МИКРОУСТРОЙСТВО ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2023 года по МПК C12M3/00 

Область техники

Область техники настоящего изобретения, в общем, относится к усовершенствованиям в микроустройствах для культивирования клеток, в частности, клеток млекопитающих. Настоящие микроустройства обычно имеют форму устройств-носителей клеток и микроустройств для их культивирования. Однако устройства-носители равным образом применимы к культивированию клеток, дифференциации стволовых клеток, анализов методом клеточных чипов, лечения бесплодия и, в частности, лечения посредством экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Конкретные воплощения относятся к микроустройствам, содержащим блоки для культивирования клеток, картриджи, наборы и перфузионные устройства, содержащие блок-носитель клеток и блок покрытия клеток.

Предшествующий уровень техники

С момента широкомасштабной доступности микроустройств для культивирования тканей методики культивирования тканей в микромасштабе продвинулись в сложности, и их область применения и приложения стала значительно более разнообразной. Микроустройства делают возможным манипулирование с клетками и их средами культивирования, порождая новые терапии, продукты и способы, многие из которых все еще находятся в их зачаточном состоянии. Новые микроустройства и улучшения существующих микроустройств, таких как микроструйные устройства, технологии «культивирования на чипе», микрокаркасные устройства и устройства для микроманипулирования, породили новые подходы 3D (трехмерной) инженерии тканей, дифференциации стволовых клеток и репродуктивной медицины, а также революционные успехи в показателях успешности данных методик.

Например, сложное культивирование ткани in vitro было ранее ограниченным в успехе и применении ограниченным возможным обменом газов посредством диффузии, однако разработка микрокапиллярных перфузионных устройств теперь делает возможным культивирование и пролиферацию больших и более сложных тканей. Относительно методик культивирования стволовых клеток (и их применения) системы культивирования органов из разных эмбриональных тканей теперь делают возможным культивирование эмбрионального мозга, сетчатки, зачатка конечности, легкого, почки, слюнной железы, волосяной луковицы и линий клеток зуба. Применение новых методик тканевой инженерии и микроустройств, которые делают возможными данные методики, будет стимулировать новые и улучшенные подходы в отношении целого ряда разных терапий.

Потенциальная польза в отношении улучшений культивирования и пролиферации клеток, возникающая из-за улучшенных микроустройств, является значимой в пределах области репродуктивной медицины. Природа данной области предлагает мало альтернатив культивированию in vitro и манипулированию с аутологическими клетками, так как данные клетки должны быть отобраны, размножены и повторно введены пациенту.

Репродуктивная помощь посредством экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) стала более доступной, показала недавнее улучшение и, соответственно, оценивается возрастающим числом пациентов. Данные, выпускаемые Управлением по оплодотворению и эмбриологии человека, демонстрируют то, что, в целом, женщины, начинающие лечение ЭКО, с большей вероятностью будут иметь ребенка, чем раньше [1]. Однако между индивидуальными клиниками наблюдается широкий интервал варьирования показателей успеха клиники ЭКО, причем некоторые клиники достигают такого высокого показателя успеха как 46%, тогда как данный показатель в других составляет лишь 10% [1].

Вероятность успеха может варьировать на нескольких стадиях способа ЭКО: во время отбора яйцеклетки, оплодотворения яйцеклетки, развития раннего эмбриона, гиалинизации эмбриона и пересадки эмбриона. Успех отбора яйцеклетки, оплодотворения, развития эмбриона, криоконсервации эмбриона и подготовки пересадки эмбриона в настоящее время, главным образом, зависят от квалификации эмбриолога.

Определяющие факторы успешной ЭКО беременности, которые встречаются во время развития эмбриона, главным образом, включают физические условия и условия среды, присутствующие во время его роста и развития. Любой вид быстрого изменения среды, физический шок или физический стресс, которые могут происходить в отношении спермы, яйцеклетки или развивающегося эмбриона, могут снижать вероятность выживания эмбриона и, в свою очередь, его успешной имплантации для успешной беременности.

Физические условия и условия среды любой системы культивирования клеток вероятно влияют на жизнеспособность и пролиферацию клеток in vitro. Например, выбор между соскобом (вручную/физическим), трипсинизацией (химической/ферментативной) и ультразвуковым воздействием (физическим/мягким) для отделения прилегающих клеток в препарате для культивирования in vivo сильно влияет на жизнеспособность клеток и, главным образом, зависит от типа клеток, буферов и других используемых компонентов сред.

В тканевой инженерии сборка функциональных трехмерных тканевых структур во время морфогенеза и органогенеза зависит от межклеточных взаимодействий между монослоями тканей. Данные взаимодействия клетка-клетка запускаются и поддерживаются физическими сигналами и сигналами среды в пределах культуральной системы, включая приложение механических сил, форму клеток, геометрию внеклеточного матрикса или другие свойства и физический контакт клетка-клетка, и другие морфогенетические факторы. Аналогично дифференциация стволовых клеток также управляется многими факторами в пределах матрикса культуры клеток, включая специфичные в отношении клеток факторы роста, ферменты и другие белки или истощение, или образование данных компонентов или их побочных продуктов.

Для эмбриогенеза самый значимый шок или стресс в отношении развивающегося эмбриона происходит посредством обращения и физического манипулирования, на которые влияют опыт, подготовка и усталость эмбриолога. Несколько событий во время роста и подготовки эмбриона для методик ЭКО включают физическое вмешательство эмбриолога и, следовательно, представляют риск для вероятности успеха выживания эмбриона и его имплантации. Процесс отбора спермы, яйцеклетки и ее введения в среду ex-vivo представляют риск стресса или шока в отношении спермы и яйцеклетки как от физического повреждения, так и от вредного влияния среды во время размещения in-silico, а также биохимического стресса от помещения в другую жидкую среду.

Процесс оплодотворения представляет риск повреждения от физического манипулирования, требующегося для введения спермы (независимо от того, является ли оно внутрицитоплазматическим или нет). Оптимизация среды для культивирования эмбриона и удаления эмбриона, как только он развился, для криоконсервации или имплантации увеличивает риск физического повреждения. Физическая имплантация эмбриона также создает возможность физического повреждения или поражения эмбриона. На риск поражения или шока от манипулирования и обращения, и, следовательно, успех процедур ЭКО, главным образом, влияет квалификация и аккуратность эмбриолога, а также точность инструментов и прибора, которые находятся в распоряжении эмбриолога, и условия среды, созданные в лаборатории, на которые влияет эмбриолог (например, стерильность, температура, предупреждение какого-либо вида загрязнения, включая загрязнение летучими органическими соединениями, помимо управления идентификацией родства для предупреждения ошибочного или смешанного родства).

Точные инструменты и оборудование снижают вероятность того, что эмбриолог может сделать ошибки, приводящие к поражению или шоку в отношении спермы, яйцеклетки или эмбриона, или в отношении ошибочного родства. Кроме того, инструменты или оборудование, которые снижают или устраняют физические вмешательства или манипуляции эмбриологом, уменьшают вероятность того, что может произойти событие, вызывающее физический шок в отношении спермы, яйцеклетки или эмбриона. Кроме того, инструменты или оборудование, которые уменьшают вариацию в оптимизированной среде ex-vivo, также уменьшают биохимический стресс в отношении яйцеклетки или эмбриона.

В то время как были сделаны успехи в отношении микроинъекционных устройств, используемый в терапиях ЭКО, а также устройств визуализации, был сделан очень малый прогресс в отношении разработки микроустройств для обращения с участвующими клетками, когда с ними необходимо осуществлять манипуляции или содержать их способом, который уменьшает избыточное обращение или манипулирование.

Типично развивающийся эмбрион культивируют в большом объеме жидкой культуральной среды, что минимизирует физическое воздействие, возникающее из-за истощения важных компонентов среды по мере того, как они утилизируются клетками, и также минимизирует любое физическое воздействие, возникающее из-за возрастающих концентраций продуктов жизнедеятельности в культуральной среде. Однако даже очень маленькие увеличения продуктов жизнедеятельности и очень маленькие уменьшения уровней питательных веществ могут весьма значительно воздействовать на развивающиеся клетки. Физическое воздействие данных изменений в композиции культуральной среды во время роста усугубляется изменением метаболических потребностей эмбриона во время развития.

Эти вызовы сродни тем, с которыми сталкиваются при разработке органоидов или сложных тканей in vitro. Изменяющиеся метаболические потребности клеток на всем протяжении их развития в более сложные ткани и, в самом деле, тканевые структуры, вводят более сложные требования системы культивирования ткани in vitro.

Сдерживание физического воздействия связанных с развитием изменений в пределах содержащегося объема культуральной среды не является простым.

Для культивирования эмбриона обеспечение достаточного разведения для минимизации воздействия изменений среды является сложным, так как объем культуральной среды должен оставаться достаточно маленьким для того, чтобы эмбрион оставался обнаруживаемым эмбриологом, и большие объемы среды увеличивают вероятность того, что эмбрион будет разводить известные вещества, продуцируемые эмбрионом, для помощи в его собственном росте или станет сложным в обнаружении, приводя к избыточным операциям или манипулированию.

Обычный подход, предпринимаемый эмбриологами для решения данного вопроса, включает получение ряда культуральных сред, через которые развивающийся эмбрион циклирует на протяжении всего его развития in vitro. Польза данного подхода заключается в том, что каждая культуральная среда, среда оплодотворения или криоконсервирующая среда может быть конкретно адаптирована к нуждам клеток на конкретной стадии развития или манипулирования, однако, даже с оптимизацией компонентов среды для удовлетворения потребностей стадии роста эмбриона стресс, испытываемый клетками при перемещении из одной жидкой среды в другую, все еще вредно воздействует на развитие.

Для преодоления данной проблемы разрабатывали разные микроструйные и жидкостные или газовые перфузионные приборы с варьирующими степенями успеха. Микроструйные микроустройства «культуры на чипе» были разработаны для использования микрогидродинамики для перемещения или «сворачивания» клетки или клеточной массы из одной «ванны» клеточной культуры в следующую для предупреждения шока клеток из-за избыточного манипулирования. Другие микроструйные устройства адаптированы для обеспечения длительного тока жидкой среды в и из более традиционной системы культуральных чашек для клеток на протяжении всего развития оплодотворенной яйцеклетки до ее стадии эмбриона и для подготовки для криоконсервации и пересадки эмбриона. Данные разработки были плохо приняты, и многие эмбриологи все еще имеют тенденцию к предпочтению статичных методик культивирования с использованием чашек Петри или варианта конструкции чашки Петри, так как в данных сосудах эмбрионы легче обнаруживать и отбирать.

Ни один подход не разрешает потребность в оптимальном газообмене, а также в обмене жидкостей. Во всей ткани и, в частности, при морфогенезе и дифференциации стволовых клеток, адекватная аэрация посредством диффузии газов является критически важной для развития.

Попытки приложения микроструйных методик к статичной культуре эмбрионов появились только недавно [2]. Исследователи все еще открывают и оптимизируют методики, которые обеспечивают то, что яйцеклетка и развивающийся эмбрион не движутся избыточно таким образом, чтобы избежать повреждения или стресса, при одновременном управлении очень маленьким объемом культуральной среды, который может удерживаться в пределах очень маленьких каналов микроструйных устройств. Однако к настоящему времени комбинация перфузии в пределах микроструйных устройств не была достигнута с какой-либо степенью клинического применения.

Посредством принципов инженерии, уставленных в работах Richard Feynman, хорошо установлено то, что уменьшение масштаба инженерных систем от макромасштаба до микромасштаба представляет более широкий спектр новых применений, однако, оно провоцирует физические вызовы испарения, смазывания, нагревания и инерции, которые в таких малых масштабах работают совсем по-другому. Инженерная конструкция, адаптированная к данному масштабу, еще не была адекватно реализована для культуры клеток in vitro. Настоящее раскрытие, по меньшей мере частично, решает данные вопросы посредством усовершенствования конструкции.

