СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2024 года по МПК A61K35/14 A61K35/17 A61K35/26 A61K35/28 A61K39/00 C07K14/525 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка заявляет приоритет и преимущество предварительной заявки на патент США № 62/923963, поданной 21 октября 2019 г., и предварительной заявки на патент США № 62/923967, поданной 21 октября 2019 г., и предварительной заявки на патент США № 62/923973, поданной 21 октября 2019 г., и предварительной заявки на патент США № 62/923975, поданной 21 октября 2019 г., и предварительной заявки на патент США № 62/923978, поданной 21 октября 2019 г., и предварительной заявки на патент США № 62/923982, поданной 21 октября 2019 г., содержание которых в полном объеме включено здесь посредством ссылки.

Область техники

Настоящее изобретение, в общем, относится к системам и способам культивирования клеток.

Уровень техники

Рак является ведущей причиной смертности и заболеваемости во всем мире, и, несмотря на годы интенсивных исследовательских усилий, способы лечения остаются труднодостижимыми. Разнообразие типов опухолей представляет собой реальную проблему в терапии рака, поскольку лечение, нацеленное на одну опухоль, может быть неэффективным против другой. Были предприняты попытки разработки персонализированных видов лечения, но при их разработке существует много проблем.

Одной из многообещающих областей является Т-клеточная терапия, при которой Т-клетки пациента модифицируют для нацеливания на определенные виды рака. Это включает терапию Т-клетками с химерными антигенными рецепторами (CAR-T), терапию на основе Т-клеточных рецепторов (TCR) и Т-клеточную терапию на основе неоантигенов. Терапия на основе неоантигенов дает возможность идентифицировать антигены по данным секвенирования опухолей для разработки высокоперсонализированных иммунотерапевтических средств, специфических для конкретных пациентов.

К сожалению, при разработке и производстве препаратов для Т-клеточной терапии существует множество проблем. Существующие способы выделения, приготовления и экспансии Т-клеток, специфических к опухолевым антигенам, ограничены. Обычные протоколы стимуляции Т-клеток человека аутологичными антигенпрезентирующими дендритными клетками (DC) включают несколько стадий, выполняемых вручную, в том числе перенос клеток между культуральными сосудами, смену среды и пополнение цитокинов и клеточной среды. Данные процессы являются трудоемкими и трудно масштабируются. Количество ручных стадий, необходимых для выполнения протокола, является непомерно высоким. Кроме того, эти протоколы включают использование колб или других контейнеров, которые открываются и закрываются во время использования, что увеличивает риск загрязнения, которое может поставить под угрозу качество и безопасность клеточного продукта. Такие способы не соответствуют действующим требованиям надлежащей производственной практики (cGMP) и непригодны для производства препаратов для Т-клеточной терапии в больших масштабах. Также существуют дополнительные проблемы, такие как время подготовки клеток, поддержание оптимального фенотипа, размножение до достаточного количества клеток, а также качество и безопасность клеточного продукта.

Сущность изобретения

Авторы изобретения признают, что автоматизация процессинга и производства препаратов для Т-клеточной терапии не увенчалась успехом за счет связанных сложных биологических процессов, а также биопроцессов и нормативных требований, связанных с процессингом аутологичных клеток. Те немногие системы, которые существуют, являются слишком сложными и непомерно дорогими, и поэтому они не подходят для доклинических исследований. Системы культивирования клеток по изобретению и родственные способы по изобретению обеспечивают решение многих проблем при культивировании клеток и обеспечивают многочисленные преимущества для снижения контаминации и погрешностей пользователя, а также для повышения эффективности, масштабируемости и простоты применения. Системы и способы по изобретению обеспечивают возможности для надежной продукции Т-клеток при минимизации затрат и повышении простоты и легкости использования, что делает раскрытые системы и способы пригодными как для доклинических исследований, так и для рутинного культивирования клеток, при этом они могут соответствовать требованиям текущей надлежащей производственной практики для клинического производства.

