Применение пирролилазинов в качестве активаторов синтеза белков теплового шока Российский патент 2023 года по МПК C07D403/04 A61K31/473 A61K31/506 A61K31/517 A61P25/28 

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины, в частности к активаторам синтеза белков теплового шока и их применению для лечения нейродегенеративных заболеваний, в особенности болезни Альцгеймера.

Болезнь Альцгеймера (БА) является нейродегенеративным заболеванием, при котором человек постепенно утрачивает умственные способности: память, речь, способность мыслить логически и ориентироваться. Чаще всего болезнь Альцгеймера обнаруживают у людей старше 65 лет, в редких случаях встречается и более раннее начало. Общемировая заболеваемость на 2010 г. оценивалась в 35,6 млн. человек, к 2030 г. прогнозируется ее увеличение до 65,7 млн., а к 2050 г. - до 115,4 млн.

Болезнь Альцгеймера распространена во многих странах: США, Китай, Индия, Латинская Америка, Россия. Самые высокие темпы роста случаев деменции прогнозируются в Китае и других азиатских странах.

В настоящее время эффективные лекарственные препараты, предупреждающие или вылечивающие болезнь Альцгеймера, только разрабатываются. Современные препараты в основном продлевают активность тех клеток мозга, которые еще не разрушены патологическим процессом. Наиболее традиционным подходом к лечению данного заболевания является компенсаторная терапия, основанная на компенсации функций холинэргической системы, пониженных при болезни Альцгеймера. Одними из используемых средств при этом способе лечения являются терапевтические препараты на основе ипидакрина (2,3,5,6,7,8-гексагидро-1H-циклопента[b]хинолин-9-амин). Также в соответствии с проведенными исследованиями выявлены препараты, помогающие улучшить качество жизни пациентов. К ним относятся ноотропы (пирацетам), антидепрессанты (пирлиндол, тразодон), нейролептики (рисперидон).

Болезнь Альцгеймера, как и другие нейродегенеративные заболевания, в последнее время называют конформационной, так как она связана с изменениями пространственной структуры белковой молекулы. Механизм возникновения различных «конформационных» патологий основан на агрегации белков с измененной пространственной структурой. За правильное сворачивание белка и предупреждение агрегации в клетке отвечают различные молекулярные шапероны, в частности шаперон Hsp70. Уровень Hsp70 в клетках человека с возрастом понижается, вследствие этого возрастает риск развития болезни Альцгеймера. В связи с этим поиск веществ, способных повысить уровень экспрессии шаперонов и, возможно, эффективность шаперонного механизма, представляется очень важным как с фундаментальной, так и с практической точки зрения.

Задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является создание средства для лечения нейродегенеративных заболеваний, а именно, создание новых соединений, обладающих свойством активировать синтез шаперонов, в частности, белков теплового шока.

Задача решалась тем, что были синтезированы новые химические соединения - производные пирролилазинов. Было продемонстрировано, что полученные соединения способны активировать синтез белков теплового шока (БТШ). Также было показано, что все соединения по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения болезни Альцгеймера.

В качестве одного из вариантов осуществления изобретения предлагается производное пирролилазина 3-(5-фенил-1H-пиррол-2-ил) хиноксалин-2(1H)-он (далее PQ-29). Было показано, что PQ-29 обладает способностью активировать синтез функционально активных БТШ, а также оказывать защитное действие в клеточной модели болезни Альцгеймера.

В качестве другого варианта осуществления изобретения предлагается производное пирролилазина 9-(5-гидрокси-1H-индол-3-ил)-10-метилакридиний иодид (далее KD-47). Было показано, что KD-47 обладает способностью активировать синтез БТШ, а также оказывать защитное действие в клеточной модели болезни Альцгеймера.

В качестве другого варианта осуществления изобретения предлагается производное пирролилазина 4-(5-бром-1H-индол-3-ил)-2-хлорпиримидин (далее ЕА-3). Было показано, что ЕА-3 обладает способностью активировать синтез БТШ, а также оказывать защитное действие в клеточной модели болезни Альцгеймера.

В качестве другого варианта осуществления изобретения предлагается производное пирролилазина 4-(5-бром-1H-индол-3-ил)хиназолин (далее ТМ-378). Было показано, что ТМ-378 обладает способностью активировать синтез БТШ, а также оказывать защитное действие в клеточной модели болезни Альцгеймера.

