ИНГИБИТОРЫ CXCR7 ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2023 года по МПК A61K31/5513 A61K45/06 A61P35/00 

Уровень техники

Опухолевые ткани состоят из многих гетерогенных типов клеток; не только опухолевых клеток, но и других типов клеток, включая ассоциированные с раком фибробласты (CAF), которые представляют собой основной компонент стромы опухоли. В последнее время большое внимание уделяют микросреде опухоли как новой терапевтической мишени, поскольку все эти клетки, по-видимому, поддерживают выживание и рост опухолевых клеток. Накопленные данные указывают на то, что сами опухолевые клетки гетерогенны и включают небольшое количество раковых стволовых клеток (CSC), которые представляют собой раковые клетки с признаками стволовости, и большое количество быстрорастущих дифференцированных опухолевых клеток. Считается, что CSC контролируют нишу CSC, которая представляет собой микросреду, окружающую CSC, для их собственного выживания и роста. Считается, что среда, богатая воспалительными цитокинами, вовлечена в формирование микросреды CSC и опухоли. В нескольких отчетах было показано, что фактор транскрипции ядерного фактора-κB (NFκB) играет ключевую роль в производстве цитокинов, включая цитокины семейства инсулиноподобного фактора роста (IGF) и хемокиновый лиганд CXC (CXCL) 12. Цитокины семейства IGF поддерживают недифференцированное состояние CSC, и CXCL12, как известно, участвует в хемотаксисе CAF, а сам CXCL12 активирует NFκB. Известно, что NFκB представляет собой основной воспалительный фактор транскрипции и имеет вид гетеродимерного комплекса (RelA и p50 или RelB и p52), который связывается с IκB в неактивном состоянии. Стимуляция лигандами приводит к фосфорилированию IKKα/β и IκB. Затем фосфорилированный IκB подвергается убиквитилированию/деградации, а высвободившийся гетеродимер NF-κB транспортируется в ядро для активации транскрипции. Однако остается неясным, как это происходит в начале развития опухоли, когда в очевидно нормальной ткани имеется всего несколько опухолевых клеток.

Рак груди представляет собой самый распространенный вид рака у женщин. В последнее время большое внимание уделяется профилактике рака с целью уменьшения количество больных. Новые данные свидетельствуют о том, что воспаление способствует возникновению рака груди, однако основные молекулярные механизмы остаются неизвестными. Несмотря на достижения в терапевтических стратегиях, связанная с заболеванием смертность все еще высока из-за частых рецидивов. Накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что CSC представляют собой основную причину плохого прогноза. Они устойчивы к различным стрессовым условиям и, как считается, ответственны за возникновение, рецидив и терапевтическую резистентность опухоли. Ткани рака молочной железы во многих случаях содержат достаточное количество стромы, что указывает на то, что CAF-содержащая микросреда опухоли играет важную роль в развитии рака молочной железы. Таким образом, есть большая надежда, что нацеливание на микросреду опухоли или нишу CSC для устранения CSC будет эффективной терапевтической стратегией при раке груди. Несмотря на эту задачу, по-прежнему необходимы надежно эффективные способы лечения.

Часть рака молочной железы принадлежит к подтипу рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2)/ErbB2, при котором в раковых клетках наблюдается амплификация гена HER2 или/и сверхэкспрессия белка HER2. Герцептин, гуманизированное антитело против HER2, эффективно против HER2-положительных случаев; однако резистентность к герцептину или рецидив по-прежнему создают серьезные проблемы. Трансгенные мыши с вирусом опухоли молочной железы мыши (MMTV)-ErbB2 обладают сверхэкспрессией ErbB2 в тканях молочной железы, что вызывает онкогенез. Ткани молочных желез состоят из множества ветвящихся канальцев, которые заканчиваются в альвеолах, и оба они расширяются во время беременности. Эпителий состоит из двух основных клеточных слоев: люминальных клеток, которые окружают внутренний просвет, и сильно удлиненного миоэпителия с другой стороны. Считается, что люминальные клетки -предшественники существуют в слое люминальных клеток. Данные свидетельствуют о том, что люминальные клетки-предшественники представляют собой клетки происхождения онкогенеза молочной железы в этой модели и в раке молочной железы у человека. Однако эффективные способы лечения для предотвращения или лечения онкогенеза этих клеток остаются активными областями изучения.

ErbB2 гомодимеризуется или гетеродимеризуется с другими членами семейства ErbB и активирует сигнальные пути протеинкиназы (ERK) и фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), регулируемой внеклеточным сигналом, что приводит ко многим аспектам биологии опухоли. Передача сигналов ErbB-ERK увеличивает пролиферацию и дифференцировку клеток в зависимости от клеточного контекста. Передача сигналов ErbB-PI3K активирует NFκB.

Адаптерный белок FRS2β, также называемый SNT-2 или FRS3, обильно экспрессируется в головном мозге, но только в нескольких областях других тканей, тогда как другой член семейства FRS2, FRS2α, экспрессируется обильно в большинстве тканей. Дополнительная информация об экспрессии FRS2β обсуждают в работе Gotoh et al. FEBS Lett. 2004. 564 (1-2): 14-8. FRS2β, но не FRS2α, конститутивно связывается с членами семейства ErbB, включая ErbB2, который связывается с активированным ERK для ингибирования обратной связи и точно настраивает передачу сигналов ErbB-ERK. FRS2β также индуцирует субиквитилирование и деградацию ErbB1/2. Однако роль FRS2β in vivo, в особенности, в развитии опухоли, остается неизвестной.

В совокупности в данной области техники остается потребность в идентификации процессов, которые приводят к развитию нишевых сред CSC, и средств, которые могут нацеливаться на соответствующие агенты, чтобы модулировать, уменьшать или предотвращать развитие опухоли. Настоящее изобретение удовлетворяет эту потребность, а также обеспечивает связанные с этим преимущества.

Краткое раскрытие изобретения

В одном аспекте настоящего документа представлены способы лечения рака у индивидуума, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение индивиду ингибитора CXCR7, при этом индивидуум имеет аберрантную экспрессию FRS2β.

В другом аспекте настоящего документа представлены способы предотвращения развития предраковых клеток, экспрессирующих FRS2β, в рак, указанный способ включает введение индивидууму, имеющему предраковые клетки, экспрессирующие FRS2β, ингибитора CXCR7.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру формулы I и/или II:

определения для каждой вариабельной группы более подробно описаны ниже.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 1

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 2

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 3

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 4

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 5

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 6

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 7

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 8

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 9

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, в способах, представленных в настоящем документе, применяют одно или несколько терапевтических средств. В некоторых воплощениях, одно или несколько терапевтических средств представляют собой ингибитор IGF1 и/или ингибитор CXCR4. В некоторых воплощениях ингибитор IGF1 представляет собой антитело против IGF1.

Другие объекты, особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны специалисту в данной области техники из следующего подробного описания и фигур.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1A-H. Дефицит FRS2β, экспрессируемого в люминальных клетках, сильно задерживает онкогенез молочной железы. (A) Репрезентативные изображения окрашивания β-галактозидазой для зрелых женских молочных желез гетерозиготного мутантного аллеля Frs2β. Красные стрелки указывают на FRS2β-положительные клетки. (B) Схема молочных желез. Многие из ветвящихся трубочек окружены внутренним слоем люминальных эпителиальных клеток и внешним слоем миоэпителиальных эпителиальных клеток. (C) Иммуногистологическое окрашивание женских молочных желез антителом против FRS2β и антителом к фосфогистону H3 (верхняя панель) или DAPI (нижняя панель). (D) Иммуногистологическое окрашивание женских молочных желез антителом против FRS2β и цитокератином 18 (верхние панели) или цитокератином 14 (нижние панели). (E) Репрезентативная NMR-визуализация опухолей молочной железы, показанная во фронтальных плоскостях мышей через 14 недель после начала наблюдения. Левая сторона – голова, правая – живот. (F) Рост опухоли у мышей MMTV-neu (+)/Frs2β (+/+) и MMTV-neu (+)/Frs2β (-/-). Размеры опухолей измеряли один раз в неделю в течение 14-ти недель (среднее значение ± SEM, n = 15). Уровень экспрессии FRS2β сравнивали с помощью анализа qRT-PCR среди девственниц, беременных и продуцирующих молоко (среднее ± SEM, n = 4, **p< 0,005, *p< 0,01). (G) Типичные окрашенные гематоксилином и эозином (HE) срезы опухолей молочной железы. (H) Иммуногистохимическое окрашивание опухолей молочной железы Frs2β (+/+) и Frs2β(-/-) с применением антител против αSMA. Масштабный отрезок: 100 мкм.

Фиг. 2A-F. FRS2β, экспрессируемый в люминальных клетках-предшественниках, поддерживает онкогенез, происходящий из ксенотрансплантатов опухолевых клеток. (A) Frs2β (+/+) сферические опухолевые клетки, культивированные в течение 14-ти дней, как показано на репрезентативном изображении, инокулировали в жировые подушечки молочной железы Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) 8-недельных девственных самок мышей. (B) репрезентативные опухоли фотографировали через 30 дней после трансплантации, и (C) измеряли объем удаленных опухолей. (D) Опухоль, происходящую от сферических опухолевых клеток Frs2β (+/+), наблюдали у мышей Frs2β (+/+), но не у мышей Frs2β (-/-) (n = 4). Цифры указывают отношение количества опухолей к количеству засеянных участков. (E) Иммуногистохимическое окрашивание женских молочных желез MMTV-neu (-) или MMTV-neu (+) антителом против FRS2β и антителом против ErbB2. Стрелки указывают на FRS2β-положительные люминальными клетки. (F) Эпителиальные клетки молочных желез были отсортированы с применением маркеров. Субпопуляции люминальных клеток P1 (CD49f_низкий/CD24_{высокий}) дополнительно сортировали с применением CD61. Субпопуляции люминальных клеток-предшественников P2 (CD49f_низкий/CD24_{высокий}/CD61₊) дополнительно сортировали с помощью FRS2β для получения субпопуляции P3 (CD49f_низкий/CD24_{высокий}/CD61₊ /FRS2β₊).