В некоторых аспектах раскрытые системы и способы обеспечивают усовершенствованную автоматизированную технологию получения антигенспецифических Т-клеток. Автоматизация выполняемых вручную процессов существенно снижает вероятность погрешностей пользователя и снижает риск контаминации. Например, изобретение относится к системам и способам получения Т-клеток, трансдуцированных CAR-T и TCR, а также Т-клеток, нацеленных на неоантиген, в закрытой системе. Это позволяет избежать необходимости открывать и закрывать Т-колбы, как это обычно делается на предшествующем уровне техники, тем самым упрощая процесс и устраняя источники контаминации. В качестве другого примера раскрыты системы культивирования клеток, которые оснащены легко взаимозаменяемыми камерами для культивирования клеток, что позволяет пользователю увеличивать или уменьшать масштаб клеточной популяции. Различные камеры и резервуары соединяются посредством сплавления стерильных трубок, так что система может оставаться закрытой на протяжении всего использования. Изобретение также относится к газонепроницаемым картриджам для культивирования клеток, которые обеспечивают твердую полистироловую поверхность для оптимальной адгезии клеток и жесткую конструкцию картриджа, которая проста в изготовлении и менее подвержена контаминации при работе с соединениями, выполненными сплавлением трубок. Раскрытые системы также обеспечивают параллельный процессинг дендритных клеток и Т-клеток в процессе получения стимулированных Т-клеток. Конструкция системы упрощает процесс культивирования Т-клеток, обеспечивая экономию времени и материалов. Другим путем экономии материалов в системе является рециркуляция клеточной культуральной среды для обеспечения возможности культивирования клеток с минимальным количеством дорогостоящей среды для культивирования и добавок.

В дополнение к преимуществам, описанным выше, специалистам в данной области техники будут очевидны и другие преимущества, поскольку раскрытые системы и способы обеспечивают многочисленные возможности для оптимизации процессов получения иммунотерапевтических продуктов.

Аспекты настоящего изобретения относятся к системе культивирования клеток с взаимозаменяемыми картриджами. Система культивирования клеток включает в себя первую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для жидкости, содержащего среду для культивирования клеток, и вторую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для отходов. Система культивирования клеток также имеет один или несколько насосов, гидравлически соединенных с резервуаром для жидкости, и подложку, конфигурированную для вмещения и поддержания камер для культивирования клеток различных форм и/или размеров.

В вариантах осуществления подложка имеет множество различных отверстий, расположенных таким образом, чтобы подложка конфигурирована для вмещения и поддержания камер для культивирования клеток различных форм и/или размеров. Подложка может быть конфигурирована для одновременного вмещения и поддержания нескольких камер для культивирования клеток. Первая часть подложки может быть конфигурирована для вмещения первой камеры для культивирования клеток первого размера, в то время как вторая часть подложки конфигурирована для вмещения второй камеры для культивирования клеток второй формы, которая отличается от первой формы. В вариантах осуществления первая часть подложки конфигурирована для вмещения первой камеры для культивирования клеток первой формы, и вторая часть подложки конфигурирована для вмещения второй камеры для культивирования клеток второй формы, которая отличается от первой формы. В вариантах осуществления первая часть подложки конфигурирована для вмещения первой камеры для культивирования клеток первого размера и формы, и вторая часть подложки конфигурирована для вмещения второй камеры для культивирования клеток второго размера и формы, которые отличаются от первого размера и формы.

В вариантах осуществления резервуар для жидкости расположен в первой зоне, и резервуар для отходов расположен в зоне отходов. Могут быть включены одна или несколько трубок, которые гидравлически соединяют резервуар для жидкости с одним или несколькими насосами, и/или один или несколько насосов с камерами для культивирования клеток, и/или камеры для культивирования клеток с резервуаром для отходов. Каждая камера для культивирования клеток может соединяться гидравлически с отдельным насосом. В некоторых вариантах осуществления процессор функционально соединен с одним или несколькими насосами, и одним или несколькими датчиками, функционирующими для измерения показателя жидкости в системе культивирования клеток, где процессор управляет одним или несколькими насосами на основе измеренного показателя.

