Средство, обладающее противовирусным действием в отношении вируса клещевого энцефалита Российский патент 2023 года по МПК A61K36/85 A61K31/05 C07C13/00 A61P31/12 

Изобретение относится к фармакологии и вирусологии, а именно к разработке новых противовирусных средств с прямым вирулицидным действием в отношении вируса клещевого энцефалита (ВКЭ).

ВКЭ является этиологическим агентом такого инфекционного заболевания, как клещевой энцефалит (КЭ). Клинически КЭ чаще всего проявляется в форме менингита, энцефалита или менингоэнцефалита (Lind-quist L, Vapalahti О. Tick-borne encephalitis. Lancet. 2008; 371(9627): 1861-71. doi:10.1016/S0140-6736(08)60800-4). По распространенности ВКЭ занимает довольно большой ареал от Западной Европы до Японии. Ежегодно отмечается более 13000 клинических случаев КЭ по всей территории Европы и Азии. При этом, количество случаев КЭ в эндемичных регионах Европы резко возросло за последние 30 лет (Haviernik J, Eyer L, Yoshii K, Kobayashi S, Cemy J, Nougairede A, Driouich JS, Volf J, Palus M, de Lamballerie X, Gould EA, Ruzek D. Development and characterization of recombinant tick-borne encephalitis virus expressing mCherry reporter protein: A new tool for high-throughput screening of antiviral compounds, and neutralizing antibody assays. Antiviral Res. 2021; 185:104968. doi: 10.1016/j.antiviral.2020.104968). Смертность от КЭ может варьировать в зависимости от субтипа ВКЭ. Так, показано, что для европейского субтипа количество смертельных случаев составляет примерно 1-2%, для сибирского субтипа 2-3%, больше всего случаев со смертельным исходом течения заболевания отмечается для дальневосточного субтипа 20-40%) (Mansfield KL, Johnson N, Phipps LP, Stephenson JR, Fooks AR, Solomon T. Tick-borne encephalitis virus - a review of an emerging zoonosis. J Gen Virol. 2009; 90(Pt 8):1781-1794. doi: 10.1099/vir.0.011437-0).

У значительной части пациентов после перенесенного КЭ развивается постэнцефалитический синдром, который характеризуется длительным или постоянным расстройством здоровья и функциональности человека (Bogovic P., Strle F., Tick-bome encephalitis: a review of epidemiology, clinical characteristics, and management. World J Clan Cases. 2015; 3 (5), 430-441. https://doi.org/10.12998/wjcc.v3.i5.430). В итоге, КЭ и его осложнения создают значительную нагрузку на службы общественного здравоохранения стран Европы и Азии. Отсюда следует, что в современной медицине разработка противовирусных препаратов для профилактики и лечения КЭ актуальна и востребована (Пеньевская Н.А., Рудаков Н.В. Оценка эффективности этиотропной профилактики инфекций, передающихся иксодовыми клещами: систематизация понятий и методологические особенности // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2018. №17(6). С. 48-56. doi: 10.31631/2073-3046-2018-17-6-48-56).

Известен препарат, назначаемый пациентам с КЭ для специфического лечения и профилактики - это донорский иммуноглобулин G человека (Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 07.03.2008 г. №19 (ред. от 20.12.2013) «Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 3.1.3.2352-08 "Профилактика клещевого вирусного энцефалита»). Донорские иммуноглобулины G, несмотря на доказанную эффективность против ВКЭ, обладают рядом критических недостатков. В первую очередь, иммуноглобулины выделяют из крови иммунизированных людей-доноров, поэтому препараты отличаются низким уровнем стандартизации, могут содержать вещества, способные вызывать анафилактический шок и сопутствующие инфекции. Также к недостаткам относится то, что производство иммуноглобулинов трудоемко и дорого, вследствие этого препарат относится к категории дефицитных. В соответствии с инструкцией по применению введение противоклещевого иммуноглобулина с профилактической целью необходимо провести из расчета 1 мл на 10 кг веса пациента в первые 96 час с момента присасывания клеща, что не всегда возможно при нахождении в удаленной (труднодоступной) местности.

