ИММУНОГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ ПРОТИВ ВИРУСА ПТИЧЬЕГО ГРИППА ПОДТИПА H5 Российский патент 2023 года по МПК A61K39/145 G01N33/569 A61P31/16 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение относится к области ветеринарной медицины, в особенности к иммуногенной композиции против вируса птичьего гриппа подтипа Н5.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Вирус птичьего гриппа (AIV) принадлежит к типу вирусов гриппа А, и в природе встречается среди диких водоплавающих птиц во всем мире и может инфицировать домашних птиц и других птиц, включая млекопитающих. Вирусы гриппа А делятся на подтипы на основе двух белков на поверхности вируса: гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA). Существует 18 известных подтипов НА и 11 известных подтипов NA. Возможны многие различные комбинации белков НА и NA. Например, «вирус H5N1» означает, что вирус имеет подтип 5 НА и подтип 1 NA.

[0003] Существует девять известных подтипов вирусов Н5 (H5N1, H5N2, H5N3, H5N4, H5N5, H5N6, H5N7, H5N8 и H5N9, именуемые в данном описании «H5Nx»). Большинство вирусов Н5, идентифицированных во всем мире у диких птиц и домашней птицы, представляют собою вирус птичьего гриппа с низкой патогенностью, но некоторые вирусы, содержащие Н5, относятся к вирусам высокопатогенного птичьего гриппа (HPAI). Вирусы H5Nx быстро эволюционируют, что приводит к значительной дивергентной антигенной изменчивости между разными кладами, что выявляет эволюционные связи между различными линиями Н5. Заражение домашней птицы вирусами HPAI может вызвать тяжелые заболевания с высокой смертностью.

[0004] В странах с эндемическим вирусом H5Nx вакцинация использовалась для борьбы с этим заболеванием. Наиболее распространенными вакцинами против AIV являются вакцины, содержащие инактивированный цельный вирус (инактивированные вакцины), которые получают путем инактивации целого вируса и эмульгирования с соответствующими адъювантами. Однако инактивированная вакцина не может обеспечить широкую защиту от различных клад. Из-за быстрой эволюции AIV людям приходится постоянно разрабатывать новые вакцины против различных клад. Более того, для производства инактивированной вакцины требуется большое количество живых вирусов AIV, и поэтому биобезопасность представляет собой серьезную проблему.

[0005] НА белок представляет собой рецептор-связывающий и слитый с мембраной гликопротеин вируса гриппа А. Известно, что НА белок способен вызывать появление защитных антител, и поэтому исследователи проявляют интерес к разработке субъединичных вакцин на основе рекомбинантного НА белка. WO2007/019094 раскрывает молекулу НА, содержащую аминокислотную замену в рецептор-связывающем сайте, которая делает молекулу НА более антигенной по сравнению с молекулой НА, в которой отсутствует аминокислотная замена в рецептор-связывающем сайте. WO2008/052173 раскрывает гемагглютининовый белок вируса птичьего гриппа подтипа Н5 (в дальнейшем называемый «НА белок AIV подтипа Н5» или «НА белок Н5»), содержащий некоторые аминокислотные мутации, и вакцины, содержащие адъювантный НА белок Н5, могут обеспечивать защиту от клинического заболевания, вызванного вирусом гриппа А. Однако приведенные выше сведения не связаны с более широкой защитой от вирусов гриппа А различных клад.

[0006] В WO2013/148164 раскрыт способ получения оптимизированного НА полипептида гриппа H5N1 и H1N1 на основе изолятов гриппа H5N1 человека и H1N1 свиньи. Также получают вирусоподобную частицу гриппа (VLP), содержащую оптимизированный НА полипептид гриппа. Результаты экспериментов показывают, что VLP могут вызывать гуморальную иммунную реакцию, которая может распознавать вирусы гриппа двух разных клад у мышей, но эффективность защиты составляет только 40-60%.

[0007] Существует потребность в разработке вакцины, которая может обеспечить более широкую, более эффективную, длительную и раннюю защиту домашней птицы от AIV подтипа Н5.

КОРОТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0008] Данное изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую гемагглютининовый белок вируса птичьего гриппа подтипа Н5, причем гемагглютининовый белок содержит: (а) аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N и 223N или 223S; и (б) один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981; причем нумерация относительно аминокислотных остатков такая, как указано в SEQ ID NO: 1.

[0010] Данное изобретение также обеспечивает способ получения иммуногенной композиции, который включает: (i) культивирование клеток, содержащих вектор экспрессии, экспрессирующий гемагглютининовый белок вируса птичьего гриппа подтипа Н5; и (ii) сбор всей клеточной культуры; где гемагглютининовый белок содержит: (а) аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N и 223N или 223S; и (б) один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 87I, 99А, 102А, 110N, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981; причем нумерация относительно аминокислотных остатков такая, как указано в SEQ ID NO: 1.

[0011] Также предложена иммуногенная композиция в соответствии с изобретением для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызываемых вирусом птичьего гриппа, предпочтительно H5Nx. В одном из вариантов осуществления H5Nx представляет собой H5N1, H5N2 и/или H5N6. В одном из вариантов осуществления H5Nx представляет собой H5N1. В одном из вариантов осуществления H5Nx представляет собой H5N2. В одном из вариантов осуществления H5Nx представляет собой H5N6. В одном из вариантов осуществления H5Nx представляет собой H5N1 и H5N2. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N2 и H5N6.

[0012] Также предложен способ дифференциации животных, естественно инфицированных AIV, от животных, вакцинированных иммуногенной композицией в соответствии с изобретением.

[0013] Иммуногенная композиция в соответствии с изобретением может обеспечивать более широкую, более эффективную, длительную и раннюю защиту домашней птицы. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция в соответствии с изобретением обеспечивает более широкую защиту домашней птицы. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция в соответствии с изобретением обеспечивает более эффективную защиту домашней птицы. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция в соответствии с изобретением обеспечивает длительную защиту домашней птицы. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция в соответствии с изобретением обеспечивает защиту домашней птицы на раннем этапе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0014] В одном из аспектов изобретение обеспечивает иммуногенную композицию, содержащую НА белок Н5, где НА белок Н5 содержит: (а) аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N и 223N или 223S; и (б) один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из: 61D, 87I, 99А, 102А, 110N, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981; причем нумерация относительно аминокислотных остатков такая, как указано в SEQ ID NO: 1.

[0015] Используемый в данном описании термин «иммуногенная композиция», также называемая «вакциной», относится к композиции, которая содержит по меньшей мере один антиген, который вызывает иммунный ответ на указанную композицию. Хозяин будет показывать терапевтический или защитный иммунный ответ, так что устойчивость к новым инфекциям будет увеличиваться и/или тяжесть клинических признаков уменьшаться.

[0016] Аминокислотная последовательность НА белка Н5 конструируется посредством серии выравниваний аминокислотных последовательностей НА, последующего создания консенсусных аминокислотных последовательностей и анализа наиболее часто встречающихся остатков в каждом положении. Используемые в данном описании термины «гемагглютининовый белок в соответствии с изобретением», «НА белок AIV подтипа Н5» и «НА белок Н5» являются взаимозаменяемыми.

[0017] В данном контексте SEQ ID NO: 1 представляет собой аминокислотную последовательность НА белка штамма А/утка/Китай/Е319-2/03 (A/duck/China/E319-2/03), но не содержит сигнального пептидана N-конце (аминокислотная последовательность НА белка штамма А/утка/Китай/Е319-2/03 также была опубликована в WO2008/052173). SEQ ID NO: 1 используется в качестве стандартной последовательности НА белка для определения аминокислотного положения НА белка в соответствии с настоящим изобретением.

[0018] Нумерация положений аминокислот НА белка в соответствии с настоящим изобретением, как использовано в данном описании, относится к положению аминокислот, представленному в SEQ ID NO:l. Например, обозначение "120N или 120S" означает N или S в положении, которое соответствует положению 120 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "155N" означает N в положении, которое соответствует положению 155 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:l. "223N или 223S" означает N или S в положении, которое соответствует положению 223 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "61D" означает D в положении, которое соответствует положению 61 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "871" означает I в положении, которое соответствует положению 87 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "99А" означает А в положении, которое соответствует положению 99 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "102А" означает А в положении, которое соответствует положению 102 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "HON" означает N в положении, которое соответствует положению ПО аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "136S" означает S в положении, которое соответствует положению 136 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "140D" означает D в положении, которое соответствует положению 140 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "149S" означает S в положении, которое соответствует положению 149 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "156Т" означает Т в положении, которое соответствует положению 156 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "157Р" означает Р в положении, которое соответствует положению 157 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "170N" означает N в положении, которое соответствует положению 170 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "172Т" означает Т в положении, которое соответствует положению 172 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "178R" означает R в положении, которое соответствует положению 178 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "190V" означает V в положении, которое соответствует положению 190 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "191L" означает L в положении, которое соответствует положению 191 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "200А" означает А в положении, которое соответствует положению 200 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "226V" означает V в положении, которое соответствует положению 226 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "243D" означает D в положении, которое соответствует положению 243 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "268Y" означает Y в положении, которое соответствует положению 268 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "279А" означает А в положении, которое соответствует положению 279 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. "2981" означает I в положении, которое соответствует положению 298 аминокислотной последовательности SEQ ID NO:1. Способы определения положений аминокислот известны в данной области, включая, но не ограничиваясь описанным, выравнивание аминокислот, выполняемое с помощью программы BLAST.

[0019] В одном варианте осуществления иммуногенной композиции в соответствии с данным изобретением, НА белок Н5 содержит любой из аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, HON, 136S, HOD, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления НА белок Н5 в соответствии с данным изобретением содержит два аминокислотных остатка, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, HON, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления, НА белок Н5 в соответствии с данным изобретением содержит три, четыре, пять, ……, или все аминокислотные остатки, выбранные из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, HON, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. Весь НА белок из AIV природного происхождения имеет длину около 568 аминокислотных остатков, и все аминокислотные остатки перед аминокислотой 514 расположены на поверхности вируса. Вышеупомянутые аминокислотные сайты в соответствии с настоящим изобретением идентифицированы как расположенные в области аминокислот 60-300 НА белка, который, как полагают, содержит большинство иммуногенных эпитопов. В одном варианте осуществления НА белок Н5 в соответствии с настоящим изобретением дополнительно содержит аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N и 223N или 223S. В одном варианте осуществления НА белок Н5 в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотные остатки 120N, 155N и 223N. В одном варианте осуществления НА белок Н5 в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотные остатки 120N, 155N и 223S. В одном варианте осуществления НА белок Н5 в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотные остатки 120S, 155N и 223N. В одном варианте осуществления НА белок Н5 в соответствии с настоящим изобретением содержит аминокислотные остатки 120S, 155N и 223S.

[0020] В одном варианте осуществления иммуногенной композиции настоящего изобретения, НА белок Н5 содержит аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 120N, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223N, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления НА белок Н5 настоящего изобретения содержит аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102А, HON, 120S, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223S, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления НА белок Н5 настоящего изобретения содержит аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102А, HON, 120S, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223N, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления НА белок Н5 настоящего изобретения содержит аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102A, 110N, 120N, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223S, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981.

[0021] В одном варианте осуществления иммуногенной композиции настоящего изобретения НА белок Н5 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления НА белок Н5 настоящего изобретения содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5. В одном варианте осуществления НА белок Н5 настоящего изобретения состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления НА белок Н5 настоящего изобретения состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 5.

[0022] Используемый в данном описании термин «НА белок Н5 в соответствии с настоящим изобретением» может означать изолированную форму НА белка Н5 или неизолированную форму НА белка Н5, например, НА белок Н5, содержащийся в клеточной культуре. В одном варианте осуществления иммуногенной композиции настоящего изобретения НА белок Н5 представляет собой неизолированную форму НА белка Н5. В одном варианте осуществления иммуногенной композиции настоящего изобретения НА белок Н5 представляет собой изолированную форму НА белка Н5.

[0023] В одном варианте осуществления иммуногенной композиции настоящего изобретения, НА белок Н5 получают путем экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей НА белок Н5.

[0024] В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может быть дополнительно кодон-оптимизирована для экспрессии в клетках. Термин «кодон-оптимизированная молекула нуклеиновой кислоты» в контексте настоящего описания означает молекулу нуклеиновой кислоты, выбранную таким образом, что кодоны являются оптимальными для экспрессии в конкретной системе (такой как конкретный вид или группа видов). Кодон-оптимизация не изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения кодон-оптимизирована для экспрессии в клетках насекомых.

[0025] В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения содержит последовательность нуклеиновой кислоты, представленную в SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 11.

[0026] Молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения может содержаться в векторе экспрессии. В одном варианте осуществления вектор экспрессии настоящего изобретения представляет собой вирус, плазмиду, космиду или фаг. Вектор может состоять из ДНК или РНК, предпочтительно ДНК.