В родственном аспекте изобретение относится к способу культивирования клеток. Способ включает обеспечение системы культивирования клеток, которая имеет первую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для жидкости, содержащего среду для культивирования клеток, и вторую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для отходов, один или несколько насосов, гидравлически соединенных с резервуаром для жидкости, и подложку, конфигурированную для вмещения и поддержания камер для культивирования клеток различных форм и/или размеров. Способ дополнительно включает загрузку резервуара для жидкости в первую зону и резервуара для отходов во вторую зону, загрузку первой камеры для культивирования клеток первого размера и/или формы в первую часть подложки и загрузку второй камеры для культивирования клеток второго размера и/или формы во вторую часть подложки. Способ дополнительно включает соединение резервуара для жидкости, одного или нескольких насосов, первой и второй камер для культивирования клеток и резервуара для отходов с помощью трубок. Способ дополнительно включает функционирование системы для культивирования клеток в первой и второй камерах для культивирования клеток.

В вариантах осуществления подложка имеет множество различных отверстий, расположенных таким образом, чтобы подложка была способна вмещать и поддерживать камеры для культивирования клеток различных форм и/или размеров. Первая камера для культивирования клеток может быть первого размера, и вторая камера для культивирования клеток может быть второго размера. Первая камера для культивирования клеток может иметь первую форму, и вторая камера для культивирования клеток может иметь вторую форму. Первая камера для культивирования клеток может иметь как первый размер, так и форму, и вторая камера для культивирования клеток может иметь как второй размер, так и форму.

В вариантах осуществления каждая из первой и второй камер для культивирования клеток гидравлически соединена с отдельным насосом. Система также может включать процессор, функционально соединенный с одним или несколькими насосами, и одним или несколькими датчиками, функционирующими для измерения показателя жидкости в системе культивирования клеток, где процессор управляет одним или несколькими насосами на основе измеренного показателя.

В вариантах осуществления после завершения культивирования клеток в первой и второй камерах для культивирования клеток культивированные клетки в каждой из первой и второй камер для культивирования клеток собирают. Культивированные клетки в каждой из первой и второй камер для культивирования клеток могут быть собраны в один и тот же резервуар для сбора или в разные резервуары для сбора клеток.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения трансдуцированных Т-клеток с CAR или TCR в закрытой системе. Способ включает обеспечение устройства для культивирования клеток, которое имеет первую и вторую культуральные камеры, и протекание суспензии, содержащей клетки, в первую культуральную камеру. Способ дополнительно включает перфузию Т-клеток в первую культуральную камеру с соответствующими реагентами для трансдукции и экспансии для получения трансдуцированных Т-клеток, которые экспандируют в первой культуральной камере. Способ дополнительно включает протекание трансдуцированных и экспандированных Т-клеток из первой культуральной камеры во вторую культуральную камеру. Способ дополнительно включает протекание среды для культивирования клеток во вторую культуральную камеру для дальнейшей экспансии трансдуцированных и экспандированных Т-клеток, где способ проводят в одном устройстве в закрытом режиме, так что стерильность сохраняется на протяжении всего способа.

В некоторых вариантах осуществления вторая культуральная камера больше, чем первая кульутраьная камера. Одна или обе культуральные камеры могут быть изготовлены из полистирола. Культуральные камеры могут быть соединены стерильной трубкой. Первая культуральная камера может содержать реагент для активации и/или реагент для трансдукции клеток, который может представлять собой неактивный вирус, экспрессирующий CAR или TCR. В качестве альтернативы вторая культуральная камера может представлять собой отдельное устройство для культивирования клеток, которое не является частью первого устройства для культивирования клеток.

В вариантах осуществления среда для культивирования клеток обеспечивается в стерильном резервуаре и соединяется с закрытой системой посредством сплавления стерильных трубок. Протекание среды для культивирования клеток в первую культуральную камеру может включать элиминацию свободного пространства в первой культуральной камере. Среда для культивирования клеток может включать среду AIM V с интерлейкином-2.

Способ может дополнительно включать активацию Т-клеток в первой культуральной камере, что может быть осуществлено посредством приведения в контакт с магнитной или немагнитной гранулой, содержащей одно или более активирующих антител или реагенты, содержащие растворимые активирующие антитела, и реагент для трансдукции. Способ может дополнительно включать слив жидкости из второй культуральной камеры, промывание трансдуцированных и экспандированных Т-клеток буфером и протекание среды для криоконсервации во вторую культуральную камеру для ресуспендирования трансдуцированных и экспандированных Т-клеток. Способ может дополнительно включать протекание трансдуцированных и экспандированных Т-клеток в резервуар для сбора в закрытом режиме.