Все четыре производных пирролилазина по настоящему изобретению активируют синтез белков теплового шока, вызывая значимое накопление Hsp70 в клетках, а также стимулируют повышение шаперонной активности Hsp70 в клетках. Также, соединения по настоящему изобретению демонстрируют защитное действие в клеточной модели болезни Альцгеймера: препятствуют ингибированию пролиферации, вызванному Аβ1-42, предотвращают активацию β-галактозидазы, вызванную Аβ1-42, препятствуют активации апоптоза в культуре нейрональных клеток человека в ответ на действие Аβ1-42, - и, таким образом, могут быть использованы при создании препарата для лечения болезни Альцгеймера.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами.

На Фиг. 1А представлен результат скрининга производных пирролилазинов с помощью клеточной линии, HEK-hsp70.1pr-luc, трансфицированной геном люциферазы под контролем промотора, содержащего участок heat shock element (HSE), который в норме регулирует экспрессию генов нескольких белков теплового шока, в частности, Hsp70. Активация промотора происходит в ответ на тримеризацию белка Hsf1 и приводит к накоплению люциферазы в модельных клетках, т.е. представляемые в заявке вещества способны активировать экспрессию генов белков теплового шока, в том числе Hsp70.

На Фиг. 1Б представлены химические формулы отобранных для дальнейших экспериментов производных пирролилазинов.

На Фиг. 1В представлены результаты вестерн-блот анализа лизатов мезенхимальных стволовых клеток человека, перепрограммированных в нейрональный фенотип и культивированных в течение 24 ч в присутствии производных пирролилазинов. Представлена окраска на шаперон Hsp70 и на белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД, в качестве контроля нагрузки). В качестве положительного контроля для накопления белка Hsp70 был использован тепловой шок.

На Фиг. 1Г представлены результаты измерения шаперонной активности Hsp70, проведенные с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) методом Ваврзинова и др. и модифицированным Новоселовым и др. (Wawrzynów and Zylicz, 1995; Novoselov et al., 2005). В качестве положительного контроля для повышения шаперонной активности Hsp70 был использован тепловой шок.

На Фиг. 1Д представлены данные о полулетальной концентрации производных пирролилазинов на культуре мезенхимальных стволовых клеток человека, перепрограммированных в нейрональный фенотип. Результаты были получены с помощью набора CytoTox96 (Promega, UK).

На Фиг. 2А представлены результаты анализа клеточного индекса в культуре мезенхимальных стволовых клеток человека, перепрограммированных в нейрональный фенотип, в присутствии Аβ1-42 и производных пирролилазинов в различных концентрациях.

На Фиг. 2Б представлены результаты анализа активности β-галактозидазы в культуре мезенхимальных стволовых клеток человека, перепрограммированных в нейрональный фенотип, спустя 48 ч культивирования в присутствии Аβ1-42 и производных пирролилазинов в различных концентрациях. Результаты получены с помощью набора Mammalian beta-Galactosidase Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, USA).

На Фиг 2B представлены результаты анализа доли апоптозных клеток в культуре мезенхимальных стволовых клеток человека, перепрограммированных в нейрональный фенотип, спустя 24 ч культивирования в присутствии Аβ1-42 и производных пирролилазинов в различных концентрациях. Результаты получены с помощью метода проточной цитометрии клеток, окрашенных с помощью набора Annexin V, Alexa Fluor™ 488 conjugate (Thermo Fisher Scientific, USA).