Известно средство профилактики и лечения КЭ у взрослых с помощью 4-йодантипирина (Иерусалимский А.П. Клещевой энцефалит. Новосибирск. 2001 г. Стр. 321). Указанное средство предлагается использовать, как таблетированный препарат, индуктор эндогенного интерферона - йодантипирин. К медицинскому применению в качестве лечебно-профилактического средства допущена твердая лекарственная форма 4-йодантипирина, выполненная в виде таблетки, которая содержит в качестве активного начала 1-фенил-2,3-диметил-4-йодпиразолон-5, в качестве фармацевтических добавок - крахмал картофельный, глюкозу кристаллическую гидратную, магния стеарат (Патент РФ №2141826, МПК А 61 К 31/415, Опубл. 27.11.1999). К недостаткам средства относится ряд ограничений и противопоказаний в применении, в том числе возраст до 18 лет, низкая скорость высвобождения действующего вещества (72% за 45 минут), нестабильность таблетки, существенно ограничивающая срок хранения (2 года), низкие показатели прочности и распадаемости, снижающие фармакологически необходимую концентрацию активного соединения в организме и достижение экстренного терапевтического эффекта.

Известен ряд препаратов с противовирусной активностью в отношении ВКЭ in vitro, в частности флавоноиды, выделенные из Scutellaria baicalensis, которые обладают прямым вирулицидным действием на ВКЭ в экспериментах на культуре клеток СПЭВ (Leonova GN, Shutikova AL, Lubova VA et al. Inhibitory Activity of Scutellaria baicalensis Flavonoids against Tick-Borne Encephalitis Virus // Bull Exp Biol Med. 2020. Vol. 168 (5). P. 665-668. doi: 10.1007/s10517-020-04776-y). Однако, конкретного компонента, определяющее активное действие, не идентифицировано и в медицинской практике данный препарат не используется. Также известны розмариновая кислота и лютеолин - компоненты полифенольного комплекса морских трав семейства Zosteraceae, обладающие противовирусным действием в отношении ВКЭ на культуре клеток СПЭВ (Крылова Н.В., Попов A.M., Леонова Г.Н. Антиоксиданты как потенциальные противовирусные препараты при флавивирусных инфекциях // Антибиотики и химиотер. 2016. Т. 61. С. 5-6). Известны полисахариды из бурых водорослей Laminaria japonica, Laminaria cichorioides, Fucus evanescens и Costaria costata показали, что фукоиданы обладают вирулицидным действием в отношении высокопатогенного штамма ВКЭ (Макаренкова И.Д., Леонова Г.Н., Майстровская О.С. и др. Противовирусная активность сульфатированных полисахаридов из бурых водорослей при экспериментальном клещевом энцефалите // Тихоокеанский медицинский журнал. 2012. №1. С. 44-46). Известны противовирусные молекулы к ВКЭ, продуцируемые протеобактериями Pseudoalteromonas nigrifaciens. Обнаруженный экзополисахарид, как отмечают исследователи, способен отменить индуцированную вирусом супрессию клеток врожденного иммунитета человека (Средство для создания фармакологических препаратов для лечения клещевого энцефалита моноцитов периферической крови человека компонентами протеобактерий Pseudoalteromonas nigrifaciens // Тихоокеанский медицинский журнал. 2009. №3. С. 45-48). Известен эхино-хром А - хиноидный пигмент морских ежей, проявляющий активность в отношении ВКЭ. В экспериментах использовалась композиция антиоксидантов: эхинохрома А, аскорбиновой кислоты и α-токоферола, которая позволила увеличить эффективность ингибирования вируса, в отношении применения одного эхинохрома (Патент РФ №2697886, Опубл. 21.08.2019 Бюл. №24). Известны эпросартан и рибавирин, способные к ингибированию ВКЭ, как в опытах in vitro, так и in vivo (Леонова Г.Н., Майстровская О.С., Лубова В.А. Ингибирование репликации вируса клещевого энцефалита препаратами эпросартан и рибавирин in vitro и in vivo // Антибиотики и Химиотерапия. 2020. Т. 65(9-10). Р. 8-12. doi: 10.37489/0235-2990-2020-65-9-10-8-12). Известны нуклеозидные аналоги (5-(perylen-3-yl)ethynyl-arabino-uridine, 5-(perylen-3-yl)ethynyl-2'-deoxy-uridine), которые способны ингибировать ВКЭ, в опытах на клеточной линии СПЭВ (Orlov АА, Chistov АА, Kozlovskaya LI et al. Rigid amphipath-ic nucleosides suppress reproduction of the tick-borne encephalitis virus // Medchemcomm. 2016. T. 7(3). P. 495-499. doi: 10.1039/c5md00538h). Известны синтетические производные 5-аминоизоксазола, содержащие в своем составе адамантильную группу, которые проявили сильную противовирусную активность и высокий индекс ингибирования в отношении ВКЭ, омской геморрагической лихорадки и вируса энцефалита повассан (Vasilenko DA, Dueva EV, Kozlovskaya LI et al. Tick-borne flavivirus reproduction inhibitors based on isoxazole core linked with adamantine // Bioorgan-ic Chemistry. 2019. Vol. 87. P. 629-637. doi: 10.1016/j.bioorg.2019.03.028). Известен 4-аминопиримидин N-оксид широкого спектра противовирусного действия против трех субтипов ВКЭ (Dueva EV, Tuchynskaya KK, Kozlovskaya LI et al. Spectrum of antiviral activity of 4-aminopyrimidine N-oxides against a broad panel of tick-borne encephalitis virus strains // Antiviral Chemistry and Chemotherapy. 2020. Vol. 28. P. 1-10. doi: 10.1177/2040206620943462).