В вариантах осуществления каждая из стадий протекания может осуществляться через стерильные трубки. Стерильные трубки могут быть соединены сплавлением стерильных трубок.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу получения Т-клеток, нацеленных на неоантиген, в закрытой системе. Способ включает обеспечение устройства для культивирования клеток, имеющего первую и вторую культуральные камеры, и протекание среды для культивирования клеток, содержащей моноциты, в первую культуральную камеру. Способ также включает перфузию очищенных моноцитов в первую культуральную камеру для получения дендритных клеток в первой культуральной камере и приведение дендритных клеток в контакт с антигенным материалом, который может включать опухолеспецифические пептиды, в первой культуральной камере для получения зрелых дендритных клеток. Способ дополнительно включает протекание зрелых дендритных клеток из первой культуральной камеры во вторую культуральную камеру, содержащую очищенные Т-клетки, для сокультивирования зрелых дендритных клеток и очищенных Т-клеток с получением тем самым Т-клеток, нацеленных на неоантиген. Способ выполняется в одном устройстве в закрытом режиме, так что стерильность сохраняется на протяжении всего способа.

В вариантах осуществления способ также включает протекание второй партии моноцитов во вторую культуральную камеру, их дифференцировку в дендритные клетки и созревание дендритных клеток для проведения затем второго сокультивирования с очищенными Т-клетками. Первая и вторая культуральные камеры могут быть изготовлены из полистирола. Первая и вторая культуральные камеры могут быть соединены стерильной трубкой. Среду для культивирования клеток можно поместить в стерильный резервуар и можно соединить с закрытой системой посредством сплавления стерильных трубок. Стадия протекания среды для культивирования клеток в первую культуральную камеру может включать элиминацию свободного пространства в первой культуральной камере. Каждая из стадий протекания может быть выполнена с помощью стерильных трубок, которые можно соединить сплавлением стерильных трубок.

В вариантах осуществления способ также включает активацию Т-клеток во второй культуральной камере. В вариантах осуществления способ также включает слив жидкости из второй культуральной камеры, промывание буфером Т-клеток, нацеленных на неоантиген, и протекание среды для криоконсервации во вторую культуральную камеру для ресуспендирования Т-клеток, нацеленных на неоантиген. Способ может также включать поступление Т-клеток, нацеленных на неоантиген, в резервуар для сбора в закрытом режиме.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу параллельного процессинга для получения дендритных клеток и параллельно стимуляции Т-клеток. Способ включает обеспечение устройства для культивирования клеток с первой и второй культуральными камерами и протекание среды для культивирования клеток, содержащей моноциты, в первую культуральную камеру. Способ дополнительно включает перфузию моноцитов в первую культуральную камеру для получения дендритных клеток в первой культуральной камере. Способ дополнительно включает протекание Т-клеток, культивированных во второй культуральной камере, из второй культуральной камеры в первую культуральную камеру с дендритными клетками для дальнейшего культивирования Т-клеток в первой культуральной камере. В вариантах осуществления стерильность поддерживается на протяжении всего способа.

Способ также может включать сбор культивированных Т-клеток из первой культуральной камеры протеканием культивированных Т-клеток в резервуар для сбора. Способ также может включать созревание дендритных клеток в первой культуральной камере посредством приведения в контакт дендритных клеток с антигенным материалом, который может включать опухолеспецифические пептиды. В вариантах осуществления способ также включает активацию Т-клеток во второй культуральной камере, которую можно осуществить с помощью активирующего реагента. В вариантах осуществления способ также включает промывание стимулированных Т-клеток буфером и, необязательно, перенос стимулированных Т-клеток в среду для криоконсервации. Способ может также включать протекание Т-клеток, нацеленных на неоантиген, в резервуар для сбора в закрытом режиме. Каждую из проточных стадий можно выполнить с помощью стерильных трубок, которые необязательно соединяют сплавлением стерильных трубок.