Изобретение поясняется следующими примерами

Пример 1. Получение производных пирролилазинов

Производные пирролилазинов были получены методом аэробного сочетания азаароматических соединений с производными азолов (пирролов и индолов) в присутствии кислорода воздуха и катализатора TiO₂ в качестве эффективной гетерофазной фотокаталитической окислительной системы. Соединения PQ-29 (3-(5-фенил-1H-пиррол-2-ил)хиноксалин-2(1H)-он) и KD-47 (9-(5-гидрокси-1H-индол-3-ил)-10-метилакридиний иодид) были получены из соответствующих азинов (хиноксалин-2(1H)-она и 10-метилакридиния иодида) (1 экв.) и производных азолов (2-фенипиррола и 5-гидрокси-1H-индола) (2 экв.) при облучении в диапазоне видимого света в течение 5 часов и барботаже воздухом, подходящей температуре и растворителе в присутствии TiO₂ катализатора (10 масс. %), для соединения PQ-29 (растворитель - уксусная кислота, 120°С), для соединения KD-47 (растворитель - н-бутанол, 20°С). Производное ТМ-378 (4-(5-бром-1H-индол-3-ил)хиназолин) было получено при перемешивании хиназолина (1 экв.) и 5-бром-1H-индола (2 экв.) в смеси растворителей CF₃COOH - С₆Н₆ (1:2) при комнатной температуре в течение 10 часов, а затем при добавлении водного раствора NaOH (2 экв.) и облучении в диапазоне видимого света и барботаже воздухом в присутствии TiO₂ катализатора (10 масс. %) в течение 5 часов. Соединение ЕА-3 (4-(5-бром-1H-индол-3-ил)-2-хлорпиримидин) было получено при перемешивании 2-хлорпиримидина (1 экв.) и 5-бром-1H-индола (2 экв.) в ацетонитриле с BF₃OEt₂ (2 экв.) в течение 10 часов, а затем при добавлении водного раствора NaHCO₃ (2 экв.) и облучении в диапазоне видимого света и барботаже воздухом в присутствии TiO₂ катализатора (10 масс. %) в течение 5 часов. Подробнее способ получения производных пирролилазинов описан в: Utepova I.A., Trestsova М.А., Chupakhin O.N., et al. (2015) Aerobic oxidative C-H/C-H coupling of azaaromatics with indoles and pyrroles in the presence of TiO₂ as a photocatalyst. Green Chem., 17, 4401-4410; Утепова И.А., Тресцова M.A., Чупахин O.H. и др. (2016) Прямая функционализация С-Н-связи в (гетеро)аренах: аэробное фотоиндуцируемое окислительное сочетание азинов с ароматическими нуклеофилами (S_N^H-реакции) в присутствии фотокатализатора CdS/TiO₂. Известия Академии наук. Серия химическая, 2016, 2, 445-450].

Пример 2. Скрининг полученных соединений.

Для поиска индукторов синтеза Hsp70 была использована репортерная система, основанная на клеточной линии HEK-hsp70.1pr-luc, трансфицированной геном люциферазы под контролем промотора, содержащего участок heat shock element (HSE), который в норме регулирует экспрессию генов нескольких белков теплового шока, в частности, Hsp70. Активация промотора происходит в ответ на тримеризацию белка Hsf1 [Westerheide, S.D., Bosman, J. D., Mbadugha, B. N. A., et al. (2004). Celastrols as inducers of the heat shock response and cytoprotection. J. Biol. Chem. 279, 56053-56060] и приводит к накоплению люциферазы в модельных клетках.

Было показано, что ряд производных пирролилазинов приводит к многократному увеличению количества люциферазы в клетках, что свидетельствует о способности этих соединений активировать промотор белков теплового шока (Фиг. 1А). В результате были отобраны четыре производных пирролилазинов для дальнейших экспериментов (Фиг. 1Б)

Пример 3. Активация синтеза белков теплового шока.

Далее была проверена способность отобранных соединений вызывать накопление белка Hsp70 в культуре перепрограммированных в нейрональный фенотип мезенхимальных стволовых клеток человека MSC-DP. Клетки MSC-DP (получены из Российской коллекции клеточных культур) для перепрограммирования культивировали в среде Neurobasal (Gibko, USA) в присутствии добавки НейроМакс (ПанЭко, Россия) в течение 5 дней. Верификацию нейронального фенотипа проводили на основе анализа экспрессии нейрональных маркеров МАР-2 и β-3-тубулина с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. После дифференцировки клеток в нейрональный фенотип в среду добавляли тестируемые соединения. Спустя еще 48 часов клетки лизировали, лизат подвергали электрофоретическому разделению и вестерн-блот анализу по описанному ранее протоколу [Lazarev, V. F., Sverchinskyi, D. V, Ippolitova, et al. (2013). Factors Affecting Aggregate Formation in Cell Models of Huntington's Disease and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Acta Naturae 5, 81-9]. Мембрану с перенесенными белками последовательно инкубировали с мышиными антителами против Hsp70 клон 2Н9 [Lasunskaia, Е. В., Fridlianskaia, I. I., Guzhova, I. V., et al. (1997). Accumulation of major stress protein 70kDa protects myeloid and lymphoid cells from death by apoptosis. Apoptosis 2, 156-163], GAPDH (клон 6C5, Abeam, Великобритания) и затем с антителами против антител мыши, меченными пероксидазой хрена (Abeam, Великобритания). Окраску блота антителами против GAPDH использовали в качестве контроля общей белковой нагрузки проб.

Все проверенные соединения вызывали значимое накопление Hsp70 в клетках спустя 48 часов инкубации (Фиг. 1В). В качестве положительного контроля для накопления белка Hsp70 был использован тепловой шок.

