Штамм Sarocladium kiliense 346(A-2) - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области биотехнологии и представляет собой новый штамм гриба, продуцирующего комплекс биологически активных веществ, обладающих способностью стимулировать рост растений, а также элиситорным действием, т.е. способностью вызывать у растения иммунную защитную реакцию, что определяет большую устойчивость растений к болезням, неблагоприятным условиям, что способствует улучшению качества и количества сельскохозяйственной продукции.

Известно, что различные грибы могут быть продуцентами стимуляторов роста растений. Например, известна стимуляция роста растений в присутствии микоризных грибов, которые участвуют в защите растений от патогенных организмов и стимулируют их рост [US 5002603 A, МПК: A01N 63/04, A01N 43/16, 26.03.1991], ускорение роста и повышение урожайности пшеницы с помощью спор грибов рода Coprinus [US 5017374 A, МПК: A01C 1/06, C05F 11/08, 21.05.1991].

Недостатком указанных грибов является их приуроченность к древесине, как к живому дереву, так и к отходам древесины и переработке соломы, что может обогащать почву, однако не может оказывать специфического ростостимулирующего и элиситорного действия, что очень важно при росте и развитии сельскохозяйственной продукции, особенно зерновых культур.

Наиболее близким к заявляемому является «Штамм Acremonium lichenicola - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием» [RU 2079216 C1, МПК: A01N 63/04, C12N 1/14, 10.05.1997], содержащий штамм микромицета Acremonium lichenicola (ГНЦА № 346A - продуцент комплекса биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием. Недостатком этого штамма является низкий уровень биосинтеза биологически активных веществ, обладающих элиситорным действием.

Технической задачей, на решение которой направлено заявляемое техническое решение, является повышение уровня биосинтеза биологически активных веществ, обладающих элиситорным действием.

Технический результат, который может быть получен при использовании заявляемого изобретения, заключается в повышении уровня биосинтеза биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием, обеспечивающих защиту от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериям. Технический результат достигается тем, что применяется штамм Sarocladium kiliense 346(A-2).

Штамм грибов Sarocladium kiliense 346(A-2). Корни женьшеня были отделены от растения, поверхностно стерилизованы путем последовательного погружения в 70%-й этанол, 0,1%-й раствор амоксициллина, 0,01%-й раствор гипохлорита натрия и промыты в дистиллированной воде, после чего помещены на чашку Петри со средой сусло-агар следующего состава: сусло - 10 г, агар - 20 г, дистиллированная вода - 1 л. Чашки инкубированы в течение 7 суток при 24°С, вслед за чем проводилось выделение появившегося мицелия грибов в чистые культуры. Идентификация (98% сходства) была проведена по анализу последовательности генов 18S и 5.8S рДНК в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) ФГБУ ГосНИИгенетика Минобрнауки России (с 10.07.2017 - ФГБУ «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика)).

Штамм депонирован в БРЦ ВКПМ ФГБУ ГосНИИгенетика Минобрнауки России (НИЦ «Курчатовский институт» - ГосНИИгенетика) 22 февраля 2017 года под регистрационным номером F-1345.

1. Культурально-морфологические характеристики:

Колонии на сусло-агаре - медленно растущие, достигающие диаметра 8-10 мм за 10 суток при 24°С, колонии слабо порошистые и немного влажные, белесые, слегка розоватые, цвет реверса колонии коричневатый, пигмент и экссудат отсутствуют, по мере старения культуры становятся оранжеватые, затем коричневатые.

Мицелий тонкий, светло-бежевый, фиалиды возникают непосредственно на поверхности агара из субстратного мицелия 30-60 мкм длиной, утончаются от основания к верхушке от 2-3 до 0,7-1,5 мкм шириной. Конидии в ослизненных головках, цилиндрические или эллипсоидальные, часто двуклетные. Хламидоспоры, склероции отсутствуют.

2. Физиолого-биохимические характеристики:

Аэроб, гетеротроф, температурный оптимум штамма - 24-26°С, рН-оптимум - 6-6,5.

3. Условия культивирования:

Для получения препаративной формы в виде раствора заявляемого штамма Sarocladium kiliense 346(A-2) используется питательная среда следующего состава (на литр дистиллированной воды): глюкоза - 8 г, KH₂PO₄ - 0,9 г, K₂HPO₄ - 0,3 г, MgSO₄ - 0,2 г, MnSO₄ - 0,2 г, FeSO₄ - 0,2 г, CuSO4 - 0,2 г, KNO₃ - 0,1 г. Для получения посевного материала используют стандартную методику: культуру рассеивают в пробирки со скошенной агаровой средой, инкубируют в условиях термостата при температуре 26°С в течение 10 суток. Затем бактериологической петлей снимают с поверхности агара мицелиальную массу и переносят её в колбы с жидкой питательной средой. Встряхивают в течение 2-3 мин. Инкубация проводится при температуре 26°С в течение 95 суток с перемешиванием каждые 3-4 суток вручную. Экстракция препарата проводится путем адсорбции активированным углем из расчета 10 г угля на 1 л культуральной жидкости в течение 10 ч при 250 об/мин, после чего проводится десорбция 70%-м этанолом в течение 6-8 ч. Оставшийся уголь и мицелий удаляются путем фильтрации через бумажный фильтр. Концентрация препарата рассчитывается опытным путем для каждого конкретного случая.