Среду для культивирования клеток можно поместить в стерильный резервуар и можно соединить с закрытой системой посредством сплавления стерильных трубок. Протекание среды для культивирования клеток в первую культуральную камеру может включать элиминацию свободного пространства в первой культуральной камере. В вариантах осуществления первая и вторая культуральные камеры изготовлены из полистирола и необязательно могут соединяться стерильной трубкой. В некоторых вариантах осуществления одну или обе из первой и второй камер для культивирования клеток из устройства для культивирования клеток можно заменить, и способ можно повторить.

В еще одном аспекте изобретение относится к газонепроницаемой камере для культивирования клеток, в которой верхняя, нижняя и обе боковые стенки состоят из газонепроницаемого материала. Газонепроницаемый материал также может представлять собой материал, к которому адгезируют клетки. Газонепроницаемым материалом может быть полистирол.

В вариантах осуществления камера для культивирования клеток имеет входное отверстие. Камера для культивирования клеток также может иметь выходное отверстие. Входное и выходное отверстия могут располагаться в верхней части камеры для культивирования клеток, и необязательно входное и выходное отверстия выполнены с возможностью гидравлического и герметичного соединения с трубами. Камера для культивирования клеток может быть выполнена как единое целое, и ее размеры и конфигурация могут соответствовать инкубатору. Камера для культивирования клеток может иметь размеры и конфигурацию для соединения с подложкой устройства для культивирования клеток.

В родственном аспекте изобретение относится к способу культивирования клеток, который включает обеспечение камеры для культивирования клеток, имеющей вход и выход, где верхняя, нижняя и обе боковые стенки выполнены из газонепроницаемого материала. Способ также включает загрузку клеток в камеру для культивирования клеток и протекание среды для культивирования клеток в камеру для культивирования клеток через входное отверстие для культивирования клеток в культуральной камере и из камеры для культивирования клеток через выходное отверстие, где протекание среды для культивирования клеток через камеру для культивирования клеток через входное отверстие и выходное отверстие обеспечивает непрерывный поток среды для культивирования клеток через камеру для культивирования клеток и обеспечивает газообмен между клетками в камере для культивирования клеток и средой для культивирования клеток.

В вариантах осуществления газонепроницаемый материал также представляет собой материал, к которому адгезируют клетки, такой как полистирол. В вариантах осуществления входное и выходное отверстия располагаются в верхней части камеры для культивирования клеток и необязательно выполнены с возможностью гидравлического и герметичного соединения с трубкой. Трубка может представлять собой трубку с высокой проницаемостью, которая позволяет среде для культивирования клеток осуществлять газообмен, находясь в трубке с высокой проницаемостью. В вариантах осуществления камера для культивирования клеток выполнена как единое целое. Камера для культивирования клеток может иметь такие размеры и конфигурацию, чтобы соответствовать инкубатору, и необязательно ее размеры и конфигурация могут быть рассчитаны на соединение с подложкой устройства для культивирования клеток.

В еще одном аспекте изобретение относится к способу культивирования клеток, который включает культивирование клеток в камере для культивирования клеток в устройстве для культивирования клеток при протекании среды для культивирования клеток через камеру для культивирования клеток, где часть среды для культивирования клеток, которая уже прошла через камеру для культивирования клеток, рециркулируется обратно в камеру для культивирования клеток во время процесса культивирования клеток.

В вариантах осуществления способ также включает измерение одного или более параметров использованной среды перед рециркуляцией. Параметрами могут представлять собой концентрацию одного или более соединений в использованной среде, таких как глюкоза, лактат, растворенный кислород или клеточные метаболиты. Параметром также может быть pH или количество клеток.

В вариантах осуществления способ включает определение с использованием процессора, функционально соединенного с камерой для культивирования клеток, насколько, по меньшей мере, один из одного или более параметров в использованной среде соответствует заранее определенному пороговому значению перед стадией рециркуляции. Стадия измерения может выполняться одним или более датчиками, функционально связанными с камерой для культивирования клеток. Один или более датчиков могут быть функционально связаны с резервуаром для отходов посредством гидравлического сообщения с камерой для культивирования клеток. Камера для культивирования клеток может функционально соединяться с одним или несколькими насосами и может иметь вход и выход. Стадия рециркуляции может включать перенаправление порции использованной среды из резервуара для отходов обратно в камеру для культивирования клеток. В вариантах осуществления порция использованной среды объединяется с болюсом свежей среды.