В работе Kim Eric Drexler также хорошо установлено то, что применение устройств в нано- и микромасштабе обеспечивает возможности, которые не доступны для устройств в макромасштабе. Макромасштабные клеточные устройства имеют тенденцию к тому, чтобы полагаться на случайные взаимодействия между многими клетками в надежде на то, что одно или более чем одно из данных взаимодействий будет давать намеченные результаты в пределах заранее заданных границ для принятия. Микромасштабные устройства позволяют используемому прямо взаимодействовать с индивидуальной клеткой с целью получения намеченного результата значительно точнее и эффективнее. Последующие взаимодействия затем основываются на предмете значительно ближе к идеалу с получением более точных результатов.

Посредством поддержания физической стабильности спермы, яйцеклетки и эмбриона в пределах их культурального прибора эмбриолог может легче и/или аккуратнее обращаться или манипулировать со спермой, яйцеклеткой или эмбрионом, и минимизировать риск физического шока и/или биохимического стресса или дополнительно предупреждать риск смешанного родства во время оплодотворения, культивирования эмбриона или пересадки эмбриона. Стабилизация клеток во время культивирования может улучшать успех процедур ЭКО.

Такие подходы могут не только решать проблемы при успешном оплодотворении и культивировании развивающихся эмбрионов, но также могут быть применимыми к культивированию других линий клеток, чувствительных к изменению среды культивирования в градиентном процессе.

Краткое изложение сущности изобретения

В одном аспекте данного изобретения воплощения настоящего раскрытия относятся к микроустройству культивирования клетки для поддержания и культивирования в нем клетки, содержащему: блок культивирования клетки, имеющий по меньшей мере первый блок-носитель клетки, определяющий образованную в нем камеру культивирования клетки, причем данный первый блок-носитель клетки, образованный по меньшей мере из следующего: основание камеры, имеющее форму для поддержания на нем клетки, и одна или более чем одна стенка камеры, имеющая одну или более чем одну поверхность стенки камеры, закрывающую данную камеру культивирования клеток примерно по границе камеры, причем данный первый блок-носитель клетки дополнительно обеспечивает направляющую поверхность для направления инструментов или текучих сред в камеру культивирования клеток, расположенную у отверстия, через стенку камеры, причем данное микроустройство для культивирования клеток выполнено в таком масштабе, чтобы по существу закрывать одиночную клетку или клеточную массу в нем.

Термин «клетка» в том виде, в котором он используется в данном документе, следует понимать как взаимозаменимый с термином «клеточный материал», и его следует относить к клетке, группе клеток, ткани или органоиду, который является объектом изобретения, описанным в данном документе.

Термин «культура клеток» в том виде, в котором он используется в данном документе, будет описывать любые средства или процессы, в которых клеточный материал выделяют и поддерживают при контролируемых условиях для анализа, роста, наблюдения, экспериментирования, отбора культуральной среды или других биологических научных процессов.

Термин «микроустройство» в том виде, в котором он используется в данном документе, будет описывать изделия, которые производятся в микрометровом масштабе, например, от 0,1 мкм до 1000 мкм. Микроустройства будут охватывать и статические, и механические устройства, а также устройства в области микроструйной техники.

Термин «поддержание клетки» в том виде, в котором он используется в данном документе, будет относиться к любому способу, при котором клеточный материал хранится в контролируемом окружении таким образом, чтобы получать условия, требующиеся для жизнеспособности. Термин «культивирование клетки» будет относиться к способам культивирования клеток.

Термин «криоконсервация» в том виде, в котором он используется в данном документе, будет относиться к гиалинизации или замораживанию, используемым взаимозаменяемо.

Термин «граница» в том виде, в котором он используется в данном документе, будет использоваться для названия трехмерного разграничения между внутренней частью блока клеточной камеры и наружной частью блока клеточной камеры, и она может определяться стенками, поверхностями, просветами и отверстиями.

В предпочтительных воплощениях направляющая поверхность будет определять искривленную канавку на дне, через которую будут проходить инструменты и будут вводиться в камеру культивирования клеток через отверстие. В качестве альтернативы, текучие среды могут направляться и проходить через искривленную канавку на дне и через отверстие между внутренней и наружной частью камеры культивирования клеток.

В альтернативных воплощениях данная направляющая поверхность будет определять узкое отверстие через стенку камеры, через которое будут проходить инструменты и будут вводиться в камеру культивирования клеток через данное отверстие. В качестве альтернативы, текучие среды могут направляться и проходить через узкое отверстие между внутренней и наружной частью камеры культивирования клеток.

В предпочтительных воплощениях основание данной камеры для клеток может быть по существу вогнутым. В качестве альтернативы, основанию камеры для клеток может быть придана такая форма, чтобы оно было по существу выгнутым, ступенчатым, рифленым или имеющим другие формы, которые можно использовать для поддержания клеточного материала в пределах камеры культивирования клеток.

Блок-носитель клеток по аспектам данного изобретения выполнен так, чтобы он был образован в микромасштабе. Он также, следовательно, предпочтительно образован из подходящих материалов для производства в микромасштабе, которые являются нетоксичными для клеток.

Одна или более чем одна стенка камеры по определенному воплощению может содержать одну или более чем одну внутреннюю поверхность стенки, наклоненную в направлении проксимальной точки камеры таким образом, что они выполнены с возможностью направления размещения инструмента или клетки в пределах камеры культивирования.

В предпочтительных воплощениях одна или более чем одна стенка камеры по аспектам данного изобретения содержит проксимальную стенку, имеющую искривленную внутреннюю поверхность стенки, выполненную с возможностью направления размещения инструмента в пределах камеры культивирования.

В определенных воплощениях данная проксимальная стенка может быть ступенчатой, рифленой или выполненной иным образом для направления размещения инструмента в пределах данной камеры культивирования.

В предпочтительных воплощениях камера культивирования клеток по аспектам данного изобретения открыта сверху, и основание данной камеры содержит искривленную внутреннюю поверхность.

Граница по аспектам данного изобретения предпочтительно по существу имеет прямоугольную форму с открытием наверху и искривленной проксимальной стенкой напротив направляющего отверстия, которое способно обеспечивать ориентацию и стабильность клеточному материалу во время обращения. Камера культивирования клеток предпочтительно содержит отверстия для замены текучей среды как на поверхности искривленной проксимальной стенки, так и на поверхности основания культивирования. В качестве альтернативы, площадь у основания данной камеры культивирования клеток может быть по существу треугольной или V-образной в основании и наклоненной в направлении проксимальной точки.

В альтернативных воплощениях граница по аспектам данного изобретения может быть по существу цилиндрической, сферической, треугольной, несимметричной или ступенчатой.

В предпочтительных воплощениях одна или более чем одна стенка камеры по аспектам данного изобретения содержит проксимальную стенку, имеющую искривленную внутреннюю поверхность стенки, выполненную с возможностью направления размещения инструмента в пределах данной камеры культивирования, и дистальную стенку, определяющую дистальную границу камеры и имеющую отверстие через стенку камеры, образованное через нее, причем данное отверстие определяет открытие, сообщающееся с удлиненной направляющей частью, выступающей наружу из камеры культивирования клеток, имеющей образованный в ней канал, обеспечивающий направляющую поверхность для направления инструментов или текучих сред в данную камеру культивирования клеток.

Предпочтительно одна или более чем одна стенка камеры по аспектам данного изобретения содержит промежуточную дистальную стенку напротив искривленной проксимальной стенки. Данная промежуточная дистальная стенка, содержит отверстие и обеспечивает направляющую поверхность, определяющую канал, образованный перпендикулярно промежуточной дистальной стенке, снаружи от камеры культивирования клеток.

Предпочтительно внутренняя поверхность промежуточной дистальной стенки является по существу вогнутой для направления инструментов или текучих сред от камеры к направляющей поверхности. В качестве альтернативы, внутренняя поверхность промежуточной дистальной стенки может быть плоской.

В предпочтительных воплощениях одна или более чем одна стенка камеры по аспектам данного изобретения содержит по меньшей мере левую боковую стенку и правую боковую стенку, причем каждая имеет левое боковое отверстие и правое боковое отверстие, образованное через нее.

В предпочтительных воплощениях проксимальная стенка по аспектам данного изобретения имеет проксимальное отверстие, образованное через нее, выполненное в горизонтальном выравнивании с направляющей поверхностью для облегчения тока текучей среды через камеру культивирования клеток между отверстием и проксимальным отверстием.

В предпочтительных воплощениях отверстие по аспектам данного изобретения сконфигурировано для перфузии через него. Предпочтительно данное отверстие расположено через основание камеры и доведено до такого размера, чтобы клетка не могла проходить через него. В качестве альтернативы, данное отверстие расположено через стенку камеры или составлено из нескольких отверстий, распределенных над одной или более чем одной поверхностью границы.

В предпочтительных воплощениях проксимальная стенка по аспектам данного изобретения содержит перфузионное впускное отверстие, приспособленное для перфузии жидкости через него, и трубчатый патрубок, выполненный с возможностью взаимодействия перфузионной трубки с перфузионным впускным отверстием.

В качестве альтернативы, данный трубчатый патрубок может быть выполнен с возможностью взаимодействия с перфузионным трубопроводом или другими средствами, подающими перфузионную среду.

Отверстия для обмена текучей среды, в качестве альтернативы, могут быть расположены на других поверхностях, могут быть интегрированы в другие отверстия и просветы, или в некоторых случаях могут не требоваться для поддержания и культивирования клеточного материала.

В предпочтительных воплощениях первый блок-носитель клеток по аспектам данного изобретения содержит стенку камеры для клеток, имеющую внешнее соединение стенки, приспособленное для взаимодействия с соответствующим внешним соединением стенки на по меньшей мере втором блоке-носителе клеток, посредством этого образуя набор носителей клеток. Предпочтительно данный набор носителей клеток может содержать неограниченное число блоков-носителей клеток, причем каждый из них приспособлен для взаимодействия с другим. Предпочтительно данный набор носителей клеток будет линейным набором в горизонтальной плоскости, но, в качестве альтернативы, может образовать стопку в вертикальной плоскости или смесь обоих. Предпочтительно блоки-носители клеток будут скреплены друг с другом в горизонтальной плоскости и образовать стопку в вертикальной плоскости или, в качестве альтернативы, могут формировать скользящее соединение друг с другом либо в горизонтальной, либо в вертикальной плоскости.

В некоторых воплощениях микроустройство для культивирования клеток по аспектам данного изобретения содержит по меньшей мере второй блок-носитель клеток, сконструированный интегрально с первым блоком-носителем клеток, посредством этого образуя картридж-носитель клеток. Предпочтительно данный картридж-носитель клеток может содержать неограниченное число блоков-носителей клеток, причем каждый находится в интегральном соединении с другим. Предпочтительно данный картридж-носитель клеток будет линейным в горизонтальной плоскости, но, в качестве альтернативы, может давать картридж в вертикальной плоскости или смесь обоих. В предпочтительных воплощениях данный картридж-носитель клеток может образовать стопку или взаимодействовать с другим картриджем-носителем клеток с определением набора картриджей-носителей клеток.

В альтернативных воплощениях наборы для культивирования клеток и картриджи культивирования клеток могут образоваться в виде кольцевого набора или картриджа, или в другой форме, которая может адаптировать набор или картридж для дальнейшей обработки.

В предпочтительных воплощениях микроустройство для культивирования клеток по аспектам данного изобретения дополнительно содержит первый блок покрытия клеток, имеющий первую стенку покрытия, выполненную с возможностью покрытия по меньшей мере части отверстия сверху камеры для культивирования клеток, при соединении первого блока покрытия клеток и первого блока-носителя клеток с образованием основы блока для культивирования клеток.

В предпочтительных воплощениях блоку покрытия клеток будет придана такая форма, чтобы он по существу окружал блок-носитель клеток на трех поверхностях, включая верхнюю поверхность, и полностью покрывал верхнее отверстие при расположении на нем.