[0027] Векторы и способы создания и/или использования векторов (или рекомбинантов) для экспрессии могут быть способами или аналогичны способам, раскрытым в таких как: Патенты США №№4,603,112, 4,769,330, 5,174,993, 5,505,941, 5,338,683, 5,494,807, 4,722,848, 5,942,235, 5,364,773, 5,762,938, 5,770,212, 5,942,235, 382,425, РСТ публикации WO 94/16716, WO 96/39491, WO 95/30018; Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349 - 11353, Октябрь 1996 г.; Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341 - 11348, Октябрь 1996 г.; Smith и соавт., Патент США №4,745,051 (рекомбинантный бакуловирус); Richardson, С.D. (редактор), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.); Smith и соавт., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, Декабрь 1983 г., том. 3, №. 12, стр. 2156-2165; Pennock и соавт., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology Март 1984 г., том. 4, №3, стр. 406; ЕРА0 370 573; Заявка США №920,197, поданная 16 октября 1986 г.; Европейская патентная публикация №265785; Патент США №4,769,331 (рекомбинантный герпесвирус); Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307 - 11312, Октябрь 1996 г.; Andreansky и соавт., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313 - 11318, Октябрь 1996 г.; Robertson и соавт., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to В lymphocytes", PNAS USA 93: 11334 - 11340, Октябрь 1996 г.; Frolov и соавт., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371 - 11377, Октябрь 1996 г.; Kitson и соавт., J. Virol. 65, 3068 - 3075, 1991; Патенты США №№5,591,439, 5,552,143; WO 98/00166; выданные заявки США серийн. №№08/675,556 и 08/675,566, обе поданные 3 июля 1996 г. (рекомбинантный аденовирус); Grunhaus и соавт., 1992 г., "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (том 3) стр. 237-52, 1993 г.; Ballay и соавт.EMBO Journal, том 4, стр. 3861 - 65, Graham, Tibtech 8, 85 - 87, Апрель, 1990 г.; Prevec и соавт., J. Gen Virol. 70, 42434; PCT WO 91/11525; Feigner и соавт.(1994), J. Biol. Chem. 269, 2550 - 2561, Science, 259: 1745 - 49, 1993; и McClements и соавт., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414 - 11420, Октябрь 1996 г.; и Патенты США №№5,591,639, 5,589,466 и 5,580,859, а также WO 90/11092, W093/19183, W094/21797, WO95/11307, WO95/20660; Tang и соавт., Nature, и Furth и соавт., Analytical Biochemistry, что касается векторов экспрессии ДНК, среди прочего. См. также WO 98/33510; Ju и соавт., Diabetologia, 41: 736 - 739, 1998 (лентивирусная экспрессирующая система); Sanford и соавт., Патент США №4,945,050; Fischbachet и соавт.(Intracel); WO 90/01543; Robinson и соавт., Seminars in Immunology том 9, стр. 271-283 (1997), (системы ДНК-векторов); Szoka и соавт., Патент США №4,394,448 (способ встраивания ДНК в живые клетки); McCormick и соавт., Патент США №5,677,178 (применение цитопатических вирусов); и Патент США №5,928,913 (векторы генной доставки); а также в других документах, процитированных в данном описании.

[0028] В одном варианте осуществления вектор экспрессии настоящего изобретения представляет собою вирусный вектор.

[0029] В одном варианте осуществления вектор экспрессии настоящего изобретения представляет собою вирус герпеса, такой как Вирус болезни Ауески, вирус герпеса у лошадей или вирус простого герпеса. В одном варианте осуществления вектор экспрессии настоящего изобретения представляет собою аденовирус, такой как свиной аденовирус.В одном варианте осуществления вектор экспрессии настоящего изобретения представляет собою поксвирус, такой как вирус коровьей оспы, авипоксвирус, канарипокс-вирус (вирус оспы канареек) или вирус оспы свиней.

[0030] В одном варианте осуществления вирусный вектор представляет собою рекомбинантный бакуловирус. В одном варианте осуществления, указанный рекомбинантный бакуловирус настоящего изобретения получают из BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, Calif.). В одном варианте осуществления, указанный рекомбинантный бакуловирус настоящего изобретения получают из Sapphire™ Baculovirus (Allele Biotechnology). В одном варианте осуществления, указанный рекомбинантный бакуловирус настоящего изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует НА белок Н5 настоящего изобретения. В одном варианте осуществления, указанный рекомбинантный бакуловирус настоящего изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления, указанный рекомбинантный бакуловирус настоящего изобретения содержит молекулу нуклеиновой кислоты, как представлено в SEQ ID NO: 11.

[0031] В одном варианте осуществления иммуногенной композиции настоящего изобретения, НА белок Н5 содержится в клеточной культуре. Клеточная культура в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой цельноклеточную культуру, полученную в процессе культивирования клеток, включая клетку и культуральную среду, или часть клеточной культуры, содержащую НА белок, например, часть клеточной культуры, содержащую НА белок, полученную фильтрацией или любой другой стадией разделения.

[0032] В одном варианте осуществления, клеточная культура содержит НА белок Н5, где НА белок Н5 содержит: (а) аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N и 223N или 223S; и (б) один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, HON, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981; при этом нумерация касательно аминокислотных остатков такая, как представлено в SEQ ID NO:l. В одном варианте осуществления клеточная культура содержит НА белок Н5, где НА белок Н5 содержит аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 120N, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223N, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления клеточная культура содержит НА белок Н5, где НА белок Н5 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления клеточная культура содержит НА белок Н5, где НА белок Н5 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

[0033] Иммуногенная композиция настоящего изобретения дополнительно содержит адъювант. В одном варианте осуществления иммуногенную композицию рецептируют в адъюванте. "Адъюванты", как использовано в данном описании, могут включать гидроксид алюминия и фосфат алюминия, сапонины, например, Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), эмульсию вода-в-масле, эмульсию масло-в-воде, эмульсию вода-в-масле-в-воде. Эмульсия может быть основана, в частности, на легком жидком парафиновом масле (тип Европейской Фармакопеи); изопреноидном масле, таком как сквалан или сквален; масле, полученном в результате олигомеризации алкенов, в частности изобутена или децена; сложных эфиров кислот или спиртов, содержащих линейную алкильную группу, в частности растительных масел, этилолеата, ди- (каприлат/капрат) пропиленгликоля, три- (каприлат/капрат) глицерина или диолеата пропиленгликоля; сложных эфиров разветвленных жирных кислот или спиртов, в частности сложных эфиров изостеариновой кислоты. Масло используют в комбинации с эмульгаторами для образования эмульсии. Эмульгаторы предпочтительно представляют собой неионные поверхностно-активные вещества, в частности сложные эфиры сорбитана, маннида (например, ангидроманнитололеат), гликоля, полиглицерина, пропиленгликоля и олеиновой, изостеариновой, рицинолевой или гидроксистеариновой кислоты, которые необязательно являются этоксилированными. блоки сополимера полиоксипропилена и полиоксиэтилена, в частности продукты Pluronic, особенно L121. См. Hunter и соавт., Theory and Practical Application of Aduvants (Ed.Stewart-Tull, DES), JohnWiley and Sons, NY, стр. 51 - 94 (1995) и Todd и соавт., Vaccine 15: 564 - 570 (1997). Примеры адъювантов представляют собой эмульсию SPT, описанную на странице 147 книги "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" под редакцией M. Powell и M. Newman, Plenum Press, 1995, и эмульсию MF59, описанную на странице 183 этой же книги.

[0034] Еще одним примером адъюванта является соединение, выбранное из полимеров акриловой или метакриловой кислоты и сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного. Предпочтительными адъювантами являются полимеры акриловой или метакриловой кислоты, которые являются поперечно сшитыми, особенно с полиалкениловыми эфирами Сахаров или многоатомных спиртов. Эти соединения известны под названием карбомер (Phameuropa том 8, №2, Июнь 1996 г. ). Специалисты, квалифицированные в данной области, могут также обратиться к патенту США №2.909.462, в котором описаны такие акриловые полимеры, поперечно сшитые с полигидроксилированным соединением, имеющим по меньшей мере 3 гидроксильные группы, предпочтительно не более 8, причем атомы водорода по меньшей мере трех гидроксилов заменены на ненасыщенные алифатические радикалы, содержащие не менее 2 атомов углерода. Предпочтительными радикалами являются радикалы, содержащие от 2 до 4 атомов углерода, например, винилы, аллилы и другие этилен-ненасыщенные группы. Сами ненасыщенные радикалы могут содержать другие заместители, такие как метил. Продукция, продаваемая под названием Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, USA) является особенно подходящей. Они являются поперечно сшитыми с аллилсахарозой или аллилпентаэритритом. Среди них можно упомянуть Carbopol 974Р, 934Р и 971Р. Наиболее предпочтительным является использование Cabopol 971Р. Среди сополимеров малеинового ангидрида и алкенильного производного есть сополимеры EMA (Monsanto), которые представляют собой сополимеры малеинового ангидрида и этилена. Растворение этих полимеров в воде приводит к получению кислого раствора, который будет нейтрализован, предпочтительно до физиологического рН, чтобы получить раствор адъюванта, в который будет включена сама иммуногенная, иммунологическая композиция или композиция вакцины.

[0035] Дополнительные подходящие адъюванты включают, но не ограничиваются перечисленными, систему адъюванта RIBI (Ribi Inc.), блок-сополимер (CytRx, Atlanta GA), SAF-M (Chiron, Emeryville CA), монофосфориллипид А, липидно-аминовый адъювант Avridine, термолабильный энтеротоксин из Е. coli (рекомбинантный или другой), холерный токсин, IMS 1314 или мурамилдипептид, или встречающиеся в природе или рекомбинантные цитокины или их аналоги, или стимуляторы высвобождения эндогенных цитокинов, среди многих других.

[0036] В одном варианте осуществления иммуногенную композицию формулируют в эмульсию вода-в-масле с подходящим адъювантом. Указанный адъювант может содержать масла и поверхностно-активные вещества. В одном варианте осуществления, указанный адъювант представляет собой MONTANIDE™ ISA 71R VG (изготовленный Seppic Inc, Cat no: 365187). Указанный адъювант может быть добавлен в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу. Даже более предпочтительно указанный адъювант добавляют в количестве от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг на дозу. Еще более предпочтительно указанный адъювант добавляют в количестве от приблизительно 500 мкг до приблизительно 5 мг на дозу. Еще более предпочтительно указанный адъювант добавляют в количестве от приблизительно 750 мкг до приблизительно 2,5 мг на дозу. Наиболее предпочтительно указанный адъювант добавляют в количестве приблизительно 1 мг на дозу. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит приблизительно 7 частей масляной фазы, содержащей адъювант, и приблизительно 3 части водной фазы, содержащей НА белок Н5 настоящего изобретения, на дозу.

[0037] Неожиданно было обнаружено, что иммуногенная композиция настоящего изобретения может привести к более широкой защите домашней птицы. Используемый в данном описании термин «более широкая защита домашней птицы» охватывает широкую защиту от различных AIV подтипов Н5. Такие подтипы охватывают или в соответствии с дополнительным вариантом осуществления состоят из H5N1, H5N2 и/или H5N6. В соответствии с дополнительным вариантом осуществления термин «более широкая защита домашней птицы» также охватывает защиту от различных клад AIV подтипов Н5. Такие клады AIV Н5 охватывают или в соответствии с дополнительным вариантом осуществления состоят из 2.3.4.4, 2.3.2.1, 2.3.2.1d, 2.3.4.4d и/или 7.2.

[0038] Кроме того, защита, обеспечиваемая иммуногенной композицией настоящего изобретения, имеет раннее начало и длительный период. Используемый в данном описании термин «период раннего начала» или «раннее начало защиты» означает, что частичную защиту от инфекционного вируса AIV Н5 можно получить через 7 дней после вакцинации. Полная защита от инфекционного вируса AIV Н5 достигается через 14 дней после вакцинации. Термин «длительный период» или «длительная защита домашней птицы» охватывает период защиты не менее 42 дней после вакцинации.

[0039] Иммуногенная композиция настоящего изобретения может обеспечивать защиту курей в разном возрасте, даже у только что вылупившихся, то есть первого дня жизни. Иммуногенная композиция настоящего изобретения не должна ограничиваться определенным путем введения, и разные пути введения не влияют на эффективность защиты иммуногенной композиции настоящего изобретения.

[0040] В другом аспекте изобретение также относится к способу получения иммуногенной композиции, который включает: (i) культивирование клеток, содержащих вектор экспрессии, способный экспрессировать НА белок Н5; и (ii) сбор НА-белка Н5 или цельноклеточной культуры, содержащей НА-белок Н5, где НА-белок Н5 включает: (а) аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N и 223N или 223S; и (б) один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 136S, HOD, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981; при этом нумерация касательно аминокислотных остатков такая, как представлена в SEQ ID NO: 1.

[0041] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения НА белок Н5 содержит аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 120N, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223N, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981. В одном варианте осуществления НА белок Н5 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6. В одном варианте осуществления НА белок Н5 содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

[0042] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения вектор экспрессии представляет собою рекомбинантный бакуловирус, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 11 В одном варианте осуществления рекомбинантный бакуловирус получают из коммерческого продукта, продаваемого под торговой маркой Sapphire™ Baculovirus (Allele Biotechnology). В одном варианте осуществления клетки представляют собой клетки насекомого. В одном варианте осуществления клетки насекомого представляют собой SF+клетки. В одном варианте осуществления указанные SF+клетки являются коммерческим продуктом, продаваемым корпорацией Protein Sciences (Meriden, СТ).

[0043] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения способ включает стадию получения рекомбинантного бакуловируса, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления рекомбинантный бакуловирус получают из коммерческого продукта, продаваемого под торговой маркой Sapphire™ Baculovirus (Allele Biotechnology).

