Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов Российский патент 2019 года по МПК C12N5/71 C12N7/00 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и вирусологии, в частности к разработке клеточного субстрата для репродукции вируса клещевого энцефалита in vitro и производству вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов.

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к семейству Flaviviridae и ежегодно вызывает до 10 тысяч случаев заболевания человека. Человеку ВКЭ передается при укусах иксодовых клещей. Естественными хозяевами вируса в природе являются прокормители клещей - мелкие млекопитающие, в том числе восточноазиатская лесная мышь Apodemus peninsulae, зараженность которой ВКЭ может достигать 20% [Клещевой энцефалит…, 1996; Балахонов С.В. и др., 2012]. В последние годы, в качестве наиболее перспективного пути совершенствования модельных и производственных систем культивирования вирусов in vitro, рассматривается создание новых модельных систем на основе естественных хозяев инфекций [Eckerle I et al., 2014; Stoltz M et al., 2011; Mourya DT et al., 2013; Sheng et al., 2011]. Однако разнообразие, доступность и степень изученности таких моделей еще очень невелики. Так, недавно была разработана клеточная линия MRK101 красно-серой полевки (Myodes rufocanus bedfordiae). Линия клеток MRK101 получена в Японии из почки полевки - представителя хомякообразных - другого семейства грызунов, являющихся важными хозяевами многих трансмиссивных инфекций, в том числе ВКЭ [Sanada Т et al., 2012]. Однако, данная линия клеток рекомендована как инструмент для изучения хантавирусов in vitro и не тестирована на восприимчивость к ВКЭ и другим флавивирусам.

В настоящее время для производства антигена ВКЭ, изучения биологии вируса и разработки новых средств диагностики, профилактики и лечения заболевания используются клетки позвоночных: VERO, ВНК-21, ФЭК, СПЭВ. Все эти клеточные линии получены от животных, не являющихся естественными хозяевами клещевых флавивирусов - курицы, обезьяны, свиньи, хомяка, человека. Именно с этим связаны основные недостатки существующих клеточных культур. Это и быстрая (до 4 пассажей) адаптация ВКЭ к линии клеток, приводящая к изменению естественных свойств вируса [Mandl et al, 2001], и избыток куриного белка в иммунопрепаратах при производстве вакцинных антигенов на культуре ФЭК [Воробьева М.С. и др., 2007], и то, что доступные клеточные модели не отражают характеристики специфичных взаимодействий вирусов и их позвоночных хозяев [Stoltz et al. 2011, Eckerle et al. 2013, Tigabu В et al., 2010]. У линии клеток VERO отсутствует секреция интерферонов типа I (IFN α/β) [Emeny J. and Morgan M., 1979], кроме того, эффективность репродукции ВКЭ в этих клеток снижена [Морозова О.В. и др., 2012]. Отмечается дерегуляция естественных клеточных механизмов, связанная с вырождением традиционных клеточных линий в процессе культивирования [Eckerle et al., 2014]. Многие традиционные культуры клеток (СПЭВ, ВНК-21) быстро, в течение 3-5 дней, гибнут от цитопатического действия ВКЭ, что повышает ресурсоемкость производства антигена с использованием этих линий в качестве субстрата. Эти недостатки традиционных линий оказывают негативное влияние на совершенствование производства вакцин и диагностических препаратов. Поэтому разработка новых эффективных клеточных субстратов для репродукции ВКЭ и производства вирусного антигена является актуальной задачей.

Задачей, на решение которой направлено данное изобретение, явилось создание новой линии клеток из почки Apodemus peninsulae, пригодной для репродукции ВКЭ, а также для производства вирусного антигена.

Цель данного изобретения создание монослойной перевиваемой линии клеток естественного хозяина ВКЭ для репродукции вируса и производства вирусного антигена.

Поставленная цель достигается тем, что создана перевиваемая линия клеток почки восточноазиатской лесной мыши (Apodemus peninsulae), для которой показана возможность репродукции ВКЭ и накопления вирусного антигена в культуральной жидкости. Полученная клеточная линия обладает стабильными культуральными и морфологическими характеристиками. Клеточная линия хранится в коллекции клеточных культур лаборатории трансмиссивных инфекций Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» (г. Иркутск) под обозначением ApnK.