Однако, вышеприведенные в качестве аналогов препараты, имеющие разные механизмы действия, не обладают высокой вирулицидной активностью по отношению к ВКЭ. Трудность заключается в создании средств, избирательно подавляющих репродукцию вируса и не затрагивающих процессы жизнедеятельности клеток и всего организма в целом. Большинство противовирусных средств, ингибирующих вирусспецифические процессы, тесно связанные с метаболизмом, энергетическим обменом и ферментативными реакциями в клетке, практически всегда оказывают токсическое воздействие и на саму клетку. Поэтому расширение арсенала эффективных и малотоксичных средств для профилактики и лечения ВКЭ является в настоящее время актуальной задачей.

Задача изобретения - расширение арсенала противовирусных средств в отношении ВКЭ.

Технический результат достигается за счет применения 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы ([(2R,3R,4S,5R,6S)-3,5-дигидрокси-4,6-бис[(3,4,5-тригидроксибензоил)окси]оксан-2-ил]метил 3,4,5-тригидроксибензоата) в качестве средства активного в отношении ВКЭ.

1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкоза (Название IUPAC: [(2R,3R,4S,5R,6S)-3,5-дигидрокси-4,6-бис[(3,4,5-тригидроксибензоил)окси]оксан-2-ил]метил 3,4,5-тригидроксибензоат) - низкотоксичный гидролизуемый танин, который входит в группу фенольных соединений, растительного происхождения, и имеющий молекулярную массу 636,5 (номер в базе данных PubChem - 452707).

Известно о вирулицидной активности гидролизуемого танина в отношении ВИЧ (Sun W, Wang НТ, Xia CL et al. 1,2,6-tri-O-galloyl-beta-D-glucopyranose inhibits gp41-mediated HIV envelope fusion with target cell membrane // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2008. Vol. 28(7). P. 1127-31). Ингибирование ВИЧ происходит путем связывания шестиспиральных пучков белка gp41. Известна вирус ингибирующая активность гидроли-зуемых танинов в отношении сериновой протеазы NS3 вируса гепатита С (Duan D, Li Z, Luo H et al. Antiviral compounds from traditional Chinese medicines Galla Chinese as inhibitors of HCV NS3 protease // Bioorg Med Chem Lett. 2004. Vol. 14(24). P. 6041-4. doi: 10.1016/j.bmcl.2004.09.067), значение EC50 составило 1,89 мкмоль. Известно, что 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкоза способна к связыванию к рецептор связывающим доменом вируса SARS CoV-2, тем самым нарушая взаимодействие с рецептором клеток хозяина АСЕ2 (Binette V, КАРТ, Haddad M et al. Corilagin and 1,3,6-Tri-O-galloy-β-D-glucose: potential inhibitors of SARS-CoV-2 variants // Phys Chem Chem Phys. 2021. Vol. 23(27). P. 14873-14888. doi: 10.1039/dlcp01790j).

Проведенный анализ патентной и научно-технической литературы не выявил публикаций, описывающих противовирусные свойства 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы в отношении ВКЭ. Полученные нами данные являются новыми и оригинальными. Новые свойства 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы не вытекают с очевидностью из его химической структуры или ранее известных данных. Таким образом, данное техническое решение соответствует критериям изобретения «новизна» и «изобретательский уровень».

Предлагаемое средство может быть использовано как противовирусное средство в отношении ВКЭ.

На фиг. 1 представлено цитотоксическое действие 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы в культуре клеток СПЭВ.

На фиг. 2 представлены результаты определения прямого вирулицидного действия 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы на ВКЭ.

На фиг. 3 представлены результаты определения вирус ингибирующего действия 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы на ВКЭ.

В работе использовали высокоочищенную 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозу лиофилизированную (Sigma-Aldrich), 1 мг которой перед исследованием растворяли в 1 мл стерильной бидистиллированной воды и стерилизовали фильтрованием. В качестве референс образца в работе использовали стерильный фосфатно-солевой буфер.