[0044] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения способ включает стадию заражения (инфицирования) клеток рекомбинантным бакуловирусом настоящего изобретения. В одном варианте осуществления указанные клетки представляют собой клетки насекомых. В одном варианте осуществления указанные клетки насекомых представляют собой SF+клетки. В одном варианте осуществления указанные SF+клетки являются коммерческим продуктом, продаваемым корпорацией Protein Sciences (Meriden, СТ).

[0045] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения способ включает получение рекомбинантного бакуловируса, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, и заражение клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом. В одном варианте осуществления указанный рекомбинантный бакуловирус получают из коммерческого продукта, продаваемого под торговой маркой Sapphire™ Baculovirus (Allele Biotechnology). В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления указанные клетки насекомых представляют собой SF+клетки. В одном варианте осуществления указанные SF+клетки являются коммерческим продуктом, продаваемым корпорацией Protein Sciences (Meriden, СТ).

[0046] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения способ включает: (i) получение рекомбинантного бакуловируса, содержащего молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения; (ii) заражение клеток насекомых рекомбинантным бакуловирусом; (iii) культивирование этих клеток насекомых в культуральной среде; и (iv) сбор НА белка Н5 настоящего изобретения или цельноклеточной культуры, содержащей НА белок Н5 настоящего изобретения. В одном варианте осуществления, рекомбинантный бакуловирус получают из коммерческого продукта, продаваемого под торговой маркой Sapphire™ Baculovirus (Allele Biotechnology). В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 10. В одном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения представлена в SEQ ID NO: 11. В одном варианте осуществления, указанные клетки насекомых представляют собой SF+клетки. В одном варианте осуществления указанные SF+клетки являются коммерческим продуктом, продаваемым корпорацией Protein Sciences (Meriden, СТ).

[0047] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения культуральная среда для культивирования клеток настоящего изобретения будет определена специалистами, квалифицированными в данной области. В одном варианте осуществления культуральная среда представляет собой бессывороточную среду для клеток насекомых. В одном варианте осуществления культуральная среда представляет собой Ex-CELL 420 (бессывороточная среда для клеток насекомых Ex-CELL® 420, Sigma-Aldrich, Cat. 14420C).

[0048] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения клетки насекомых культивируют в условиях, подходящих для экспрессии НА белка Н5. В одном варианте осуществления клетки насекомых инкубируют в течение периода до десяти дней, предпочтительно от примерно двух дней до примерно десяти дней, более предпочтительно от примерно четырех дней до примерно девяти дней и даже более предпочтительно от примерно пяти дней до примерно восьми дней. В одном варианте осуществления условия, подходящие для культивирования клеток насекомых, включают температуру примерно 22-32°С, предпочтительно примерно 24-30°С, более предпочтительно примерно 25-29°С, еще более предпочтительно примерно 26 -28°С, а наиболее предпочтительно около 27°С.

[0049] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения способ дополнительно включает стадию инактивации культуры клеток настоящего изобретения. Для целей настоящего изобретения можно использовать любой подходящий способ инактивации, включая, не ограничиваясь перечисленными, химические и/или физические обработки.

[0050] В одном варианте осуществления стадия инактивации включает добавление циклизированного бинарного этиленимина (BEI), предпочтительно в концентрации от приблизительно 1 до приблизительно 20 мМ, предпочтительно от приблизительно 2 до приблизительно 10 мМ, более предпочтительно приблизительно 5 мМ или 10 мМ. В одном варианте осуществления стадия инактивации включает добавление раствора гидробромида 2-бромэтиленамина, который подвергается циклизации с образованием BEI в NaOH.

[0051] В одном варианте осуществления стадию инактивации проводят при температуре в интервале 25-40°С, предпочтительно в интервале 28-39°С, более предпочтительно в интервале 30-39°С, более предпочтительно в интервале 35-39°С. В одном варианте осуществления стадию инактивации проводят в течение 24-72 ч., предпочтительно в течение 30-72 ч., более предпочтительно в течение 48-72 ч. Как правило, стадия инактивации выполняется до тех пор, пока не будет обнаруживаться никакая репликация вирусного вектора.

[0052] В одном варианте осуществления способа настоящего изобретения способ дополнительно включает стадию нейтрализации после стадии инактивации. Стадия нейтрализации включает добавление эквивалентного количества агента, который нейтрализует инактивирующий агент в растворе. В одном варианте осуществления инактивирующий агент представляет собой BEI. В одном варианте осуществления нейтрализующий агент представляет собой тиосульфат натрия. В одном варианте осуществления, когда инактивирующий агентом является BEI, будет добавлено эквивалентное количество тиосульфата натрия. Например, в случае добавления BEI до конечной концентрации 5 мМ, добавляется 1,0 М раствор тиосульфата натрия, чтобы получить конечную минимальную концентрацию 5 мМ для нейтрализации любого остаточного BEI. В одном варианте осуществления стадия нейтрализации включает добавление раствора тиосульфата натрия до конечной концентрации от 1 до 20 мМ, предпочтительно от 2 до 10 мМ, более предпочтительно от 5 мМ или 10 мМ, когда инактивирующим агентом является BEI. В одном варианте осуществления нейтрализующий агент добавляют после завершения стадии инактивации, что означает, что никакая репликация вирусного вектора не может быть обнаружена. В одном варианте осуществления нейтрализующий агент добавляют после того, как стадию инактивации проводят в течение 24 часов. В одном варианте осуществления нейтрализующий агент добавляют после того, как стадию инактивации проводят в течение 30 часов. В одном варианте осуществления нейтрализующий агент добавляют после того, как стадию инактивации проводят в течение 48 часов. В одном варианте осуществления нейтрализующий агент добавляют после того, как стадию инактивации проводят в течение 72 часов.

[0053] Количество НА белка Н5, содержащегося в иммуногенной композиции настоящего изобретения, может быть определено количественно с использованием любых традиционных способов, известных в данной области, например, анализа гемагглютинации (см. OIE Terrestrial Manual 2015, глава 2.3. 1 & 2.3.2, Avian Influenza (заражение вирусом птичьего гриппа)). В одном варианте осуществления количество НА белка Н5, содержащегося в иммуногенной композиции настоящего изобретения, определяют с помощью теста гемагглютинации с куриными эритроцитами, и количество НА белка Н5 может быть выражено в единицах анализа гемагглютинина (hemagglutinin assay unit-HAU).

[0054] Термин «HAU» относится к единице активности агглютинирования эритроцитов (RBC), а 1 HAU гемагглютининового белка относится к минимальной единице, которая вызывает агглютинацию, когда гемагглютинин смешивают с RBC. HAU можно оценить с помощью анализа титра гемагглютинации. В этом анализе образец, содержащий гемагглютининовый белок, подвергается двукратному серийному разведению в 96-луночном планшете, и в лунки добавляется раствор RBC. Значение HAU представляет собой наибольшую кратность разбавления образца, которая приводит к полной агглютинации эритроцитов (RBC). Например, если наибольшая кратность разбавления образца 25 мкл составляет 256, количество гемагглютининового белка, содержащегося в образце, составляет 256 HAU на 25 мкл.

[0055] Чтобы вызвать эффективный иммунный ответ согласно настоящему изобретению, количество НА белка Н5, содержащегося в иммуногенной композиции настоящего изобретения, составляет по меньшей мере 32 HAU на дозу. Таким образом, иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере 32 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере 64 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере 128 HAU на дозу НА-белка Н5 настоящего изобретения. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере 256 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения.

[0056] Специалист в данной области может определить верхний предел количества НА белка Н5 просто путем обычного тестирования. В общем, верхний предел, используемый специалистом в данной области, будет в диапазоне примерно 1024 HAU на дозу, но также может быть выше. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере от 32 до 1024 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере от 64 до 1024 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция по настоящему изобретению содержит по меньшей мере от 128 до 1024 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения. В дополнительном аспекте иммуногенная композиция настоящего изобретения содержит по меньшей мере от 256 до 1024 HAU на дозу НА белка Н5 настоящего изобретения.

[0057] По сравнению с обычными вакцинами, содержащими цельный инактивированный вирус, которые должны производиться с уровнем биобезопасности 2 или 3 (BSL-2, BSL-3), вышеуказанный способ производства НА белка Н5 отнесен к категории требований уровня биобезопасности 1.

[0058] В другом аспекте изобретение также обеспечивает способ профилактики и/или лечения инфекций, вызванных AIV, включающий введение эффективного количества иммуногенной композиции настоящего изобретения субъекту, нуждающемуся в этом. Изобретение также обеспечивает иммуногенную композицию настоящего изобретения для использования в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных AIV.

[0059] Используемый в данном описании термин «профилактика» относится к снижению частоты или тяжести клинических симптомов инфекции гриппа, вплоть до полного предотвращения таких клинических симптомов. Эффективность иммуногенной композиции для профилактической защиты можно оценить на основании выживаемости вакцинированного субъекта в отношении различных клад AIV. В одном варианте осуществления эффективность защиты иммуногенной композиции увеличивается по меньшей мере на 10%, более предпочтительно по меньшей мере на 20%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 30%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 40%, более предпочтительно по меньшей мере на 50%, еще более предпочтительно по меньшей мере 60%, еще более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95% и наиболее предпочтительно 100% по сравнению с субъектом, который не получал вакцину по настоящему изобретению, но подвергся воздействию инфекционных уровней AIV. В одном варианте осуществления эффективность защиты иммуногенной композиции составляет 100% у вакцинированного субъекта против различных клад AIV.

[0060] В одном варианте осуществления нуждающимся в этом субъектом может быть домашняя птица, даже более предпочтительно птица, курица, утка, индейка и т.п. В одном варианте осуществления субъектом является курица или утка.

[0061] В одном варианте осуществления AIV представляет собой подтип Н5. В одном варианте осуществления AIV представляет собой H5Nx. В одном варианте осуществления AIV представляет собой HPAI H5Nx, который циркулирует в основном в Азии, на Ближнем Востоке и в Африке. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N1, H5N2 и/или H5N6 В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N1. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N2. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N6. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N1 и H5N2. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N2 и H5N6. В одном варианте осуществления AIV представляет собой кладу 2, предпочтительно кладу 2.3, и наиболее предпочтительно клады 2.3.4 и 2.3.2. В одном варианте осуществления AIV представляет собой кладу 2.3.4.4, 2.3.2.1, 2.3.2.Id или 2.3.4.4d. В одном варианте осуществления AIV представляет собой кладу 7.2.

[0062] H5Nx подтипа H5N1, H5N2 и/или H5N6 являются хорошо известными в данной области техники.

[0063] Используемый в данном описании термин «клада» относится к группе биологических таксонов (таких как виды), которая включает всех потомков одного общего предка. А/гусь/Гуандун/1/96 (A/goose/Guangdong/1/96) считался предком для всех вирусов линии Н5 и был обозначен как клада 0. Эта номенклатура теперь используется для различения групп вариантов гена Н5 НА, до настоящего времени было официально идентифицировано около 20 различных клад вируса. Помимо клады 0, были описаны и определены дополнительные 9 клад (1-9) на основе всех депонированных последовательностей. Однако со временем большинство клад вирусов вымерли. Вирус линии Н5 продолжал циркулировать среди домашних и диких птиц в некоторых частях Азии, на Ближнем Востоке и в Африке и продолжал развиваться. Наиболее доминирующей кладой, приведшей к эндемическим инфекциям в нескольких разных странах, являются вирусы клады 2, а дальнейшие подлинии, возникшие в результате антигенного дрейфа (изменчивости), были описаны как клады 2-го, 3-го, 4-го и даже 5-го порядка. Номенклатуру и появившуюся кладу можно увидеть в WHO/OIE/FAO. Продолжается продвижение к единой номенклатуре высокопатогенных вирусов птичьего гриппа H5N1: дивергенция вирусов клады 2.2. Influenza Other Respiration Viruses. Letter. 2009; 3: 59-62; WHO/OIE/FAO. Continued evolution of highly pathogenic avian influenza A (H5N1): updated nomenclature. (Продолжающаяся эволюция высокопатогенного птичьего гриппа A (H5N1): обновленная номенклатура) Influenza Other Respiration Viruses 2012; 6: 15; и WHO-OIE-FAO HNEWG. Revised and updated nomenclature for highly pathogenic avian influenza A (H5N1) viruses (Пересмотренная и обновленная номенклатура высокопатогенных вирусов птичьего гриппа А (H5N1)). Influenza Other Respiration Viruses 2014; 8: 384-388.

[0064] Например, H5Nx клады 2.3.4.4 описаны в Lee и соавт., Emerging Infectious Diseases, 2016; том 22(7) стр. 1283-1284 и в Lee и соавт., Journal Veterinary Science 2017; том (SI), стр. 269-280. Изолят птичьего гриппа А/сорока/Гонконг/5052/2007 (H5N1), описанный в Smith и соавт., Emerging Infectious Diseases, 2009; том 15(3), стр. 402-407, относится к кладе 2.3.2.1. Последующие H5Nx изоляты клады 2.3.2.1, включая А/курица/Индия/СЕ03485/2011 (H5N1) или А/курица/Индия/САОЗ02/2011 (H5N1), описаны, например, в Bhat и соавт., 2015, Microbial Pathogenesis; том 88, стр. 87-93. Последующие H5Nx подклад 2.3.2.1, а также 2.3.4.4, включая 2.3.4.4d, такие как, например, А/утка/Вьетнам/НШ-1507/2014 (H5N6) или А/утка/Вьетнам/ HU1-1151/2014 (H5N6) описаны в Nguyen и соавт., 2019, Scientific Reports 9; статья 7723, стр. 1-13. H5Nx изоляты клады 7.2, включая, например, (А/курица/Ганьсу/62012 (H5N1)) описаны и охарактеризованы, например, в Liu и соавт., Journal of Virology 2016, том 90(21), стр. 9797-9804.