Таким образом, создана новая перевиваемая линия клеток для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов и следовательно, данное техническое решение соответствует критерию изобретения «новизна».

Проведенный анализ патентной и научной литературы не выявил публикаций, описывающих перевиваемые линии клеток A. peninsulae и их применение для репродукции ВКЭ. А именно, предлагаемая линия клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae позволяет поддерживать репродукцию вируса клещевого энцефалита и накапливать вирус в культуральной жидкости в количестве 6-7,1 lg БОЕ/мл. При этом происходит выработка специфичного антигена ВКЭ в количествах, сопоставимых с коммерческими антигенами ВКЭ. По результатам иммуноферментного анализа, через 4 дня после заражения клеток ApnK, концентрация антигена ВКЭ в культуральной среде превышает как концентрацию коммерческих антигенов (2,5 ОЕ), так и аналитический предел тест-системы (3,5 ОЕ). Репродукция ВКЭ и накопление специфичного антигена проходит на протяжении 3 недель без смены культуральной среды.

В отличие от традиционных клеточных линий, линия клеток ApnK является более адаптированным к ВКЭ субстратом, поскольку получена от естественного хозяина вируса. Это обеспечивает стабильную репродукцию ВКЭ в культуре клеток и накопление вирусного антигена в культуральной жидкости в течение трех недель.

Предлагаемую линию клеток можно использовать в научно-исследовательских лабораториях как модельную систему для изучения ВКЭ, в биотехнологических компаниях, на фармацевтических заводах для производства антигена ВКЭ для вакцин и диагностических препаратов.

Таким образом, предлагаемое техническое решение соответствует критериям изобретения «изобретательский уровень» и «промышленная применимость».

Пассажная история клеточной линии ApnK. Первичная культура клеток получена из почек взрослой самки Apodemus peninsulae, отловленной в Иркутской области. Животное эвтаназировали под анестезией и немедленно препарировали для извлечения органов. Суспензию клеток почки культивировали в течение 40 суток до получения монослоя первичной культуры прикрепленных клеток и затем пассировали с разведением от 1:2 до 1:5. Стабильно растущая перевиваемая морфологически однородная линия клеток ApnK сформировалась на 17 пассаже. Основные характеристики клеточной линии установлены на 30 пассаже.

Морфология клеточной линии ApnK. Адгезивная, монослойная, эпителиоподобная (см приложение к описанию фиг. 1 а, в). На фиг. 1 представлена морфология адгезивной монослойной линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши ApnK. Фиксация формальдегидом, окраска кристаллическим фиолетовым. А) увеличение ×10; В) увеличение ×40.

Культуральные свойства клеточной линии ApnK. Ростовая среда RPMI-1640 с добавлением 10% или 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и L-глутамина (2 mM). Клеточную линию ApnK в количестве 1×10⁶ клеток ресуспендируют в 5 мл ростовой среды и засевают в культуральный флакон с площадью рабочей поверхности 25 см². Условия инкубации: 37°C в атмосфере 5% CO₂. Монослой клеток плотностью 90-100% формируется через 3-5 дней. Среднее время удвоения клеточной культуры ApnK составляет 28 часов. Без смены среды монослой стабилен не менее 19 суток. Клетки снимаются с использованием 0,25% раствора трипсина с добавлением 0,5 mM этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA). Частота пересева 1-2 раза в неделю с кратностью 1:5. Для криоконсервации в жидком азоте используется среда для заморозки, состоящая из 90% эмбриональной телячьей сыворотки и 10% диметилсульфоксида (DMSO). Замораживание медленное со снижением температуры на 1°C в минуту до -80°C затем перенос в жидкий азот. Размораживание быстрое при 37°C. Размороженные клетки ресуспендируют в 5 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и L-глутамина (2 mM), засевают в культуральный флакон с площадью рабочей поверхности 25 см² и инкубируют в течение ночи при 37°C в атмосфере 5% CO₂. На следующий день культуральную жидкость над монослоем заменяют на 5 мл свежей ростовой среды.

Подтверждение видовой принадлежности клеточной линии ApnK. Кариологичская характеристика: кариотип нормальный диплоидный, 2n=48 A-хромосом (см приложение к описанию, фиг. 2), присутствует 21±2 B-хромосом.