В работе использовали изолят ВКЭ сибирского субтипа 92 М (Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Злобин В.И. и др. Вирус клещевого энцефалита в Монголии // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2012. №4. С. 9-12). Пассирование ВКЭ и определение концентрации инфекционного вируса проводили на клеточной линии почек эмбриона свиньи (СПЭВ), приобретенной из «Коллекции линий клеток человека и животных» для исследований в области вирусологии (ФГУ НИИ гриппа, Санкт-Петербург, РФ). Культуру клеток поддерживали на среде RPMI 1640 с добавлением антибиотиков (пенициллин G 500 ЕД/мл, стрептомицин 100 мкг/мл) и 5% фетальной телячьей сыворотки (ThermoScientific, Великобритания). Концентрацию инфекционного вируса в исходной суспензии и в опытах по ингибированию ВКЭ определяли путем титрования бляшкообразующих единиц (БОЕ) в культуре клеток и выражали в виде десятичного логарифма БОЕ на миллилитр суспензии (lg БОЕ/мл).

Пример 1. Цитотоксическая активность 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы

Для оценки токсичности 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы для клеток млекопитающих определяли 50% цитотоксическую концентрацию (СС50) в культуре клеток СПЭВ.

Монослой культуры клеток СПЭВ выращивали в 96-луночных планшетах и инкубировали с 100 мкл 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы (начальная концентрация 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы составляла 0,5 мг/мл) в серии двукратных разведений в фосфатно-солевом буфере в течение трех суток. Концентрация фетальной бычьей сыворотки в среде поддержки составляла 2%. Параллельно инкубировали референс-образцы клеток, в которых вместо тестируемых компонентов использовали стерильный фосфатно-солевой буфер в двукратных разведениях. Через 3 суток среду поддержки убирали, монослой клеток промывали стерильным фосфатно-солевым буфером и фиксировали формолом (10% формалин в фосфатно-солевом буфере) в течение 3 часов. Фиксированные монослои клеток окрашивали в течение 30 минут кристаллическим фиолетовым (0,05% водный раствор). Для оценки количества жизнеспособных клеток в каждой лунке проводили экстракцию красителя в 100 мкл метанола и измеряли оптическую плотность (ОП) экстрактов при длине волны 540 нм. Измерения производили с помощью спектрофотометра Immunochem 2100 (High Technology Inc., США). Выживаемость клеток при контакте с исследуемым препаратом в заданной концентрации рассчитывали как отношение ОП экстракта кристаллического фиолетового в лунке с препаратом к ОП экстракта кристаллического фиолетового в лунке с контрольным монослоем в соответствующем разведении и выражали в процентах. Расчет СС50 выполняли по методу Рида-Менча и выражали в мг/мл.

На фиг. 1 представлено цитотоксическое действие 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы в культуре клеток СПЭВ. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение средних значений.

Как видно на фиг. 1 (см приложение к описанию заявки) 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкоза оказывает выраженное цитотоксическое действие на культуру клеток СПЭВ в концентрациях от 0,5 до 0,06 мг/мл, при которых выживает от 50% до 92% клеток, соответственно. С уменьшением концентрации 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы наблюдается увеличение доли выживших клеток.

Установлено, что СС50 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы для культуры клеток СПЭВ составляет 0,5±0,12 мг/мл (Табл. 1).

Пример 2. Прямое вирулицидное действие 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы на ВКЭ

Прямое вирулицидное действие определяли инкубацией 100 мкл 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы в концентрации 1 мг/мл со 100 мкл суспензии ВКЭ (инфекционность вируса 5×10⁴ БОЕ на миллилитр), при 37°С в течение 30 минут. В качестве отрицательного контроля использовали стерильный фосфатно-солевой буфер, в качестве положительного контроля иммуноглобулин G против ВКЭ (10 мг/мл, ФГУС «НИЦ Микро-ген», Томск). После инкубации образцы подвергали двукратному разведению в сериях, которыми проводили заражение монослоя культуры клеток СПЭВ (Gould ЕА, Clegg JCS. Growth, titration and purification of togaviruses // In: Mahy BWJ, editor. Virology: A Practical Approach. IRL Press Ltd., Oxford. 1985. P. 43-48). Заражение культуры клеток проводили при комнатной температуре 20 минут. После чего суспензию убирали, а к культуре клеток добавляли среду поддержки с 1% агарозой и инкубировали 3 суток в CO2-инкубаторе (5% атмосфера CO2) при 37°С. Через 3 суток среду поддержки убирали, монослой клеток промывали стерильным фосфатно-солевым буфером и фиксировали формолом (10% формалин в фосфатно-солевом буфере) в течение 3 часов. Фиксированные монослои клеток окрашивали в течение 30 минут кристаллическим фиолетовым (0,05% водный раствор). Определение концентрации инфекционного вируса проводили подсчетом бляшкообразующих единиц (БОЕ) в культуре клеток СПЭВ, которые выражали в виде десятичного логарифма на миллилитр суспензии (lg БОЕ /мл).