[0065] В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения может быть введена путем подкожного (S.C.) или внутримышечного (I.M.) введения.

[0066] Время введения иммуногенной композиции настоящего изобретения может определить специалист, квалифицированный в данной области, в соответствии с практическими требованиями. Например, что касается белых бройлеров, продолжительность жизни которых составляет около 40-50 дней, иммуногенная композиция настоящего изобретения может вводиться в виде однократной дозы; что касается желтых бройлеров, продолжительность жизни которых составляет около 70 дней, иммуногенная композиция настоящего изобретения может вводиться двумя дозами; и что касается кур, таких как племенные куры, продолжительность жизни которых составляет более одного года или дольше, иммуногенная композиция настоящего изобретения может вводиться в нескольких дозах. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения вводится в виде однократной дозы. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция согласно настоящему изобретению вводится в виде нескольких доз, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 доз. В одном варианте осуществления интервал между двумя дозами составляет около 4-6 недель, например, 4 недели, 5 недель или 6 недель.

[0067] Специалист в данной области также может определить, когда вводить первую дозу, в соответствии с практическими требованиями. Например, при вакцинации цыплят. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения может сначала вводиться в 1 день жизни или позже, на 7 день жизни или позже, на 10 день жизни или позже, на 15 день жизни или позже, или на 21 день жизни или позже. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения вводится в 1 день жизни или позже, на 7 день жизни или позже, на 10 день жизни или позже, на 15 день жизни или позже, или на 21 день жизни или позже. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения вводится с 1 дня жизни, с 7 дня жизни, с 10 дня жизни, с 15 дня жизни или с 21 дня жизни однократно. В одном варианте осуществления иммуногенная композиция настоящего изобретения вводится с 1 дня жизни однократно.

[0068] В другом аспекте изобретение также относится к способу дифференциации животных, естественно инфицированных AIV, от животных, вакцинированных вакциной или иммуногенной композицией настоящего изобретения. Изобретение также обеспечивает применение иммуногенной композиции настоящего изобретения для приготовления агента для дифференциации животных, естественно инфицированных AIV, и вакцинированных животных.

[0069] В одном варианте осуществления, способ включает: а) анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который не присутствует в иммуногенной композиции, но присутствует у естественно инфицированных на животных, где иммунный анализ представляет собой иммуноферментный анализ или твердофазный иммуноферментный анализ, или анализ преципитации в агаровом геле, или анализ вестерн-блоттинга; б) определение того, является ли образец положительным или отрицательным для маркера птичьего гриппа, и в) корреляцию результатов анализа в отношении статуса тестируемого животного, при этом животное, которое положительно по маркеру птичьего гриппа, является естественно инфицированным животным, а животное, которое отрицательно по маркеру птичьего гриппа, является животным, вакцинированным иммуногенной композицией или вакциной настоящего изобретения.

[0070] В одном варианте осуществления, способ включает: а) анализ образца животного в иммунном и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который специфичен для иммуногенной композиции, но не присутствует у естественно инфицированного животного, где иммунный анализ представляет собой иммуноферментный анализ или твердофазный иммуноферментный анализ, б) определение того, является ли образец положительным или отрицательным по маркеру птичьего гриппа, и в) корреляцию результатов анализа со статусом тестируемого животного, где животное, которое является положительным по маркеру птичьего гриппа, представляет собой животное, вакцинированное иммуногенной композицией или вакциной настоящего изобретения.

[0071] В одном варианте осуществления, животным может быть домашняя птица, даже более предпочтительно птица, курица, утка, индейка и т.п. В одном варианте осуществления, животным является курица или утка.

[0072] В одном варианте осуществления AIV представляет собой подтип Н5. В одном варианте осуществления, указанный AIV представляет собой H5Nx. В одном варианте осуществления, указанный AIV представляет собой HPAI H5Nx, который циркулирует в основном в Азии, на Ближнем Востоке и в Африке. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N1, H5N2 и/или H5N6. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N1. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N2. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N6. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N1 и H5N2. В одном варианте осуществления H5Nx представляет собой H5N2 и H5N6.

[0073] В одном варианте осуществления AIV представляет собой кладу 2, предпочтительно кладу 2.3, и более предпочтительно клады 2.3.4 и 2.3.2. В одном варианте осуществления AIV представляет собой кладу 2.3.4.4 или 2.3.2.1, 2.3.2.1d или 2.3.4.4d. В одном варианте осуществления AIV представляет собой кладу 7.2.

[0074] Животные, вакцинированные вакциной или иммуногенной композицией, содержащей НА белок Н5 настоящего изобретения, будут иметь ответ антител только против этого специфического антигена, в то же время отрицательный ответ на другие вирусные компоненты. Еще одним преимуществом настоящего изобретения является то, что он полезен для концепции DIVA со специфическим ELISA для дифференциации животных, инфицированных AIV, и вакцинированных животных.

[0075] В другом аспекте изобретение также относится к наборам, содержащим НА белок Н5 настоящего изобретения, молекулу нуклеиновой кислоты, вектор, клетку или вакцину, или иммуногенную композицию настоящего изобретения. В одном варианте осуществления наборы можно использовать для субъекта, такого как домашняя птица, даже более предпочтительно птица, курица, утка, индейка и тому подобное. В одном варианте осуществления, когда курицу вакцинируют, НА белок Н5, вакцину или иммуногенную композицию по настоящему изобретению можно использовать для вакцинации в 1-й день жизни или позже, на 7-й день жизни или позже, на 10-й день жизни или позже, на 15-й день жизни или позже, или на 21-ый день жизни или позже. В одном варианте осуществления иммуногенную композицию настоящего изобретения вводят с 1-ого дня жизни, с 7-ого дня жизни, с 10-ого дня жизни, с 15-ого дня жизни или с 21-ого дня жизни однократно. В одном варианте осуществления иммуногенную композицию настоящего изобретения вводят с 1-ого дня жизни однократно.

[0076] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение на момент подачи заявки. Значение и объем терминов должны быть ясны; однако в случае любой скрытой двусмысленности определения, приведенные в данном документе, имеют приоритет над любым словарным или поданным в других источниках определением. Кроме того, если иное не требуется контекстом, термины в единственном числе должны включать множественное число, а термины во множественном числе должны включать единственное число. В данном описании использование «или» означает «и/или», если не указано иное. Кроме того, использование термина «включающий», а также других форм, таких как «включает» и «включенный», не является ограничивающим. Все патенты и публикации, упомянутые в данном описании, включены в данное описание посредством ссылки.

[0077] На практике, в соответствии с настоящим изобретением, если не указано иное, будут использоваться обычные методы вирусологии, молекулярной биологии, микробиологии, технологии рекомбинантной ДНК, химии белков и иммунологии, которые находятся в пределах компетенции специалистов в данной области. Такие способы полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, тома I, II и III, второе издание (1989); DNA Cloning, тома I и II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ред. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins ред. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ред. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, В., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); серии Methods In Enzymology (S. Colowick и N. Kaplan ред., Academic Press, Inc.); Protein purification methods a practical approach (E.L.V. Harris и S. Angal, ред., IRL Press at Oxford University Press); и Handbook of Experimental Immunology, тома I-IV (D. M. Weir и С.С.Blackwell ред., 1986, Blackwell Scientific Publications).

[0078] Также следует понимать, что используемая в данном описании терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначена для ограничения. Следует отметить, что, как используется в этом описании и прилагаемой Формуле изобретения, формы единственного числа включают термины и понятия во множественном числе, если содержание явно не указывает иное. Таким образом, например, ссылка на «антиген» включает смесь двух или более антигенов, ссылка на «носитель» включает смеси двух или более носителей и тому подобное.

ПУНКТЫ

[0079] Следующие пункты также описаны в данном описании и части раскрытия настоящего изобретения:

[0080] 1. Иммуногенная композиция, содержащая гемагглютининовый белок вируса птичьего гриппа подтипа Н5, где гемагглютининовый белок содержит:

(а) аминокислотные остатки 120N или 120S, 155N, и 223N или 223S; и

(б) один или несколько аминокислотных остатков, выбранных из группы, состоящей из таких как: 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 136S, 140D, 149S, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981; при этом нумерация касательно аминокислотных остатков такая, как представлено в SEQ ID NO:l

[0081] 2. Иммуногенная композиция по пункту 1, где гемагглютининовый белок содержит:

(а) аминокислотные остатки 61D, 871, 99А, 102А, 110N, 120N, 136S, 140D, 149S, 155N, 156Т, 157Р, 170N, 172Т, 178R, 190V, 191L, 200А, 223N, 226V, 243D, 268Y, 279А и 2981;

(б) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6; или

(в) аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

[0082] 3. Иммуногенная композиция по пунктам 1 или 2, где гемагглютининовый белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 6.

[0083] 4. Иммуногенная композиция по пунктам 1 или 2, где гемагглютининовый белок содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 5.

[0084] 5. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 14, где гемагглютининовый белок содержится в клеточной культуре, и клеточную культуру получают путем культивирования клеток, содержащих вектор экспрессии, способный экспрессировать гемагглютининовый белок, как описано в любом из пунктов 1-4.

[0085] 6. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1 - 5, в которой вектор экспрессии содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую гемагглютининовый белок, как описано в любом из пунктов 1-4.

[0086] 7. Иммуногенная композиция по положению 6, в которой молекула нуклеиновой кислоты представлена в SEQ ID NO: 10.

[0087] 8. Иммуногенная композиция по положению 6, в которой молекула нуклеиновой кислоты представлена в SEQ ID NO: 11.

[0088] 9. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 5-8, в которой вектор экспрессии представляет собой бакуловирус, и клетки представляют собой клетки насекомых.

[0089] 10. Иммуногенная композиция по пунктам 5-9, в которой клеточную культуру подвергают стадии инактивации, предпочтительно стадии инактивации бинарным этиленимином.

[0090] 11. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 5-10, где иммуногенная композиция содержит часть или всю клеточную культуру.

[0091] 12. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-11, где иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант.

[0092] 13. Иммуногенная композиция по пункту 12, в которой адъювант представляет собой эмульсию вода-в-масле.

[0093] 14. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1 - 13, где иммуногенную композицию вводят однократным или многократным введением; и/или

иммуногенную композицию вводят подкожно или внутримышечно; и/или иммуногенную композицию следует вводить животному в 1-ый день жизни или старше, на 7-ой день жизни или старше, на 10-ый день жизни или старше, на 15-ый день жизни или старше, или на 21-ый день жизни или старше.

[0094] 15. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-14, где иммуногенную композицию следует вводить животному в 1-ый день жизни или старше, на 7-ой день жизни или старше, на 10-ый день жизни или старше, на 15-ый день жизни или старше, или на 21-ый день жизни или старше.

[0095] 16. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1 - 14, где иммуногенную композицию следует вводить животному с 21-ого дня жизни.

[0096] 17. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-14, где иммуногенную композицию следует вводить животному с 15-ого дня жизни.

[0097] 18. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-14, где иммуногенную композицию следует вводить животному с 7-ого дня жизни.

[0098] 19. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-14, где иммуногенную композицию следует вводить животному с 1-ого дня жизни.

[0099] 20. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-14, где иммуногенную композицию следует вводить животному с 1-ого дня жизни.

[00100] 21. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа, предпочтительно H5Nx, более предпочтительно одним или несколькими из H5N1, H5N2 и H5N6.

[00101] 22. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5N1 вирусом птичьего гриппа.

[00102] 23. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5N2 вирусом птичьего гриппа.

[00103] 24. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5N6 вирусом птичьего гриппа.

[00104] 25. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2, предпочтительно клады 2.3 и более предпочтительно клад 2.3.4 или 2.3.2.

[00105] 26. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.

[00106] 27. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.

[00107] 28. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.4.

[00108] 29. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.4.4.

[00109] 30. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.4.4d.

[00110] 31. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.2.

[00111] 32. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.2.1.

[00112] 33. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 2.3.2.1d.

[00113] 34. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-20 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных H5Nx вирусом птичьего гриппа клады 7.2.

[00114] 35. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-34, где иммуногенную композицию вводят однократным введением.

[00115] 36. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-34, где иммуногенную композицию вводят в виде однократной дозы и где указанная однократная доза является эффективной в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа.

[00116] 37. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-34, где иммуногенную композицию вводят в виде однократной дозы и где указанная однократная доза является эффективной в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных одним или несколькими из H5N1, H5N2 и H5N6.

[00117] 38. Иммуногенная композиция по любому из пунктов 1-34, где иммуногенную композицию вводят в виде однократной дозы и где указанная однократная доза является эффективной в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных любым из H5Nx, как описано в положениях 22 - 34.