В родственном аспекте настоящее изобретение относится к способу культивирования клеток, который включает обеспечение камеры для культивирования клеток, содержащей клетки, протекание среды для культивирования клеток в камеру для культивирования клеток, удаление использованной среды для культивирования клеток из камеры для культивирования клеток, оценку параметра использованной среды для культивирования клеток и возвращение использованной среды для культивирования клеток в камеру для культивирования клеток, если параметр соответствует заранее определенному пороговому значению.

В вариантах осуществления способ также включает объединение использованной среды для культивирования клеток с болюсом свежей среды для культивирования клеток перед стадией возвращения. Стадия оценки может включать измерение параметра с использованием датчика, функционально соединенного с камерой для культивирования клеток. Стадия оценки может включать в себя определение с использованием процессора, насколько параметр соответствует заранее определенному пороговому значению. Параметр может представлять собой измеренную концентрацию одного или более соединений в использованной среде для культивирования клеток, таких как глюкоза, лактат или клеточные метаболиты. В вариантах осуществления стадия возвращения включает перенаправление использованной среды для культивирования клеток из резервуара для отходов в камеру для культивирования клеток. В еще одних вариантах осуществления способ также включает удаление использованной среды для культивирования клеток, если параметр не соответствует заранее определенному пороговому значению, и поступление свежей среды для культивирования клеток в камеру для культивирования клеток.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к системе культивирования клеток, которая включает в себя множество стеллажей для размещения резервуаров для жидкости. Стеллажи могут быть уложены друг на друга таким образом, что первый стеллаж находится поверх второго стеллажа, где каждый из первого и второго стеллажа конфигурирован для размещения резервуара для жидкости. Каждый из стеллажей может включать удерживающий механизм, который удерживает резервуар для жидкости на каждом из первого и второго стеллажей.

Система может дополнительно включать, по меньшей мере, один насос, процессор, функционально связанный, по меньшей мере, с одним насосом; и подложку, размеры и конфигурация которой позволяют одновременно вмещать множество камер для культивирования клеток. Предпочтительно система дополнительно включает, по меньшей мере, один датчик, и процессор может быть соединен, по меньшей мере, с одним датчиком, и может быть конфигурирован для функционирования, по меньшей мере, одного насоса на основе показателя, измеренного датчиком. Например, датчик может измерять концентрацию одного или более соединений в клеточной культуральной среде, таких как глюкоза, лактат или клеточные метаболиты. Процессор может регулировать насос (например, включать или выключать насос) на основе измерений, сделанных одним или несколькими датчиками. Например, один датчик может быть присоединен к камере для культивирования клеток. Этот датчик может измерять, например, уровни глюкозы в среде внутри камеры для культивирования клеток. Когда уровень глюкозы падает ниже заранее определенного порогового значения, то процессор может запустить насос для замены среды в камере для культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления процессор конфигурирован для получения и выполнения инструкций для культивирования клеток определенного типа. В других случаях процессор может быть конфигурирован для получения и выполнения инструкций для трансдукции Т-клеток.

В некоторых вариантах осуществления подложка конфигурирована для вмещения камер для культивирования клеток разных размеров и/или форм. Такая конфигурация является преимущественной, поскольку она позволяет адаптировать систему для культивирования различного количества клеток или клеток различных типов в зависимости от конкретных потребностей пользователя. Система может дополнительно включать в себя множество насосов. Например, система может включать отдельный насос для каждой камеры для культивирования клеток, включенной в систему, что позволяет культивировать клетки в каждой камере для культивирования клеток отдельно.

В некоторых вариантах осуществления система дополнительно включает в себя множество трубок, которые гидравлически соединяют первый резервуар для жидкости на первом стеллаже с множеством насосов, множество насосов с множеством камер для культивирования клеток и множества камер для культивирования клеток камеры со вторым резервуаром для жидкости на втором стеллаже. Предпочтительно система рассчитана на помещение в инкубатор.

