Illumina Nextera XT
[0417] Для получения библиотек испольховали набор Illumina NEXTERA XT DNA Kit с модификациями (объем образца кДНК, реагентов и реакционной смеси оптимизировали как 1/4 от объема, указанного в инструкциях производителя)
[0418] кДНК соответственно разбавляли и доводили до 300 пг.
[0419] 1,25 мкл кДНК (300 пг) переносили в 0,2 мл пробирку для ПЦР.
[0420] Добавляли 2,5 мкл буфера Tagment DNA Buffer и 1,25 мкл Amplicon Tagment Miz.
[0421] Реакционную смесь для тагментации инкубировали на термоциклере при 55 градусах в течение 5 мин.
[0422] Немедленно добавляли 1,25 мкл NT и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин.
[0423] К тагментированной ДНК добавляли 1,25 мкл индекса 1, 1,25 мкл индекса 2 и 3,75 мкл смеси для ПНР Nextera PCR Master Mix (NPM).
[0424] Выполняли амплификацию с использованием следующей программы:
[0425] (5) Очистка библиотек ДНК:
[0426] К библиотеке ДНК добавляли гранулы AMPure ХР Beads (0,6Х объем реакционной смеси).
[0427] Гранулы выбрасывали, а надосадочную жидкость после первой очистки сохраняли. [0428] При второй очистке добавляли гранулы AMPure ХР Beads (0,7Х объем реакционной смеси).
[0429] Гранулы сохраняли и элюировали фрагменты ДНК.
[0430] Успешно полученные библиотеки (средняя длина 400 п.о.) количественно оценивали с использованием набора High Sensitivity DNA Kit на Agilent 2100 Bioanalyzer.
[0431] Для объединения библиотек концентрацию каждого образца библиотеки доводили до 19 нМ и объединяли по объему.
[0432] (6) Секвенирование библиотек ДНК:
[0433] Библиотеки передавали на аппарат для секвенирования и секвенировали со спаренными концами (2×101 п.о.) на системе Illumina HiSeq™ High Output v3.
[0434] Пример 6: Обнаружение клеток трофобласта
[0435] В данном примере описан способ обнаружения клеток трофобласта. В этом примере использовали технологию на основе ферромагнитной жидкости для захвата и отбора клеток, а технологию DEPArray -для сортировки клеток.
[0436] Клетки трофобласта захватывали с помощью технологии на основе ферромагнитной жидкости и контролируемой агрегации. Образец крови беременного субъекта приводили в контакт с ферромагнитной жидкостью, содержащей коллоидные магнитные частицы, конъюгированные с антителом против ЕрСАМ (EpCAM-FF), или коллоидные магнитные частицы, конъюгированные с антителом против CD105 (CD105-FF). Образец крови содержал множество клеток (клеток плода и клеток матери). Первый экзогенный фактор, усиливающий агрегацию, например, детиобиотин, конъюгировали с коллоидной магнитной частицей. Второй экзогенный фактор, усиливающий агрегацию, например, стрептавидин, добавляли к образцу. Безотносительно к теоретическим представлениям, добавление второго экзогенного фактора, усиливающего агрегацию, индуцировало агрегацию коллоидных магнитных частиц, тем самым облегчая выделение клеток плода и снижая загрязнение клетками, не являющимися клетками плода. Образец наносили на магнитный сепаратор и выделяли клетки, связанные EpCAM-FF или CD105-FF.
[0437] Для облегчения дальнейшего анализа клеток, связанных EpCAM-FF или CD105-FF, к выделенным клеткам добавляли третий экзогенный фактор, усиливающий агрегацию, например, биотин. Безотносительно к теоретическим представлениям, добавление третьего экзогенного фактора, усиливающего агрегацию, устраняло агрегацию коллоидных магнитных частиц, тем самым облегчая анализ одиночных клеток.