[00118] 39. Способ дифференциации животных, естественно инфицированных вирусом птичьего гриппа, от животных, вакцинированных иммуногенной композицией по любому из пунктов 1-13, включающий: (а) анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который не присутствует в иммуногенной композиции, но присутствует у естественно инфицированного животного, где иммунный анализ представляет собой иммуноферментный анализ или твердофазный иммуноферментный анализ,

(б) определение того, является ли образец положительным или отрицательным по маркеру птичьего гриппа, и

(в) корреляцию результатов анализа со статусом тестируемого животного, где животное, положительное по маркеру птичьего гриппа, является естественно инфицированным животным, а животное, которое отрицательно по маркеру птичьего гриппа, является животным, вакцинированным иммуногенной композицией по любому из пунктов 1 - 13.

[00119] 40. Способ дифференциации животных, естественно инфицированных вирусом птичьего гриппа, от животных, вакцинированных иммуногенной композицией по любому из пунктов 1-13, включающий:

(а) анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который является специфичным для иммуногенной композиции, но не присутствует у естественно инфицированного животного, где иммунный анализ представляет собой иммуноферментный анализ или твердофазный иммуноферментный анализ,

(б) определение того, является ли образец положительным или отрицательным по маркеру птичьего гриппа, и

(в) корреляцию результатов анализа со статусом тестируемого животного, где животное, положительное по маркеру птичьего гриппа, является животным, вакцинированным иммуногенной композицией по любому из пунктов 1 - 13.

ОБЗОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[00120] Следующие последовательности подробно описаны и раскрыты в настоящем изобретении:

[00121] SEQ ID NO: 1: Аминокислотная последовательность НА белка штамма утка/Китай/Е319-2/03, которая не содержит сигнального пептида на N-конце.

[00122] SEQ ID NO: 2: Аминокислотная последовательность H5Con1.

[00123] SEQ ID NO: 3: Аминокислотная последовательность H5Con3.

[00124] SEQ ID NO: 4: Аминокислотная последовательность H5Con5.

[00125] SEQ ID NO: 5: Аминокислотная последовательность H5Con5Mut.

[00126] SEQ ID NO: 6: Аминокислотная последовательность от положения 60 до 300 H5Con5Mut.

[00127] SEQ ID NO: 7: Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con1.

[00128] SEQ ID NO: 8: Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con3.

[00129] SEQ ID NO: 9: Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con5.

[00130] SEQ ID NO: 10: Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5ConMut.

[00131] SEQ ID NO: 11: Оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислотную последовательность от положения 60 до 300 H5Con5Mut.

КОРОТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[00132] Следующие ниже рисунки составляют часть настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации определенных аспектов настоящего изобретения. Изобретение можно лучше понять, если обратиться к одному или нескольким из этих рисунков в сочетании с подробным описанием конкретных вариантов осуществления, представленных в данном документе.

[00133] Фигура 1: HSConl последовательность была создана последовательным методом из 444 последовательностей, выделенных с 1996 по 2012 год.

[00134] Фигура 2: H5Con3 последовательность была создана с помощью одного цикла метода из 297 последовательностей конкретных клад, выделенных с 1996 по 2012 год.

[00135] Фигура 3: H5Con5 последовательность была создана с помощью одноциклового способа из 196 последовательностей, выделенных с 2005 по 2012 год.

[00136] Фигура 4: Конструирование плазмиды переноса pVL1393-H5Con5Mut.

ПРИМЕРЫ

[00137] Следующие примеры включены, чтобы дополнительно проиллюстрировать изобретение, описанное в данном документе, и продемонстрировать варианты осуществления настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что способы, раскрытые в примерах, которые следуют ниже, представляют способы, обнаруженные изобретателями для хорошего функционирования в практике настоящего изобретения, и, таким образом, могут рассматриваться как составляющие способы его применения. Однако специалисты в данной области техники должны, в свете настоящего раскрытия, принять во внимание, что многие изменения могут быть внесены в конкретные раскрытые варианты осуществления и все же получить подобный или аналогичный результат, который находится в пределах сущности и объема настоящего изобретения.

[00138] Пример 1: Создание НА Н5 консенсусных аминокислотных последовательностей и их мутантов

[00139] Создание НА консенсусной аминокислотной последовательности 1 гриппа H5N1

[00140] Для создания НА консенсусной аминокислотной последовательности 1 гриппа H5N1 (H5Con1) были собраны и проанализированы 444 НА аминокислотные последовательности вируса гриппа H5N1, выделенные в Китае с 1996 по 2012 год. 444 НА аминокислотные последовательности включают кладу 0, кладу 2.2, кладу 2.3.2, кладу 2.3.2.1, кладу 2.3.4, кладу 2.4, кладу 2.5, кладу 3, кладу 4, кладу 5, кладу 6, кладу 7 и кладу 9. На Фигуре 1 показан последовательный метод генерирования Н5Соп1 из 444 аминокислотных последовательностей, выделенных с 1996 по 2012 год. Во-первых, были сгенерированы 13 консенсусных аминокислотных последовательностей уровня 1, и каждый уровень представляет собой отдельную кладу с использованием (1) 36 последовательностей клады 0; (2) 31 последовательности клады 2.2; (3) 8 последовательностей клады 2.3.2; (4) 49 последовательностей клады 2.3.2.1, (5) 2 последовательностей клады 2.3.3; (6) 210 последовательностей клады 2.3.4; (7) 18 последовательностей клады 2.4; (8) 6 последовательностей клады 2,5; (9) 9 последовательностей клады 3; (10) 5 последовательностей клады 4; (11) 8 последовательностей клады 5; (12) 3 последовательностей клады 6; (13) 34 последовательностей клады 7; и (14) 21 последовательностей клады 9. Конечная консенсусная аминокислотная последовательность представляет собой консенсусную аминокислотную последовательность уровня 2, которая была получена путем выравнивания и анализа всех 13 консенсусных аминокислотных последовательностей уровня 1 с помощью программного обеспечения MEGA 5.0. Эта конечная консенсусная аминокислотная последовательность была обозначена как H5Conl (SEQ ID NO: 2).

[00141] Создание НА консенсусной аминокислотной последовательности 3 гриппа H5N1

[00142] Для создания НА консенсусной аминокислотной последовательности 3 гриппа H5N1 (H5Con3) были собраны и проанализированы 297 НА аминокислотных последовательностей гриппа H5N1, выделенных в Китае с 1996 по 2012 год. Указанные 297 НА аминокислотных последовательностей состоят только из определенных клад, т.е. клады 2.3.2.1, клады 2.3.4 и клады 7. На Фигуре 2 показан одноцикловой способ генерации H5Con3 из 297 аминокислотных последовательностей конкретных клад, выделенных с 1996 по 2012 год. Окончательная консенсусная аминокислотная последовательность была получена путем выравнивания и анализа (1) 49 последовательностей клады 2.3.2.1, (2) 214 последовательностей клады 2.3.4; и (3) 34 последовательностей клады 7 с программным обеспечением MEGA 5.0. Эта конечная консенсусная аминокислотная последовательность была обозначена как H5Con3 (SEQ ID NO: 3).

[00143] Создание НА консенсусной аминокислотной последовательности 5 гриппа H5N1

[00144] Для создания НА консенсусной аминокислотной последовательности 5 вируса гриппа H5N1 (H5Con5) были собраны и проанализированы 196 НА аминокислотных последовательностей вируса гриппа H5N1, выделенных в Китае с 2005 по 2012 год. Указанные 196 НА аминокислотных последовательностей взяты из клад 0, 2.2, 2.3.1, 2.3.2, 2.3.2.1, 2.3.4, 2.4, 7 и 9. На Фигуре 3 показан одноцикловой способ генерации H5Con5 из 196 аминокислотных последовательностей, выделенных с 2005 по 2012 год. Всего 196 аминокислотных последовательностей были выровнены одновременно с помощью программы MEGA 5.0. Конечная консенсусная аминокислотная последовательность была обозначена как H5Con5 (SEQ ID NO: 4).

[00145] Стратегии создания Н5Соп1, H5Con3 и H5Con5 суммированы в Таблице 1.

[00147] Создание мутанта НА консенсусной аминокислотной последовательности 5 вируса гриппа H5N1

[00148] Для создания мутанта НА консенсусной аминокислотной последовательности 5 вируса гриппа H5N1 (H5Con5Mut) в аминокислотную последовательность Н5Соп5 были введены две аминокислотные мутации. В положениях аминокислот 120 и 223 оба серина (S) были изменены на аспарагины (N), то есть S120N и S223N. Аминокислотная последовательность H5Con5Mut показана в SEQ ID NO: 5.

[00149] Анализ H5Conl, H5Con3 и H5Con5

[00150] В Таблице 2 показан процент идентичности консенсусных аминокислотных последовательностей H5Con1, H5Con3 и H5Con5 и последовательностей из преобладающих клад. В Таблице 3 также показано использование аминокислот каждой из консенсусных аминокислотных последовательностей H5Con1, H5Con3 и H5Con5 в некоторых предсказанных антигенных сайтах НА белка Н5.

[00153] Из Таблиц 2 и 3 видно, что H5Con1, H5Con3 и H5Con5 отличаются по аминокислотным последовательностям по сравнению с последовательностями из каждой из преобладающих клад, а также имеют некоторые аминокислотные изменения в антигенных сайтах среди трех различных преобладающих клад.

[00154] Пример 2: Оптимизация последовательностей нуклеиновых кислот H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut, создание рекомбинантных систем экспрессии бакуловирусов и экспрессия H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut в клетках насекомых

[00155] Оптимизация последовательностей нуклеиновых кислот H5Con1, H5Con3. H5Con5 и H5Con5Mut

[00156] Чтобы оптимизировать для лучшей экспрессии, каждая из аминокислотных последовательностей HSConl, H5Con3 и H5Con5, как идентифицировано в Примере 1, была обратно выведена в соответствующую последовательность нуклеиновой кислоты с помощью программного обеспечения Vector NTI и оптимизирована для экспрессии в клетках насекомых системы экспрессии бакуловирусов (Allele Biotechnology, CAT ABP-BVP-10002). Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con1, H5Con3 и H5Con5 были синтезированы GenScript (GenScript, NJ, США). Указанные оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con1, H5Con3 и H5Con5 показаны в SEQ ID NO: 7-9 соответственно. Оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты H5Con5Mut была создана с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза (QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit, № по каталогу 200518, Agilent) на основе оптимизированной последовательности нуклеиновой кислоты Н5Соп5. Оптимизированная последовательность нуклеиновой кислоты H5ConMut представлена в SEQ ID NO: 10.

[00157] Конструкция рекомбинантных систем экспрессии бакуловирусов и экспрессия H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut в клетках насекомых.

[00158] Каждую из оптимизированных последовательностей нуклеиновых кислот H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut, как описано выше, вставляли в вектор переноса системы экспрессии бакуловируса pVL1393, который был включен в набор Sapphire™ Baculovirus DNA and Transfection Kit (Allele Biotechnology, CAT ABP-BVD-10002), чтобы получить плазмиды для переноса, обозначенные как pVL1393-H5Conl, PVL1393-H5Con3, PVL1393-H5Con5 и pVL1393-H5Con5Mut, соответственно. На Фигуре 4 в качестве примера показана конструкция плазмиды для переноса pVL1393-H5Con5Mut.

[00159] Каждую из pVL1393-H5Conl, PVL1393-H5Con3, PVL1393-H5Con5 и pVL1393-H5Con5Mut затем котрансфицировали линеаризованной ДНК бакуловируса Sapphire™ дикого типа (Sapphire™ Baculovirus DNA and Transfection Kit; Allele Biotechnology, CAT ABP-BVD-10002) в клетки насекомых sf9 (Invitrogen, Cat # B825-01, Lot #1030672), таким образом, чтобы получить выделенные рекомбинантные бакуловирусы. Указанные рекомбинантные бакуловирусы, содержащие оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut, были обозначены как rBacH5Conl, rBacH5Con3, rBacH5Con5 и rBacH5Con5Mut, соответственно. И были получены трансфицированные клетки sf9, содержащие каждый из рекомбинантных бакуловирусов.

[00160] Трансфицированные клетки sf9, полученные выше, культивировали при 27°С в инкубаторе в течение четырех дней и собирали супернатант клеточной культуры. Чтобы получить чистый рекомбинантный вирус, собранный супернатант затем подвергали клонированию с помощью метода бляшкообразования. Было проведено три цикла клонирования с помощью метода бляшкообразования, и вирусные бляшки, содержащие rBacH5Con1, rBacH5Con3, rBacH5Con5 и rBacH5Con5Mut, соответственно, были собраны после третьего цикла клонирования с помощью метода бляшкообразования, таким образом, чтобы получить очищенные rBacH5Conl, rBacHSConl, rBacH5Con3, rBacH5Con3, rBacH5Con3 и rBacH5Con5.

[00161] Каждый из указанных выше очищенных rBacHSCon1, rBacH3Con3, rBacH5Con5 и rBacH5Con5Mut был дополнительно размножен в суспензионной культуре клеток линии SF+клеток насекомых (бессывороточная среда Ex-CELL® 420 для клеток насекомых, Sigma-Aldrich, Cat. 14420С) во встряхиваемых колбах. Вкратце, клетки SF+(Protein Sciences Corporation, Meriden, СТ) высевали во встряхиваемую колбу при плотности 106 клеток/мл, и каждый из указанных выше очищенных rBacH5Conl, rBacH5Con3, rBacH5Con5 и rBacH5Con5Mut был инокулирован в клетки SF+(Protein Sciences, Inc., Meriden, СТ) с показателем множественности заражения от MOI=0,01 до MOI=1. Инокулированные клетки SF+культивировали в среде EX-CELL 420 при 27°С при скорости встряхивания 80-120 об./мин. в течение 3-7 дней, и для следующей стадии собирали суспензии клеточных культур, содержащие экспрессированные H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut, соответственно. Собранные суспензии клеточных культур содержали количество клеток в интервале 0,5-1,5×10⁶ клеток/мл.