Фиг. 3A-F. Люминальные клетки -предшественники с дефицитом FRS2β продуцируют меньшее количество цитокинов. (A) Типичные изображения маммосфер, полученных из эпителиальных клеток молочной железы Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-), культивируемых в сферической культуральной среде (SCM). (B) Количественная оценка эффективности образования сфер клеток маммосферы. N.T., не обрабатывали цитокинами -коктейлями в SCM. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n = 4. **p<0,01, *p<0,05. (C) Анализ обогащения набора генов (GSEA) применяли для сравнения профилей экспрессии генов в клетках маммосферы Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-). Показаны два набора генов с высокой активностью в клетках маммосферы Frs2β (+/+). (D) Анализ обогащения набора генов (GSEA) применяли для сравнения профилей экспрессии генов в предраковых эпителиальных клетках молочной железы Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-). Показаны наборы генов с высокой активностью в клетках Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-). ES, показатель обогащения; NES, нормализованный показатель обогащения; FDR, коэффициент ложного обнаружения. (E) Уровни экспрессии транскриптов указанных генов сравнивали между Frs2β (+/-) и Frs2β (-/-) клетками маммосферы с помощью количественной ПЦР в реальном времени (qPCR). Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n = 4. **p<0,01. (F) Иммуногистохимическое окрашивание опухолей молочной железы Frs2β (+/+) и Frs2β(-/-) с применением антител против αSMA, CXCL12 и IGF1.

Фиг. 4A-I. CXCL12, продуцируемый из предраковых клеток молочной железы Frs2β (+/+), индуцирует сферы опухоли и миграцию CAF. (A) Схема совместного культивирования опухолевых клеток Frs2β (+/+) с образованием сфер в нижней камере с Frs2β (+/+) предраковыми эпителиальными клетками молочной железы в верхней камере. (B) Типичные изображения образования сферы опухоли в присутствии эпителиальных клеток молочной железы Frs2β (+/+), обработанных контрольным IgG (400 нМ) или нейтрализующим антителом IGF1 (Nab) (400 нМ). N.T., без обработки (без совместного культивирования с эпителиальными клетками молочной железы). Масштабный отрезок: 100мкм. (C) Количественная оценка эффективности образования сфер опухоли. Результаты показаны как средние значения ± SEM. n = 4. ***p<0,001, **p<0,01. (D) Схема совместного культивирования клеток молочной железы Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) в нижней камере с Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) CAF в верхней камере. (E) Уровни экспрессии Cxcl12 сравнивали между клетками молочной железы Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) в верхней камере с помощью qPCR. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n = 6. ***p<0,001. (F) Репрезентативные изображения мигрировавших Frs2β (+/+) CAF, совместно культивируемых с Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) клетками молочной железы в верхней камере в течение 24-х часов. (G) Количественное определение мигрировавших Frs2β (+/+) CAF. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n = 4. **p<0,01. (H) Репрезентативные изображения мигрировавших CAF, совместно культивируемых с Frs2β (+/+) раковыми клетками в течение 24-х часов. Клетки обрабатывали соединением 1 в указанной концентрации и/или + 0,1 мг/мл AMD3100) или представляли собой контроль. (I) Количественная оценка мигрировавших CAF, совместно культивируемых с Frs2β (+/+) раковыми клетками в течение 24-х часов. Результаты представлены как среднее значение ± SEM.n = 4. ***p<0,001 и **p<0,01.

Фиг. 5A-K FRS2β-зависимое увеличение активации AKT-NFkB увеличивает продукцию IGF1 и CXCL12, способствуя онкогенезу. (A) Схема обработки DHMEQ культивированных Frs2β (+/+) предраковых эпителиальных клеток молочной железы in vitro. (B) Уровни экспрессии Igf1, Cxcl12 и IκBα в предраковых эпителиальных клетках молочной железы Frs2β (+/+), обработанных указанной концентрацией DHMEQ, сравнивали с помощью qPCR. Результаты показаны как средние значения ± SEM. n = 4. **p<0,01. (C) Анализ с помощью иммуноблоттинга указанных белков в лизате Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) предраковых тканей молочной железы. Актин применяли в качестве контроля нагрузки. (D) Анализ с помощью иммуноблоттинга уровней цитоплазматической и ядерной экспрессии указанных белков (контроль как ядерный белок) в лизате Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) тканей молочной железы. PARP1 применяли в качестве репрезентативного белка в ядре. Актин применяли в качестве контроля нагрузки. (E)Анализ с помощью иммуноблоттинга указанных белков в лизате Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) тканей молочной железы. Актин применяли в качестве контроля нагрузки. (F) Схема обработки DHMEQ мышей Frs2β (+/+) in vivo. Мышам внутрибрюшинно вводили 10 мкг/г DHMEQ один раз в день в течение 3-х недель. (G) Иммуногистохимическое окрашивание тканей молочной железы Frs2β (+/+) с или без 3-недельной обработки 10 мкг/г DHMEQ или Frs2β (-/-) тканей молочной железы с применением антител против RelA. Масштабный отрезок: 50 мкм. (H) Уровни экспрессии Igf1 и Cxcl12 в тканях молочной железы Frs2β (+/+) с 3-недельной обработкой 10 мкг/г DHMEQ или без нее. Н.Т., без обработки. Результаты показаны как средние значения ± SEM. n = 4. ***p< 0,001 и **p<0,01. (I) Обработка мышей ингибитором CXCR7 и/или антителом IGF1 уменьшает объем опухоли. Клетки опухолевой сферы Frs2β (+/+) инокулировали в жировые подушечки молочных желез 8-недельных девственных самок мышей MMTV-neu (+)/Frs2β (+/+). Через 7 дней мышам внутрибрюшинно вводили 0,1 мкг/г антитела IGF1 («R&D Biosystems») один раз в неделю и/или 1 мкг/г AMD3100 («Sigma») один раз в день и 1,5 мкг/г соединения 1 один раз в день. Репрезентативные опухоли фотографировали на 35 день после трансплантации CXCL12 Inh, комбинации AMD3100 и CCX771. Объемы (J) и массы (K) опухолей измеряли у мышей, получавших обработку, как в (I). Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM, nK = 4, *p<0,05.

Фиг. 6 A-G Опухолевые клетки, экспрессирующие FRS2β, продуцируют IGF1 и CXCL12 и связаны с обильной стромой и плохим прогнозом (A) Иммуногистохимическое окрашивание опухолей молочной железы Frs2β (+/+) антителами против FRS2b и против ErbB2. Масштабный отрезок, 25 мкм. (B) Уровни экспрессии Cxcl12 и Igf1 сравнивали между опухолевыми клетками Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-) с помощью qPCR. Результаты показаны как средние значения ± SEM. n = 4. ***p< 0,001. (C) Иммуногистохимическое окрашивание антителами против IGF1 и CXCL12. Масштабный отрезок, 200 мкм (D) Тканевые панели подвергали иммуногистохимическому окрашиванию антителом против FRS2b или окрашиванию трихромом Массона для обнаружения коллагена в строме. Стрелками обозначена область стромы. Шкала: 50 мкм. (E) Образцы опухолей были разделены на три группы в соответствии с отношением площади стромы опухоли к общей площади опухоли (+: 0-10%, ++; 10-20%, +++; > 20%). Медиану уровней окрашивания FRS2b применяли для значений отсечения. n = 30. (F) Кривая выживаемости Каплана-Мейера, построена с применением когорты Упсалы (GSE3494). Медианы применяли для порогового значения. P-значение было получено с помощью лог-рангового теста. (G) FRS2b может запускать продукцию цитокинов в подмножестве люминальных клеток, что приводит к созданию богатого цитокинами предракового микроокружения (верхняя левая панель). Как только CSC появляются в предраковом микроокружении, они приобретают способность самообновляться в присутствии IGF1 и продуцировать опухолевые клетки с помощью CXCL12-мобилизованных стромальных клеток, которые впоследствии превращаются в CAF. CSC и опухолевые клетки могут самостоятельно продуцировать IGF1 и CXCL12, что приводит к быстрому росту и онкогенезу (нижняя левая панель). Без FRS2β цитокины остаются на низком уровне, и соответствующее предраковое микроокружение не создается (верхняя правая панель); даже когда появляются CSC, они не могут эффективно расти (нижняя правая панель).

Осуществление изобретения

I. Общее

Настоящее описание демонстрирует, что аберрантная экспрессия FRS2β поддерживает подходящие условия микроокружения для роста опухоли и играет критическую роль в создании богатой цитокинами ниши CSC. Неожиданно вредные эффекты этой экспрессии можно эффективно модулировать путем введения ингибитора CXCR7 или ингибитора CXCR7 в комбинации с другим терапевтическим средством.

II. Определения

Термин «алкил» сам по себе или как часть другого заместителя означает, если не указано иное, углеводородный радикал с прямой или разветвленной цепью, имеющий указанное число атомов углерода (т.е. C_1-8 означает от одного до восьми атомов углерода). Примеры алкильных групп включают метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, трет-бутил, изобутил, втор-бутил, н-пентил, н-гексил, н-гептил, н-октил и тому подобное. Термин «алкенил» относится к ненасыщенной алкильной группе, имеющей одну или несколько двойных связей. Аналогично, термин «алкинил» относится к ненасыщенной алкильной группе, имеющей одну или несколько тройных связей. Примеры таких ненасыщенных алкильных групп включают винил, 2-пропенил, кротил, 2-изопентенил, 2-(бутадиенил), 2,4-пентадиенил, 3-(1,4-пентадиенил), этинил, 1- и 3-пропинил, 3-бутинил, а также высшие гомологи и изомеры. Термин «циклоалкил» относится к углеводородным кольцам, имеющим указанное количество кольцевых атомов (например, C_3-6циклоалкил) и полностью насыщенным или имеющим не более одной двойной связи между вершинами кольца. «Циклоалкил» также означает бициклические и полициклические углеводородные кольца, такие как, например, бицикло[2.2.1]гептан, бицикло[2.2.2]октан и т.д. Термин «циклоалкенил» относится к циклоалкильной группе, имеющей, по меньшей мере, одну двойную связь между вершинами кольца. Циклопентенил и циклогексенил представляют собой примеры циклоалкенила. Термин «спироциклоалкил» относится к циклоалкильной группе, в которой одна вершина кольца присоединена к двум другим неводородным частям молекулы. Спироциклоалкильный заместитель представляет собой заместитель, в котором два атома углерода алкиленовой цепи (обычно концы алкиленовой цепи) присоединены к одному и тому же атому углерода в остальной части молекулы. Термин «гетероциклоалкил» относится к циклоалкильной группе, которая содержит от одного до пяти гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота и серы необязательно окислены, а атом (атомы) азота необязательно кватернизован (кватернизованы). Гетероциклоалкил может представлять собой моноциклическую, бициклическую или полициклическую кольцевую систему. Неограничивающие примеры гетероциклоалкильных групп включают пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, бутиролактам, валеролактам, имидазолидинон, гидантоин, диоксолан, фталимид, пиперидин, 1,4-диоксан, морфолин, тиоморфолин, тиоморфолин-S-оксид, тиоморфолин-S,S-оксид, пиперазин, пиран, пиридон, 3-пирролин, тиопиран, пирон, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, хинуклидин и тому подобное. Гетероциклоалкильная группа может быть присоединена к остатку молекулы через углерод кольца или гетероатом.