В альтернативных воплощениях блоку покрытия клеток может быть придана такая форма, чтобы он по существу покрывал по меньшей мере одну поверхность блока-носителя клеток.

Предпочтительно данный блок покрытия клеток имеет по меньшей мере один край, выполненный для окончания частью, способной к взаимодействию с блоком-носителем клеток по аспектам данного изобретения. Предпочтительно данная часть, способная к взаимодействию с блоком-носителем клеток, адаптирована для взаимодействия с основанием блока-носителя клеток, посредством этого образуя основание культивирования клеток. В другой предпочтительной форме блок покрытия клеток выполнен с возможностью скользящего взаимодействия с основанием блока-носителя клеток.

В предпочтительных воплощениях первый блок покрытия клеток по аспектам данного изобретения содержит внешнее соединение стенки, адаптированное для взаимодействия с соответствующим внешним соединением стенки на по меньшей мере втором блоке покрытия клеток, посредством этого образуя набор покрытий клеток. Предпочтительно данный набор покрытий клеток может содержать неограниченное число блоков покрытия клеток, причем каждое приспособлено для взаимодействия с другим. Предпочтительно данный набор покрытий клеток будет линейным набором в горизонтальной плоскости, но, в качестве альтернативы, может образовать стопку в вертикальной плоскости или смесь и того, и другого. Предпочтительно блоки покрытия клеток будут скреплены друг с другом в горизонтальной плоскости и формировать стопку в вертикальной плоскости или, в качестве альтернативы, могут формировать скользящее соединение друг с другом либо в горизонтальной, либо в вертикальной плоскости.

В предпочтительных воплощениях микроустройство для культивирования клеток по аспектам данного изобретения дополнительно содержит по меньшей мере второй блок покрытия клеток, сконструированный интегрально с первым блоком покрытия клеток, посредством этого образуя картридж покрытия клеток. Предпочтительно данный картридж покрытия клеток может содержать неограниченное число блоков покрытия клеток, причем каждый находится в интегральном соединении с другим. Предпочтительно данный картридж покрытия клеток будет линейным в горизонтальной плоскости, но, в качестве альтернативы, можно получать картридж в вертикальной плоскости или смесь и того, и другого. В предпочтительных воплощениях картридж покрытия клеток может образовать стопку или соединение с другим картриджем покрытия клеток с определением набора картриджей покрытия клеток.

В предпочтительных воплощениях первый блок покрытия клеток и первый блок-носитель клеток по аспектам данного изобретения определяют основу блока культивирования клеток. В предпочтительных воплощениях основа блока культивирования клеток определяется первым блоком покрытия клеток и первым блоком-носителем клеток, заканчиваясь на плоской поверхности дна, с предоставлением устойчивой подложки. В качестве альтернативы, основание культивирования клеток может определяться одним из первого блока-носителя клеток или первым блоком покрытия клеток в одной конфигурации и другого в другой конфигурации.

В предпочтительной форме основание культивирования клеток адаптировано для соединения с другим картриджем для культивирования клеток, блоком-носителем клеток или блоком покрытия клеток. Данное основание предпочтительно выполнено с возможностью физической стабилизации блока-носителя клеток при помещении на поверхность или при соединении с другим компонентом или устройством.

В предпочтительных воплощениях первый блок покрытия клеток по аспектам данного изобретения выполнен с возможностью скользящего взаимодействия с первым блоком-носителем клеток. В предпочтительных воплощениях первому блоку покрытия клеток придают форму для скользящего взаимодействия с каждой из двух сторон первого блока-носителя клеток перпендикулярно проксимально-дистальной оси.

В некоторых воплощениях первый блок покрытия клеток содержит впускное отверстие для среды, выполненное с возможностью взаимодействия с трубчатым патрубком на первом блоке-носителе клеток, и обеспечивает присоединение перфузионной трубки к трубчатому патрубку на нем. В качестве альтернативы, впускное отверстие для среды может быть выполнено с возможностью взаимодействия с перфузионным трубопроводом или другими средствами поставки перфузионной среды.

В предпочтительных воплощениях первый блок покрытия клеток дополнительно содержит образованное через него отверстие доступа, причем данное отверстие доступа, образованное через первый блок покрытия клеток, выполнено с возможностью обеспечения доступа к просвету сверху в первом положении и покрытию по меньшей мере части данного просвета сверху во втором положении, и адаптировано для скользящего взаимодействия с первым блоком-носителем клеток от первого положения до второго положения.

В предпочтительных воплощениях данное отверстие доступа имеет такой же размер и форму, что и верхний просвет, таким образом, что данный верхний просвет является полностью доступным через отверстие доступа. В альтернативных воплощениях данное отверстие доступа может быть больше, чем верхний просвет, и иметь наклонную форму для направления инструментов или клетки в камеру для культивирования клеток при конфигурировании для доступа.

В некоторых воплощениях внешняя поверхность основы камеры по аспектам данного изобретения содержит желобок, выполненный с возможностью принятия лапки, выступающего наружу из блока-носителя клеток или блока покрытия клеток.

Способ применения микроустройства для культивирования клеток по аспектам данного изобретения, включающий следующие стадии: свободное размещение одной клетки в пределы камеры для культивирования клеток микроустройства для культивирования клеток и культивирование данной клетки в нем.

Способ применения микроустройства для культивирования клеток по аспектам данного изобретения, включающий следующие стадии: получение инструкций для конструирования микроустройства для культивирования клеток и выполнение данной инструкции в процессе аддитивного производства.

В предпочтительных формах аспектов данного изобретения блок культивирования клеток содержит по меньшей мере четыре стенки и основание, определяющее в нем камеру культивирования клеток. Данные по меньшей мере четыре стенки предпочтительно содержат проксимальную стенку, имеющую искривленную внутреннюю поверхность, определяющую камеру культивирования клеток, причем данная кривизна обеспечивает исходную точку для осуществления ориентации прибора для обращения с клеткой, левую боковую стенку, правую боковую стенку и промежуточную дистальную стенку. В предпочтительных воплощениях данная промежуточная дистальная стенка содержит отверстие, образованное через нее, внутреннюю поверхность, определяющую камеру культивирования клеток, и наружную поверхность, имеющую канал, образованный по существу перпендикулярно ей. Данный канал предпочтительно образуется внутренней поверхностью левой боковой стенки и внутренней поверхностью правой боковой стенки, продолжаясь дистально за пределы промежуточной дистальной стенки и заканчиваясь по существу перпендикулярно наружной дистальной стенке, имеющей отверстие, образованное через нее.

Данное отверстие, образованное в промежуточной дистальной стенке, посредством канала и в наружной дистальной стенке, предпочтительно выровнено для обеспечения линии видимости от дистального конца носителя для культивирования клеток до камеры культивирования клеток. Данное выравнивание предпочтительно обеспечивает направление для эмбриолога или других пользователей для аккуратного введения инструментов, таких как микропипетки, в камеру культивирования клеток для введения клеток с малым возмущающим воздействием или разрушением клеток.

Например, эмбриолог, старающийся удалить эмбрион из камеры культивирования клеток для имплантации, может вводить микропипетку через отверстие внешней дистальной стенки, они могут вести и/или бережно удерживать кончик микропипетки в канале, пока данная микропипетка не достигнет искривленной внутренней поверхности проксимальной стенки. Кривизна данной проксимальной стенки направляет микропипетку к центру камеры культивирования клеток, причем в данное время эмбриолог может аккуратно отсасывать или инъецировать клетки эмбриона и среды непосредственно под микропипеткой. Конформация носителя для культивирования клеток, который обеспечивает физическую поддержку для инструментов, таких как микропипетки, и направление для размещения или позиционирования инструментов, уменьшает влияние ошибок, сделанных оператором, которые могут повреждать клетки или препятствовать их оптимальному росту. Конформация носителя для культивирования клеток, следовательно, оптимизирует методики культивирования и, в свою очередь, выживание клеток, и уменьшает влияние ошибок пользователя.

Предпочтительно левая и/или правая боковые стенки содержат отверстие для переливания, образованное через них. Предпочтительно проксимальная стенка содержит впускное отверстие, определенное впускным патрубком, расположенным на наружной поверхности данной проксимальной стенки. Данный впускной патрубок может работать в качестве соединителя для трубки или других инструментов. Он может соединяться с трубкой, используемой для переноса текучей среды в блок культивирования клеток для осуществления перфузионного культивирования. Данный впускной патрубок также может соединять трубки или тому подобное, которые просто используются в качестве исходной точки для расположения блока культивирования клеток или держателя для сохранения блока культивирования клеток на месте.

В другой предпочтительной форме впускное отверстие, промежуточная дистальная стенка, канал и внешняя дистальная стенка предпочтительно выровнены для обеспечения линии видимости от дистальной стенки через носитель для культивирования клеток и через впускное отверстие. Выравнивание линии видимости через носитель для культивирования клеток предпочтительно адаптируется для обеспечения культивирования клеток во время перфузии культуральной среды через блок культивирования клеток. Предпочтительно основание камеры для культивирования клеток по меньшей мере частично находится ниже линии видимости через носитель для культивирования клеток. Данная конфигурация минимизирует физическое разрушение клеток в культуре из-за турбулентности или тока, вызванного перфузией текучей среды.

Перфузионные методики могут оптимизировать условия для роста определенных типов клеток, в частности, клеток, которые являются чувствительными к биохимическим изменениям в культуральной среде, которые могут возникать в результате истощения питательных веществ или увеличения уровня продукта жизнедеятельности в культуральной среде, или тех, которые могут иметь варьирующие биохимические потребности по мере того, как клетки культивируются в разных фазах роста. Культура эмбрионов для методик ЭКО может выигрывать от перфузионного культивирования, как и культура сложных структур, таких как структуры клапанов или органоиды, кожа, печень, почка, легкое или другие трансплантаты тканей, или сложные линии клеток, такие как костный мозг или стволовые клетки, или для культуры любой линии клеток для пациентов, чувствительных к отторжению ткани.

Широкие воплощения данного изобретения теперь будут описаны со ссылкой на сопровождающие графические материалы, наряду с Примерами и предпочтительными воплощениями, раскрытыми в подробном описании. Данное изобретение может быть воплощено во многих разных формах и его не следует истолковывать как ограниченное описанными в данном документе воплощениями. Данные воплощения приводятся лишь в качестве иллюстрации таким образом, что данное раскрытие будет тщательным, полным и будет передавать полный объем и широту данного изобретения.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показан перспективный вид сверху собранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 2 показан вид спереди собранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 3 показан вид сзади собранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 4 показан перспективный вид снизу собранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 5 показан вид снизу собранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 6 показан перспективный вид сверху несобранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 7 показан вид сзади несобранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 8 показан перспективный вид снизу несобранного набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 9а и 9b показана часть-люлька для клетки блока-носителя для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения. На Фиг. 9а показан перспективный вид сверху и на Фиг. 9b показан перспективный вид снизу. На Фиг. 9с, 9d и 9е показаны несобранный блок покрытия клеток и несобранный набор для культивирования клеток. На Фиг. 9с показан перспективный вид сзади расширяемого блока покрытия клеток, на 9d показан перспективный вид сзади расширяемого набора для культивирования клеток, и на Фиг. 9е показан перспективный вид снизу расширяемого набора для культивирования клеток.

На Фиг. 10а, 10b и 10с показан блок-носитель для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения. На Фиг. 10а показан перспективный вид сверху и спереди, и на Фиг. 10b показан перспективный вид сверху и сзади. На Фиг. 10с показан перспективный вид сверху и спереди блока-носителя для культивирования клеток согласно альтернативному воплощению. На Фиг. 10d, 10е и 10f предоставлены перспективные виды сверху и спереди блока-носителя для культивирования клеток в трех положениях для взаимодействия с набором для культивирования клеток. На Фиг. 10д и 10h показан перспективный вид сверху блока-носителя для культивирования клеток в двух положениях взаимодействия для введения клеток в блок-носитель для культивирования клеток.