[00162] Пример 3: Определение HATJ суспензий клеточных культур

[00163] HAU суспензий клеточных культур, содержащих Н5Соп1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut, соответственно, исследовали с помощью анализа гемагглютинации (см. OIE Terrestrial Manual 2015, глава 2.3.1 & 2.3.2, Avian Influenza (заражение вирусами птичьего гриппа)) с методом двухкратного серийного разведения. Вкратце, 10 мл эритроцитов (от завода Southern Regent Plant, провинция Чжэцзян) центрифугировали при 500 об./мин. в течение 20 мин, и 1 объем 4% центрифугированных эритроцитов добавляли к 3 объемам ФСБ для получения 1% эритроцитов. 25 мкл ФСБ вносили в лунки с 1 по 11 лунку 96-луночного планшета. 25 мкл каждой из суспензий клеточных культур добавляли в лунку 1-лунку 11, а затем подвергали серийному разведению от 1:2 до 1:2048 раз. Во все лунки добавляли 25 мкл 1% эритроцитов и инкубировали при комнатной температуре в течение примерно 40 минут.

[00164] Отрицательные лунки выглядели как точки в центре лунок, а положительные результаты образовывали однородный красноватый цвет по всей лунке. Конечная точка разбавления соответствует наибольшему разбавлению образца, приводящему к полной агглютинации эритроцитов. Результаты показали, что HAU суспензий клеточных культур HSConl, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut было больше, чем 71,1 HAU/25 мкл (что соответствует 256 HAU/90 мкл или 256 HAU/дозу).

[00165] Пример 4: Получение иммуногенных композиций

[00166] Собранные суспензии клеточных культур с HAU более 256/дозу дополнительно подвергали обработке бинарным этиленимином (BEI) путем добавления 10 мМ раствора BEI при 37°С в течение 72 часов, чтобы инактивировать инфекционность бакуловируса. Затем добавляли 10 мМ раствор тиосульфата натрия при 4°С для нейтрализации остатка BEI.

[00167] После инактивации HAU суспензий клеточных культур снова оценивали, и суспензии инактивированных клеточных культур с HAU более 256 на дозу применяли в качестве активного антигенного ингредиента для использования в следующей процедуре эмульгирования с адъювантами.

[00168] Иммуногенные композиции HSConl, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut были приготовлены в виде эмульсий вода-в-масле. Вкратце, эмульсии вода-в-масле представляют собой двухфазные системы, состоящие из непрерывной масляной фазы и диспергированной водной фазы, при этом водная фаза диспергирована в виде небольших капель в масляной фазе. Масляная фаза, используемая для получения иммуногенной композиции, представляла собой коммерчески доступный адъювант MONTANIDETM ISA 71R VG (производства Seppic Inc, №по каталогу 365187), в то время как водная фаза содержала каждую из суспензий инактивированных клеточных культур HSConl, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut. Для каждой дозы (0,3 мл) иммуногенной композиции примерно 3 части водной фазы (90 мкл) добавляли примерно к 7 частям масляной фазы (210 мкл) и диспергировали при низкой скорости сдвига (примерно 11000 об./мин. в течение 1 минуты) при комнатной температуре, а затем при высокой скорости сдвига 16000 об./мин. в течение 2 минут на бане лед-вода. Диспергатор Miccra (диспергатор, каталожный номер Miccra D-9, диспергаторная головка, каталожный номер DS-14/P) использовали для приготовления эмульсий вода-в-масле. Для каждой иммуногенной композиции H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut количество HSCon1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut составляло не менее 256 HAU/дозу.

[00169] Пример 5: Испытания на перекрестную реактивность и выбор для H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut

[00170] Куриные яйца с развивающимся эмбрионом SPF были приобретены в SPAFAS Jinan. После вылупления цыплят SPF случайным образом отбирали и содержали в специальных изоляторах. В испытаниях на перекрестную реактивность H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut, для оценки испытаний реактивности H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut использовали от Re-4 до Re-8 и 03Н5 (MutK+).

[00171] Re-4 - Re-8 представляют собой инактивированные вакцины цельного AIV (подтип Н5) против клад 7.2, 2.3.4, 2.3.2.1, 7.2 и 2.3.4.4, соответственно, и они являются коммерческими продуктами от Harbin Weike Biotechnology. Development Co., Ltd. 03H5 (MutK+) представляет собой НА белок, экспрессируемый бакуловирусом из штамма А/утка/Китай/ЕЗ 19-2/03, в дополнение со следующими заменами аминокислот: S120N, D150N, S223N и дополнительным К328 (см. WO2013024113Al). 03Н5 (MutK+) формулировали в иммуногенную композицию с использованием тех же методов, что и H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut.

[00172] Десять специальных свободных от патогенов (SPF) цыплят в возрасте 10 дней вакцинировали одной дозой (0,3 мл) вышеуказанных композиций от Re-4 до Re-8 и иммуногенной композиции, соответственно, посредством подкожной инъекции. Вакцинированные цыплята постоянно содержались в изоляторах. Образцы сыворотки отдельных цыплят собирали перед вакцинацией, через две недели после вакцинации и через три недели после вакцинации. Кроме того, образцы сыворотки, приготовленные из пула из 10 цыплят одной вакцинированной группы, были протестированы для определения перекрестной HI-реактивности H5Con1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut с помощью анализа ингибирования гемагглютинация (HI) (см. OIE Terrestrial Manual 2015, глава 2.3.4, Avian Influenza (заражение вирусами птичьего гриппа). В анализе HI оценивали перекрестную реактивность HSConl, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut с 6 различными кладами (rBac03H5 представляет кладу 2.3.2, Re4 представляет кладу 7.2, Re5 представляет кладу 2.3.4, Re6 представляет кладу 2.3.2.1, Re7 представляет кладу 7.2, a Re8 представляет кладу 2.3.4.4.) антигенов.

[00173] Показатели перекрестной HI-реактивности Re-4 - Re-8, 03Н5 (MutK+), HSCon1, H5Con3, H5Con5 и H5Con5Mut показаны в Таблице 4. В Таблице 4 «+» означает количество гетерологичных антигенов, полученных из разных клад, на которые тестируемые сыворотки могут перекрестно реагировать. Сыворотки с оценкой «++++» продемонстрировали перекрестную реактивность с 4 различными кладами, сыворотки с оценкой «+++» продемонстрировали перекрестную реактивность с 3 разными кладами, сыворотки с оценкой «++» продемонстрировали перекрестную реактивность с 2 различными кладами, а иммунные сыворотки с оценкой «+» продемонстрировали перекрестную реактивность только с 1 кладой. Оценка от «+» до «++++» указывает на более широкую перекрестную реактивность. Антигены, дающие оценку «++++», были выбраны для следующих экспериментов.

[00175] На основании результатов перекрестной реактивности можно определить, что H5Con5Mut имеет более широкую перекрестную реактивность.

[00176] Пример 6: Исследования на выявление вирусов и эффективность защиты

[00177] Эффективность защиты 03H5MutK+(клада 2.3.2), H5Con3 и H5Con5Mut была дополнительно протестирована в этом примере. В исследованиях эффективности защиты оценивали Re6+7+8, 03H5MutK+(клада 2.3.2), H5Con3 и H5Con5Mut. Re6+7+8 представляет собой трехвалентную вакцину против клады 2.3.2.1, клады 7.2 и клады 2.3.4.4 (смесь Re6+Re7+Re8), приобретенная у Harbin Weike Biotechnology Development Co., Ltd. Re6+7+8 использовалась в качестве вакцины положительного контроля для эффективности защиты против каждой клады контрольного вируса. Были приготовлены исходные смеси трех различных клад вирусов высокопатогенного птичьего гриппа (HPAI) H5Nx, которые использовали для контрольных испытаний: 1) штамм 383 (клада 2.3.2.1), 2) штамм 14079 (клада 2.3.4.4) и 3) штамм 13147 (клада 7.2). SPF-цыплят вакцинировали подкожным путем в возрасте 21 дня одной дозой (0,3 мл) Re6+7+8 и иммуногенной композицией, содержащей 03H5MutK+(клада 2.3.2), Н5СопЗ и H5Con5Mut, каждая со сравнимыми HAU по крайн й мере 256/дозу, соответственно. Вакцинированных цыплят содержали в помещениях ABSL3 (уровень биологической безопасности животных 3).

[00178] Через три недели (21 день) после вакцинации цыплят заражали с помощью носовых капель одним из трех контрольных вирусов H5Nx на испытание. Доза контрольного заражения для каждого цыпленка составляла 6Logi₁₀EID50 (EID50=50% доз для заражения эмбрионов, что означает количество инфекционного вируса, вызывающего инфекцию у 50% инокулированных яиц с эмбрионами). За цыплятами наблюдали в течение двух недель после заражения, и ежедневно регистрировали смертность и заболеваемость цыплят. Мазки ватными тампонами трахеи и клоаки каждого цыпленка собирали через 3, 5 и 7 дней после заражения. Выделение вируса исследовали с помощью образцов на ватных тампонах путем выделения вируса на основе куриных эмбрионов.

[00179] Оценка эффективности защиты от каждого заражающего вируса была основана на следующих критериях: 1) выживут ли 100% вакцинированных цыплят в течение двухнедельного периода мониторинга (0% смертность).

[00180] Было проведено три испытания вакцинации/заражения на животных, и в Таблице 5 показана эффективность защиты Re6+7+8, 03H5MutK+(клада 2.3.2), H5Con3 и H5Con5Mut.

[00182] Было показано, что цыплята, вакцинированные иммуногенной композицией, содержащей H5Con5Mut, продемонстрировали 100% защиту при заражении HPAI вирусами клады 2.3.4.4, клады 2.3.2.1 и клады 7.2. То есть, по сравнению с обычными вакцинами, такими как смесь Re6+Re7+Re8, иммуногенная композиция, содержащая H5Con5Mut per se, обеспечивала превосходную и более широкую защиту от трех разных клад AIV одновременно.

[00183] Пример 7: Исследования эффективности защиты от различных HPAI подтипов Н5

[00184] Эффективность защиты H5Con5Mut от различных HPAI подтипов Н5 была дополнительно протестирована в этом примере.

[00185] Группы 1а - 5а были определены как группы иммунизации, которым вводили H5Con5Mut, а группы lb - 5b были определены как контрольные группы, которым проводилось только заражение HPAI. В каждой группе было по 12 10-дневных цыплят SPF. В день испытания (D0) цыплят в группах 1а - 5а вакцинировали подкожным путем одной дозой (0,3 мл) иммуногенной композиции, содержащей H5Con5Mut. Через 21 день после иммунизации (дпи) цыплят во всех группах заражали интраназально различными HPAI подтипов Н5, и доза заражения составляла 6Log₁₀EID₅₀/200 мкл/цыпленка. В течение 14 дней после заражения заболеваемость и смертность цыплят в каждой группе рассчитывались ежедневно.

[00186] Клинические симптомы HAPI включают плохое настроение, неровное оперение, значительно сниженный аппетит, кашель, выделения из носа и глаз, отек лицевой части головы, цианоз, диарею, неврологические симптомы. Появление по крайней мере этих клинических симптомов использовалось для расчета заболеваемости. Смертность рассчитывали путем подсчета мертвых цыплят. % защиты рассчитывали путем деления количества защищенных цыплят на общее количество исследованных цыплят.

[00187] HPAI подтипов Н5, использованные для заражения, были следующими:

Контрольные штаммы были получены из Южно-Китайского сельскохозяйственного университета, Ушань-роуд, район Тяньхэ, Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай, и являются репрезентативными изолятами H5N1 (Клады 2.3.3.1 (d) и 2.3.4.4), H5N2 (Клада 7.2) и H5N6 (Клада 2.3.4.4 (d)), описанными выше.

[00188] Наблюдаемая эффективность защиты H5Con5Mut от различных AIV подтипов Н5 суммирована в Таблице 6.

[00190] В Таблице 6 показало, что в каждой контрольной группе заражение на 21 день после иммунизации было эффективным, поскольку в течение 14 недель после заражения наблюдалась 100% смертность, а группа H5Con5Mut продемонстрировала 100% защиту, когда цыплята были заражены H5N1, H5N2 и H5N6. Данные продемонстрировали, что H5Con5Mut обеспечивает превосходную и более широкую эффективность защиты от различных HPAI подтипов Н5.

[00191] Пример 8: Исследования начала защиты H5Con5Mut

[00192] Начало защиты H5Con5Mut от заражения HPAI дополнительно исследовали в данном примере.

[00193] Группы 1а и 2а были определены как группы иммунизации, которым вводили H5Con5Mut, а группы lb и 2b были определены как контрольные группы, которым проводилось только заражение HPAI (штамм 14079). Каждая группа состояла из 12 10-дневных цыплят SPF, и испытания повторяли дважды. В день испытания (DO) цыплят в группах 1а и 2а вакцинировали подкожным путем одной дозой (0,3 мл) иммуногенной композиции, содержащей H5Con5Mut. Через 7 дней после иммунизации (дпи) цыплят в группах 1а и lb интраназально заражали штаммом 14079. Через 14 дней после иммунизации (дпи) цыплят в группах 2а и 2b интраназально заражали штаммом 14079. Доза контрольного заражения составляла 6Log₁₀EID₅₀/200 мкл/цыпленка. В течение 14 дней после заражения заболеваемость и смертность цыплят в каждой группе рассчитывались ежедневно. Наблюдаемое начало защиты H5Con5Mut суммировано в Таблице 7.