На фиг. 2 представлен кариотип A-хромосом ApnK. Метафазные пластинки приготовлены по методу A. Nagy et al. (Nagy A., Gertsenstein M., Vintersten K., Behringer R. 2008. CSH Protocols; doi: 10.1101/pdb.prot4706) с окраской по Гимза. Увеличение ×1000, масляная иммерсия.

Генетическая характеристика: проанализирована первичная нуклеотидная структура двух локусов генома клеточной линии ApnK - гена цитохрома В (mtCytB) и D-петли митохондриального генома (d-loop). Последовательности депонированы в международную базу данных GenBank с номерами доступа KT983422 (mtCytB) и KT983423 (d-loop). Филогенетический анализ и анализ BLAST (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine) показали что клеточная линия ApnK является линией клеток восточноазиатской лесной мыши А. peninsulae. Наиболее генетически близкие особи A. peninsulae были отловлены в Республике Бурятия (номер доступа AY588251), Приморском крае (DQ121415), Томской области (АВ073806) и Монголии (JQ664596).

Контроль контаминации. При культивировании в течение 3-х недель бактерии и грибы не обнаружены (ПНР). Микоплазмы не обнаружены (ПЦР). При исследовании в ПЦР и методом культивирования не выявлено ВКЭ, хантавирусов, морбилливирусов (в т.ч. вируса чумы плотоядных), вируса бешенства, Borrelia burgdorferi sensu lato, Anaplasma phagocytophilum, Ehrlichia muris, Ehrlichia chaffeensis, Rickettsia sp.

Чувствительность к вирусам. Поддерживает репродукцию ВКЭ.

Пример 1. Получение линии клеток ApnK.

Цельные почки азиатской лесной мыши получали при заборе материала от грызунов для вирусологических исследований. Вид мыши определяли на основе морфологических признаков. Для приготовления суспензии клеток почек, органы гомогенизиовали с помощью фарфоровой ступки и пестика. Клетки суспендировали в 5 мл раствора трипсина (0,167%) в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. После этого суспензию центрифугировали при 1200g, удаляли супернатант и ресуспендировали в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Первичные культуры клеток инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂ до формирования монослоя. Клеточную линию пассировали по мере формирования монослоя с разведениями 1:2-1:5.

Пример 2. Культивирование линии клеток ApnK.

Клеточную линию ApnK выращивали в культуральном флаконе с площадью рабочей поверхности 25 см² до формирования 90% монослоя. Ростовую среду удаляли и клетки открепляли с помощью раствора трипсина (0,25%) и ЭДТА (0,5 mM) в фосфатно-солевом буфере (pH=7,4) при температуре 37°C. После этого суспензию клеток центрифугировали при 1200g, удаляли супернатант и ресуспендировали в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина. Суспензию клеток в количестве 1 мл переносили в чистый культуральный флакон с площадью рабочей поверхности 25 см² и инкубировали при 37°C в атмосфере 5% CO₂. Клеточную линию пассировали по мере формирования монослоя с разведением 1:5.

Пример 3. Репродукция ВКЭ в клеточной линии ApnK. Линию клеток ApnK выращивали на 24-луночных планшетах в количестве 1,5×10⁵ клеток на лунку. Культуральную жидкость удаляли, промывали монослой стерильным фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и заражали ВКЭ с множественностью инфекции 1 бляшкообразующая единица (БОЕ) на клетку. Адсорбцию проводили в течение 1 ч при 37°C. После этого, заражающую дозу убирали и тщательно отмывали несвязавшийся вирус посредством трех промывок монослоя и стенок планшеты средой RPMI 1640 без сыворотки. Затем вносили в каждую лунку 1 мл среды поддержки (RPMI1640 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина). Зараженные клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение двух недель. В течение первых суток культуральную жидкость собирали каждые 4 часа, после этого - один раз в 4 дня. Каждую временную точку собирали в трех независимых повторах. Содержание инфекционного ВКЭ в культуральной жидкости определяли с помощью титрования БОЕ и выражали в виде логарифма БОЕ по основанию 10 в 1 мл культуральной жидкости (lg БОЕ/мл). Нарастание количества инфекционного вируса начинается между 12 и 16 часами после заражения и достигает максимальных значений с титром 7,1 lg БОЕ/мл на 4 день инфекции. Без смены среды поддержки к 14 дню количество инфекционного вируса снижается до титра 6 lg БОЕ/мл, возможно, из-за деградации монослоя клеток вследствие истощения культуральной среды (см приложение к описанию, фиг. 3). На фиг. 3 представлена репродукция инфекционного ВКЭ в линии клеток ApnK. Приведены средние значения трех независимых повторов. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение. Обнаружено, что ВКЭ не оказывает цитопатического действия на линию клеток ApnK, через трое суток после заражения выживаемость клеток составляет 90-100% по сравнению с контролем, а через 8 суток - 80-81%. Таким образом, установлено, что клеточная линия ApnK стабильно и эффективно поддерживает репродукцию ВКЭ в течение длительного времени без гибели культуры клеток.