На Фиг. 11а, 11 b и 11с показан набор или картридж для культивирования клеток, имеющий расположенный в нем блок-носитель согласно воплощениям данного изобретения. На Фиг. 11а показан вид сзади, на Фиг. 11 b показан вид спереди под углом и на Фиг. 11с показан перспективный вид снизу.

На Фиг. 12 показан вид сбоку набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 13а, 13b и 13с показан вид сбоку клетки в пределах набора или картриджа для культивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения, получающей микроинъекционную пипетку.

На Фиг. 14 показан выявленный атомно-силовой микроскопией (AFM) сборочный узел микроустройства для култивирования клеток согласно воплощениям данного изобретения.

На Фиг. 15а, 15b и 15с приводятся результаты исследований токсичности полимеров, полученных на 3D (трехмерный) принтере. На Фиг. 15а показана процентная доля развития эмбриона в присутствии микроустройств согласно данному изобретению и их сред, на Фиг. 15b показана процентная доля развития эмбриона в присутствии микроустройств согласно данному изобретению, и на Фиг. 15с показана процентная доля репарации ДНК.

На Фиг. 16 приводится схематичная диаграмма, иллюстрирующая васкуляризацию тканей посредством применения блоков культивирования клеток согласно воплощениям.

На Фиг. 17а-17е приводятся результаты исследований по оптимизации культивирования клеток. На Фиг. 17а-17с показано развитие эмбриона в условиях статичного культивирования в каждые сутки развития до суток 5 согласно типу среды и вмешательству, на Фиг. 17е показана процентная доля репарации ДНК в пределах тех же самых групп, и на Фиг. 17f показана внутренняя клеточная масса для тех же самых групп обработки.

На Фиг. 18a-18d приводятся результаты исследований по оптимизации уровня кислорода. На Фиг. 18a-18d показаны изменения развития эмбриона с течением времени при воздействии разных концентраций кислорода, на Фиг. 18е показана процентная доля репарации ДНК в пределах тех же самых групп.

Несколько воплощений данного изобретения описываются в следующих примерах.

Осуществление изобретения

Микроустройства для культивирования клеток, как описано в следующих воплощениях, обычно построены из единичного блока культивирования клеток, имеющего блок-носитель и покрытие блока, набора повторяющихся блоков, соединенных с образованием набора для культивирования клеток, имеющего множество носителей и множество покрытий, или картриджа из повторяющихся блоков, интегрированных с образованием картриджа для культивирования клеток, имеющего носитель картриджа и покрытие картриджа. Каждый из них ниже будет обычно называться «носителем» и «покрытием», когда они могут принимать любую из данных форм, которые представляют собой одиночный блок, набор из повторяющихся блоков любой формы или числа, или картридж из повторяющихся блоков любой формы или числа.

Специалистам в данной области будет понятна польза изготовления воплощений «носителя» и «покрытия» в унитарном формате, форматах, способных к вставному соединению в наборе, и форматах, которые интегрально содержат много «носителей» или «покрытий». В то время как в каждом из приведенных ниже воплощений может даваться ссылка на один из данных форматов, следует понимать то, что при определенных обстоятельствах может осуществляться замена на другие форматы.

Пример 1 - набор для культивирования клеток

На Фиг. 1 проиллюстрирован собранный набор 100 для культивирования клеток, имеющий покрытие 110 набора, помещенное на носитель 120 набора. На Фиг. 1 показан линейный набор для культивирования клеток, имеющий пять повторяющихся блоков 130а, 130b, 130 с, 130d и 130е культивирования клеток, расположенных в ряд. Покрытие 110 линейного набора сконфигурировано таким образом, что каждое покрытие блока расположено рядом со следующим, образуя плоскую поверхность по верхней внешней стороне покрытия набора 110, имеющую в ней небольшую канавку между каждым покрытием блока. Данное покрытие образован из четырех стенок, включающих прямоугольную плоскую верхнюю стенку 140, заканчивающуюся на том и другом конце плоской левой концевой стенкой 150 (не показана) и плоской правой концевой стенкой 160, образованными под углом 90 градусов и простирающимися вниз от верхней стенки 140. Ряд круглых отверстий 170 образуется через верхнюю стенку 140 по длине данной верхней стенки; причем одно отверстие образуется через верхнюю стенку каждого единичного покрытия. Левая концевая стенка 150 (не показана) и правая концевая стенка 160 заканчиваются на их нижнем крае левым фланцем 180 основания (не показан) и правым фланцем 190 основания.

Левый фланец основания и правый фланец основания могут быть выполнены с возможностью взаимодействия с другими компонентами, такими как роботизированное оборудование, культуральные чашки, дополнительные блоки для культивирования клеток или другое лабораторное оборудование; или они могут быть сконфигурированы, как показано на Фиг. 1, просто для обеспечения устойчивости набора для культивирования клеток 100 при установке на них.

Помимо верхней стенки, левой концевой стенки и правой концевой стенки данное покрытие 110 набора дополнительно включает переднюю стенку. На Фиг. 2 проиллюстрирована передняя стенка 200 покрытия 120 набора. Прямоугольная плоская передняя стенка 200 покрытия 120 набора проходит вниз от верхней стенки 140 под углом примерно 90 градусов и проходит между передним краем левой концевой стенки 150 и передним краем правой концевой стенки 160. Нижний край передней стенки 200 находится на одном уровне с нижним краем левой концевой стенки 150 и нижним краем правой концевой стенки 160. Вертикальная канавка 210 в пределах передней стенки 200 отделяет одно покрытие блока от следующего и проходит через покрытие набора, образуя непрерывную канавку в пределах верхней стенки. Ряд круглых отверстий 220а, 220b, 220 с, 220d и 220е образован через переднюю стенку 200 по ширине верхней стенки, так как одно отверстие образуется через переднюю стенку каждого покрытия блока. Каждое круглое отверстие определяется круглым соединителем 230, выступающим от поверхности передней стенки. Данный круглый соединитель может быть выполнен с возможностью соединения с любым числом других приборов, но чаще всего представляет собой простой силиконовый трубчатый соединитель, способный создавать гидравлическое уплотнение с силиконовой трубкой.

На Фиг. 3 показана открытая задняя часть покрытия 100 набора, имеющего расположенный в нем носитель 250 набора. Вертикальные канавки 210 между каждым покрытием блока в пределах покрытия набора простираются через покрытие набора между внутренними стенками 260, которые завершают форму каждого покрытия блока в пределах покрытия набора. Как проиллюстрировано на Фиг. 3, внутренние стенки 260, образующие каждое покрытие блока, имеют форму или формируются таким образом, чтобы заполнять пространство между смежными блоками-носителями для минимизации просвета между блоком-носителем и покрытием блока таким образом, что форма покрытия блока способна направлять скользящую установку блока-носителя и также минимизировать просвет между наружной поверхностью стенки каждого покрытия блока. При образовании в наборе повторяющаяся природа данной конфигурации обеспечивает то, что каждый блок-носитель данного набора носителей способен легко скользить до желательного положения относительно покрытия данного набора и становиться неподвижно расположенным в нем.

Скользящий механизм 270 предоставлен у нижнего края каждой стенки покрытия блока для обратимого и неподвижного соединения одного покрытия блока со следующим с образованием покрытия данного набора. Данный скользящий механизм обеспечивает сборку индивидуальных блоков для культивирования клеток в виде набора, но также легкое отделение друг от друга таким образом, что с одной клеточной культурой можно обращаться иначе относительно другой с минимальным разрушением или возмущающим воздействием (от манипулирования, не являющегося необходимым) для клеток в культуре.

На Фиг. 4 и 5 показано основание набора для культивирования клеток; посредством перспективного вида на Фиг. 4 и посредством прямого вида на Фиг. 5. На данных Фиг. проиллюстрирована конфигурация нижней поверхности набора носителей, показывающая внутренние стенки индивидуальных покрытий блоков и форму фланцев основания: левого фланца 180 основания и правого фланца 190 основания. Скользящий механизм 270 проходит только через часть внутренних стенок индивидуальных покрытий блоков.

На Фиг. 6, 7 и 8 проиллюстрировано покрытие набора и носитель набора раздельно рядом друг с другом и предоставлен перспективный вид сверху, вид сзади и перспективный вид снизу соответственно. Со ссылкой на Фиг. 6, носитель 120 набора образован из линейного носителя набора для культивирования клеток, имеющего пять повторяющихся блоков-носителей 280а, 280b, 280 с, 280d и 280е, расположенных линейно. Каждый блок-носитель содержит впускное отверстие 290 для среды, выдающееся из внешней передней поверхности блока-носителя, люльку 300 для клетки, образованную в пределах блока- носителя, и направляющий канал 310, образованный между люлькой для клетки и наружной стороной блока-носителя 280. Впускное отверстие 290 для среды обеспечивает перфузию жидкой среды (или других текучих сред) в или через окружение клетки в пределах данного носителя. Текучие среды также могут течь из окружения клетки в пределах носителя через направляющий канал 310 наружу из блока-носителя через выпускное отверстие 320 канала. На Фиг. 7 проиллюстрировано выравнивание основания выпускного отверстия 320 канала, нижней поверхности направляющего канала 310 и отверстия, образованного впускным отверстием 290 для среды. На Фиг. 7 показано то, что образуется прозрачная линия наблюдения через данные отверстия, следовательно, невероятно, что любая турбулентность во время клеточной перфузии через впускное отверстие 290 для среды влияет на клеточный рост в люльке 300 для клетки.

На Фиг. 6 и 7 проиллюстрирован относительный размер круглого соединителя 230 покрытия 110 набора по отношению к впускному отверстию 290 для среды носителя 120 набора. Наружная поверхность впускного отверстия 290 для среды выполнена так, чтобы быть немного меньше, чем внутренняя поверхность круглого соединителя 230. Посредством этого, при скольжении покрытия набора по носителю набора наружная поверхность впускного отверстия для среды 290 способна весьма близко соответствовать внутренней поверхности круглого соединителя 230. Посредством этого текучие среды могут проходить через круглый соединитель и впускное отверстие для среды без утечки текучий среды через данные точки контакта.

Фиг. 6 и 8 иллюстрируют расположение круглого отверстия 170 через покрытие 110 набора относительно носителя 120 набора. Обращаясь к Фиг. 8, скользящий механизм 270 дополнительно иллюстрируется как состоящий из бегунка 330, расположенного между индивидуальными покрытиями блоков покрытия 110 набора, заканчивающегося перед щелью 340 между индивидуальными покрытиями блоков покрытия набора в направлении задней части покрытия 110 набора. Бегунок 330 и щель 340 покрытия 110 набора взаимодействуют с ползунком 350 на блоке-носителе 120. При размещении перекрывающимся образом, ползунок 350 скользит по бегунку 330 и направляется допустимым пространством для скольжения ползунка 350 между индивидуальными покрытиями блоков. Скольжение прекращается при достижении ползунком 350 щели 340, и он может оставаться неподвижным в ней в закрытом положении. В открытом положении ползунок 350 находится в контакте с бегунком 330. В данном положении круглое отверстие 170 располагается над люлькой для клетки 300 и находится в правильном выравнивании с люлькой для клетки 300 для оптимального помещения яйцеклетки или других клеток в центр люльки сверху. В закрытом положении ползунок 350 движется и останавливается в пределах щели 340, при этом круглое отверстие 170 целиком находится над направляющим каналом 310, и люлька 300 для клетки закрывается сверху. Выпускное отверстие 360 люльки также иллюстрируется в носителе 120 набора Фиг. 8. Данный элемент является опционным, однако, при предоставлении, он обеспечивает дополнительный доступ к люльке для клетки для обеспечения удаления или переноса эмбриона или окружающей его среды.