4. Хранение штамма

Длительное хранение культуры штамма Sarocladium kiliense 346(A-2) осуществляется в пробирках на скошенной среде сусло-агар при +4°С с рассевом не менее одного раза в 3-4 месяца. Заявляемый штамм Sarocladium kiliense 346(A-2) хранится в ВКПМ под номером F-1345.

Для исследования эффективности изобретения использован продукт, синтезируемый штаммом - комплекс биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием.

Биологическая активность штамма доказывается следующими примерами:

Пример 1. Семена риса сорта Лиман обрабатывают 0,0005%-м раствором препарата при соотношении 1:100. Результаты представлены в Таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Влияние препарата на ростовые показатели риса сорта Лиман Высота растений, см Длина корней, см Объем корней, см³ Площадь корней, см² Фаза кущения Контроль 26,9 16,0 3,4 45,5 Препарат 29,6 18,2 5,0 57,5 Фаза выметывания Контроль 70,8 28,0 15,0 291,4 Препарат 78,7 34,0 19,2 340,9

Таблица 2. Влияние препарата на урожайность и структуру урожая риса сорта Лиман Общая кустистость Озерненность Масса зерна, г/раст. Урожайность, ц/га Контроль 4,0 249,1 5,62 49,7 Препарат 5,0 309,1 6,56 55,0

Таким образом, предпосевная обработка семян риса сорта Лиман препаратом заявляемого штамма Sarocladium kiliense 346(A-2) обеспечивает повышение урожайности на 10,7%.

Пример 2. Семена сахарной свеклы сорта Дружба МС-34 обрабатывали раствором препарата с концентрацией 0,001% в соотношении 3:100. Кроме того, провели опрыскивание растений раствором той же концентрации в период вегетации. Результаты представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Продуктивность сахарной свеклы Дружба МС-34 в зависимости от применения регуляторов роста растений Контроль Препарат Концентрация для обработки семян - 0,001% Концентрация для опрыскивания растений - 0,0001% Густота насаждений при уборке, тыс. шт/га 92,4 96,0 Урожайность, ц/га 364 400 Содержание сахара, % 13,6 14,1 Сбор сахара, ц/га 49,5 56,4 Выход белого сахара, ц/га 38,44 43,92 Доброкачественность сока, % 89,6 90,6

Таким образом, предпосевная обработка семян сахарной свеклы Дружба МС-34 препаратом заявляемого штамма Sarocladium kiliense 346(A-2) обеспечивает повышение урожайности сахара на 14,26%.

Пример 3. Деревья яблони сорта Антоновка обыкновенная в начале фазы цветения обрабатывали раствором препарата концентрацией 0,001%, расход жидкости - 1000 л/га. Через 45 дней после цветения обработку повторяли. Результаты представлены в Таблицах 4, 5.

Таблица 4. Влияние препарата на рост и экологическую устойчивость яблони сорта Антоновка обыкновенная Длина побегов, см Площадь листовой пластинки, см² Обводненность листьев, % Буферность цитоплазмы клеток листьев, ед. Контроль 15,8 23,6 52,2 3,6 Препарат 18,6 26,4 59,0 4,0

Таблица 5. Влияние препарата на качество плодов и урожайность деревьев яблони сорта Антоновка обыкновенная Титруемая кислотность Сухие растворимые вещества, % Масса плода, г Завязываемость плодов, % Урожайность, кг/дер Контроль 1,3 10,0 102,5 8,1 78,1 Препарат 1,0 10,0 114,2 13,5 86,1

Таким образом, при обработке препаратом заявляемого штамма Sarocladium kiliense 346(A-2) наблюдается усиление роста побегов деревьев яблони сорта Антоновка обыкновенная на 17-24%, увеличение размера листовой пластинки на 12-15% и повышение устойчивости к неблагоприятным факторам окружающей среды.

Пример 4. Кусты черной смородины сорта Черный жемчуг обрабатывали препаратом из расчета 3 мл/га. Результаты приведены в таблице 6.

Таблица 6. Влияние препарата на урожайность и степень пораженности септориозом и мучнистой росой черной смородины сорта Черный жемчуг Урожайность, кг/куст Септориоз, % куст Мучн. роса, % куст Контроль 0,75 27 55 Препарат 1,2 20 40

Таким образом, при обработке препаратом заявляемого штамма Sarocladium kiliense 346(A-2) кустов черной смородины сорта Черный жемчуг наблюдается прибавка урожая на 60%, а также уменьшение процента кустов, пораженных септориозом (на 7%) и мучнистой росой (на 15%).

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм гриба Sarocladium kiliense 346(A-2), являющийся продуцентом комплекса биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием. Указанный штамм депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГБУ ГосНИИгенетика Минобрнауки России 22 февраля 2017 года под регистрационным номером F-1345. Изобретение обеспечивает защиту от различных заболеваний, вызываемых фитопатогенными грибами и бактериями. 6 табл., 4 пр.

Штамм гриба Sarocladium kiliense 346(A-2), депонированный в Национальном биоресурсном центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов ФГБУ ГосНИИгенетика Минобрнауки России 22 февраля 2017 года под регистрационным номером F-1345, являющийся продуцентом комплекса биологически активных веществ, обладающих ростостимулирующим и элиситорным действием.