[0438] Технология сортировки клеток DEPArray: TLS1 (т.е. TREML2) использовали в качестве кандидата для окрашивания клеток трофобласта. Выделенные клетки окрашивали антителом против TLS (т.е. антителом против TREML2), антителом против HLA-G и цито кератином, мечеными флуоресцентной меткой. Образец с выделенными и окрашенными клетками наносили на картридж DEPArray и анализировали с помощью прибора DEPArray. Клетки идентифицировали как трофобласты, если они положительно окрашивались по TLS, HLA-G и цитокератину.
[0439] Пример 7: Диагностика аномалий плода
[0440] Клетки плода, выделенные или идентифицированные с помощью слюбого из способов, описанных в настоящем документе, в дальнейшем анализировали для диагностики аномалий плода. В клетках плода выполняли анализ кариотипа для обнаружения хромосомных аберраций. При обнаружении хромосомной аберрации у плода диагностировали соответствующее расстройство. Например, при обнаружении трех копий 21 хромосомы у плода диагностировали синдром Дауна. В еще одном примере при обнаружении трех копий 18 хромосомы у плода диагностировали синдром Эдвардса.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Menarini Biomarkers Singapore PTE LTD
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ, ОБНАРУЖЕНИЯ И АНАЛИЗА
КЛЕТОК ПЛОДА
<130> 111346-0203
<140> PCT/IB2020/056632
<141> 2020-07-14
<150> US 62/874 306
<151> 2019-07-15
<160> 11
<170> Версия PatentIn 3.5
<210> 1
<211> 321
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Ala Pro Ala Phe Leu Leu Leu Leu Leu Leu Trp Pro Gln Gly Cys
1 5 10 15
Val Ser Gly Pro Ser Ala Asp Ser Val Tyr Thr Lys Val Arg Leu Leu
20 25 30
Glu Gly Glu Thr Leu Ser Val Gln Cys Ser Tyr Lys Gly Tyr Lys Asn
35 40 45
Arg Val Glu Gly Lys Val Trp Cys Lys Ile Arg Lys Lys Lys Cys Glu
50 55 60
Pro Gly Phe Ala Arg Val Trp Val Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Leu Gln
65 70 75 80
Asp Asp Ala Gln Ala Lys Val Val Asn Ile Thr Met Val Ala Leu Lys
85 90 95
Leu Gln Asp Ser Gly Arg Tyr Trp Cys Met Arg Asn Thr Ser Gly Ile
100 105 110
Leu Tyr Pro Leu Met Gly Phe Gln Leu Asp Val Ser Pro Ala Pro Gln
115 120 125
Thr Glu Arg Asn Ile Pro Phe Thr His Leu Asp Asn Ile Leu Lys Ser
130 135 140
Gly Thr Val Thr Thr Gly Gln Ala Pro Thr Ser Gly Pro Asp Ala Pro
145 150 155 160
Phe Thr Thr Gly Val Met Val Phe Thr Pro Gly Leu Ile Thr Leu Pro
165 170 175
Arg Leu Leu Ala Ser Thr Arg Pro Ala Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Phe
180 185 190
Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ser Gln Gly Pro Arg Arg Thr Met Gly Ser
195 200 205
Gln Thr Val Thr Ala Ser Pro Ser Asn Ala Arg Asp Ser Ser Ala Gly
210 215 220
Pro Glu Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Leu Ser Thr Arg Ser Pro
225 230 235 240
Thr Thr Gly Leu Cys Leu Thr Ser Arg Ser Leu Leu Asn Arg Leu Pro
245 250 255
Ser Met Pro Ser Ile Arg His Gln Asp Val Tyr Ser Thr Val Leu Gly
260 265 270
Val Val Leu Thr Leu Leu Val Leu Met Leu Ile Met Val Tyr Gly Phe
275 280 285
Trp Lys Lys Arg His Met Ala Ser Tyr Ser Met Cys Ser Asp Pro Ser
290 295 300
Thr Arg Asp Pro Pro Gly Arg Pro Glu Pro Tyr Val Glu Val Tyr Leu
305 310 315 320
Ile
<210> 2
<211> 250
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Pro Ser Ala Asp Ser Val Tyr Thr Lys Val Arg Leu Leu Glu Gly
1 5 10 15
Glu Thr Leu Ser Val Gln Cys Ser Tyr Lys Gly Tyr Lys Asn Arg Val
20 25 30
Glu Gly Lys Val Trp Cys Lys Ile Arg Lys Lys Lys Cys Glu Pro Gly
35 40 45
Phe Ala Arg Val Trp Val Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Leu Gln Asp Asp
50 55 60
Ala Gln Ala Lys Val Val Asn Ile Thr Met Val Ala Leu Lys Leu Gln
65 70 75 80
Asp Ser Gly Arg Tyr Trp Cys Met Arg Asn Thr Ser Gly Ile Leu Tyr
85 90 95
Pro Leu Met Gly Phe Gln Leu Asp Val Ser Pro Ala Pro Gln Thr Glu