Данные фигуры иллюстрируют конфигурацию линейного набора, однако, как будет совершенно очевидно специалистам в данной области, конфигурация данного набора может быть расширена за пределы пяти блоков и также может быть легко адаптирована к конфигурациям набора, которые не являются линейными. Например, конфигурация линейного набора может быть легко адаптирована к кольцевому набору, который может легче поддаваться автоматизированным или роботизированным методикам обращения. Например, кольцевой набор может быть установлен на карусель и, в свою очередь, установлен в пределах микроскопического или другого визуализирующего прибора. Карусельная организация может быть легче доступна операторам, ручному прибору или роботизированному прибору для пипетирования, для введения вакуумного трубопровода, для введения насосных систем или для применения способов криоконсервации.

Пример 2 - блок для культивирования клеток

На Фиг. 9а и 9b приводится иллюстрация конфигурации люльки 300 для клетки блока-носителя одной клетки изолированно от направляющего канала 310 (показан на Фиг. 6); и на Фиг. 10а и 10b проиллюстрирована внутренняя конфигурация полного блока 400 для культивирования одиночной клетки. Блок-носитель 400 клетки образован из пяти стенок, включая прямоугольную плоскую левую боковую стенку 410 и прямоугольную плоскую правую боковую стенку 420, причем каждая заканчивается в направлении задней части блока с соединением под углами 90 градусов с плоской задней стенкой выпускного отверстия 430, и заканчивается в направлении передней части блока с соединением под углами 90 градусов с плоской передней стенкой впускного отверстия 440. Люлька для клетки, проиллюстрированная на Фиг. 9а и 9b, имеет самое широкое измерение приблизительно 0,23 мм и самое высокое измерение приблизительно 0,23 мм.

Кольцевой выступ из наружной передней поверхности стенки впускного отверстия 420 образует впускное отверстие 290 для среды, имеющее внешний диаметр поверхности, приблизительно равный (но слегка меньший, чем) внутренний диаметр поверхности круглого соединителя 230 (Фиг. 6). Внутренняя поверхность передней стенки 440 впускного отверстия горизонтально искривлена для обеспечения введения пипетки в область люльки для клетки через выпускное отверстие 320 канала и направляющий канал 310 для локализации в центральной точке области люльки для клетки по горизонтальной оси. Внутренняя поверхность левой боковой стенки 410, правой боковой стенки 420 и задней стенки 430 выпускного отверстия обычно является плоской. Каждая из левой боковой стенки 410 и правой боковой стенки 420 содержит отверстие 450 для перелива для обеспечения перелива среды из люльки 300 для клетки, в частности, при использовании для осуществления перфузий клеток. Как проиллюстрировано на Фиг. 9b, самая нижняя точка отверстия 450 для перелива находится на такой же высоте, как и самая нижняя точка направляющего канала 310, что обеспечивает то, что избыточная текучая среда предпочтительно движется из области люльки для клеток со стороны блока для культивирования клеток, а не через направляющий канал 310.

Пример 3 - покрытие клеток

На Фиг. 9 с показан блок 600 покрытия клеток, сконфигурированный для сборки линейного набора с другими блоками покрытия клеток и для содержания одной люльки для клетки. На данной Фиг. проиллюстрирован зажим по типу «куска пазла» и замковая система 610а и 610b, каждая из которых обеспечивает соединение блоков покрытия клеток друг с другом в линейном наборе бесконечной масштабируемости. На Фиг. 9 с также проиллюстрировано воплощение блока покрытия клеток, который не имеет отверстия для доступа в камеру для культивирования клеток, скорее полагаясь на скользящее соединение блока-носителя клеток в пределах каждого покрытия либо на выявление по меньшей мере части просвета сверху. Данное воплощение блока покрытия для клеток иллюстрирует желобок 620, подлежащий применению для выравнивания с впускным каналом 470 люльки для клеток.

На Фиг. 9d и 9е показаны блоки покрытия клеток, интегрально организованные в линейный картридж 700 покрытия клеток с дополнительной способностью образовать трехмерный набор. Слева и справа от картриджа покрытия клеток зажим по типу «куска пазла» и замковая система 710а и 710b, которая сохраняет ориентацию с последующими блоками, обеспечивает образование наборов в данных направлениях. Вариация данной системы 720а и 720b также иллюстрируется в отношении передней и задней части картриджа покрытия клеток, что, аналогичным образом, сохраняет ориентацию с последующими блоками и обеспечивает образование наборов в данных направлениях. Над картриджем покрытия клеток находится лапка 730а, которая выполнена с возможностью вставления в желобок 730b обратной формы под картриджем покрытия клеток для облегчения образования стопки в данном направлении.

На Фиг. 10а и 10b (с Фиг. 9а и 9b) проиллюстрировано размещение внутренней стенки 460, отделяющей люльку 300 для клетки от направляющего канала 310 (Фиг. 10а и 10b). Внутренняя стенка 460 сохраняет согласующуюся высоту по отношению к передней стенке впускного отверстия 440, левой боковой стенке 410, правой боковой стенке 420 и задней стенке 430 выпускного отверстия таким образом, что покрытие 120 набора (или покрытие блока) останавливает смыв через верх блока-носителя, который, в противном случае, открыт сверху. Внутренняя стенка 460 имеет продольный впускной канал 470, образованный через нее. Как проиллюстрировано на Фиг. 10а и 10b, самая нижняя точка впускного канала 470 находится на уровне основания направляющего канала 310. Впускной канал 470 открывается в направлении задней части блока-носителя к направляющему каналу 310 и открывается к передней части блока-носителя к внутренней поверхности люльки 300 для клетки. Внутренняя поверхность люльки для клетки определяет полость 510 для культивирования клеток для культивирования и/или выращивания в ней клеток.

Размер и форма полости 510 для культивирования клеток управляется максимальным размером эмбриона, как только он разовьется, для обеспечения физической стабильности эмбриона, содержащегося в ней. Размер люльки 300 для клетки составляет приблизительно 0,23 мм × 0,23 мм. Форма поверхности, определяющей люльку для клетки, обычно скругляется для соответствия обычной форме клеточной массы. В частности, каждая из стенок сужается вниз с получением более скругленной внутренней формы до люльки 300 для клетки.

Положение полости 510 для культивирования клеток является удаленным от тока перфузионной текучей среды. Отверстие, определенное впускным отверстием для среды, задняя стенка выпускного отверстия, направляющий канал, продольный выпускной канал и отверстия для перелива обычно выравниваются горизонтально, что определяет путь текучей среды. Положение полости для культивирования клеток ниже, чем путь тока текучей среды, что обеспечивает то, что клетки в пределах люльки для клеток остаются погруженными в жидкую среду и физически не встряхиваются или иным образом разрушаются током вдоль пути тока текучей среды. Стенки полости для культивирования клеток заканчиваются у основания 520 люльки для клеток, которое обычно образуется в горизонтальной плоскости, в более низком положении относительно отверстия, определенного впускным отверстием для среды, задней стенкой выпускного отверстия, направляющим каналом, продольным выпускным каналом или отверстиями перелива. Основание 520 люльки для клетки также имеет выпускное отверстие 530 люльки для клетки, которое закрыто во время применения, но может быть открыто для слива жидкости из люльки 300 для клетки.

На Фиг. 10с проиллюстрированы альтернативные воплощения элементов блока-носителя 800 клеток, которые включают суженный направляющий канал 810, закругленный впускной канал 820 и треугольную площадь у основания камеры 840 для культивирования клеток. Суженный направляющий канал 810 и закругленный впускной канал 820 функционируют тандемно для обеспечения направления и вставки инструментов в камеру 840 для культивирования клеток без дергания или вывода через суженный направляющий канал, но все еще позволяя видеть инструмент по мере того, как он движется через суженный направляющий канал. Треугольная площадь у основания камеры 840 для культивирования клеток демонстрирует другие формы, которые могут подходить для принятия для камеры для культивирования клеток без необходимости в искривленной проксимальной стенке.

Пример 4 - покрытие клеток и носитель клеток

На Фиг. 10d, 10е, 10f, 10g и 10h проиллюстрировано то, как картридж 900 покрытия клеток согласно воплощениям образует соединение (взаимодействует) с блоком-носителем 950 клеток согласно воплощениям. На Фиг. 10d показан перспективный вид сзади картриджа 900 покрытия клеток и блока-носителя 950 клеток в разобранном виде, обеспечивая вставку данного блока-носителя клеток в центральный блок покрытия. На Фиг. 10d дополнительно проиллюстрирована камера 960 для культивирования клеток, открытая сверху, и круглые отверстия 920, выполненные с возможностью обеспечения доступа через них. Каждая сторона данного воплощения камеры 960 для культивирования клеток характеризуется отверстием 965 перелива, обеспечивающим потенциальный перелив из камеры для культивирования клеток через аналогично расположенные отверстия 925 перелива покрытия.

На Фиг. 10е и 10g проиллюстрирован картридж 900 покрытия клеток и блок-носитель 950 клеток, частично соединенные вставкой в первом положении, где камера 960 для культивирования клеток доступна сверху через круглое отверстие 920 для внесения клеток, обращения и отбора, а направляющий канал 980 доступен как сверху, так и через впускное отверстие 970 канала.

На Фиг. 10f и 10g проиллюстрирован картридж 900 покрытия клеток и блок-носитель 950 клеток, полностью соединенные вставкой во втором положении, причем камера 960 для культивирования клеток покрыта картриджем 900 покрытия клеток, и впускное отверстие 990 для среды экспонировано через переднюю часть данного картриджа покрытия клеток. В данном положении отверстия 965 перелива являются сопряженными с отверстиями 925 перелива покрытия, обеспечивая перелив через них. Сохраняется линия видимости через впускное отверстие канала в камеру 960 для культивирования клеток и через впускное отверстие 990 для среды.

Обращаясь к внешней форме блока-носителя 400, как показано на Фиг. 10а и 10b, левая боковая стенка 410 и правая боковая стенка 420 соединяются со стенкой 480 основания под углом примерно 100 градусов наружу, тогда как задняя стенка 430 выпускного отверстия и передняя стенка 440 впускного отверстия соединяются со стенкой 480 основания под углами 90 градусов. На Фиг. 9а, 9b, 10а и 10b проиллюстрированы левый скользящий фланец 490 и правый скользящий фланец 500, выступающие из стенки 480 основания. Данным левому и правому боковым фланцам 490 и 500 придается форма, или они иным образом сконфигурированы для заякоривания основания блока-носителя в пределах или на другом объекте, или для скольжения по или через другой объект. На Фиг. 11а, 11b и 11с проиллюстрировано размещение блока-носителя 400 в пределах покрытия 110 набора. На Фиг. 11а предоставлен вид сзади блока-носителя 400, иллюстрирующий расположение выпускного отверстия 320 канала. На Фиг. 11b приводится вид спереди блока-носителя 400, иллюстрирующий расположение впускного отверстия 290 для среды с круглым соединителем 230 покрытия 110 набора. На Фиг. 11 с приводится перспективный вид снизу блока-носителя 400, имеющего левый и правый боковые фланцы 490 и 500, соответственно расположенные в скользящем соединении на бегунках 330.

В некоторых воплощениях ползунок 350, проиллюстрированный на Фиг. 8, может быть ослаблен для обеспечения отрыва или отлома индивидуальных блоков-носителей носителей 120 набора (с использованием или без использования специализированного инструмента) на индивидуальные блоки-носители. Когда набор носителей 120 выполнен с возможностью разлома на индивидуальные блоки-носители этим способом, данный набор выполнен с возможностью предоставления при разломе левого и правого боковых фланцев.

Способность отламывать индивидуальные носители для культивирования клеток или блоки-носители от набора может давать преимущества для обработки клеток для криоконсервации. Например, в носителе для криоконсервации могут быть получены индивидуальные блоки и могут храниться в виде аликвот после отламывания блока от набора без какой-либо дополнительной физической манипуляции с клетками.