[00195] В Таблице 7 показано, что H5Con5Mut индуцировал защиту уже на 7 день после иммунизации, со 100% защитой на 14 день после иммунизации. Данные продемонстрировали, что H5Con5Mut обеспечивает быструю и раннюю защиту от заражения HPAI.

[00196] Пример 9: Исследования продолжительности защиты H5Con5Mut

[00197] Продолжительность защиты H5Con5Mut от заражения HPAI дополнительно исследовали в данном примере.

[00198] Группы 1-3 были определены как группы иммунизации, которым вводили H5Con5Mut, и группа 4 была определена как контрольная группа, которой проводилось только заражение HPAI (штамм 14079). Каждая группа состояла из 12 10-дневных цыплят SPF, и эксперименты проводили дважды. В день испытания (D0) цыплят в группах 1-3 вакцинировали подкожным путем одной дозой (0,3 мл) иммуногенной композиции, содержащей H5Con5Mut. Через 28 дней после иммунизации (дпи), 35 дпи и 42 дпи цыплятам в группах 1-3 интраназально вводили штамм 14079, соответственно. В контрольной группе цыплятам интраназально вводили штамм 14079 через 28 дней после иммунизации. Доза контрольного заражения составляла 6Log₁₀EID₅₀/200 мкл/цыпленка. В течение 14 дней после заражения заболеваемость и смертность цыплят в каждой группе рассчитывались ежедневно. Наблюдаемая продолжительность защиты H5Con5Mut суммирована в Таблице 8.

[00200] В Таблице 8 показано, что H5Con5Mut обеспечивает 100% защиту с продолжительностью не менее 42 дней после иммунизации. Данные показали, что H5Con5Mut обеспечивает длительную и эффективную защиту от HPAI.

[00201] Пример 10: Исследование защиты на цыплятах разного возраста

[00202] Защиту H5Con5Mut на цыплятах разного возраста от заражения HPAI дополнительно исследовали в данном примере.

[00203] Группы 1-2 были определены как группы иммунизации, которым вводили H5Con5Mut, и группа 3 была определена как контрольная группа, в которой проводилось только заражение HPAI (штамм 14079). Каждая группа состояла из 12 цыплят SPF, и эксперименты проводили дважды. В группе 1 цыплят в возрасте 1 дня вакцинировали подкожным путем одной дозой (0,3 мл) иммуногенной композиции, содержащей H5Con5Mut. В группе 2 цыплят в возрасте 10 дней вакцинировали подкожным путем одной дозой (0,3 мл) иммуногенной композиции, содержащей H5Con5Mut. Через 21 день после иммунизации цыплятам в группах 1-3 интраназально вводили штамм 14079, соответственно. Доза контрольного заражения составляла 6Log₁₀EID₅₀/200 мкл/цыпленка. В течение 14 дней после заражения заболеваемость и смертность цыплят в каждой группе рассчитывались ежедневно. Наблюдаемая защита H5Con5Mut у цыплят разного возраста суммирована в Таблице 9.

[00205] В Таблице 9 показано, что H5Con5Mut обеспечивает 100% защиту однодневных цыплят от заражения HPAI. Данные показали, что H5Con5Mut обеспечивает превосходную защиту цыплят даже у только что вылупившихся.

[00206] Пример 11: Исследование защиты при различных способах введения

[00207] Защиту цыплят с помощью H5Con5Mut при различных способах введения дополнительно исследовали в данном примере.

[00208] Группы 1-2 были определены как группы иммунизации, которым вводили H5Con5Mut, а группа 3 была определена как контрольная группа, которой проводилось только заражение HPAI (штамм 14079). Каждая группа состояла из 12 10-дневных цыплят SPF, и эксперименты проводили дважды. В день испытания (D0) цыплят в группах 1-2 вакцинировали подкожным путем одной дозой (0,3 мл) иммуногенной композиции, содержащей H5Con5Mut, путем подкожного (S.C.) или внутримышечного (I.M.) введения. Через 21 дней после вакцинации цыплятам в группах 1-3 интраназально вводили штамм 14079, соответственно. Доза контрольного заражения составляла 6Log₁₀EID₅₀/200 мкл/ цыпленка. В течение 14 дней после заражения заболеваемость и смертность цыплят в каждой группе рассчитывались ежедневно. Наблюдаемая защита H5Con5Mut у цыплят при различных путях введения суммирована в Таблице 10.

[00210] В Таблице 10 показано, что H5Con5Mut обеспечивает превосходную защиту цыплят как при подкожном введении S.C., так и при внутримышечном введении, а эффективность защиты H5Con5Mut не ограничивается определенным путем введения. Гибкий способ введения позволил H5Con5Mut быть подходящим для цыплят с разным статусом роста, таким как только что вылупившиеся с небольшой мускулатурой.

[00211] Все композиции и способы, раскрытые и заявленные в данном документе, могут быть созданы и выполнены без излишнего экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Несмотря на то, что композиции и способы настоящего изобретения были описаны с помощью иллюстративных вариантов осуществления, специалистам в данной области техники будет очевидно, что варианты могут быть применены к композициям и способам, а также на стадиях или в последовательности стадий способа, описанного в данном описании, не отходя от концепции, сущности и объема настоящего изобретения. Более конкретно, будет очевидно, что определенные агенты, которые являются как химически, так и физиологически родственными, могут быть заменены агентами, описанными в данном документе, при этом могут быть достигнуты такие же или аналогичные результаты. Все такие аналогичные замены и модификации, очевидные для специалистов в данной области техники, считаются находящимися в пределах сущности, объема и концепции настоящего изобретения, как определено следующей формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БЁРИНГЕР ИНГЕЛЬХАЙМ ВЕТМЕДИКА ГМБХ

<130> P19-0002-WO-2

<160> 11

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 551

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность белка НА штамма

duck/China/E319-2/03, но без сигнального пептида N-конца.

<400> 1

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

1 5 10 15

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

35 40 45

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

100 105 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

115 120 125

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Ser Ser Ser Phe Phe

130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile

145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

165 170 175

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln

180 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

195 200 205

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

210 215 220

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

245 250 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

260 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

275 280 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

305 310 315 320

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

325 330 335

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

340 345 350

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

355 360 365

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

370 375 380

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

385 390 395 400

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

405 410 415

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu

420 425 430

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr

435 440 445

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn

450 455 460

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser

465 470 475 480

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

485 490 495

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr

500 505 510

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu

515 520 525

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

530 535 540

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

545 550

<210> 2

<211> 552

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность H5Con1 (без сигнального

пептида)

<400> 2

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

1 5 10 15

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

20 25 30

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

35 40 45

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

65 70 75 80

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

85 90 95

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

100 105 110

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

115 120 125

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe

130 135 140

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Ala Tyr Pro Thr Ile

145 150 155 160

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

165 170 175

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

180 185 190

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

195 200 205

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

210 215 220

Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

225 230 235 240

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

245 250 255

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly

260 265 270

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile Asn Ser Ser

275 280 285

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

290 295 300

Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

305 310 315 320

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

325 330 335

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

340 345 350

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

355 360 365

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

370 375 380

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

385 390 395 400

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

405 410 415

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

420 425 430

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

435 440 445

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

450 455 460

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

465 470 475 480

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

485 490 495

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

500 505 510

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

515 520 525

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

530 535 540

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

545 550

<210> 3

<211> 568

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность H5Con3

<400> 3

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

130 135 140

Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Asn Pro Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Glu Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 4

<211> 567

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность H5Con5

<400> 4

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Asn Pro Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala

340 345 350

Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly

355 360 365

Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu

370 375 380

Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile

385 390 395 400

Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn

405 410 415

Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly

420 425 430

Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu

435 440 445

Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr

450 455 460

Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn

465 470 475 480

Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser

485 490 495

Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg

500 505 510

Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr

515 520 525

Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu

530 535 540

Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser

545 550 555 560

Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 5

<211> 568

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность Con5Mut

<400> 5

Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser

1 5 10 15

Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val

20 25 30

Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile

35 40 45

Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys

50 55 60

Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn

65 70 75 80

Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val

85 90 95

Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn

100 105 110

Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu

115 120 125

Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser

130 135 140

Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Thr Pro Ser Phe Phe

145 150 155 160

Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr Ile

165 170 175

Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp

180 185 190

Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln

195 200 205

Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg

210 215 220

Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Asn Gly

225 230 235 240

Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn

245 250 255

Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile

260 265 270

Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Glu Val Glu Tyr Gly

275 280 285

Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser

290 295 300

Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys

305 310 315 320

Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser

325 330 335

Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile

340 345 350

Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr

355 360 365

Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys

370 375 380

Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser

385 390 395 400

Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe

405 410 415

Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp

420 425 430

Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met

435 440 445

Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu

450 455 460

Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly

465 470 475 480

Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu

485 490 495

Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala

500 505 510

Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly

515 520 525

Thr Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala

530 535 540

Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly

545 550 555 560

Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile

565

<210> 6

<211> 241

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность от положения 60 до 300

H5Con5Mut

<400> 6

Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly

1 5 10 15

Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu

20 25 30

Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr

35 40 45

Pro Gly Asn Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg

50 55 60

Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Asn Ser Trp Ser

65 70 75 80

Asp His Glu Ala Ser Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly

85 90 95

Thr Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn

100 105 110

Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp

115 120 125

Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln

130 135 140

Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser

145 150 155 160

Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val

165 170 175

Asn Gly Gln Asn Gly Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro

180 185 190

Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu

195 200 205

Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser

210 215 220

Glu Val Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly

225 230 235 240

Ala

<210> 7

<211> 1707

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con1

<400> 7

atggaaaaaa tcgtgctgct cttggctatt gtcagtttgg ttaagtcgga ccagatctgc

60

attggatacc acgccaacaa ctctaccgaa caagtcgaca ctatcatgga gaagaacgtt

120

acagtgacgc acgctcagga tatcctggag aagacccata acggaaaact gtgtgacctc

180

gatggtgtga agcctttgat cctgcgtgac tgctctgtgg ctggttggct gctgggaaac

240

cctatgtgtg atgagttcat caacgtcccc gaatggtctt acattgttga gaaggctaac

300

ccagccaacg acctctgcta cccgggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg

360

ctgagtagga tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagtccag ctggtccgac

420

cacgaggctt cttcaggagt gagttcggcc tgtccgtacc agggcaagtc cagcttcttc

480

cgtaacgtgg tctggctgat taagaaaaac aacgcctacc caacaatcaa gaggtcatac

540

aacaacacga accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc aaacgatgct

600

gccgagcaga ctcgtctcta ccaaaacccg accacttaca tctccgtcgg caccagcact

660

ttgaaccaga gactggttcc gaagatcgca acacgctcca aagtgaacgg tcaaagcggc

720

aggatggact tcttctggac gatcctgaag cctaacgatg ctattaactt cgaatccaac

780

ggaaacttca tcgcacccga gtacgcgtac aagattgtca agaaaggtga ctctgcaatc

840

atgaaatcag agctggaata cggtaactgc aacacaaagt gtcaaacgcc catgggcgcg

900

atcaactctt caatgccttt ccacaacatc catcccctca caattggcga gtgccctaag

960

tacgttaaaa gtaacagact cgtgttggct accggattgc gtaactcgcc ccagagggaa

1020

cgccgtagga agaaacgcgg actgttcggt gctatcgccg gtttcattga gggtggctgg

1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccatagta acgaacaggg atcgggttac

1140

gcagcggaca aggagtctac ccaaaaagct atcgatggtg tgactaacaa ggtcaactca

1200

atcattgaca aaatgaacac tcagttcgag gccgtcggca gagaattcaa caacctcgag

1260

agacgcatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac

1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgcactc tcgacttcca cgattccaac

1380

gtgaagaacc tctacgacaa agtcagactg caactccgcg ataacgctaa ggaattgggc

1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaatc cgtccgcaac

1500

ggcacatacg attacccaca gtacagcgag gaagctcgtc tcaagaggga ggaaatttct

1560

ggcgttaaat tggagtcaat cggaacatac caaatcctgt ccatttacag cacggttgca

1620

agttcgttgg cactggcgat catggtggcg ggcctcagct tgtggatgtg ctctaacgga

1680

tcactgcagt gccgcatctg tatttaa

1707

<210> 8

<211> 1707

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con3

<400> 8

atggaaaaga tcgtgctgct cttggcaatt gtctccttgg ttaagagcga ccagatctgc

60

attggatacc acgcgaacaa cagcacagaa caagtcgaca cgatcatgga gaagaacgtt

120

acagtgacgc acgcacagga tatcctggag aaaacccata acggaaagct gtgtgacctc

180

gatggtgtga agcctttgat cctgcgcgac tgctctgtcg ctggttggct gctcggcaac

240

ccaatgtgtg atgagttcat caacgtcccg gaatggtcat acattgttga gaaggcaaac

300

cctgcgaacg acctctgcta ccccggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg

360

ctgtctcgta tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagtccag ctggagtgac