Пример 4. Накопление антигена ВКЭ в клеточной линии ApnK. Линию клеток ApnK выращивали на 24-луночных планшетах в количестве 1,5×10⁵ клеток на лунку. Культуральную жидкость удаляли, промывали монослой стерильным фосфатно-солевым буфером (pH=7,4) и заражали ВКЭ с множественностью инфекции 1 бляшкообразующая единица (БОЕ) на клетку. Адсорбцию проводили в течение 1 ч при 37°C. После этого, заражающую дозу убирали и тщательно отмывали несвязавшийся вирус посредством трех промывок монослоя и стенок планшеты средой RPMI 1640 без сыворотки. Затем вносили в каждую лунку 1 мл среды поддержки (RPMI1640 с добавлением 2% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина). Зараженные клетки инкубировали при 37°C, 5% CO₂ в течение трех недель. В течение первых суток культуральную жидкость собирали каждые 4 часа, после этого - один раз в 4 дня. Каждую временную точку собирали в трех независимых повторах. Антиген ВКЭ выявляли с помощью иммуноферментного анализа с тест-системой «Векто-ВКЭ антиген» (Вектор-бест, Новосибирск). Концентрацию антигена ВКЭ оценивали по оптической плотности реакционной смеси при длине волны 450 нм в сравнении с незараженными клетками и контрольными образцами антигена ВКЭ. Нарастание концентрации специфичного антигена начинается через 16-20 часов после заражения и достигает максимальных значений на четвертые сутки инфекции (см приложение к описанию, фиг. 4). К этому времени концентрация антигена ВКЭ превышала как концентрацию контрольных коммерческих антигенов (2,7±0,4 ОЕ), так и аналитический предел тест-системы (3,5 ОЕ). После этого концентрация оставалась стабильно высокой в течение 14 дней с тенденцией к некоторому снижению к концу третьей недели инкубации (см приложение к описанию, фиг. 4).

На фиг. 4 показано накопление антигена ВКЭ в культуральной жидкости с использованием клеточной линии ApnK. Приведены средние значения трех независимых повторов. Планки погрешностей отражают стандартное отклонение.

К концу эксперимента показатели серопозитивности культуральной жидкости (3,4 ОЕ) превышали таковые контрольных образцов антигена ВКЭ (в среднем 2,45 ОЕ) в 1,5 раза. Установлено, что линия клеток ApnK позволяет накапливать антиген ВКЭ в культуральной жидкости без смены среды в течение, не менее 3-х недель.

Таким образом, предлагаемая монослойная перевиваемая линия клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae позволяет поддерживать репродукцию вируса клещевого энцефалита и накапливать вирус в культуральной жидкости в количестве 6-7,1 lg БОЕ/мл. При этом происходит выработка специфичного антигена ВКЭ в количествах, сопоставимых с коммерческими антигенами ВКЭ. Кроме того, полученную линию клеток можно использовать для изучения in vitro биологии ВКЭ в условиях близких к естественным.