Мелкосерийное изготовление вышеописанных наборов для культивирования клеток может осуществляться с использованием методик 3D печати из биосовместимых полимерных материалов. Было показано, что определенные полимеры представляют собой печатаемые биосовместимые вещества, и также было показано, что они являются устойчивыми к разламыванию при подготовке для криоконсервации, например, наногравируемый полимер или кристаллический полистирол.

Пример 5 - применение набора для культивирования клеток

Воплощения, описанные в данном документе, можно использовать для культивирования клеток любого вида, но они могут находить конкретное применение при культивировании линий клеток млекопитающих. Описанные в данном документе воплощения являются особенно полезными для культур клеток, включающих эмбриогенез, и, в свою очередь, для их последующего применения в методиках ЭКО.

Воплощения также могут использоваться для обычного культивирования клеток, статичной перфузии или активной перфузии клеток в культуре.

Как проиллюстрировано на Фиг. 12, блок для культивирования одной клетки можно использовать индивидуально вне конфигурации набора. Одна силиконовая трубка может присоединяться к данному блоку через круглый соединитель, который может использоваться для расположения или локализации данного блока, где требуется. Данная трубка может использоваться для фиксации блока в положении для наблюдения клеток во время микроскопии или манипулирования с ними с использованием микропипеток или тому подобного. Данная трубка может использоваться для фиксации положения блока в пределах жидкой среды, которая может быть статичной или текущей (например, в среде в пределах большего сосуда, причем данный блок поддерживается и непрерывно подвергается перфузии или пополнению). Данная трубка также может соединяться с насосом или вакуумным трубопроводом для нагнетания текучей среды через блок для культивирования клеток и перфузии текучей среды для культивирования клеток, сохраняющейся в нем.

Как проиллюстрировано на Фиг. 13, в наборе для культивирования клеток, имеющем пять блоков для культивирования клеток в пределах данного набора, силиконовая трубка, имеющая внутренний диаметр 100 мкм, была присоединена к трем из пяти блоков для культивирования клеток. Перфузия среды через каждый блок-носитель осуществлялась посредством пропускания среды для культивирования клеток через каждый из трех блоков, тогда как перфузия не осуществлялась в других двух блоках.

На Фиг. 14 приведен узел для удержания набора для культивирования клеток в пределах сборочного узла атомно-силового микроскопа (AFM). Могут приниматься изменения данного узла для установки набора для культивирования клеток в пределах автомата или другого оборудования, например, для адаптации сборочного узла для пользователя лазером, пьезоинъекцией, микронасосами, «обученными» видеть роботами или другим оборудованием, которое может уменьшать или устранять осуществляемое вручную вмешательство эмбриолога во время культивирования клеток.

Узел, проиллюстрированный на Фиг. 14, удерживает основание чашки Петри, имеющее диаметр 35 мм, на стеклянном диске толщиной 1 мм для установки на нем набора для культивирования клеток или блока для культивирования клеток, как проиллюстрировано на Фиг. 12 и 13. Данная чашка Петри может быть специально адаптирована для удерживания на ней силиконовой трубки, показанной на Фиг. 12 и 13, или они могут быть просто прикреплены на месте. Данная чашка Петри устанавливается с использованием специальных креплений, которые могут удерживать 12 мм или 25 мм круглые покровные стекла для высокосветосильной инвертированной оптической микроскопии. Данный узел позволяет клеткам, поддерживаемым в пределах наборов или блоков, культивироваться и визуализироваться в чашках Петри.

Закрытый узел, проиллюстрированный на Фиг. 14, обеспечивает установку чашки Петри на закрытом зажиме для проточной ячейки. Данный зажим представляет собой запечатанный при помощи мембраны зажим с резьбой, и он закрепляется на закрытой чашке проточной ячейки. Обеспечивается впускной и выпускной доступ к чашке посредством заглушки отверстия и впускной/выпускной трубок, предоставленных через закрытую чашку проточной ячейки. Данный узел запечатывается при помощи нижнего зажима с резьбой, присоединенного к AFM, посредством установки уплотнительного кольца (О-кольца) между закрытой чашкой проточной ячейки и стеклянным диском. Специалистам в данной области хорошо известно, где требуется замена или применение дополнительных уплотнительных колец (О-колец), или применение инструментов для сборки, пинцетов и очистительных кистей для достижения успешной установки.

Набор для культивирования клеток сконструирован для применения помимо чашки Петри, предметного стекла микроскопа или другой культуральной чашки. Он не заменяет данные устройства, но используется с данными существующими культуральными устройствами для локализации клетки или агрегата клеток в пределах таких устройств для обращения с клеткой или агрегатом клеток без беспокойства клетки(ток), для более легкого манипулирования с клеткой(ками) или для хранения клетки(ток). Описанный выше узел является типичным по природе и может легко адаптироваться к конкретному применению специалистом в данной области. Например, вероятно, что некоторые пользователи могут предпочитать размещать данное микроустройство на предметном стекле, которое можно легко разместить в пределах описанного выше узла вместо чашки Петри.

Узел на Фиг. 14 применялся в перфузионном узле для перфузии набора в закрытом и запечатанном состоянии. Порты доступа использовали для обмена жидкости и газа для перфузий набора посредством инъекции шприцем, подпитки самотеком и систем микронасосов. Установка на AFM может быть приспособлена для цейтраферной микроскопии, культивирования эмбриона (с перфузией и без) и гиалинизации, помимо оплодотворения с использованием или без использования внутрицитоплазматической инъекции спермы (ICSI). Полимеры, использованные вещества и характеристики (данным устройствам была придана микроформа с использованием установки Nanoscribe GT Professional (Nanoscribe GmbH, Германия)).

Пример 6 - схема исследований in vitro

Все эксперименты были одобрены Комитетом по этике обращения с животными Университета Аделаиды (М-2019-008) и были проведены согласно Австралийскому кодексу практики в отношении ухода и применения животных для научных целей. П ре пубертатных самок мышей гибрида F1 СВА × C57BI/6 и Swiss Albino (в возрасте 3-4 недель) с массой 9-11 г содержали в службах для лабораторных животных (Универститет Аделаиды, Австралия) при контролируемой температуре, 12-часовом цикле дневного света (12 часов света: 12 часов темноты) с предоставлением воды и корма без ограничений.

Препубертатных самок мышей подвергали суперовуляции с использованием 5 IU (международные единицы) лошадиного хорионного гонадотропина (eCG; Folligon, Intervet, Boxmeer, Нидерланды), введенного внутрибрюшинно, через 47 часов мышей индуцировали человеческим хорионным гонадотропином (hCG; Humagon, Orgenon), введенным внутрибрюшинно.

Мышей затем случали с самцом (1 самец: 1 самка) из той же самой линии, и копуляционные пробки проверяли на следующие сутки утром. Через 22 часа после hCG мышей забивали посредством смещения шейных позвонков, и предположительные зиготы отбирали из ампулы для случайного распределения в каждую группу обработки.

Среды, использованные в исследованиях, закупали в ART Lab Solutions (Аделаида, Австралия), включая промывку для эмбриона и среду для дробления.

Конструкции микроформ разрабатывали в CAD, и придавали микроформу с использованием Nanoscribe GT Professional (Nanoscribe GmbH, Германия), используя рекомендованные изготовителями полимеры, вещества и установки.

Все статистические анализы проводили с использованием GraphPad Prism 8.0 (программа GraphPad, Сан-Диего, Калифорния). Статистический анализ проводили для сравнения развития эмбриона в стандартной культуре эмбрионов и развития эмбриона в стандартной культуре внутри контейнеров, введенных в гаражи, в присутствии других переменных, как описано ниже. Сначала выполняли анализ нормальности для того, чтобы определить следует ли использовать параметрический или непараметрический анализ. Статистическую значимость различия среднего между группами оценивали с использованием непарного t-критерия для нормально распределенных данных или критерия Крускала-Уоллиса для данных, распределенных ненормально. Значение Р меньше 0,05 рассматривали как значимое различие и 10%-ное различие рассматривали как биологически значимое.

Пример 7 - предварительный анализ безопасности

Проводили предварительные эксперименты для исследования токсичности 3D печатаемого полимера, предоставленного Nanoscribe и используемого для построения наборов и блоков для культивирования клеток, и для определения его потенциального влияния на развитие эмбриона.

В следующей таблице приводятся результаты первой повторности анализов развития эмбриона от суток 1 (зигота) и суток 2 (двухклеточный) эмбрион до суток 5 (бластула) после обработки.

- In vivo: отбор бластулы через 94 ч после hCG и случки.

- Обработка 1: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые при стандартных протоколах культивирования эмбрионов с использованием свежей среды для дробления.

- Обработка 2: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в среде для дробления, используемой для промывки гаджетов.

- Обработка 3: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в свежей среде для дробления плюс гаджеты.

- Обработка 4: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в среде для дробления, используемой для промывки гаджетов, плюс гаджеты.

В следующей таблице приводятся результаты второй повторности анализов развития эмбрионов.

- In vivo: отбор бластулы через 94 ч после hCG и случки.

- Обработка 1: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые при стандартных протоколах культивирования эмбрионов с использованием свежей среды для дробления.

- Обработка 2: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в среде для дробления, используемой для промывки гаджетов.

- Обработка 3: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в свежей среде для дробления плюс гаджеты.

- Обработка 4: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в среде для дробления, используемой для промывки гаджетов, плюс гаджеты.

В следующей таблице приводятся результаты третьей повторности анализов развития эмбрионов.

- In vivo: отбор бластулы через 94 ч после hCG и случки.

- Обработка 1: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые при стандартных протоколах культивирования эмбрионов с использованием свежей среды для дробления.

- Обработка 2: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в среде для дробления, используемой для промывки гаджетов.

- Обработка 3: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в свежей среде для дробления плюс гаджеты.

- Обработка 4: предположительные зиготы, отобранные и культивируемые в среде для дробления, используемой для промывки гаджетов, плюс гаджеты.

Проводили дополнительные исследования, при этом четыре блока-носителя вставляли в два набора носителей. Культивирование эмбрионов проводили в 20 мкл каплях среды для дробления. Мышиные эмбрионы, полученные от гиперстимулированных и слученных самок 4-недельных мышей F1 CBA×C57BI6, культивировали в течение 24 часов от зиготы до 2-клеточной стадии. Результаты 4 повторностей культивирования зиготы до бластулы за 4 суток, причем каждая имеет 40 повторностей на группу, не продемонстрировали статистически значимого различия в жизнеспособности между клетками, культивируемыми в блоке-носителе, относительно клеток, культивируемых в чашке Петри.

Результаты исследований токсичности полимеров, напечатанных на 3D принтере, продемонстрированы на Фиг. 15а, которая показывает процентную долю показателя развития эмбрионов мышей CBAF1 от подвергнувшихся дроблению эмбрионов. Вкратце, 10 эмбрионов культивировали в 20 мкл каплях среды для дробления. Для групп обработки эмбрионы культивировали в приборе, полученном с использованием методик 3D печати, который включал 2 покрытия набора и 10 блоков-носителей, сконфигурированных в виде наборов 2×5 блоков. 10 эмбрионов помещали в пределы 20 мкл капли среды для дробления. Капли культуры покрывали парафиновым маслом.

Эмбрионы, распределенные в группу 1, культивировали в чистой среде для дробления (контроль). Эмбрионы в группе 2 культивировали в среде для дробления, ранее подвергавшейся воздействию 10 контейнеров и 2 гаражей. Эмбрионы в группе 3 культивировали в новой среде для дробления и совместно инкубировали с 10 контейнерами и 2 гаражами на каплю культуры. Эмбрионы в группе 4 культивировали в чистой среде для дробления и совместно инкубировали с 10 контейнерами и 2 гаражами на каплю.