420

cacgaggcat cgctgggagt gtcttcagcg tgtccttacc aaggtaaccc cagtttcttc

480

aggaacgtgg tctggctcat taagaaaaac aacacatacc cgacgatcaa gaaatcctac

540

aacaacacta accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc taacgatgag

600

gctgaacaga caaagctcta ccaaaacccc accacttaca tctctgtcgg cacctcaact

660

ttgaaccaga gactggttcc caaaatcgct acacgcagta aggtgaacgg tcaatcgggc

720

cgtatggact tcttctggac gatcctgaag ccaaacgatg ccattaactt cgaatccaac

780

ggaaacttca tcgctccgga gtacgcctac aaaattgtca agaaaggtga ctccgctatc

840

atgaagagcg aggttgaata cggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatcggcgcc

900

attaacagtt cgatgccatt ccacaacatc catccgctga caattggcga gtgccctaag

960

tacgttaaat ctaacaagct cgtgttggct accggattgc gtaactcacc ccagagggaa

1020

cgccgtagga agaaacgcgg actgttcggt gcaatcgcgg gtttcattga gggtggctgg

1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccattcta acgaacaggg atcaggttac

1140

gctgccgaca aagagtccac ccaaaaggca atcgatggtg tgactaacaa agtcaacagc

1200

atcattgaca agatgaacac ccagttcgag gcggtcggca gagaattcaa caacctcgag

1260

agacgcatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac

1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgcactc tcgacttcca cgattcaaac

1380

gtgaaaaacc tctacgacaa ggtcagactg caactccgcg ataacgccaa ggaattgggc

1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaaag tgtgcgtaac

1500

ggcacttacg attaccccca gtactcggag gaagcccgtc tcaaaaggga ggaaatttcc

1560

ggcgtcaagt tggagagcat cggaacatac caaatcctgt ctatttactc aacggttgct

1620

tccagcttgg ctctggccat catggtggcc ggcctctcct tgtggatgtg cagtaacgga

1680

tcgctgcagt gcaggatctg tatttaa

1707

<210> 9

<211> 1707

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированные последовательности нуклеиновых кислот H5Con5

<400> 9

atggaaaaga tcgtgctgct cttggctatt gtctctctgg ttaaatcaga ccagatctgc

60

attggatacc acgccaacaa ctccacagaa caagtcgaca cgatcatgga gaagaacgtt

120

acagtgacgc acgctcagga tatcctcgag aaaacccata acggaaagct gtgtgacctc

180

gatggtgtga agcctttgat cctgagggac tgcagtgtcg ccggttggct gctcggcaac

240

ccaatgtgtg atgagttcat caacgtcccg gaatggtcct acattgttga gaaggctaac

300

cctgccaacg acctctgcta ccccggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg

360

ctgtctagaa tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagtccag ctggtcagac

420

cacgaggctt cttcaggagt gagttcggcc tgtccttacc aaggtactcc cagcttcttc

480

aggaacgtgg tctggctgat taagaaaaac aacacatacc cgacgatcaa gagatcttac

540

aacaacacta accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc taacgatgct

600

gccgagcaga caaagctcta ccaaaacccc accacttaca tcagtgtcgg cacctcgact

660

ttgaaccagc gcctggttcc caaaatcgca acacgtagta aggtgaacgg tcaatcgggc

720

aggatggact tcttctggac gatcctcaag ccaaacgatg ctattaactt cgaaagcaac

780

ggaaacttca tcgcaccgga gtacgcgtac aaaattgtca agaaaggtga ctccgcaatc

840

atgaagagcg aggttgaata cggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatcggcgcg

900

attaactcca gcatgccatt ccacaacatc catccgctga caattggcga gtgccctaag

960

tacgttaaat ctaacaagct cgtgttggcc accggattga ggaactcacc ccagagagaa

1020

cgccgtagga gaaagcgcgg actgttcggt gctatcgccg gtttcattga gggtggctgg

1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccattcta acgaacaggg atcaggttac

1140

gcagcggaca aagagtccac ccaaaaggct atcgatggtg tgactaacaa agtcaacagc

1200

atcattgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtcggcc gcgaattcaa caacctcgag

1260

cgccgtatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac

1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgtactc tcgacttcca cgattcaaac

1380

gtgaaaaacc tctacgacaa ggtccgcctg caactccgtg ataacgctaa ggaattgggc

1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaaag tgtgcgcaac

1500

ggcacttacg attaccccca gtactcggag gaagctaggt tgaaaagaga ggaaatttcc

1560

ggcgtcaagt tggagagcat cggaacatac caaatcctga gtatttactc gacggttgca

1620

tcttcattgg cactggcgat catggtggcg ggcctctcct tgtggatgtg ctccaacgga

1680

agcctgcagt gccgtatctg tatttaa

1707

<210> 10

<211> 1704

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированная последовательность нуклеиновых кислот

H5ConMut

<400> 10

atggaaaaga tcgtgctgct cttggctatt gtctctctgg ttaaatcaga ccagatctgc

60

attggatacc acgccaacaa ctccacagaa caagtcgaca cgatcatgga gaagaacgtt

120

acagtgacgc acgctcagga tatcctcgag aaaacccata acggaaagct gtgtgacctc

180

gatggtgtga agcctttgat cctgagggac tgcagtgtcg ccggttggct gctcggcaac

240

ccaatgtgtg atgagttcat caacgtcccg gaatggtcct acattgttga gaaggctaac

300

cctgccaacg acctctgcta ccccggtaac ttcaacgatt acgaggaatt gaagcacttg

360

ctgtctagaa tcaaccattt cgaaaagatc cagatcatcc caaagaatag ctggtcagac

420

cacgaggctt cttcaggagt gagttcggcc tgtccttacc aaggtactcc cagcttcttc

480

aggaacgtgg tctggctgat taagaaaaac aacacatacc cgacgatcaa gagatcttac

540

aacaacacta accaggaaga cctcttggtg ctgtggggta tccaccatcc taacgatgct

600

gccgagcaga caaagctcta ccaaaacccc accacttaca tcagtgtcgg cacctcgact

660

ttgaaccagc gcctggttcc caaaatcgca acacgtagta aggtgaacgg tcaaaatggc

720

aggatggact tcttctggac gatcctcaag ccaaacgatg ctattaactt cgaaagcaac

780

ggaaacttca tcgcaccgga gtacgcgtac aaaattgtca agaaaggtga ctccgcaatc

840

atgaagagcg aggttgaata cggtaactgc aacaccaaat gtcaaactcc aatcggcgcg

900

attaactcca gcatgccatt ccacaacatc catccgctga caattggcga gtgccctaag

960

tacgttaaat ctaacaagct cgtgttggcc accggattga ggaactcacc ccagagagaa

1020

cgccgtagga gaaagcgcgg actgttcggt gctatcgccg gtttcattga gggtggctgg

1080

caaggcatgg tggacggctg gtacggatac caccattcta acgaacaggg atcaggttac

1140

gcagcggaca aagagtccac ccaaaaggct atcgatggtg tgactaacaa agtcaacagc

1200

atcattgaca agatgaacac ccagttcgag gccgtcggcc gcgaattcaa caacctcgag

1260

cgccgtatcg aaaacttgaa caagaaaatg gaagacggat tcctggatgt ctggacctac

1320

aacgctgagc tgctcgttct gatggagaac gaacgtactc tcgacttcca cgattcaaac

1380

gtgaaaaacc tctacgacaa ggtccgcctg caactccgtg ataacgctaa ggaattgggc

1440

aacggatgct tcgagttcta ccataagtgc gacaacgagt gtatggaaag tgtgcgcaac

1500

ggcacttacg attaccccca gtactcggag gaagctaggt tgaaaagaga ggaaatttcc

1560

ggcgtcaagt tggagagcat cggaacatac caaatcctga gtatttactc gacggttgca

1620

tcttcattgg cactggcgat catggtggcg ggcctctcct tgtggatgtg ctccaacgga

1680

agcctgcagt gccgtatctg tatt

1704

<210> 11

<211> 723

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Оптимизированная последовательность нуклеиновых кислот,

кодирующая

аминокислотную последовательность от положения 60 до 300 H5Con5Mut

<400> 11

ctcgatggtg tgaagccttt gatcctgagg gactgcagtg tcgccggttg gctgctcggc

60

aacccaatgt gtgatgagtt catcaacgtc ccggaatggt cctacattgt tgagaaggct

120

aaccctgcca acgacctctg ctaccccggt aacttcaacg attacgagga attgaagcac

180

ttgctgtcta gaatcaacca tttcgaaaag atccagatca tcccaaagaa tagctggtca

240

gaccacgagg cttcttcagg agtgagttcg gcctgtcctt accaaggtac tcccagcttc

300

ttcaggaacg tggtctggct gattaagaaa aacaacacat acccgacgat caagagatct

360

tacaacaaca ctaaccagga agacctcttg gtgctgtggg gtatccacca tcctaacgat

420

gctgccgagc agacaaagct ctaccaaaac cccaccactt acatcagtgt cggcacctcg

480

actttgaacc agcgcctggt tcccaaaatc gcaacacgta gtaaggtgaa cggtcaaaat

540

ggcaggatgg acttcttctg gacgatcctc aagccaaacg atgctattaa cttcgaaagc

600

aacggaaact tcatcgcacc ggagtacgcg tacaaaattg tcaagaaagg tgactccgca

660

atcatgaaga gcgaggttga atacggtaac tgcaacacca aatgtcaaac tccaatcggc

720

gcg

723

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к иммуногенной композиции против подтипа вируса птичьего гриппа Н5, содержащей гемагглютининовый белок вируса птичьего гриппа подтипа Н5. Также раскрыт способ дифференциации животных, естественно инфицированных вирусом птичьего гриппа, от животных, вакцинированных вышеуказанной иммуногенной композицией, предусматривающий анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который не присутствует в указанной иммуногенной композиции, или анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который является специфичным для указанной иммуногенной композиции. Изобретение эффективно для профилактики и/или лечения инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа. 3 н. и 10 з.п. ф-лы, 4 ил., 10 табл., 11 пр.

1. Иммуногенная композиция против подтипа вируса птичьего гриппа Н5, содержащая гемагглютининовый белок вируса птичьего гриппа подтипа Н5, в которой гемагглютининовый белок содержит аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 6; или аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5.

2. Иммуногенная композиция по п. 1, в которой гемагглютининовый белок содержится в клеточной культуре, которую получают путем культивирования клеток, содержащих вектор экспрессии, кодирующий указанный гемагглютининовый белок.

3. Иммуногенная композиция по п. 2, в которой молекула нуклеиновой кислоты представлена в SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

4. Иммуногенная композиция по любому из пп. 2, 3, в которой вектор экспрессии представляет собой бакуловирус, а клетки представляют собой клетки насекомых.

5. Иммуногенная композиция по пп. 2-4, в которой клеточная культура подвергнута стадии инактивации, предпочтительно стадии инактивации с помощью бинарного этиленимина.

6. Иммуногенная композиция по любому из пп. 2-5, где иммуногенная композиция содержит часть или всю клеточную культуру.

7. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-6, где иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант.

8. Иммуногенная композиция по п. 7, в которой адъювант представляет собой эмульсию вода-в-масле.

9. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-8, где иммуногенную композицию вводят однократным или многократным введением; и/или

иммуногенную композицию вводят подкожно или внутримышечно; и/или иммуногенную композицию следует вводить животному в 1-й день жизни или старше, на 7-й день жизни или старше, на 10-й день жизни или старше, на 15-й день жизни или старше или на 21-й день жизни или старше.

10. Иммуногенная композиция по любому из пп. 1-9 для применения в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа, предпочтительно вирусом H5Nx, более предпочтительно одним или несколькими из H5N1, H5N2 и H5N6.

11. Иммуногенная композиция по п. 10, где иммуногенная композиция является эффективной в профилактике и/или лечении инфекций, вызванных вирусом птичьего гриппа, предпочтительно вирусом H5Nx, более предпочтительно одним или несколькими из H5N1, H5N2 и H5N6, после введения однократной дозы или многократных доз иммуногенной композиции.

12. Способ дифференциации животных, естественно инфицированных вирусом птичьего гриппа, от животных, вакцинированных иммуногенной композицией по любому из пп. 1-9, включающий:

(а) анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который не присутствует в иммуногенной композиции, но присутствует у естественно инфицированного животного, где иммунный анализ представляет собой иммуноферментный анализ или твердофазный иммуноферментный анализ,

(б) определение того, является ли образец положительным или отрицательным по маркеру птичьего гриппа, и

(в) корреляцию результатов анализа со статусом тестируемого животного, где животное, положительное по маркеру птичьего гриппа, является естественно инфицированным животным, а животное, которое отрицательно по маркеру птичьего гриппа, является животным, вакцинированным иммуногенной композицией по любому из пп. 1-9.

13. Способ дифференциации животных, естественно инфицированных вирусом птичьего гриппа, от животных, вакцинированных иммуногенной композицией по любому из пп. 1-9, включающий:

(а) анализ образца животного в иммунном анализе и/или геномном аналитическом анализе на наличие маркера птичьего гриппа, который является специфичным для иммуногенной композиции, но не присутствует у естественно инфицированного животного, где иммунный анализ представляет собой иммуноферментный анализ или твердофазный иммуноферментный анализ,

(б) определение того, является ли образец положительным или отрицательным по маркеру птичьего гриппа, и

(в) корреляцию результатов анализа со статусом тестируемого животного, где животное, положительное по маркеру птичьего гриппа, является животным, вакцинированным иммуногенной композицией по любому из пп. 1-9.