Для количественной оценки прямого вирулицидного действия использовали показатель 50% эффективной концентрации (ЕС50). Для этого определяли остаточную инфекционность после обработки серийных двукратных разведений тестового препарата и рассчитывали концентрацию препарата, которая снижала инфекционность вируса на 50% по сравнению с референс образцом. При этом использовали фиксированную инфекционность вируса. Расчет выполняли по методу Рида-Менча, ЕС50 выражали в мг/мл.

На фиг. 2 (см приложение к описанию заявки) представлены результаты определения прямого вирулицидного действия 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы на ВКЭ. Планки погрешностей отражают величину стандартного отклонения по результатам трех независимых воспроизведений эксперимента. * - выявлены достоверные отличия от референс-образца (р<0,05).

Как видно на фиг. 2 прямая инкубация суспензии ВКЭ с 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозой приводит к существенному снижению инфекционности вируса вплоть до полного уничтожения. Вирулицидный эффект имеет выраженную дозозависимость и по интенсивности сопоставим или более интенсивен, чем нейтрализующая активность иммуноглобулина (ИГ) человека против ВКЭ. ЕС50 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы составила 0,0065±0,0007 мг/мл. Индекс селективности (SI), представляющий собой отношение 50% цитотоксической концентрации к 50% эффективной концентрации, составил 75 (Табл. 1). Это свидетельствует о низкой токсичности действующих концентраций 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы для культуры клеток млекопитающих.

Пример 3. Вирулицидное действие 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы на ВКЭ

Для определения вирус ингибирующего действия монослой культуры клеток СПЭВ заражали 5×10⁴ бляшкообразующих единиц на миллилитр среды RPMI 1640 без сыворотки. Заражение монослоя клеток проводили при комнатной температуре в течение 30 минут. Далее убирали вирусную суспензию, а монослой клеток промывали средой. Затем вносили серии двукратных раститровок тестируемых образцов 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы и фосфатно-солевого буфера для проверки вирус ингибирующего действия. 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозу использовали в концентрациях от 0,25 до 0,03 мг/мл. Клетки инкубировали трое суток в CO2-инкубаторе (5% атмосфера CO2) при 37°С, после этого среду поддержки собирали и определяли инфекционность ВКЭ с помощью титрования БОЕ. В качестве отрицательного контроля использовали 4 лунки серийного разведения стерильного фосфатно-солевого буфера. Эксперименты проводили в трех независимых повторах, результаты представляли в виде средних значений трех независимых биологических воспроизведений. Достоверность различий между группами оценивали с помощью U-критерия Манна-Уитни, различия считали достоверными при уровне значимости 0,05.

На фиг. 3 (см приложение к описанию заявки) представлены результаты определения вирус ингибирующего действия 1,3,6-три-О-галлоил-бета-D-глюкозы в отношении вируса клещевого энцефалита. Крестиками обозначены значения инфекционности ВКЭ при различной концентрации 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы. Кружками даны значения инфекционности ВКЭ при инкубации фосфатно-солевым раствором. Планки погрешностей отражают величину стандартного отклонения по результатам трех независимых воспроизведений эксперимента.

Вирус ингибирующее действие 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы при совместной инкубации с зараженной ВКЭ культурой клеток определено в диапазоне концентраций от 0,03 до 0,25 мг/мл. На фиг. 3 видна зависимость уменьшения инфекционности ВКЭ при увеличении концентрации 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы.

Таким образом, 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкоза([(2R,3R,4S,5R,6S)-3,5-дигидрокси-4,6-бис[(3,4,5- тригидроксибензо-ил)окси]оксан-2-ил]метил 3,4,5-тригидроксибензоат) является высокоэффективным вирулицидным средством в отношении вируса клещевого энцефалита с низкой цитотоксичностью.

Изобретение относится к области фармакологии и вирусологии, а именно к средствам с прямым вирулицидным действием в отношении вируса клещевого энцефалита. Раскрывается применение 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении вируса клещевого энцефалита. Изобретение обеспечивает эффективное противовирусное действие в отношении вируса клещевого энцефалита. 3 ил., 1 табл., 3 пр.

Применение 1,3,6-три-O-галлоил-бета-D-глюкозы в качестве средства, обладающего противовирусным действием в отношении вируса клещевого энцефалита.