Процентная доля развития эмбрионов мышей CBAF1 из претерпевших дробление эмбрионов показана на Фиг. 15b. Культивирование эмбрионов осуществляли в 10 мкл каплях среды для дробления. Эмбрионы, распределенные в контрольную группу обработки, культивировали при стандартных культуральных условиях, и эмбрионы, распределенные в опытную группу обработки, культивировали при стандартных культуральных условиях внутри контейнеров, введенных в гараж. Группы культивирования опытной обработки имели 5 контейнеров и 1 гараж на каплю (среднее плюс/минус SEM (стандартная ошибка среднего).

Процентная доля репарации ДНК при развитии эмбрионов мышей CBAF1 показана на Фиг. 15 с после окрашивания бластул на репарацию ДНК γН2А.Х в пределах групп контрольной и опытной обработки. Эмбрионы, распределенные в группу контрольной обработки, культивировали при стандартных условиях культивирования, а эмбрионы, распределенные в группу опытной обработки, культивировали при стандартных условиях культивирования внутри контейнеров, введенных в гараж (среднее плюс/минус SD (стандартное отклонение)).

Во всех исследованиях не наблюдали значимого различия в группах обработки. Токсичность материалов, используемых при изготовлении, не была показана, указывая на вероятную безопасность данных микроустройств.

Пример 8 - оптимизация условий культивирования эмбрионов в пределах блока для культивирования клеток

На Фиг. 16 приводится схематическая диаграмма, иллюстрирующая достижимую васкуляризацию тканей посредством применения блоков для культивирования клеток согласно воплощениям. Предполагается, что при оптимальных условиях будут успешно развиваться органоиды в пределах камеры для культивирования клеток. Данная камера, покрытая матригелевым покрытием, обеспечивает каркасное окружение для стимуляции пролиферации прикрепившихся клеток. Направленный линейный рост клеточной массы обеспечивается через дополнительные отверстия между камерой для культуры клеток и внешней средой. Размещение и размер отверстий через блок-носитель и покрытие блока выбирают для стимуляции васкуляризации для поддержания роста in situ. Это зависит от типа клеток и типа органоидов и может определяться специалистами в данной области.

Условия культивирования клеток были оптимизированы для развития эмбрионов. Оптимальные культуральная среда и воздушная смесь были определены с использованием способов, которые могут быть адаптированы для оптимизации других условий. Предполагается то, что оптимизированные условия культивирования клеток являются переносимыми на пролиферацию других типов клеток. Предположительные зиготы отбирали и случайно распределяли в пять групп обработки. Ежесуточно наблюдали и записывали развитие эмбриона.

Эмбрионы распределяли в пять групп, причем каждая получает обработку другой культуральной средой. Для эмбрионов, распределенных в группу 1, развивающиеся в срок эмбрионы перемещали в новые капли среды для дробления в пределах той же самой чашки. Эмбрионы в группе 2 помещали в среду для дробления и затем перемещали в новую чашку с новыми каплями среды для дробления в сутки 3. Эмбрионы в группе 3 помещали в среду G1+, и жизнеспособные эмбрионы перемещали в новую каплю среды G1+ в пределах той же самой чашки. Эмбрионы в группе 4 находились в среде G1+ и затем перемещались в новую каплю среды G1+ в сутки 3. Эмбрионы в группе 5 культивировали в среде G1+ и затем перемещали в новую чашку с каплями среды G2+. Культивирование эмбрионов проводили в увлажненном традиционном инкубаторе в стиле печи при 6% СО₂, 5% О₂ и при температуре 37°С.

Результаты развития эмбрионов в процентах для эмбрионов, культивируемых в пределах стандартной 10 мкл капли культуры с наслоением масла в чашке Петри показаны на Фиг. 17. Эмбрионы группы 1 культивировали в среде для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions с суток 1 до суток 5. Эмбрионы группы 2 культивировали в среде для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions с суток 1 до суток 3, затем эмбрионы переводили в новую среду для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 3 культивировали в среде Vitrolife G1 + с суток 1 до суток 5.

Эмбрионы группы 4 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3, затем эмбрионы переводили в новую среду Vitrolife G1+ и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 5 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3, затем переводили в новую среду Vitrolife G2+ и культивировали до суток 5.

Развитие эмбрионов записывали ежесуточно; процентная доля развития эмбрионов для каждой группы обработки показана на Фиг. 17. На Фиг. 17а показана процентная доля развития эмбрионов с суток 1 до суток 2, на Фиг. 17b показана процентная доля развития эмбрионов с суток 1 до суток 4, на Фиг. 17 с показана процентная доля развития эмбрионов с суток 1 до суток 5 (среднее плюс/минус SD). К суткам 5 эмбрионы, культивированные в среде Vitrolife G1+с последующей средой Vitrolife G2+ с суток 3, демонстрировали заметное улучшение развития.

На Фиг. 17d приводятся результаты дальнейших исследований, в которых клетки культивировали в пределах блока-носителя для клеток и покрывали покрытием блока для клеток. Эмбрионы группы 1 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 5. Эмбрионы группы 2 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3, и затем эмбрионы эмбрионы переводили в новую среду Vitrolife G1+ и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 3 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3 и затем переводили в новую среду Vitrolife G2+ и культивировали до суток 5. На Фиг. 17d показана процентная доля развития эмбрионов с суток 1 до суток 5 для каждой группы обработки при культивировании клеток в устройствах согласно данному изобретению.

На Фиг. 17е показана процентная доля интенсивности окрашивания уН2а.х, демонстрирующего репарацию ДНК в эмбрионах, культивируемых в стандартной 10 мкл капле культуры с наслоением масла в чашке Петри (контроли представляли собой бластулы in vivo). Эмбрионы группы 1 культивировали в среде для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions с суток 1 до суток 5. Эмбрионы группы 2 культивировали в среде для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions с суток 1 до суток 3, и затем переводили в новую среду для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 3 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 5. Эмбрионы группы 4 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3 и затем переводили в новую среду Vitrolife G1+ и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 5 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3 и затем переводили в новую среду Vitrolife G2+ и культивировали до суток 5 (среднее плюс/минус SD).

На Фиг. 17f показан процент массы внутренних клеток (ICM) относительно общего числа клеток (TCN) в эмбрионах, культивируемых в стандартной 10 мкл капле культуры с наслоением масла в чашке Петри (контроли представляли собой бластулы in vivo). Эмбрионы группы 1 культивировали в среде для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions с суток 1 до суток 5. Эмбрионы группы 2 культивировали в среде для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions с суток 1 до суток 3, и затем переводили в новую среду для дробления эмбрионов от ART Lab Solutions и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 3 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 5. Эмбрионы группы 4 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3 и затем переводили в новую среду Vitrolife G1+ и культивировали до суток 5. Эмбрионы группы 5 культивировали в среде Vitrolife G1+ с суток 1 до суток 3 и затем переводили в новую среду Vitrolife G2+ и культивировали до суток 5 (среднее плюс/минус SD).

Репарация ДНК и процентная доля массы внутренних клеток улучшались для всех групп обработки, в которых эмбрионы переводили, относительно репарации ДНК и процентной доли массы внутренних клеток в той же самой культуральной среде, из которой не осуществляли перевод. Результаты как в отношении репарации ДНК, так и процентной доли массы внутренних клеток у эмбрионов, культивируемых в среде Vitrolife G1+ с последующей средой Vitrolife G2+, демонстрировали улучшения над эмбрионами, переведенными в среду Vitrolife G1+ в сутки 3.

Проблема плохого развития, наблюдаемого у эмбрионов, культивируемых в среде Vitrolife G1+ с последующей средой Vitrolife G1+, разрешалась посредством проведения дополнительных исследований, в которых такие же вмешательства оказывались на эмбрионов, культивируемых в пределах блоков-носителей клеток и блоков покрытия клеток. В то время как среда Vitrolife G1+ с последующей средой Vitrolife G2+ все еще демонстрировала оптимальные условия среды для роста, клетки, культивируемые в пределах блоков-носителей клеток и блоков покрытия клеток, также демонстрировали улучшение от изменения среды относительно отсутствия изменения среды. Данные результаты демонстрируют то, что блоки-носители клеток и блоки покрытия клеток улучшали ростовую недостаточность от сохранения той же самой среды на протяжении пятисуточного периода роста.

Результаты по развитию эмбрионов в процентах для эмбрионов, культивируемых в пределах стандартной 10 мкл капли культуры с наслоением масла в чашке Петри показаны на Фиг. 18a-18d под воздушной смесью либо из 6% СО₂, 5% О₂, 89% N₂, либо 6% СО₂, 20% О₂, 74% N₂ и при условиях увлажнения при 37°С. На Фиг. 18а показана процентная доля развития эмбриона с суток 1 до суток 2, на Фиг. 18b показана процентная доля развития эмбриона с суток 1 до суток 3, на Фиг. 18с показана процентная доля развития эмбриона с суток 1 до суток 4, на Фиг. 18d показана процентная доля развития эмбриона с суток 1 до суток 5 (среднее плюс/минус SD). На Фиг. 18е показана процентная доля интенсивности окрашивания γН2а.х, демонстрирующего репарацию ДНК в эмбрионах, культивируемых в стандартной 10 мкл капле культуры с наслоением масла в чашке Петри (контроли представляли собой бластулы in vivo) с воздушной смесью с повышенным уровнем кислорода или без нее.

В то время как процентная доля развития эмбрионов демонстрировала небольшое снижение к суткам 5 при культивировании эмбрионов в 20%-ном О₂, а не в 5%-ном О₂, данный результат не был согласующимся на протяжении всех суток культуры. Процентная доля репарации ДНК, однако, демонстрировала заметное улучшение к суткам 5 при культивировании клеток в присутствии 20% О₂.

Данные результаты демонстрируют то, что несмотря на травму, выдерживаемую клетками при их беспокойстве во время развития, пополнение культуральной среды привело к значимому улучшению роста и жизнеспособности культивируемых клеток. Может ожидаться, что данное улучшение усилит принятие непрерывной перфузии для введения свежей культуральной среды и, кроме того, дополнительно, когда клетки не беспокоятся во время перфузии. Несоответствия результатов развития и жизнеспособности с течением времени отражает варьирующие потребности развивающегося эмбриона на каждой стадии роста. Можно ожидать то, что статичная перфузия в присутствии оптимизированных ростовых сред и других условий культуры для каждой стадии роста, кроме того, дополнительно увеличит результаты роста.

Во всем данном описании изобретения будет понятно то, что слово «содержать» или вариации, такие как «содержит» или «содержащий», подразумевают включение заявленного элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий, но не исключение любого другого элемента, целого числа или стадии, или группы элементов, целых чисел или стадий.

Разные приборы и компоненты приборов, как описано в данном документе, могут быть предоставлены в разных размерах и/или измерениях по желанию. Подходящие размеры и/или измерения будут варьировать, в зависимости от спецификаций соединительных компонентов или области применения, которые могут быть выбраны специалистами в данной области.

Будет понятно то, что свойства, элементы и/или характеристики, описанные в отношении одного воплощения данного раскрытия, можно использовать с другими воплощениями данного изобретения по желанию.

Хотя предпочтительные воплощения настоящего раскрытия и были раскрыты в иллюстративных целях, специалистам в данной области будет понятно то, что возможны разные модификации, дополнения и замены без отступления от объема и сущности данного раскрытия и сопровождающей формулы изобретения.

Будет понятно то, что при ссылке на элемент или слой как находящийся «на» или «в пределах» другого элемента или слоя данный элемент или слой может находиться непосредственно на или в пределах другого элемента или слоя, или находящихся между элементов или слоев. В отличие о этого, при ссылке на элемент как находящийся «непосредственно на» или «непосредственно в пределах» другого элемента или слоя, отсутствуют находящиеся между элементы или слои.

Термин «и/или» в том виде, как он используется в данном документе, включает любую и все комбинации одного или более чем одного из ассоциированных перечисленных элементов.