Термин «алкилен» сам по себе или как часть другого заместителя означает двухвалентный радикал, производный от алкана, как проиллюстрировано следующей формулой -CH₂CH₂CH₂CH₂-. Обычно алкильная (или алкиленовая) группа будет иметь от 1 до 24 атомов углерода, причем группы, содержащие 10 или меньше атомов углерода, представляют собой предпочтительные группы в настоящем изобретении. «Низший алкил» или «низший алкилен» представляет собой алкильную или алкиленовую группу с более короткой цепью, обычно имеющую четыре или меньше атомов углерода. Аналогично, «алкенилен» и «алкинилен» относятся к ненасыщенным формам «алкилена», имеющим двойные или тройные связи соответственно.

Как применено в настоящем документе, волнистая линия, "", которая пересекает одинарную, двойную или тройную связь в любой химической структуре, изображенной в данном документе, представляет собой точечное присоединение одинарной, двойной или тройной связи к остальной части молекулы.

Термины «алкоксигруппа», «алкиламиногруппа» и «алкилтиогруппа» (или тиоалкоксигруппа) применяют в их общепринятом смысле и относятся к тем алкильным группам, которые присоединены к остальной части молекулы через атом кислорода, аминогруппу или атом серы, соответственно. Кроме того, для диалкиламиногрупп алкильные части могут быть одинаковыми или разными, а также могут быть объединены с образованием 3-7-членного кольца с атомом азота, к которому каждая присоединена. Соответственно, группа, представленная как NR^aR^b, включает пиперидинил, пирролидинил, морфолинил, азетидинил и тому подобное.

Термины «гало-» или «галоген» сами по себе или как часть другого заместителя означают, если не указано иное, атом фтора, хлора, брома или йода. Кроме того, такие термины, как «галогеналкил», включают моногалогеналкил и полигалогеналкил. Например, термин «C_1-4галогеналкил» означает трифторметил, 2,2,2-трифторэтил, 4-хлорбутил, 3-бромпропил и тому подобное.

Термин «арил» означает, если не указано иное, полиненасыщенную, обычно ароматическую углеводородную группу, которая может представлять собой одно кольцо или несколько колец (до трех колец), которые конденсированы вместе или связаны ковалентно. Термин «гетероарил» относится к арильным группам (или кольцам), которые содержат от одного до пяти гетероатомов, выбранных из N, O и S, где атомы азота и серы необязательно окислены, а атом (атомы) азота необязательно кватернизован (кватернизованы). Гетероарильная группа может быть присоединена к остальной части молекулы через гетероатом. Неограничивающие примеры арильных групп включают фенил, нафтил и бифенил, в то время как неограничивающие примеры гетероарильных групп включают пиридил, пиридазинил, пиразинил, пириминдинил, триазинил, хинолинил, хиноксалинил, хиназолинил, циннолинил, фталазинил, бензолпиразинил, пуринил, бензимидазолил, бензопиразолил, бензотриазолил, бензизоксазолил, изобензофурил, изоиндолил, индолизинил, бензотриазинил, тиенопиридинил, тиенопиримидинил, пиразолопиримидинил, имидазопиридины, бензотиаксолил, бензофуранил, бензотиенил, индолил, хинолил, изохинолил, изотиазолил, пиразолил, индазолил, птеридинил, имидазолил, триазолил, тетразолил, оксазолил, изоксазолил, тиадиазолил, пирролил, тиазолил, фурил, тиенил и тому подобное. Заместители для каждой из указанных выше арильных и гетероарильных кольцевых систем выбирают из группы приемлемых заместителей, описанной ниже.

Термин «арилалкил» включает те радикалы, в которых арильная группа присоединена к алкильной группе (например, бензил, фенэтил и тому подобное). Аналогичным образом, термин «гетероарилалкил» предназначен для включения тех радикалов, в которых гетероарильная группа присоединена к алкильной группе (например, пиридилметил, тиазолилэтил и тому подобное).

Вышеупомянутые термины (например, «алкил», «арил» и «гетероарил») в некоторых воплощениях будут включать как замещенные, так и незамещенные формы указанного радикала. Ниже приведены предпочтительные заместители для каждого типа радикала.

Заместители для алкильных радикалов (включая группы, часто называемые алкиленом, алкенилом, алкинилом и циклоалкилом) могут быть различными группами, выбранными из: -галогена, -OR’, -NR’R”, -SR’, -SiR’R”R”’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO₂R’, -CONR’R”, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NR”C(O)₂R’, -NH-C(NH₂)=NH, -NR’C(NH₂)=NH, -NH-C(NH₂)=NR’, -S(O)R’, -S(O)₂R’, -S(O)₂NR’R”, -NR’S(O)₂R”, -CN и -NO₂в диапазоне от нуля до (2 m’+1), где m’ представляет собой общее количество атомов углерода в таком радикале. R’, R” и R’” каждый независимо означает водород, незамещенный C_1-8алкил, незамещенный арил, арил, замещенный 1-3 атомами галогена, незамещенный C_1-8алкил, C_1-8алкоксигрупп или C_1-8 тиоалкоксигруппы, или незамещенные арил-С_1-4алкильные группы. Когда R’ и R” присоединены к одному и тому же атому азота, то они могут быть объединены с атомом азота с образованием 3-, 4-, 5-, 6- или 7-членного кольца. Например, подразумевается, что -NR’R’’ включает 1-пирролидинил и 4-морфолинил.

Аналогичным образом заместители для арильной и гетероарильной групп варьируются и обычно выбираются из: -галогена, -OR’, -OC(O)R’, -NR’R”, -SR’, -R’, -CN, -NO₂, -CO₂R’, -CONR’R”, -C(O)R’, -OC(O)NR’R”, -NR”C(O)R’, -NR”C(O)₂R’, -NR’-C(O)NR”R”’, -NH-C(NH₂)=NH, -NR’C(NH₂)=NH, -NH-C(NH₂)=NR’, -S(O)R’, -S(O)₂R’, -S(O)₂NR’R”, -NR’S(O)₂R”, -N₃, перфтор(C₁-C₄)алкокси и перфтор(C₁-C₄)алкил в количестве от нуля до общего числа открытых валентностей в ароматической кольцевой системе; и где R’, R” и R”’ независимовыбирают из водорода, C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила, C_3-6циклоалкила, C_2-8алкенила, C_2-8алкинила, незамещенного арила и гетероарила (незамещенный арил)-C_1-4алкила и незамещенного арилокси -C_1-4алкила. Другие подходящие заместители включают каждый из указанных выше арильных заместителей, присоединенный к атому кольца алкиленовой связью из 1-4 атомов углерода.

Два заместителя у соседних атомов арильного или гетероарильного кольца необязательно могут быть заменены заместителем формулы -T-C(O)-(CH₂)_q-U-, в которой Т и U независимо представляют собой -NH-, -O-, -CH₂- или одинарную связь, а q представляет собой целое число от 0 до 2. Альтернативно, два заместителя у соседних атомов арильного или гетероарильного кольца необязательно могут быть заменены заместителем формулы -A-(CH₂)_r-B-, где А и В независимо представляют собой -CH₂-, -O-, -NH-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂-, -S(O)₂NR’- или одинарную связь, а r представляет собой целое число от 1 до 3. Одна из одинарных связей образованного таким образом нового кольца может быть необязательно заменена двойной связью. Альтернативно, два заместителя у соседних атомов арильного или гетероарильного кольца необязательно могут быть заменены заместителем формулы -(CH₂)_s-X-(CH₂)_t-, в которой s и t представляют собой целые числа от 0 до 3 независимо друг от друга, и X представляет собой -O-, -NR’-, -S-, -S(O)-, -S(O)₂- или -S(O)₂NR’-. Заместитель R’ в -NR’- и -S(O)₂NR’- выбирают из водорода или незамещенного C₁-₆алкила.

Как применен в настоящем документе, термин «гетероатом» включает кислород (O), азот (N), серу (S) и кремний (Si).

Как применен в настоящем документе, термин «клетки -предшественники» и «стволовые клетки» применяют взаимозаменяемо. «Клетки -предшественники» и «стволовые клетки» относятся к клеткам, которые в ответ на определенные стимулы могут образовывать дифференцированные клеточные линии, включая, но не ограничиваясь ими, гематопоэтические, мезенхимальные, эпителиальные, нейрональные, почечные или миелоидные клетки. Присутствие клеток-предшественников/стволовых клеток можно оценить по способности клеток в образце образовывать колониеобразующие единицы различных типов, включая, например, CFU-GM(колониеобразующие единицы, гранулоцит-макрофаг); CFU-GEMM(колониеобразующие единицы, поливалентные); BFU-E(бурстообразующие единицы, эритроид); HPP-CFC (колониеобразующие клетки с высоким пролиферативным потенциалом); или другие типы дифференцированных колоний, которые могут быть получены в культуре с применением известных протоколов. Гематопоэтические клетки -предшественники/стволовые клетки часто положительны на CD34. Однако некоторые стволовые клетки не содержат этот маркер. Эти клетки CD34+ могут быть проанализированы с применением сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS), и, таким образом, их присутствие в образце можно оценить с помощью этого способа. Альтернативно, такие клетки могут быть проанализированы с помощью FACS на наличие рецептора c-kit (CD117), отсутствие маркеров, специфичных для клонов (например, CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, NK1.1, B220, TER-119 и Gr-1 у мышей и CD3, CD14, CD16, CD19, CD20 и CD56 у людей).