100 105 110
Arg Asn Ile Pro Phe Thr His Leu Asp Asn Ile Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Val Thr Thr Gly Gln Ala Pro Thr Ser Gly Pro Asp Ala Pro Phe Thr
130 135 140
Thr Gly Val Met Val Phe Thr Pro Gly Leu Ile Thr Leu Pro Arg Leu
145 150 155 160
Leu Ala Ser Thr Arg Pro Ala Ser Lys Thr Gly Tyr Ser Phe Thr Ala
165 170 175
Thr Ser Thr Thr Ser Gln Gly Pro Arg Arg Thr Met Gly Ser Gln Thr
180 185 190
Val Thr Ala Ser Pro Ser Asn Ala Arg Asp Ser Ser Ala Gly Pro Glu
195 200 205
Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Leu Ser Thr Arg Ser Pro Thr Thr
210 215 220
Gly Leu Cys Leu Thr Ser Arg Ser Leu Leu Asn Arg Leu Pro Ser Met
225 230 235 240
Pro Ser Ile Arg His Gln Asp Val Tyr Ser
245 250
<210> 3
<211> 63
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Ala Asp Ser Val Tyr Thr Lys Val Arg Leu Leu Glu Gly Glu Thr
1 5 10 15
Leu Ser Val Gln Cys Ser Tyr Lys Gly Tyr Lys Asn Arg Val Glu Gly
20 25 30
Lys Val Trp Cys Lys Ile Arg Lys Lys Lys Cys Glu Pro Gly Phe Ala
35 40 45
Arg Val Trp Val Lys Gly Pro Arg Tyr Leu Leu Gln Asp Asp Ala
50 55 60
<210> 4
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 4
Gly Arg Tyr Trp Cys Met Arg Asn Thr Ser Gly Ile Leu Tyr Pro Leu
1 5 10 15
Met Gly Phe Gln Leu Asp Val Ser Pro Ala Pro Gln Thr Glu Arg Asn
20 25 30
Ile Pro Phe Thr His Leu Asp Asn Ile Leu Lys Ser Gly Thr Val Thr
35 40 45
Thr Gly
50
<210> 5
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 5
Thr Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Thr Ser Thr Thr Ser Gln Gly Pro Arg
1 5 10 15
Arg Thr Met Gly Ser Gln Thr Val Thr Ala Ser Pro Ser Asn Ala Arg
20 25 30
Asp Ser Ser Ala Gly Pro Glu Ser Ile Ser Thr Lys Ser Gly Asp Leu
35 40 45
Ser Thr
50
<210> 6
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 6
Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser Gly Met Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 7
Ile Trp Trp Tyr Asp Asp Lys
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 8
Val Arg Ile Glu Ser Thr Met Ile Thr Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 9
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Tyr Ser Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 3
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 10
Ala Ala Ser
1
<210> 11
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Mus musculus
<400> 11
Gln Gln Ser Ile Glu Asp Pro Trp Thr
1 5
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К АМИЛОИДУ БЕТА | 2007 |
|
RU2498999C2 |
| Выделенное антитело к CD45RC человека, нуклеиновая кислота, вектор экспрессии, клетка, фармацевтическая композиция, их применение, in vitro способ обнаружения hCD45RC | 2019 |
|
RU2826421C2 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ GDF8 ЧЕЛОВЕКА | 2011 |
|
RU2567805C2 |
| АНТИТЕЛА К АЛЬФА-СИНУКЛЕИНУ И ВАРИАНТЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2812765C2 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ GDF8 ЧЕЛОВЕКА | 2011 |
|
RU2710156C2 |
| ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА К ТОКСИНАМ CLOSTRIDIUM DIFFICILE | 2013 |
|
RU2628305C2 |
| ГУМАНИЗИРОВАННОЕ АНТИТЕЛО К АМИЛОИДУ БЕТА | 2013 |
|
RU2668161C2 |
| ИНГИБИТОРЫ ПУТИ IL-4/IL-13 ДЛЯ ПОВЫШЕННОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ | 2020 |
|
RU2836467C2 |
| АНТИ-ГАЛЕКТИН-9 АНТИТЕЛО И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2021 |
|
RU2840501C1 |
| АНТИТЕЛА ПРОТИВ 5T4 И КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО | 2016 |
|