Будет понятно то, что хотя термины первый, второй, третий и т.д. и могут использоваться в данном документе для описания разных элементов, компонентов, областей, слоев и/или отрезков, данные элементы, компоненты, области, слои и/или отрезки не следует ограничивать данными терминами. Данные термины используются только для различения одного элемента, компонента, области, слоя или отрезка от другой области, слоя или отрезка. Таким образом, первый элемент, компонент, область, слой или отрезок могли бы называться вторым элементом, компонентом, областью, слоем или отрезком без отступления от идей настоящего раскрытия.

Относящиеся к пространству термины, такие как «нижний», «верхний», «верх», «низ», «лево», «право» и тому подобные, могут использоваться в данном документе для легкости описания для описания связи одного элемента или свойства с другим(ми) элементом(тами) или свойством(ами), как проиллюстрировано на графических материалах. Будет понятно то, что относящиеся в пространству термины предназначены для охватывания разных ориентаций структур в применении или действии, помимо ориентации, показанной на Фиг. графических материалов. Например, при переворачивании устройства на Фиг. графических материалов элементы, описанные как «нижние» относительно других элементов или признаков, тогда были бы ориентированы как «верхние» относительно других элементов или признаков. Таким образом, типичный термин «нижний» может охватывать ориентацию и сверху, и снизу. Данное устройство может быть ориентировано иначе (повернуто на 90 градусов или в других ориентациях), и относящиеся к пространству идентификаторы, используемые в данном документе, следует интерпретировать соответственно.

Терминология, использованная в данном документе, служит лишь для цели описания конкретных воплощений и не предназначена для того, чтобы ограничивать данное раскрытие. Подразумевается то, что формы единственного числа в том виде, как они здесь используются, также включают формы во множественном числе, если контекст явно не указывает иное. Кроме того, будет понятно то, что термины «включающий», «содержит» и/или «содержащий» при использовании в данном описании изобретения определяют присутствие изложенных характеристик, целых чисел, стадий, операций, элементов и/или компонентов, но не исключают присутствия или добавления одной или более чем одной другой характеристики, целого числа, стадии, операции, элемента, компонента и/или их групп.

Воплощения данного описания описываются в данном документе со ссылкой на диаграммы и/или иллюстрации поперечных срезов, например, которые представляют собой схематичные иллюстрации предпочтительных воплощений (и промежуточных структур) данного описания. В связи с этим, следует ожидать вариации из форм данных иллюстраций в результате, например, методик изготовления и/или допустимых погрешностей. Таким образом, воплощения данного описания не следует истолковывать как ограниченные конкретными формами компонентов, проиллюстрированных в данном документе, но они могут включать отклонения в формах, которые возникают, например, из-за изготовления.

Если не определено иначе, все термины (включая технические и научные термины), использованные в данном документе, имеют такое же значение, которое обычно понятно обычному специалисту в области, к которой принадлежит данное описание. Кроме того, будет понятно, что термины, такие как термины, определенные в обычно используемых словарях, следует интерпретировать как имеющие значение, которое согласуется с их значением в контексте релевантной области, и они не будут интерпретироваться в идеализированном или излишне формальном смысле, если прямо так не определено в данном документе.

Любая ссылка в данном описании изобретения на «одно воплощение», «воплощение», «типичное воплощение и т.д. означает то, что конкретное свойство, структура или характеристика, описанная в связи с данным воплощением, включается в по меньшей мере одно воплощение данного описания. Виды таких фраз в разных местах в данном описании изобретения не обязательно все относятся к тому же самому воплощению. Кроме того, при описании конкретного свойства, структуры или характеристики в связи с любым воплощением в пределах квалификации специалиста в данной области является воплощение и/или применение такого свойства, структуры или характеристики в связи с другими свойствами, структурами или характеристиками данных воплощений.

Также подразумевается то, что воплощения включают или иным образом охватывают способы применения и способы изготовления любого или всех элементов, раскрытых выше.

В то время как данное изобретение было описано выше в терминах конкретных воплощений, следует понимать то, что данное изобретение не ограничивается данными раскрытыми воплощениями. При прочтении идей данного раскрытия на ум специалистам в области, к которой относится данное изобретение, придут многие модификации и другие воплощения данного изобретения, которые, как подразумевается, соответствуют и охватываются данным раскрытием и приложенной формулой изобретения.

Все публикации, упомянутые в данном описании изобретения, являются включенными в данный документ посредством ссылки. Любое обсуждение документов, актов, материалов, устройств, статей или тому подобного, которые были включены в настоящее описание изобретения, служат единственно цели предоставления контекста для настоящего изобретения. Не следует принимать в качестве допущения, что любые или все из данных материалов образуют часть основы предшествующего уровня техники или представляли собой обычное общее знание в релевантной по отношению к настоящему изобретению области в том виде, в которой оно существовало в Австралии или где-либо еще перед датой приоритета каждого пункта данной заявки.

В самом деле, подразумевается то, что объем данного изобретения должен определяться правильной интерпретацией и построением приложенной формулы изобретения и ее правовых эквивалентов, как понятно специалистам в данной области, полагаясь на раскрытие в данном описании изобретения и приложенные графические материалы.

Список литературы

1. Data on IVF clinics show wide variation in success rate, BMJ 2002; 325 doi: https://doi.Org/10.1136/bmj.325.7362.460/e (опубликована 31 августа 2002 г. ).

2. JMST Advances, June 2019, Volume 1, Issue 1-2, pp 1-11| Cite as Microfluidic technology for in vitro fertilization (IVF).

Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: микроустройство для культивирования клеток для поддержания и культивирования в нем клетки и способы его применения. При этом устройство содержит блок культивирования клеток, имеющий первый блок-носитель клеток, определяющий образованную в нем камеру культивирования клеток. Данный первый блок-носитель клеток образован из по меньшей мере основания камеры, которому придана форма для поддержания на ней клетки, и одной или более чем одной стенки камеры, имеющей одну или более чем одну поверхность стенки камеры, закрывающую данную камеру культивирования клеток примерно по границе камеры. Воплощения данного микроустройства для культивирования клеток могут применяться для процедур экстракорпорального оплодотворения и осуществления анализа эффективности лекарственных средств. 3 н. и 13 з.п. ф-лы, 3 табл., 18 ил., 7 пр.

1. Микроустройство для культивирования клеток для поддержания и культивирования в нем клеток, содержащее:

блок культивирования клеток, имеющий по меньшей мере первый блок-носитель клеток, определяющий образованную в нем камеру культивирования клеток,

причем данный первый блок-носитель клеток образован из по меньшей мере следующего:

основание камеры, имеющее форму для поддержания на нем клетки, и

одна или более чем одна стенка камеры, имеющая одну или более чем одну поверхность стенки камеры, закрывающую данную камеру культивирования клеток примерно по границе камеры,

причем данный первый блок-носитель клеток дополнительно обеспечивает направляющую поверхность для направления инструментов или текучих сред в камеру культивирования клеток, расположенную у отверстия, через стенку камеры,

причем размеры данного микроустройства для культивирования клеток составляют от приблизительно 0,1 мкм до приблизительно 1000 мкм в ширину, высоту и длину,

причем данное микроустройство для культивирования клеток выполнено с возможностью поддержания в жидкой среде в пределах большего сосуда и обеспечения пассивного обмена жидкостей с указанным большим сосудом, и

причем данное микроустройство для культивирования клеток выполнено в таком масштабе, чтобы по существу закрывать в нем одну клетку или клеточную массу,

где указанные клетки выбраны из гаметы, зиготы или эмбриона.

2. Микроустройство для культивирования клеток по п. 1, в котором одна или более чем одна стенка камеры содержит одну или более чем одну внутреннюю поверхность стенки, наклоненную к проксимальной точке данной камеры и выполненную с возможностью направления размещения инструмента или клетки в пределах данной камеры культивирования.

3. Микроустройство для культивирования клеток по п. 1 или 2, в котором камера культивирования клеток открыта сверху и основание данной камеры содержит искривленную внутреннюю поверхность.

4. Микроустройство для культивирования клеток по п. 1 или 3, в котором одна или более чем одна стенка камеры содержит:

проксимальную стенку, имеющую искривленную внутреннюю поверхность стенки, выполненную с возможностью направления размещения инструмента в пределах данной камеры культивирования, и

дистальную стенку, определяющую дистальную границу камеры и имеющую отверстие через стенку камеры, образованное через нее, причем данное отверстие определяет просвет, связанный с удлиненной направляющей частью, выступающей наружу из камеры культивирования клеток, имеющей образованный в ней канал, предоставляющий направляющую поверхность для направления инструментов или текучих сред в камеру культивирования клеток.

5. Микроустройство для культивирования клеток по п. 4, в котором одна или более чем одна стенка камеры содержит по меньшей мере левую боковую стенку и правую боковую стенку, причем каждая имеет левое боковое отверстие и правое боковое отверстие, образованное через нее.

6. Микроустройство для культивирования клеток по п. 2 или 4, в котором проксимальная стенка имеет образованное через нее проксимальное отверстие, сконфигурированное в горизонтальном выравнивании с направляющей поверхностью для облегчения потока текучей среды через камеру культивирования клеток между отверстием и проксимальным отверстием.

7. Микроустройство для культивирования клеток по п. 6, в котором проксимальная стенка содержит перфузионное впускное отверстие, адаптированное для перфузии через него текучей среды, и трубчатый патрубок, выполненный с возможностью взаимодействия перфузионной трубки с перфузионным впускным отверстием.

8. Микроустройство для культивирования клеток по любому из пп. 1-7, в котором первый блок-носитель клеток содержит стенку камеры для клеток, имеющую внешнее соединение стенки, адаптированное для взаимодействия с соответствующим внешним соединением стенки на по меньшей мере втором блоке-носителе клеток, посредством этого образуя набор носителей клеток.

9. Микроустройство для культивирования клеток по любому из пп. 1-7, дополнительно содержащее по меньшей мере второй блок-носитель клеток, образованный интегрально с первым блоком-носителем клеток, посредством этого образуя картридж носителей клеток.

10. Микроустройство для культивирования клеток по п. 3 или 9, дополнительно содержащее первый блок покрытия клеток, имеющий первую стенку покрытия, выполненную с возможностью покрытия по меньшей мере части отверстия сверху камеры культивирования клеток при соединении первого блока покрытия клеток и первого блока-носителя клеток с образованием основы блока культивирования клеток.

11. Микроустройство для культивирования клеток по п. 10, в котором первый блок покрытия клеток содержит внешнее соединение стенки, адаптированное для взаимодействия с соответствующим внешним соединением стенки на по меньшей мере втором блоке покрытия клеток, посредством этого образуя набор покрытий клеток.

12. Микроустройство для культивирования клеток по п. 11, дополнительно содержащее по меньшей мере второй блок покрытия клеток, образованный интегрально с первым блоком покрытия клеток, посредством этого образуя картридж покрытия клеток.

13. Микроустройство для культивирования клеток по п. 12, в котором первый блок покрытия клеток дополнительно содержит образованное через него отверстие для доступа, причем данное отверстие для доступа, сформированное через первый блок покрытия клеток, выполнено с возможностью обеспечения доступа к отверстию сверху в первом положении и покрытия по меньшей мере части отверстия сверху во втором положении, и адаптирован для скользящего взаимодействия с первым блоком носителем клеток от первого положения до второго положения.

14. Микроустройство для культивирования клеток по любому из пп. 1-13, в котором внешняя поверхность основания камеры содержит желобок, выполненный с возможностью принятия лапки, выступающей наружу из блока-носителя клеток или блока покрытия клеток.

15. Способ применения микроустройства для культивирования клеток по любому из пп. 1-14, включающий следующие стадии: свободное размещение одной клетки в пределах камеры для культивирования клеток микроустройства для культивирования клеток и культивирование в ней клетки.

16. Способ применения микроустройства для культивирования клеток по любому из пп. 1-14, включающий следующие стадии: получение инструкций для конструирования микроустройства для культивирования клеток и выполнение данной инструкции в процессе аддитивного производства.