Литература:

1. Клещевой энцефалит: Этиология. Эпидемиология и профилактика в Сибири. / Злобин В.И., Горин О.З. - Новосибирск: Наука. Сибирская издательская фирма РАН, 1996. - 177 с;

2. Балахонов С.В., Никитин А.Я., Андаев Е.И., Алленов А.В., Борисенко Е.А., Зверева Т.В., Гордейко Н.С., Краснощеков В.Н., Аделыпин Р.В., Борисова Т.Н., Вержуцкая Ю.А., Вершинин Е.А., Сидорова Е.А. Эколого-паразитологическая характеристика совмещенных очагов инфекций, передаваемых клещами, на территории проведения саммита АТ-ЭС (2012 г.) // Сибирский медицинский журнал (Иркутск). 2012. Т. 111. №4. С. 67-71

3. Mandl CW, Kroschewski Н, Allison SL, Kofler R, Holzmann H, Meixner T, Heinz FX. Adaptation of tick-borne encephalitis virus to BHK-21 cells results in the formation of multiple heparan sulfate binding sites in the envelope protein and attenuation in vivo. J Virol. 2001; 75 (12): 5627-37.

4. Воробьева M.C., Расщепкина M.H. История создания и развитие производства вакцины клещевого энцефалита в России и за рубежом. // Дальневосточный журнал инфекционной патологии. №11, 2007, С. 21-26

5. Stoltz et al. 2011, Eckerle et al. 2013, Tigabu B1, Juelich T, Holbrook MR. Comparative analysis of immune responses to Russian spring-summer encephalitis and Omsk hemorrhagic fever viruses in mouse models. // Virology. 2010; 408 (1): 57-63

6. Emeny JM, Morgan MJ. Regulation of the interferon system: evidence that Vero cells have a genetic defect in interferon production. J Gen Virol. 1979; 43 (1): 247-52.

7. Морозова О.В., Гришечкин А.Е., Бахвалова В.Н., Исаева Е.И., Подчерняева Р.Я. Динамика репродукции вируса клещевого энцефалита в культурах клеток. // Вопросы вирусологии. 2012. Т. 57. №2. С. 40-43

8. Eckerle I, Lenk М, Ulrich RG. More novel hantaviruses and diversifying reservoir hosts--time for development of reservoir-derived cell culture models? // Viruses. 2014; 6 (3): 951-67;

9. Stoltz M, KB, Hidmark , Tolf C, Vene S, Ahlm C, Lindberg AM, Lundkvist , J. A model system for in vitro studies of bank vole borne viruses. // PLoS One. 201 1; 6 (12): e 28992.;

10. Mourya DT, Lakra RJ, Yadav PD, Tyagi P, Raut CG, Shete AM, Singh DK. Establishment of cell line from embryonic tissue of Pipistrellus ceylonicus bat species from India & its susceptibility to different viruses. // Indian J Med Res. 2013; 138: 224-31;

11. Sheng Li Xue Bao. [Primary culture and purification of cerebral astrocyte of tree shrew]. // Acta Phys. Sinica, 201 1; 63 (1): 89-92

12. Sanada T, Seto T, Ozaki Y, Saasa N, Yoshimatsu K, Arikawa J, Yoshii K, Kariwa H. Isolation of Hokkaido virus, genus Hantavirus, using a newly established cell line derived from the kidney of the grey red-backed vole (Myodes rufocanus bedfordiae). J Gen Virol. 2012; 93 (Pt 10): 2237-46

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов, включающий гомогенизацию почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae, затем суспендирование в 5 мл раствора трипсина (0,167%) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и инкубирование суспензии при 37°С в течение 1 часа, после чего суспензию центрифугируют при 1200g, удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 м кг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина, затем первичные культуры клеток инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂ до формирования монослоя. Изобретение может быть использовано для производства вакцин и диагностических препаратов, а также для выделения, накопления и изучения ВКЭ. 4 ил., 4 пр.

Способ получения монослойной перевиваемой линии клеток почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae для репродукции вируса клещевого энцефалита и производства вирусного антигена для вакцин и диагностических препаратов, включающий гомогенизацию почки восточноазиатской лесной мыши Apodemus peninsulae, затем суспендирование в 5 мл раствора трипсина (0,167%) в фосфатно-солевом буфере (рН 7,4) и инкубирование суспензии при 37°С в течение 1 часа, после чего суспензию центрифугируют при 1200g, удаляют супернатант и ресуспендируют осадок в 5 мл среды RPMI1640 с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед./мл пенициллина, 100 м кг/мл стрептомицина и 2 мМ L-глутамина, затем первичные культуры клеток инкубируют при 37°С в атмосфере 5% СО₂ до формирования монослоя.