Термин «фармацевтически приемлемые соли» включает соли активных соединений, которые получают с относительно нетоксичными кислотами или основаниями, в зависимости от конкретных заместителей, обнаруженных в соединениях, описанных в настоящем документе. Когда соединения по настоящему изобретению содержат относительно кислотные функциональные группы, соли присоединения оснований могут быть получены взаимодействием нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желаемого основания либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры солей, полученных из фармацевтически приемлемых неорганических оснований, включают алюминий, аммоний, кальций, медь, трехвалентное железо, двухвалентное железо, литий, магний, марганец, марганец, калий, натрий, цинк и тому подобное. Соли, полученные из фармацевтически приемлемых органических оснований, включают соли первичных, вторичных и третичных аминов, включая замещенные амины, циклические амины, встречающиеся в природе амины и тому подобное, такие как аргинин, бетаин, кофеин, холин, N,N'-дибензилэтилендиамин, диэтиламин, 2-диэтиламиноэтанол, 2-диметиламиноэтанол, этаноламин, этилендиамин, N-этилморфолин, N-этилпиперидин, глюкамин, глюкозамин, гистидин, гидрабамин, изопропиламин, лизин, метилглюкамин, морфолин, пиперазин, пиперидин, пипериндин, пиперазин, пиперидин, триэтиламин, триметиламин, трипропиламин, трометамин и тому подобное. Когда соединения по настоящему изобретению содержат относительно основные функциональные группы, кислотно-аддитивные соли могут быть получены взаимодействием нейтральной формы таких соединений с достаточным количеством желаемой кислоты либо в чистом виде, либо в подходящем инертном растворителе. Примеры фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей включают соли, полученные из неорганических кислот, таких как хлористоводородная, бромистоводородная, азотная, угольная, моногидрокарбоновая, фосфорная, моногидрофосфорная, дигидрофосфорная, серная, моногидросерная, йодоводородная или фосфористая кислоты и т.п., а также соли, полученные из относительно нетоксичных органических кислот, таких как уксусная, пропионовая, изомасляная, малоновая, бензойная, янтарная, субериновая, фумаровая, миндальная, фталевая, бензолсульфоновая, п-толилсульфоновая, лимонная, винная, метансульфоновая и т.п. Также включены соли аминокислот, таких как аргинат и тому подобное, и соли органических кислот, таких как глюкуроновая или галактуновая кислоты и тому подобное (смотри, например, Berge, S.M., et al, “Pharmaceutical Salts”, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19). Некоторые конкретные соединения по настоящему изобретению содержат как основные, так и кислотные функциональные группы, которые позволяют превращать соединения в соли присоединения либо основания, либо кислоты.

Нейтральные формы соединений можно регенерировать путем взаимодействия соли с основанием или кислотой и выделения исходного соединения обычным способом. Исходная форма соединения отличается от различных солевых форм некоторыми физическими свойствами, такими как растворимость, в полярных растворителях, но в остальном соли эквивалентны исходной форме соединения для целей настоящего изобретения.

В дополнение к солевым формам настоящее изобретение обеспечивает соединения, которые находятся в форме пролекарства. Пролекарства соединений, описанных в настоящем документе, представляют собой те соединения, которые легко претерпевают химические изменения в физиологических условиях с получением соединений по настоящему изобретению. Кроме того, пролекарства можно превратить в соединения по настоящему изобретению химическими или биохимическими способами в среде ex vivo. Например, пролекарства могут медленно превращаться в соединения по настоящему изобретению при помещении в резервуар для трансдермального пластыря с подходящим ферментом или химическим реагентом.

Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в несольватированных формах, а также в сольватированных формах, включая гидратированные формы. В общем, сольватированные формы эквивалентны несольватированным формам и предназначены для включения в объем настоящего изобретения. Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать во множестве кристаллических или аморфных форм. В общем, все физические формы эквивалентны для применений, предусмотренных настоящим изобретением, и предполагается, что они находятся в пределах объема настоящего изобретения.

Некоторые соединения по настоящему изобретению обладают асимметричными атомами углерода (оптическими центрами) или двойными связями; предполагается, что рацематы, диастереомеры, геометрические изомеры, региоизомеры и индивидуальные изомеры (например, отдельные энантиомеры) входят в объем настоящего изобретения. В некоторых воплощениях соединения по изобретению присутствуют в энантиомерно обогащенной форме, где количество энантиомерного избытка для конкретного энантиомера рассчитывают известными способами. Получение энантиомерно обогащенных форм также хорошо известно в данной области и может быть выполнено, например, с применением хирального разделения с помощью хроматографии или образования хиральной соли. Кроме того, настоящим изобретением предусмотрены различные конформеры, а также различные ротамеры. Конформеры представляют собой конформационные изомеры, которые могут отличаться поворотами вокруг одной или нескольких σ-связей. Ротамеры представляют собой конформеры, которые отличаются вращением только вокруг одинарной σ-связи. Кроме того, соединения по настоящему изобретению могут также содержать необычные пропорции атомных изотопов у одного или нескольких атомов, которые составляют такие соединения. Соответственно, в некоторых воплощениях соединения по изобретению присутствуют в форме, обогащенной изотопами. Неприродные пропорции изотопа могут быть определены как находящиеся в диапазоне от количества, встречающегося в природе, до количества, состоящего из 100% рассматриваемого атома. Например, соединения могут включать радиоактивные изотопы, такие как, например, тритий (³H), йод-125 (¹²⁵I) или углерод-14 (¹⁴C), или нерадиоактивные изотопы, такие как дейтерий (²H) или углерод-13 (¹³C). Такие изотопные вариации могут обеспечить дополнительные полезности по сравнению с описанными в другом месте в этой заявке. Например, изотопные варианты соединений по настоящему изобретению могут найти дополнительную полезность, включая, но не ограничиваясь ими, в качестве диагностических реагентов и/или реагентов для визуализации или в качестве цитотоксических/радиотоксических терапевтических средств. Кроме того, изотопные варианты соединений по изобретению могут иметь измененные фармакокинетические и фармакодинамические характеристики, которые могут способствовать повышению безопасности, переносимости или эффективности во время лечения. Предполагается, что все изотопные варианты соединений по настоящему изобретению, радиоактивные или нет, входят в объем настоящего изобретения.

«CXCR7», также обозначаемый как «RDC1» или «CCXCKR2», относится к рецептору с семью трансмембранными доменами, предположительно связанному с G-белком (GPCR). Ортолог собаки CXCR7 был первоначально идентифицирован в 1991 году, смотри работу, Libert et al. Science244:569-572 (1989). Последовательность собаки описана в работе Libert et al., Nuc. Acids Res.18(7):1917 (1990). Последовательность мыши описана, например, в работе Heesen et al., Immunogenetics 47:364-370 (1998). Последовательность человека описана, например, в работе Sreedharan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4986-4990 (1991), который ошибочно описал белок как рецептор вазоактивного кишечного пептида.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество рассматриваемого соединения, которое вызовет биологический или медицинский ответ клетки, ткани, системы или животного, например, человека, который требуется исследователю, ветеринару, врачу или другому поставщику лечения.

Термин «композиция», как применен в настоящем документе, предназначен для охвата продукта, содержащего указанные ингредиенты в указанных количествах, а также любого продукта, который прямо или косвенно представляет собой результат комбинации указанных ингредиентов в указанных количествах. Под «фармацевтически приемлемым» подразумевается, что носитель, разбавитель или наполнитель должны быть совместимы с другими ингредиентами препарата и не вредны для их реципиента.

III. Подробное описание воплощений

A. Способы

В одном аспекте в настоящем документе обеспечивают способы лечения рака у индивидуума, нуждающегося в этом, указанный способ включает введение индивиду ингибитора CXCR7, при этом у индивидуума наблюдают аберрантную экспрессию FRS2β.

В другом аспекте в настоящем документе обеспечивают способы предотвращения развития предраковых клеток, экспрессирующих FRS2β, в рак, указанный способ включает введение индивидууму, имеющему предраковые клетки, экспрессирующие FRS2β, ингибитора CXCR7.

Как описано в разделе «Уровень техники», FRS2β в большом количестве экспрессируется в головном мозге, но только в нескольких областях в других тканях. Таким образом, многие ткани естественным образом не экспрессируют FRS2β. Как показано в данном документе, аберрантная экспрессия FRS2β в клетках, которые в противном случае не экспрессируют этот белок, может обеспечивать нишу CSC и приводить к онкогенезу.

Понятно, что аберрантная экспрессия относится к экспрессии белка в клетке, ткани, органе или жидкости организма пациента, которые в норме не продуцируют белок у здорового человека (несоответствующая экспрессия) или экспрессии более высоких уровней белка в клетке, ткани, органе или биологической жидкости субъекта, чем обнаруживают в том же типе клетки, ткани, органа или жидкости организма здорового человека (дифференциальная экспрессия).В некоторых воплощениях аберрантная экспрессия FRS2β составляет, по меньшей мере, около 3%, по меньшей мере, около 5%, по меньшей мере, около 10%, по меньшей мере, около 15%, по меньшей мере, около 20%, по меньшей мере, около 25%, по меньшей мере, около 30%, по меньшей мере, около 35%, по меньшей мере, около 40%, по меньшей мере, около 45%, по меньшей мере, около 50% или большей экспрессии FRS2β, чем у здорового человека. Специалисту в данной области будет понятно, что экспрессию FRS2β можно определить с применением способов, известных в данной области техники. В некоторых воплощениях экспрессия FRS2β может быть обнаружена, как описано в раскрытых способах. В некоторых воплощениях экспрессия FRS2β может быть обнаружена с применением иммуногистохимии. В различных вариантах реализации аберрантную экспрессию выявляют с помощью анализа ELISA.

В данной области известно много ингибиторов CXCR7, и дополнительные подробности возможных ингибиторов CXCR7, применимых в настоящем раскрытии, дополнительно обсуждают в разделах, приведенных ниже.

Предпочтительный способ лечения рака включает введение терапевтически эффективного количества одного или нескольких ранее упомянутых соединений (или их солей) больному раком в течение времени, достаточного для лечения рака.

Помимо приматов, таких как люди, согласно способу настоящего изобретения можно лечить множество других млекопитающих. Например, можно лечить млекопитающих, включая, но не ограничиваясь ими, коров, овец, коз, лошадей, собак, кошек, морских свинок, крыс или другие виды крупного рогатого скота, овец, лошадей, собак, кошек, грызунов или мышей. Однако этот способ также можно применять на практике у других видов, таких как виды птиц (например, куры).

В некоторых случаях ингибиторы CXCR7 вводят для лечения рака, например, карцином, глиом, мезотелиом, меланом, лимфом, лейкозов (включая острые лимфоцитарные лейкемии), аденокарцином, рака груди, рака яичников, рака шейки матки, глиобластомы, лейкемии, лимфомы, рака простаты и лимфомы Беркитта, рака толстой кишки, колоректального рака, рака пищевода, рака желудка, рака поджелудочной железы, например рака печени и желчевыводящих путей, рака желчного пузыря, рака тонкой кишки, рака прямой кишки, рака почки, рака почек, рака мочевого пузыря, рака простаты, рака полового члена, рака уретры, рака яичек, рака шейки матки, рака влагалища, рака матки, рака яичников, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, эндокринного рака поджелудочной железы, карциноидного рака, рака костей, рака кожи, ретинобластомы, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы (смотри, Cancer: Principles and Practice (DeVita, V.T. et al. eds 1997) для дополнительных раков).

В некоторых воплощениях, рак, который лечатв настоящем документе, представляет собой рак молочной железы.

В некоторых воплощениях, у индивидуума была диагностирована аберрантная экспрессия FRS2β до введения ингибитора CXCR7 или дополнительного терапевтического средства.