В родственном аспекте данное изобретение относится к способу стерильного культивирования клеток. Способ включает обеспечение системы культивирования клеток, включающей множество стеллажей, уложенных друг на друга, где первый стеллаж располагается поверх второго стеллажа, где каждый из первого и второго стеллажа конфигурирован для вмещения резервуара для жидкости; по меньшей мере, один насос; процессор, функционально соединенный, по меньшей мере, с одним насосом; и подложку размер и конфигурация которой позволяют одновременно вмещать множество камер для культивирования клеток. Способ дополнительно включает загрузку первого резервуара для жидкости на первый стеллаж, загрузку второго резервуара для жидкости на второй стеллаж, загрузку первой камеры для культивирования клеток и второй камеры для культивирования клеток на подложку, соединение жидкости и вторых резервуаров для жидкостей, по меньшей мере, одного насоса и первой и второй камеры для культивирования клеток с трубками; и функционирование системы для культивирования клеток внутри первой и второй камер для культивирования клеток.

В некоторых вариантах осуществления первая и вторая камеры для культивирования клеток имеют разные размеры или формы. В некоторых вариантах осуществления система включает, по меньшей мере, один датчик. В некоторых вариантах осуществления процессор соединен, по меньшей мере, с одним датчиком и конфигурирован для управления насосом на основе показателя, измеренного датчиком.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показан пример мультибиореакторной системы.

На фиг. 2 показан вариант осуществления биореактора.

На фиг. 3 показана мультибиореакторная система.

На фиг. 4 показана последовательность операций при CAR-T/TCR.

На фиг. 5-8 приведено сравнение экспансии Т-клеток с использованием различных систем.

На фиг. 9-10 показан способ сокультивирования свежекультивированных дендритных клеток и РВМС или Т-клеток, и его результаты.

На фиг. 11 показан способ получения иммунотерапевтических продуктов на основе клеток.

На фиг. 12 показана структура системы в соответствии с некоторыми вариантами осуществления.

Подробное описание изобретения

Системы культивирования клеток по настоящему изобретению значительно усовершенствуют получение иммунотерапевтических продуктов, обеспечивая проточную технологию производства иммунотерапевтических препаратов с не имеющей себе равной степенью постоянства, качества, безопасности, экономичности, масштабируемости, гибкости и портативности. В общем, клетки выращивают в одноразовых камерах для культивирования клеток, иногда называемых картриджами, которые перфузируются при низких скоростях потока для достижения высокого уровня экспансии без необходимости использования фильтров. Система поддерживает одну или более камер для культивирования клеток, гидравлически соединенных друг с другом, для проведения процессинга клеточного материала пациента для получения иммунотерапевтического продукта, как здесь описано. Следует понимать, что в некоторых вариантах осуществления биореакторы обеспечиваются в закрытой среде. Специалистам в данной области техники будет известно, как провести масштабирование данного примерного варианта осуществления посредством добавления модулей (например, биореакторов), позволяющих выполнять последовательный и/или параллельный процессинг. Специалистам в данной области также будет понятно, что в зависимости от производимого продукта могут быть желательны различные или альтернативные устройства.

На фиг. 1 показан пример мультибиореакторной системы 900. Система 900 включает в себя первую камеру для культивирования клеток 820 и вторую камеру для культивирования клеток 920, которые имеют входные отверстия 845 и 945, соединенные с трубкой 940 и гидравлически сообщающиеся с резервуаром для жидкости 980. Камеры для культивирования клеток имеют выходные отверстия 835 и 935, гидравлически сообщающиеся с резервуаром для отходов 984. Насосы 910a и 910b облегчают перекачку жидкости из резервуара для жидкости 980 в камеры для культивирования клеток 820 и 920. Насосы управляются процессором 999 для выполнения функций, описанных здесь.