Для определения функциональной (шаперонной) активности Hsp70 в клетках после культивирования их в присутствии тестируемых соединений мы использовали иммуноферментный анализ по методу Ваврзинова [Wawrzynow, A., and Zylicz, М. (1995). Divergent effects of ATP on the binding of the DnaK and DnaJ chaperones to each other, or to their various native and denatured protein substrates. J. Biol. Chem. 270, 19300-6], модифицированного Новоселовым [Novoselov, S. S., Novoselova, Т. V, Verbova, M. V, et al. (2005). The balance between Hsp70 and its cochaperones Hdjl and Bagl determines its substrate-binding activity. Tsitologiia 47, 220-9]. Для этого субстрат для Hsp70 карбоксиметиллированный лактальбумин (КМЛА) иммобилизовывали в лунках 96 луночного планшета в концентрации 10 мкг/мл в фосфатно солевом растворе (ФСР). Для блокирования неспецифического связывания в лунки планшета вносили 0,3%-ный раствор БСА («Sigma», США) в ФСР и затем клеточные экстракты в концентрациях 10 и 30 мкг/мл. Hsp70, входящие в состав белковой смеси экстрактов, связывались с денатурированным белком мишенью. Далее в лунки вносили раствор антител 2Н9 против Hsp70. Проявление пероксидазной активности проводили ранее описанным способом [Lasunskaia, Е.В., Fridlianskaia, I., Arnoldt, А. V., et al. (2010). Sub-lethal heat shock induces plasma membrane translocation of 70-kDa heat shock protein in viable, but not in apoptotic, U-937 leukaemia cells. APMS 118, 179-187].

Все проверенные производные пирролилазинов вызывали повышение шаперонной активности Hsp70 в клетках. В качестве положительного контроля для повышения шаперонной активности Hsp70 был использован тепловой шок.

Для анализа полулетальной концентрации мы культивировали клетки, перепрограммированные в нейрональный фенотип в присутствии тестируемых соединений (в концентрациях от 10 1000 μM) в течение 48 часов. Анализ цитотоксичности проводили с помощью колориметрического набора CytoTox96 (Promega, USA). Результаты, представленные на Фиг. 1Д, свидетельствуют о крайне высоком значении полулетальной концентрации пирролилазинов и, соответственно, об их безопасности.

Пример 4. Активность производных пирролилазинов на модели болезни Альцгеймера.

Для моделирования болезни Альцгеймера мы вносили в ростовую среду к клеткам, перепрограммированным в нейрональный фенотип, препарат β-амилоида (Аβ1-42) в концентрации 20 μМ по стандартному протоколу. Эффективность защитного действия соединений из ряда пирролилазинов определяли с помощью нескольких тестов: определение клеточного индекса, определение активности β-галактозидазы, определение доли апоптозных клеток с помощью окраски на аннексии V.

Все проверенные соединения продемонстрировали защитное действие. В концентрации 0.5 μМ все производные пирролилазаинов препятствовали ингибированию пролиферации, вызванному Аβ1-42 (Фиг. 2А). Пирролилазины в концентрации 1 μМ практически полностью предотвращали активацию β-галактозидазы, вызванную Аβ1-42 (Фиг. 2Б). Все проверенные производные пирролилазинов препятствовали активации апоптоза в культуре нейрональных клеток человека в ответ на действие Aβ1-42 (Фиг. 2В).

Изобретение относится к области химии и фармацевтики, в частности к активаторам синтеза белков теплового шока. Раскрывается применение соединения, выбранного из группы 9-(5-гидрокси-1H-индол-3-ил)-10-метилакридиний иодида, 4-(5-бром-1H-индол-3-ил)-2-хлорпиримидина, 4-(5-бром-1H-индол-3-ил)хиназолина и 3-(5-фенил-1Н-пиррол-2-ил)хиноксалин-2(1H)-она для активации синтеза белков теплового шока, а также соединения 9-(5-гидрокси-1Н-индол-3-ил)-10-метилакридиний иодид и 4-(5-бром-1Н-индол-3-ил)хиназолин в качестве активаторов синтеза белков теплового шока. Использование изобретения позволяет эффективно активировать синтез белков теплового шока. 3 н.п. ф-лы, 8 ил., 4 пр.

1. Применение соединения, выбранного из группы 9-(5-гидрокси-1H-индол-3-ил)-10-метилакридиний иодида, 4-(5-бром-1H-индол-3-ил)-2-хлорпиримидина, 4-(5-бром-1H-индол-3-ил)хиназолина и 3-(5-фенил-1Н-пиррол-2-ил)хиноксалин-2(1H)-она для активации синтеза белков теплового шока.

2. Соединение 9-(5-гидрокси-1Н-индол-3-ил)-10-метилакридиний иодид в качестве активатора синтеза белков теплового шока.

3. Соединение 4-(5-бром-1Н-индол-3-ил)хиназолин в качестве активатора синтеза белков теплового шока.