B. Ингибиторы CXCR7

В некоторых воплощениях, ингибиторы CXCR7 имеют структуру Формулы I

или его фармацевтически приемлемые соли, гидраты, N-оксиды, изотопно обогащенные или энантиомерно обогащенные версии, где

индекс n представляет собой целое число от 0 до 2;

каждый R¹, если присутствует, независимо выбирают из группы, состоящей из C_1-4алкила, -CO₂R^a, -X-CO₂R^a, -CONR^aR^b и -X-CONR^aR^b;

R² и R³ каждый представляет собой член, который независимо выбирают из группы, состоящей из H, -R^a, -XR^a, -XNR^aR^b, -XNHCONR^aR^b, -XNHCOR^a, -X-O-CONR^aR^b, -XNHSO₂R^a, -CO₂R^a, -X-CO₂R^a, -CONR^aR^bи -X-CONR^aR^b; или взятые вместе представляют собой оксогруппу;

C¹ выбирают из группы, состоящей из моноциклического или конденсированного бициклического арила и гетероарила, в котором гетероарильная группа имеет 1-3 гетероатома в качестве членов кольца, выбранных из N, O и S; и где указанные арильные и гетероарильные группы необязательно замещены от 1 до 3 заместителей R⁴;

C² представляет собой моноциклическое четырех-, пяти-, шести- или семичленное кольцо, выбранное из группы, состоящей из бензола, гетероароматического соединения, циклоалкана и гетероциклоалкана, где гетероароматические и гетероциклоалкановые кольца содержат от 1 до 3 гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из N, O и S; и где каждый из указанных моноциклических C² колец необязательно замещены от 1 до 3 заместителей R⁵;

C³ выбирают из группы, состоящей из водорода, C_1-8алкила, C_3-8 циклоалкила, арила, арил-C_1-4алкила, гетероарила, гетероарил-C_1-4алкила и от четырех до шести членного гетероциклоалкила, в которой гетероциклоалкильная группа или часть гетероциклоалкила содержит от 1 до 3 гетероатомов, выбранных из N, O и S, и где группа гетероарила содержит от 1 до 3 гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из N, О и S, и каждый C³ необязательно замещен одним из 1-3 заместителей R⁶;

каждый R⁴ независимо выбирают из группы, состоит из галогена, -CN, -NO₂, -R^c, -CO₂R^a, -NR^aR^b, -OR^a, -X-CO₂R^a, -CONR^aR^b и -X-CONR^aR^b;

где в каждом из R¹, R², R³ и R⁴, каждый R^a и R^b независимо выбирают из водорода, C_1-8алкила, C_3-7циклоалкила, C_1-8галогеналкила, и от четырех до шестичленного гетероциклоалкила, или при присоединении к тому же атому азота может быть объединен с атомом азота с образованием четырех-, пяти - или шестичленного кольца, имеющего от 0 до 2 дополнительных гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из N, O или S; внутри R⁴ каждый R^c независимо выбирают из группы, состоящей из C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила, C_3-6циклоалкила, арила и гетероарила, и где алифатическая и циклическая части R^a, R^b и R^c необязательно дополнительно замещены от одного до трех галогеном, гидроксигруппой, метилом, алкоксигруппой, аминогруппой, алкиламиногруппой, диалкиламиногруппой, карбоксамидом, карбоксиалкиловым эфиром, карбоновой кислоты, гетероарилом, и от четырех до шестичленными гетероциклоалкильнымигруппами; и в которой гетероциклоалкильные части R², R³ и R⁴ необязательно замещены оксогруппой; и, необязательно, когда два заместителя R⁴ находятся на соседних атомах, объединяются в конденсированное пяти - или шестичленное кольцо, с атомами углерода и кислорода в качестве членов кольца;

каждый R⁵ независимо выбирают из группы, которая состоит из галогена, -CN, -NO₂, -R^f, -CO₂R^d,-COR^d, -NR^dR^e, -OR^d, -X-CO₂R^d, -CONR^dR^eи -X-CONR^dR^e; в которой каждый R^d и R^e независимо выбирают из водорода, C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила, C_3-6циклоалкила, C_3-6циклоалкилалкила и от четырех до шести членного гетероциклоалкила или при присоединении к тому же атому азота может быть объединен с атомом азота с образованием пяти - или шестичленного кольца, имеющего от 0 до 2 дополнительных гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из N, O или S; каждый R^f независимо выбирают из группы, состоящей из C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила и C_3-6циклоалкила, и в которой алифатическая и циклическая части R^d, R^e и R^f необязательно дополнительно замещены от одного до трех галогеном, гидроксигруппой, метилом, алкоксигруппой, аминогруппой, алкиламиногруппой, диалкиламиногруппой, карбоксамидом, карбоксиалкиловым эфиром, карбоновой кислоты, гетероарилом, от четырех до шести членными гетероциклоалкильными группами;

каждый R⁶ независимо выбирают из группы, состоит из галогена, -CN, -NO₂, -Rⁱ, -CO₂R^g,-COR^g, -NR^gR^h, -OR^g, -X-CO₂R^g, -X-COR^g, -CONR^gR^h и -X-CONR^gR^h, в которой каждый R^g и R^h независимо выбирают из водорода, C_1-8алкила и C_1-8галогеналкила; каждый Rⁱ независимо выбирают из группы, состоящей из C_1-8алкила и C_1-8галогеналкила; и

каждый X представляет собой линкерную группу, имеющую формулу-(CH₂)_mO(CH₂)_p-, в которой нижние индексы m и p представляют собой целые числа от 0 до 5, и m + p равна от 0 до 6, где метиленовые группы необязательно замещены одной или двумя метильными группами.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 1

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 2

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 3

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 4

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 5

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 6

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 выбирают из соединений или фармацевтических композиций, раскрытых в публикации РСТ № WO2010/054006, вытекающей из заявки РСТ № US2009/063298, поданной 4 ноября 2009 г. ChemoCentryx, содержание которой включено в настоящий документ для всех целей.

В некоторых воплощениях, ингибиторы CXCR7 имеют структуру Формулы II

или его фармацевтически приемлемая соль, гидрат, N-оксид, изотопно обогащенная или энантиомерно обогащенная версия или ротамер, где

каждую из вершин кольца X^a, X^b и X^c независимо выбирают из группы, состоящей из N, NH, N(R²), O, CH и C(R²);

индекс n равен 0, 1 или 2;

Z выбирают из группы, состоящей из

(i) моноциклического или конденсированного бициклического арила и гетероарила, в котором гетероарильная группа имеет от 1-4 гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из N, O и S; и в которой указанные арильные и гетероарильные группы необязательно замещены от 1 до 5 заместителями R⁵;

(ii) моноциклического четырех-, пяти-, шести- или семичленного кольца, которое выбирают из группы, состоящей из циклоалкана и гетероциклоалкана, в которой гетероциклоалкановые кольца имеют от 1-3 гетероатомов в качестве членов кольца, выбранных из N, O и S; и в которой каждое из указанных моноциклических Z колец необязательно замещены от 1 до 3 заместителей R⁵;

R¹ представляет собой член, который выбирают из группы, состоящей из H и C_1-8алкила, в котором алкильная часть необязательно замещена галогеном,-NR^aR^b, -OR^a, -CO₂R^a, и -CONR^aR^b;

каждый R² независимо выбирают из группы, состоящей из H, галогена, CN, C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила, C_1-8гидроксиалкила, -OR^a, -CO₂R^a, -X-CO₂R^a, -NR^aR^b, -CONR^aR^b и -X-CONR^aR^b;

R³ представляет собой член, который выбирают из группы, состоящей из H, C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила, C_1-8гидроксиалкила, -CO₂R^a, -X-CO₂R^a, -CONR^aR^bи -X-CONR^aR^b;

каждый R⁴, если присутствует, представляет собой член, независимо выбираемый из группы, состоящей из C_1-8алкила, C_1-8галогеналкила, C_1-8гидроксиалкила, -OR^a, -CO₂R^a, -X-CO₂R^a, -NR^aR^b, -CONR^aR^b и -X-CONR^aR^b;

каждый R⁵ представляет собой член, независимо выбираемый из группы, состоящей из галогена, CN, -X-CN, C_1-8алкила, C_3-8циклоалкила, C_3-8циклоалкенила, C_3-5спироциклоалкила, C_2-8алкенила, C_2-8алкинила, C_1-8галогеналкила, C_1-8гидроксиалкила, -OR^a, -CO₂R^a, -X-CO₂R^a, -NR^aR^b, -CONR^aR^b, -X-CONR^aR^b, арила, 5- или 6-членногогетероарила и 3-, 4-, 5- или 6-членного гетероциклила,в которой гетероатомы, присутствующие в виде вершин кольца гетероарильных и гетероциклических колецвыбирают из N, O и S, и в которой арильная, гетероарильная и гетероциклические части R⁵ необязательно дополнительно замещены 1-3 R^a;

каждый R^a и R^b независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, гидроксила, галогена, цианогруппы, C_1-8алкил, C_1-8алкоксигруппы, C_1-8галогеналкила, C_3-6циклоалкила, C_3-6циклоалкилалкила, аминогруппы, C_1-8алкиламиногруппы, диC_1-8алкиламиногруппы, карбоксамида, карбокси-С_1-4алкилового эфира, карбоновой кислоты и -SO₂-C_1-8алкила;

каждый X представляет собой C_1-4алкиленовую линкерную группу или линкерную группу, имеющую формулу-(CH₂)_mO(CH₂)_p-, где нижние индексы m и p представляют собой целые числа от 0 до 5, а m + p равна от 0 до 6, в которой любая из метиленовых частей X необязательно замещена одной или двумя метильными группами.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 7

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 8

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 имеет структуру соединения 9

или его фармацевтически приемлемая соль.

В некоторых воплощениях, ингибитор CXCR7 выбирают из соединений или фармацевтических композиций, раскрытых в публикации РСТ № WO2014/085490, вытекающей из заявки РСТ № US2013/072067, поданной 26 ноября 2013 г. ChemoCentryx, содержание которой включено в настоящий документ для всех целей.

C. Комбинированная терапия

Раскрытые в настоящем документе способы лечения рака могут дополнительно включать один или несколько дополнительных терапевтических средств.

Дополнительные терапевтические средства, которые можно применять в настоящем раскрытии, включают соединения или композиции, которые обладают противораковой активностью. В некоторых воплощениях модуляторы CXCR7 по настоящему изобретению можно вводить в сочетании с химиотерапевтическими средствами или облучением.

Дополнительные примеры других терапевтических средств, которые можно комбинировать с соединением или композицией по настоящему изобретению, вводимых отдельно или в тех же фармацевтических композициях, включают, но не ограничиваются ими: ингибитор IGF1 (например, антитело или небольшая молекула), ингибитор CXCR4 (например, AMD3100), иммуномодулирующее средство, цисплатин, паклитаксел, метотрексат, циклофосфамид, ифосфамид, хлорамбуцил, кармустин, карбоплатин, винкристин, винбластин, тиотепа, ломустин, семустин, 5-фторурацил и цитарабин. В некоторых воплощениях один или несколько дополнительных терапевтических средств могут представлять собой антитело против IGF1 и/или ингибитор CXCR4. В некоторых воплощениях одно или несколько дополнительных терапевтических средств представляют собой ингибитор CXCR4. В некоторых случаях одно или несколько дополнительных терапевтических средств представляют собой антитело против IGF1.