RU2736720C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу обнаружения клеток плода в образце крови, полученном от беременного субъекта, включающему: a) приведение образца в контакт с первым антителом, конъюгированным с магнитными частицами; b) выделение клеток, связанных с первым антителом, конъюгированным с магнитными частицами, с получением обогащенного образца; c) приведение указанного обогащенного образца в контакт со вторым антителом, конъюгированным с меткой против TREML2 и цитокератина (CK); d) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, конъюгированным с меткой, как клетки плода, а также к способу обнаружения клеток плода в образце крови, полученном от беременного субъекта, включающему: a) приведение образца в контакт с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, конъюгированным с магнитными частицами против TREML2 и цитокератина (CK); b) идентификацию клетки, связанной с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, конъюгированным с магнитными частицами, как клетки плода. Изобретение обеспечивает возможность расширения способов неинвазивного пренатального тестирования. 2 н. и 22 з.п. ф-лы, 18 ил., 11 табл.
1. Способ обнаружения клеток плода в образце крови, полученном от беременного субъекта, содержащем клетки плода и клетки, не являющиеся клетками плода, причем указанный способ включает:
(a) приведение образца в контакт с первым антителом, конъюгированным с магнитными частицами, причем указанное первое антитело связывается с эндотелиальным маркером, выбранным из CD105 и CD71;
(b) выделение клеток, связанных с первым антителом, конъюгированным с магнитными частицами, с получением обогащенного образца;
(c) приведение указанного обогащенного образца в контакт со вторым антителом, конъюгированным с меткой, которое связывается с маркером клетки плода, выбранным из аналога 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2), и цитокератина (CK); и
(d) идентификацию клетки, связанной со вторым антителом, конъюгированным с меткой, как клетки плода,
причем указанная клетка плода представляет собой трофобласт плода или эритробласт плода.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что магнитные частицы представляют собой коллоидные магнитные частицы.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что указанные коллоидные магнитные частицы представляют собой магнитные частицы ферромагнитной жидкости.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что этап (b) включает воздействие магнитным полем на образец.
5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что указанные магнитные частицы дополнительно присоединены к первому экзогенному фактору, усиливающему агрегацию (EAEF), причем указанный первый EAEF содержит один член специфично связывающейся пары, выбранной из группы, включающей биотин-стрептавидин, антиген-антитело, рецептор-гормон, рецептор-лиганд, агонист-антагонист, лектин-углевод, белок А-Fc антитела и авидин-биотин, аналог биотина-авидин, детиобиотин-стрептавидин, детиобиотин-авидин, иминобиотин-стрептавидин и иминобиотин-авидин.
6. Способ по п. 5, отличающийся тем, что этап (а) включает добавление второго EAEF для индукции агрегации магнитных частиц, причем указанный второй EAEF содержит другой член специфично связывающейся пары.
7. Способ по п. 6, отличающийся тем, что этап (b) включает добавление члена специфично связывающейся пары к обогащенному образцу с целью устранения агрегации магнитных частиц в обогащенном образце.
8. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий перед этапом (а) добавление к образцу по меньшей мере одного агента, ингибирующего агрегацию, выбранного из группы, состоящей из восстанавливающего агента, иммунного комплекса, хелатирующего агента и диаминобутана.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что агент, ингибирующий агрегацию, представляет собой хелатирующий агент, и причем указанный хелатирующий агент представляет собой ЭДТА.
10. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанное второе антитело, конъюгированное с меткой, связывается с TREML2.
11. Способ по п. 10, дополнительно включающий выделение одиночных клеток плода перед этапом (d).
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что выделение одиночных клеток плода выполняют, выделяя одиночные клетки плода, связанные со вторым антителом, конъюгированным с меткой.
13. Способ по п. 1, отличающийся тем, что метка представляет собой флуоресцентную метку.
14. Способ по п. 13, отличающийся тем, что выделение одиночных клеток плода основано на иммунофлуоресцентной технологии.
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что выделение одиночных клеток плода выполняют посредством сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS).
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что выделение одиночных клеток плода выполняют с использованием DEP Array.
17. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что этап (d) включает выполнение анализа на основе секвенирования.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что анализ на основе секвенирования включает анализ коротких тандемных повторов (КТП).
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий анализ клеток плода, отличающийся тем, что анализ клеток плода включает выполнение геномного или генетического анализа.
20. Способ по п. 19, отличающийся тем, что выполнение геномного или генетического анализа включает обнаружение наличия или отсутствия одной или более генетических аномалий в клетке плода.
21. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что второе антитело, конъюгированное с меткой, связывается с TREML2 и содержит вариабельную область тяжелой цепи (HCVR), содержащую:
(i) определяющий комплементарность участок (CDR) 1 HCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6;
(ii) CDR2 HCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7;
(iii) CDR3 HCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8; и/или вариабельную область легкой цепи (LCVR), содержащую:
(iv) CDR1 LCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9;
(v) CDR2 LCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10; и
(vi) CDR3 LCVR, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что второе антитело, конъюгированное с меткой, связывается с TREML2 и выбрано из sc-109096, ARP49877_P050, OACA04996, AF3259, MA5-30973, PA5-47471, ABIN634968, ABIN928294, 30-552, ABIN2463297, ABIN19999041, 11655-r001, ABIN749888, bs-2737r, ABIN1999045, 11655-rp02, ABIN293207, ABIN2387613, t8282-40, ABIN4249314, nbp1-70737-20ul и BD563661.
23. Способ обнаружения клеток плода в образце крови, полученном от беременного субъекта, содержащем клетки плода и клетки, не являющиеся клетками плода, причем указанный способ включает:
(a) приведение образца в контакт с первым антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, конъюгированным с магнитными частицами, причем первое антитело или его антиген-связывающий фрагмент связывается с аналогом 2 триггерного рецептора, экспрессирующегося на миелоидных клетках (TREML2); и
(b) идентификацию клетки, связанной с первым антителом или его антиген-связывающим фрагментом, конъюгированным с магнитными частицами, как клетки плода, причем указанная клетка плода представляет собой трофобласт плода или эритробласт плода.
24. Способ по п. 23, дополнительно включающий приведение образца в контакт со вторым антителом, конъюгированным с меткой, которое связывается с цитокератином (CK), и идентификацию клетки, которая связывается со вторым антителом, конъюгированным с меткой, как трофобласта плода.
| WO 2003102595 A1, 11.12.2003 | |||
| WO 2005123779 A2, 29.12.2005 | |||
| ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ЭМБРИОНАЛЬНОГО ГЕМОГЛОБИНА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПЛОДНЫХ КЛЕТОК | 1997 |
|
RU2178703C2 |
| WO 2017062672 A2, 13.04.2017 | |||
| СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ АНТИГЕН/ГАПТЕНСПЕЦИФИЧЕСКИХ СУБПОПУЛЯЦИЙ ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ КЛЕТОК КРОВИ | 1997 |
|
RU2128841C1 |
| Zheng Y.L., et al., Search for the optimal fetal cell antibody: results of immunophenotyping studies using flow cytometry, Human Genetics, 1997, v | |||
| Облицовка комнатных печей | 1918 |
|
SU100A1 |
| Скоропечатный станок для печатания со стеклянных пластинок | 1922 |
|
SU35A1 |