В данной области известен ряд ингибиторов CXCR4, включая небольшие молекулы, пептиды и антитела, каждый из них полезен в настоящем раскрытии. Некоторые иллюстративные ингибиторы CXCR4 включают AMD3100, а также ингибиторы CXCR4, представленные в WO2007115232, WO2007115231, US20070275965, US20130289020, US20140286936 и US20170226106 содержание каждого из них включено в настоящий документ для всех целей.

Известен ряд низкомолекулярных ингибиторов и антител, подобных CXCR4, нацеленных на IGF1. Примеры ингибиторов включают: AG538, AG1024, NVP-AEW541 ифигитумумаб, а также ингибиторы, представленные в US20090068110, US20140045832, US20050281812, US20050244408, US20120005767, US20140044720 и US20080161278, содержание каждой из них включено в настоящий документ для всех целей.

Массовое отношение соединения настоящего изобретения ко второму активному ингредиенту может варьировать и будет зависеть от эффективной дозы каждого ингредиента. Обычно будут применять эффективную дозу каждого из них. Таким образом, например, когда соединение по настоящему изобретению комбинируют со вторым противораковым средством, массовое отношение соединения по настоящему изобретению ко второму средству обычно будет находиться в диапазоне от примерно 1000:1 до примерно 1:1000, предпочтительно, примерно от 200:1 до примерно 1:200. Комбинации соединения по настоящему изобретению и других активных ингредиентов, как правило, также находятся в пределах вышеупомянутого диапазона, но в каждом случае следует применять эффективную дозу каждого активного ингредиента.

Понятно, что такое введение может происходить до, после или одновременно со вторым терапевтическим средством, так что терапевтические эффекты второго средства усиливаются по сравнению с введением второго средства в отсутствие модулятора CXCR7. Выбор подходящих средств для применения в комбинированной терапии может быть выполнен специалистом в данной области в соответствии с общепринятыми фармацевтическими принципами. Комбинация терапевтических средств может действовать синергетически, и, применяя этот подход, можно достичь терапевтической эффективности с более низкими дозировками каждого средства, тем самым снижая вероятность неблагоприятных побочных эффектов.

D. Способы введения

В общем, способы лечения, представленные в настоящем документе, включают введение пациенту эффективного количества одного или нескольких соединений CXCR7, обеспеченных настоящим документом. В предпочтительном воплощении соединение (соединения) по изобретению предпочтительно вводят пациенту (например, человеку) перорально. Схемы лечения могут варьировать в зависимости от применяемого соединения и конкретного состояния, которое необходимо лечить; для лечения большинства расстройств предпочтительна частота введения 4 раза в день или меньше. В общем, режим дозирования 2 раза в день представляется более предпочтительным, особенно предпочтительным представляет собой дозирование один раз в день. Однако следует понимать, что конкретный уровень дозы и схема лечения для любого конкретного пациента будут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол, диету, время введения, путь введения, скорость выведения, комбинацию лекарственных средств (т.е. другие лекарственные препараты, вводимые пациенту) и тяжесть конкретного заболевания, подвергаемого лечению, а также мнение практикующего врача, выписывающего медицинские препараты. В общем, применение минимальной дозы, достаточной для обеспечения эффективной терапии, представляется предпочтительным. Пациентов обычно можно контролировать на предмет терапевтической эффективности с применением медицинских или ветеринарных критериев, подходящих для состояния, которое лечат или предотвращают.

В зависимости от рака, подлежащего лечению, и состояния субъекта, соединения и композиции по настоящему изобретению можно вводить с помощью перорального, парентерального (например, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, ICV, с помощью внутрицистернальной инъекции или инфузии, подкожной инъекции или импланта), ингаляционого, назального, вагинального, ректального, сублингвального или местного пути введения, и они могут быть составлены, отдельно или вместе, в подходящие лекарственные формы, содержащие обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и носители, подходящие для каждого способа введения. Настоящее изобретение также предполагает введение соединений и композиций по настоящему изобретению в составе композиции для замедленного всасывания.

Полезны уровни дозировки порядка от примерно 0,1 мг до примерно 140 мг на килограмм веса тела в день (от примерно 0,5 мг до примерно 7 г на пациента-человека в день). Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалами носителя для получения разовой лекарственной формы, будет варьировать в зависимости от пациента, которого лечат, и конкретного способа введения. Стандартные лекарственные формы обычно содержат от примерно 1 мг до примерно 500 мг активного ингредиента. Следует вводить достаточное количество соединений для достижения концентрации в сыворотке от 50 до 200 нг/мл.

Соединения и композиции по настоящему изобретению можно комбинировать с другими соединениями и композициями, имеющими родственное применение для предотвращения и лечения рака. Такие другие лекарственные средства можно вводить способом и в количестве, обычно применяемом для них, одновременно или последовательно с соединением или композицией по настоящему изобретению. Когда ингибитор CXCR7 применяют одновременно с одним или несколькими другими лекарственными средствами, предпочтительна фармацевтическая композиция, содержащая такие другие лекарственные средства в дополнение к ингибитору CXCR7. Соответственно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению также включают те, которые также содержат один или несколько других активных ингредиентов или терапевтических средств в дополнение к ингибитору CXCR7.

Дополнительное терапевтическое средство, применяемое в комбинированной терапии – будь то соединения или антитело, можно вводить с помощью перорального, парентерального (например, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно, ICV, с помощью внутрицистернальной инъекции или инфузии, подкожной инъекции или импланта), ингаляционого, назального, вагинального, ректального, сублингвального или местного пути введения. Кроме того, соединения и/или антитела могут быть составлены по отдельности или вместе в подходящих стандартных лекарственных формах, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адъюванты и носители, подходящие для каждого способа введения. Настоящее раскрытие также предполагает введение соединений и антител настоящего раскрытия в составе композиции для замедленного всасывания.

Следует понимать, что конкретный уровень дозы и частота дозирования для любого конкретного пациента могут варьироваться и будут зависеть от множества факторов, включая активность конкретного применяемого соединения (соединений) и/или антител, метаболическую стабильность и продолжительность действия этого соединения, возраста, массы тела, наследственных характеристик, общего состояния здоровья, пола, диеты, способа и времени введения, скорости выведения, комбинации лекарственных средств, тяжести конкретного состояния и хозяина, подвергающегося терапии.

Комбинированная терапия включает совместное введение ингибитора CXCR7 и одного или нескольких дополнительных терапевтических средств, последовательное введение ингибитора CXCR7 и одного или нескольких дополнительных терапевтических средств или одновременное введение отдельных композиций, так что одна композиция содержит ингибитор CXCR7 и одну или несколько композиций, содержащих один или несколько дополнительных терапевтических средств.

Совместное введение включает введение ингибитора CXCR7 по настоящему раскрытию в течение 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20 или 24 часов после одного или более введения одного или нескольких дополнительных терапевтических средств. Более того, ингибитор CXCR7 и одно или несколько дополнительных терапевтических средств можно вводить один раз в день или два, три или более раз в день, чтобы обеспечить предпочтительный уровень дозировки в день.

IV. Примеры

Следующие ниже примеры предлагаются для иллюстрации, но не для ограничения заявленного изобретения.

Пример 1. FRS2β, экспрессируемый в люминальных клетках-предшественниках, создает микроокружение, благоприятное для онкогенеза молочной железы.

Чтобы изучить роль FRS2β in vivo, мы мутировали ген Frs2β у мышей путем направленного воздействия на ген. Мутантные мыши росли нормально и были фертильными без серьезных отклонений от нормы. Активность промотора Frs2β обнаруживали по окрашиванию β-галактозидазой зрелых тканей женской молочной железы, которые были гетерозиготными по мутантному аллелю Frs2β (фиг. 1A). Количество транскриптов Frs2β значительно увеличивалось во время беременности и кормления грудью, затем после отлучения (3 недели после рождения) оно уменьшалось в течение периода регрессии (данные не показаны). С помощью иммуногистохимии мы подтвердили, что FRS2β экспрессируется в нескольких клетках долек молочной железы (фиг. 1C). Большинство FRS2β-положительных клеток были отрицательными по фосфогистону H3, ядерному маркеру делящихся клеток, указывая на то, что они пролиферируют медленнее, чем другие, что согласуется с отрицательной ролью FRS2β в пролиферации клеток (фиг. 1C). FRS2β экспрессировался в нескольких клетках, которые были положительны по цитокератину 18 (маркер люминальных клеток), но не по цитокератину 14 (маркер миоэпителиальных клеток) (фиг. 1D). Эти данные указывают на то, что небольшое количество люминальных клеток в молочной железе экспрессируют FRS2β. С другой стороны, полное окрашивание молочной железы не показало серьезных структурных аномалий у мутантных мышей. Это привело нас к изучению патологической роли FRS2β в онкогенезе.

Мы скрестили мутантных мышей Frs2β с мышами MMTV-neu (+), чтобы получить мышей MMTV-neu (+)/Frs2β (+/+) и мышей MMTV-neu (+)/Frs2β (-/-), далее называемых как мыши Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-), соответственно. Мы наблюдали, что онкогенез начался раньше с большей вероятностью у мышей MMTV-neu (+), которые перенесли беременность в возрасте ~ 8 недель (23,4 + 1,9 недели, 83%, n = 8), чем у исходных MMTV-neu (+) мыши (32,6 + 2,6 недели, 23,4%, n = 8). Таким образом, мы исследовали онкогенез у мышей сразу после беременности и кормления грудью. Мы применяли томографию ядерного магнитного резонанса (NMR), которая представляет собой чувствительный способ обнаружения опухолей даже диаметром 1 мм20 (фиг. 1E). Мы начали наблюдать возникновение небольших опухолей через 5-8 недель после начала измерения и обнаружили, что скорость роста опухоли была намного ниже у мышей Frs2β (-/-), чем у мышей Frs2β (+/+) (фиг.1E, 1F), в то время как заболеваемость раком показала аналогичную частоту: 83,2% (n = 18) для Frs2β (+/+) и 88,2% (n = 17) для Frs2β (-/-). Это свидетельствует о том, что FRS2β играет важную роль в онкогенезе молочных желез. Чтобы изучить молекулярные механизмы, мы сначала сравнили гистологию опухоли. В опухолях Frs2β (+/+) было достаточно стромы, напоминающей ткани рака молочной железы человека (фиг. 1G). Однако в опухолях Frs2β (-/-) его было намного меньше. Принимая во внимание тот факт, что строма опухоли представляет собой основной компонент микроокружения опухоли, мы предположили, что FRS2β может играть роль в создании благоприятного микроокружения для онкогенеза в тканях молочной железы.

Гистологическое исследование показало, что опухоли Frs2β (+/+) содержат обильную строму, напоминающую ткани рака груди человека (стрелки на фиг. 1G). Напротив, в опухолях Frs2β (-/-) наблюдалась очень маленькая строма. Высокие уровни CAF, положительных по гладкомышечному актину (SMA), присутствовали в строме опухолей Frs2β (+/+), но не в опухолях Frs2β (-/-) (стрелки на фиг. 1H). Эти результаты показывают, что FRS2β необходим для образования стромы опухоли.

Проверяя идею о том, что FRS2β играет роль в создании микроокружения ткани молочной железы, необходимого для онкогенеза, даже до начала опухоли, мы провели эксперименты с ксенотрансплантатом, в которых опухолевые клетки Frs2β (+/+) были инокулированы в молодые девственные предраковые ткани молочной железы Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-) мышей. Мы культивировали опухолевые клетки Frs2β (+/+) в бессывороточной суспензии в виде сфер для обогащения CSC_s15,21. Затем мы инокулировали их в 8-недельные девственные ткани молочной железы Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) после предельного разведения и измерили онкогенез (фиг. 2A). Интересно, что опухоли образовывались только в Frs2β (+/+), но не в Frs2β (-/-) тканях молочной железы, и быстро росли в течение 1 месяца (фиг. 2B, 2C, 2D). Этот результат предполагает, что CSC исчезли в микроокружении Frs2β (-/-) в тканях молочных желез. Как и ожидалось, опухоли не образовывались, когда опухолевые клетки Frs2β (+/+) инокулировали в жировые подушечки мужской молочной железы Frs2β (+/+) (данные не показаны), подтверждая, что ткани молочных желез важны для онкогенеза. Следовательно, предраковые клетки молочной железы, экспрессирующие FRS2β, по-видимому, создают микроокружение, которое поддерживает рост CSC и способствует онкогенезу.

Путем иммуногистохимии мы обнаружили сходное количество люминальных клеток, экспрессирующих FRS2β, у мышей MMTV-neu (-) и мышей MMTV-neu (+) (фиг. 2E). Эндогенная экспрессия ErbB2 была умеренно снижена в FRS2β-положительных клетках мышей MMTV-neu (-) (желтые стрелки), что согласуется с тем фактом, что FRS2β участвует в убиквитилировании и деградации ErbB219; тогда как ErbB2 был сверхэкспрессирован в FRS2β-положительных клетках у мышей MMTV-neu (+) (белые стрелки). Для дальнейшего изучения того, в каком типе люминальных клеток экспрессируется FRS2β, мы отсортировали клетки молочной железы с помощью поверхностных маркеров. Известно, что люминальные клетки обогащены популяцией клеток CD49f_низкий/CD24_{высокий} и что люминальные клетки -предшественники могут быть обогащены дальнейшим фракционированием CD61 для получения популяции CD49f_низкий/CD24_{высокий}/CD61 ₊. Значительную экспрессию FRS2β наблюдали у 23,6% клеток из популяции люминальных клеток-предшественников CD49f_низкий/CD24_{+высокий}/CD61 + (фиг. 2F). Мы подтвердили, что FRS2β теряется в популяции клеток-предшественников CD49f_низкий/CD24_{высокий}/CD61 +, происходящих из Frs2β (-/-)клеток молочной железы. Эти данные предполагают, что субпопуляция люминальных клеток-предшественников в молочной железе экспрессирует FRS2β.

Пример 2. Предраковые клетки молочной железы экспрессируют цитокины, которые зависят от экспрессии FRS2β

Затем мы исследовали молекулярные механизмы, с помощью которых FRS2β, экспрессируемый в люминальных клетках-предшественниках, создает микроокружение, благоприятное для онкогенеза. Мы культивировали предраковые клетки молочной железы Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) в бессывороточной суспензии для обогащения недифференцированными клетками или клетками -предшественниками в виде сфер и измеряли их способность формировать маммосферу (фиг. 3A и 3B). Мы диссоциировали эти первичные сферы до суспензии отдельных клеток и культивировали их для создания вторичных маммосфер. Считается, что вторичные сферы точно отражают количество сферообразующих, недифференцированных клеток или клеток-предшественников. Мы обнаружили, что дефицит FRS2β приводит к значительно более низкой способности к формированию сфер (фиг. 3A, 3B). Не было существенной разницы в диаметре молочных желез, что позволяет предположить, что скорость пролиферации была сходной между предраковыми клетками молочной железы Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-). Чтобы изучить, какие функции люминальных клеток-предшественников нарушаются из-за потери FRS2β, мы сравнили транскриптомные профили между клетками маммосферы Frs2β (+/+) и Frs2β (-/-)с помощью анализа ДНК на микроматрице. Анализ обогащения набора генов (GSEA) показал, что набор генов, связанных с функцией стволовых клеток, и набор генов, связанных с сигналом интерферона, были обогащены клетками маммосферы Frs2β (+/+) по сравнению с клетками Frs2β (-/-) (фиг. 3С). GSEA в предраковых эпителиальных клетках молочной железы также выявил, что наборы генов, связанные с мишенями NFkB, функцией стволовых клеток и стромой, были обогащены клетками Frs2β (+/+) по сравнению с клетками Frs2β (-/-) (фиг. 3D). Набор генов, связанных с путём ERK, активируется в клетках Frs2β (-/-) по сравнению с клетками Frs2β (+/+), что ожидалось, потому что FRS2β ингибирует передачу сигналов ERK. Многие гены, кодирующие цитокины, были активированы в клетках Frs2β (+/+); среди них 18 генов экспрессировались на более чем в 1,5 раза более высоких уровнях в клетках Frs2β (+/+), чем в клетках Frs2β (-/-) (данные не показаны).

Затем мы сосредоточились на IGF1, который включен в набор генов, связанных с функцией стволовых клеток, и на CXCL12, который включен в набор генов, связанных с сигналом интерферона, и в набор генов, связанных со стромой, среди основных генов, которые были высоко экспрессированы в клетках Frs2β (+/+). Количественный PCT-анализ (qPCT) подтвердил, что транскрипты Igf1 и Cxcl12 сильнее экспрессировались в гетерозиготных клетках молочной железы Frs2β (+/-), чем в клетках Frs2β (-/-), тогда как маркеры дифференцированных клеток (Keratin8, Keratin18 и Keratin14) были активированы в клетках Frs2β (-/-) (фиг. 3E). С помощью иммуногистохимии мы подтвердили, что уровни белка IGF1, CXCL12 и αSMA, маркера CAF, были выше в тканях молочной железы Frs2β (+/+) (фиг. 3F). Сильное окрашивание αSMA подтвердило мобилизацию CAF в тканях молочной железы дикого типа.

Пример 3. FRS2β-зависимое увеличение продукции CXCL12 в предраковых клетках молочной железы позволяет лечить опухоль с помощью ингибитора CXCR7 или ингибитора CXCR7 в комбинации с другим терапевтическим средством, модулирующим рост опухоли

Формирование опухолевой сферы отражает свойства CSC, рост которых зависит от цитокинов в культуре. Чтобы определить, играет ли роль IGF1, полученный из предраковых эпителиальных клеток молочной железы, в формировании опухолевой сферы, мы культивировали опухолевые клетки Frs2β (+/+) в бессывороточных условиях суспензии без коктейля цитокинов в присутствии или в отсутствие предраковые эпителиальные клетки молочной железы Frs2β (+/+) (фиг. 4A). Мы наблюдали образование опухолевых сфер опухолевыми клетками Frs2β (+/+) в присутствии предраковых эпителиальных клеток молочной железы Frs2β (+/+), но не в их отсутствие (сравните контрольный IgG с необработанным [NT] на фиг. 4B и 4С). Обработка антителом, нейтрализующим IGF1 (IGF1 NAb), значительно уменьшала образование сфер опухоли опухолевыми клетками Frs2β (+/+), совместно культивированными с предраковыми клетками молочной железы Frs2β (+/+) (фиг. 4B и 4C). Эти наблюдения указывают на то, что IGF1, происходящий из соседних предраковых эпителиальных клеток молочных желез Frs2β (+/+), играет важную роль в формировании опухолевых сфер. Таким образом, IGF1, происходящий из предраковых эпителиальных клеток молочной железы Frs2β (+/+), может поддерживать рост CSC.

Чтобы проверить, играет ли роль CXCL12, полученный из предраковых эпителиальных клеток молочной железы, в отношении связанных с раком фибробластов (CAF), мы совместно культивировали Frs2β (+/+) CAF с Frs2β (+/+) или Frs2β (-/-) предраковыми эпителиальными клетками молочной железы (фиг. 4D). Мы подтвердили, что уровни экспрессии Cxcl12 были выше в этих условиях культивирования в предраковых клетках молочной железы Frs2β (+/+), чем в клетках Frs2β (-/-) (фиг. 4E). Мы наблюдали значительно больше мигрировавших CAF при совместном культивировании с предраковыми клетками молочной железы Frs2β (+/+), чем с клетками Frs2β (-/-) (фиг. 4F и 4G). CXCL12 связывается с рецептором CXC (CXCR) 4 и CXCR7. Мы не наблюдали значительного влияния на мобилизацию CAF при обработке ингибитором CXCR4 в описанной оптимальной концентрации: AMD3100 (100 мкг/мл) или соединения 1 (100 мкг/мл) отдельно (данные не показаны); тогда как при лечении комбинацией обоих ингибиторов мобилизация CAF значительно снижалась дозозависимым образом (фиг. 4H, 4I). Эти наблюдения подтверждают, что CXCL12, происходящий из соседних предраковых клеток молочной железы Frs2β (+/+), играет важную роль в мобилизации CAF. Следовательно, похоже, что FRS2β-зависимая повышенная продукция цитокинов, включая IGF1 и CXCL12, в предраковых клетках молочной железы позволяет поддерживать CSC и мобилизовать CAF.

Каковы молекулярные механизмы, которые вызывают экспрессию IGF1 и CXCL2 в предраковых тканях молочной железы? Поскольку Igf1 и Cxcl12 были включены в набор генов-мишеней NFkB (фиг. 3D), а ось AKT–NFkB активируется многими сигнальными путями, которые включают ErbB2 и CXCL12, мы исследовали, участвует ли активация NFkB в продукции этих цитокинов. С этой целью мы культивировали предраковые эпителиальные клетки молочной железы Frs2β (+/+) и обрабатывали их DHMEQ, специфическим ингибитором NFkB (фиг. 5A). Обработка DHMEQ ингибировала экспрессию Igf1, Cxcl12 и IkВα, хорошо известного гена, индуцируемого NFkB, дозозависимым образом (фиг. 5B), предполагая, что активация NFkB играет важную роль в экспрессии IGF1 и CXCL12 в предраковых эпителиальных клетках молочной железы.

Затем мы исследовали активацию оси AKT-NFkB в предраковых тканях молочной железы in vivo. Иммуноблоттинг лизатов из предраковых тканей молочной железы выявил более высокий уровень фосфорилированного AKT, более высокие количества компонентов NFkB RelA и RelB в ядре, более высокий уровень фосфорилированного IKKb и более низкий уровень IkBa в тканях Frs2β (+/+) относительно к тканям Frs2β (-/-) (фиг. 5C–5E). Как и ожидалось, фосфорилированная ERK1/2 присутствовала на сниженных уровнях в тканях Frs2β (+/+), чем в тканях Frs2β (-/-) (фиг. 5C). Более того, иммуногистохимия показала, что RelA локализован в ядре в гораздо большей доле Frs2β (+/+), чем Frs2β (-/-) в предраковых люминальных клетках (фиг. 5G, красные стрелки на левой панели и средней панели). Обработка DHMEQ in vivo резко снижает количество предраковых люминальных клеток Frs2β (+/+), несущих RelA в ядре (фиг. 5F и G, правая панель), и ингибирует экспрессию транскриптов Igf1 и Cxcl12 в предраковых тканях молочной железы (фиг. 5H). Эти результаты предполагают, что активация NFkB в предраковых люминальных клетках играет важную роль в экспрессии IGF1 и CXCL12 в предраковых эпителиальных клетках молочных желез in vivo. Похоже, что FRS2β запускает ось AKT-NFkB в предраковых люминальных клетках, тем самым вызывая выработку цитокинов, включая IGF1 и CXCL12, которые, в свою очередь, активируют NFkB аутокринным или паракринным образом, чтобы распространить эффекты активации NFkB на окружающий эпителиальный слой молочной железы клетки.

Чтобы проверить, вносят ли IGF1 и CXCL12, экспрессируемые в предраковом микроокружении молочной железы, вклад в онкогенез, мы обрабатывали мышей Frs2β (+/+) нейтрализующими антителами IGF1 и/или комбинацией ингибитора CXCR4 и ингибитора CXCR7 (соединение 1) (оба вместе, ингибитор CXCL12) после инокуляции опухолевых клеток Frs2β (+/+). Обработка либо нейтрализующим антителом IGF1, либо ингибитором CXC12 значительно снижало онкогенез, а комбинированное лечение как нейтрализующим антителом IGF1, так и ингибиторами CXCL12 показало наибольший ингибирующий эффект на объемы и вес опухоли (фиг. 5I-5K). Масса тела существенно не изменилась (данные не показаны), что свидетельствует об отсутствии токсических эффектов. Эти результаты указывают на то, что FRS2β-зависимая повышенная продукция IGF1 и CXCL12 в предраковых тканях молочной железы создает микроокружение, которое важно для онкогенеза.

Затем мы исследовали экспрессию FRS2β в опухолях молочной железы. Иммуногистохимия показала, что клетки, экспрессирующие FRS2β, присутствовали в опухолях молочной железы (фиг. 6A). Уровни экспрессии Igf1 и Cxcl12 были выше в опухолях Frs2β (+/+), чем в опухолях Frs2β (-/-) (фиг. 6B). Иммуногистохимия подтвердила, что уровни экспрессии IGF1 и CXCL12 были выше в опухолях Frs2β (+/+), чем в опухолях Frs2β (-/-) (фиг. 6C). Следовательно, разумно предположить, что FRS2β запускает ось AKT-NFkB, чтобы индуцировать продукцию IGF1 и CXCL12 в опухолевых тканях.

Наконец, мы исследовали экспрессию FRS2β в тканях рака груди человека с помощью иммуногистохимии. Уровни экспрессии FRS2β варьировали среди раковых клеток (фиг. 6D). Ткани рака молочной железы, в которых уровни экспрессии FRS2β были высокими (+++), имели значительно более высокие уровни стромы рака, чем ткани со средним (++) или низким (+) уровнями экспрессии FRS2β (p = 0,0499, тест Барнарда) (фиг. 6E). Кроме того, анализ опубликованных профилей экспрессии генов показал, что пациенты с более высокими уровнями экспрессии FRS2β в тканях рака груди имели худший прогноз (фиг. 6F).

В этом исследовании мы продемонстрировали, что белок FRS2β экспрессируется в подмножестве люминальных клеток и запускает выработку цитокинов, включая IGF1 и CXCL12. FRS2β может стимулировать ось AKT–NFkB, способствуя выработке цитокинов, при этом подавляя передачу сигналов ERK. Похоже, что эти цитокины, в свою очередь, активируют NFkB в окружающих люминальных клетках молочной железы аутокринным или паракринным образом, что приводит к созданию богатого цитокинами предракового микроокружения, которое включает некоторое количество стромы до появления опухоли (фиг. 6G, верхняя левая панель). Как только CSC появляются в предраковом микроокружении, они могут быть способны самообновляться в присутствии IGF1 и продуцировать опухолевые клетки с помощью мобилизованных CXCL12 стромальных клеток, которые впоследствии становятся CAF. CSC и опухолевые клетки могут продуцировать IGF1 и CXCL12 сами по себе, что приводит к быстрому росту и онкогенезу (фиг. 6G, нижняя левая панель). Без FRS2β цитокины остаются на низких уровнях, и не создается соответствующее предраковое микроокружение (фиг. 6G, верхняя правая панель); даже когда появляются CSC, они не могут эффективно расти (фиг. 6G, нижняя правая панель). На основании этих результатов мы предполагаем, что FRS2β представляет собой многообещающую мишень для профилактики рака груди. Кроме того, мы показали, что комбинированная терапия, направленная на IGF1 и CXCL12, эффективно предотвращает онкогенез на ранней стадии.

Микроокружение опухоли состоит из различных типов клеток: CAF, мезенхимальных стволовых клеток, дендритных клеток костного мозга, иммунных клеток и новообразованных кровеносных сосудов (3). С другой стороны, остается неясным, какие типы клеток в предраковом микроокружении способствуют возникновению опухоли. В настоящем документе мы обнаружили, что люминальные клетки и люминальные клетки-предшественники представляют собой важный тип клеток в предраковом микроокружении, и что FRS2β, экспрессируемый в люминальных клетках и люминальных клетках-предшественниках, играет критическую роль в производстве цитокинов, что приводит к созданию богатого цитокинами предракового микроокружения, которое важно для развития опухоли.

Хотя вышеизложенное изобретение было описано довольно подробно с помощью иллюстраций и примеров с целью ясности понимания, специалист в данной области техники поймет, что определенные изменения и модификации могут быть осуществлены на практике в рамках прилагаемой формулы изобретения. Кроме того, каждая ссылка, представленная в данном документе, полностью включена посредством отсылки в той же степени, как если бы каждая ссылка была индивидуально включена посредством отсылки. Если существует конфликт между настоящей заявкой и ссылкой, приведенной в настоящем документе, заявка, рассматриваемая в данный момент, имеет преимущественную силу.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначено для лечения рака молочной железы у индивидуума. Способ лечения рака молочной железы у индивидуума, нуждающегося в этом, включает введение индивидууму ингибитора CXCR7, при этом индивидуум имеет аберрантную экспрессию FRS2β, и где ингибитор CXCR7 имеет структуру Формулы I или его фармацевтически приемлемые соли или Формулы II или его фармацевтически приемлемые соли, где радикалы представлены в заявленных значениях. Использование изобретения обеспечивает лечение рака молочной железы у индивидуума. 8 з.п. ф-лы, 6 ил., 3 пр.

1. Способ лечения рака молочной железы у индивидуума, нуждающегося в этом, где указанный способ включает введение индивидууму ингибитора CXCR7, при этом индивидуум имеет аберрантную экспрессию FRS2β, и где

ингибитор CXCR7 имеет структуру Формулы I или Формулы II:

или его фармацевтически приемлемые соли, где

R² и R³ каждый представляет собой H;

C¹ представляет собой хинолинил, который необязательно замещен от 1 до 3 заместителей R⁴;

C² выбирают из группы, состоящей из тиазола, пиразола и оксазола, каждый из которых необязательно замещен от 1 до 2 заместителей R⁵;

C³ выбирают из группы, состоящей из циклогексила, пиперидинила и фенила, каждый из которых необязательно замещен от 1 до 2 заместителей R⁶;

каждый R⁴ независимо выбирают из группы, состоящей из метила, этила, изопропила, 2-фторэтила, 2-фторизопропила, 2-гидроксиизопропила, метокси, хлоро, CO₂H, -CH₂CO₂H, XCO₂H;

каждый R⁵ независимо выбирают из группы, состоящей из метила, фторо, хлоро, CO₂H, и CH₂CO₂H;

каждый R⁶ независимо выбирают из группы, состоящей из метила, фторо, хлоро, -ОН, CO₂H, и CH₂CO₂H; и

каждый X представляет собой линкерную группу, имеющую формулу, выбранную из группы, состоящей из -OCH₂-, -ОCH₂CH₂-, -ОCH₂CH₂CH₂-; или

или его фармацевтически приемлемые соли, где

бициклическая часть, имеющая X^a, X^b и X^c в качестве вершин кольца, выбрана из:

R² выбирают из группы, состоящей из H и C_1-8 алкила;

R³ представляет собой H;

Z представляет собой

каждый Q представляет собой N;

R⁵ представляет собой арил, необязательно дополнительно замещенный 1-3 заместителями R^а; и

каждый R^а представляет собой галоген или C_1-8 алкил.

2. Способ по п. 1, в котором ингибитор CXCR7 имеет структуру, выбранную из группы, состоящей из

или его фармацевтически приемлемая соль.

3. Способ по п. 1, в котором индивидуум экспрессирует FRS2β в одной или нескольких люминальных клетках-предшественниках.

4. Способ по п. 1, в котором индивидуум экспрессирует FRS2β в одной или нескольких люминальных клетках-предшественниках молочной железы.

5. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение дополнительного терапевтического средства.

6. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение терапевтически эффективных количеств антитела против IGF1 и ингибитора CXCR4.

7. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества антитела против IGF1.

8. Способ по п. 1, дополнительно включающий введение терапевтически эффективного количества ингибитора CXCR4.

9. Способ по п. 1, в котором перед введением ингибитора CXCR7 или дополнительного терапевтического средства у человека диагностировали аберрантную экспрессию FRS2β.