Другой вариант осуществления биореактора 110 показан на фиг. 2, на которой представлен более детальный схематический вид частей камеры для культивирования клеток 120. Важно отметить, что платформа для культивирования клеток, описанная здесь, конфигурирована таким образом, чтобы можно было использовать камеры для культивирования клеток различных объемов, форм и физических характеристик. Камера, показанная на фиг. 2 приведена только в качестве примера, и специалистам в данной области техники будут очевидны другие варианты осуществления. Как показано на фиг. 2, камера для культивирования клеток 120 включает нижнюю поверхность 122 и, по меньшей мере, одну дополнительную поверхность 124. Нижняя поверхность 122 состоит из первого материала, к которому адгезируют клетки. В некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, одна дополнительная поверхность 124 состоит из второго материала, который является газопроницаемым. В еще одних вариантах осуществления, которые будут более подробно описаны ниже, вся камера для культивирования клеток 120, включая поверхность 124, изготовлена из первого материала, который является газонепроницаемым. Камера для культивирования клеток также имеет одно или более входных отверстий 126, 136 и одно или более выходных отверстий 128, 138. В некоторых вариантах осуществления биореактор также включает, по меньшей мере, один резервуар для перфузионной жидкости 132, по меньшей мере, один резервуар для отработанной жидкости 134, по меньшей мере, один насос 140 для перемещения перфузионной жидкости через камеру 120, а также связанные входные отверстия 136 и выходные отверстия 138 для перемещения жидкости в и из резервуаров 132, 134 и через камеру 120.

В отношении камеры для культивирования клеток 120, то первым материалом может быть любой биосовместимый материал, к которому будут адгезировать антигенпрезентирующие клетки (АРС) или их предшественники, такие как дендритные клетки (DC) или моноциты, соответственно. Во время процесса стимуляции и экспансии Т-клеток, который происходит в камере для культивирования клеток 120, зрелые APC будут развиваться и предпочтительно адгезировать к нижней поверхности 122, тогда как Т-клетки остаются в надосадочной жидкости над нижней поверхностью, что облегчает раздельное получение экспандированных Т-клеток.

В одном примерном варианте осуществления первый материал включает полистирол. Одним из преимуществ использования полистирола для нижней поверхности, где будет происходить культивирование, является полезная роль, которую этот материал играет в процессе образования дендритных клеток из РВМС. В частности, полистироловые поверхности можно использовать для обогащения моноцитов из гетерогенной суспензии РВМС. Это первая стадия процесса культивирования, используемого для получения DC посредством дифференцировки моноцитов при культивировании в среде, содержащей, например, IL4 и GM-CSF. Использование одной и той же полистироловой поверхности для получения дендритных клеток в одном цикле стимуляции Т-клеток чрезвычайно ценно с точки зрения биопроцесса, поскольку устраняется большое число стадий переноса, которые в противном случае были бы необходимы, тем самым позволяя создать закрытую систему для получения DC-стимулированных терапевтических Т-клеток.

Нижняя поверхность может иметь площадь, сравнимую с площадью обычных луночных планшетов, таких как 6- и 24-луночные планшеты (9,5 см² и 3,8 см² соответственно). Также следует понимать, что площадь поверхности может быть меньше или даже намного больше, чем у обычных луночных планшетов (например, иметь площадь поверхности, сравнимую со стандартными чашками и колбами для культивирования клеток), например, иметь площадь поверхности примерно от 2,0 см² до примерно 200 см², например, примерно 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 100,0, 125,0, 150,0, 175,0 и 200,0 см², и любую площадь поверхности между указанными значениями.

По меньшей мере, одна дополнительная поверхность 124 может иметь любую конфигурацию, такую как одна или боле боковых стенок и верхняя стенка. В одном варианте осуществления, как показано на фиг. 2, боковые стенки могут располагаться под углом 90° по отношению друг к другу, так что в сочетании с нижней поверхностью 122 образуется коробчатая форма. В другом варианте осуществления, по меньшей мере, одна дополнительная поверхность 124 образует изогнутую боковую стенку таким образом, что камера 120 или ее поперечное сечение образуют цилиндр, эллиптический цилиндр, конус, куполообразную форму или форму треугольника. Следует понимать, что вышеприведенные примерные конфигурации не являются ограничивающими и что, по меньшей мере, одна дополнительная поверхность может иметь другие конфигурации, не приведенные в вышеуказанных примерах конфигураций.

Пример конфигурации мультибиореакторной системы можно найти на фиг. 3, с дополнительными деталями, касающимися процессов, выполняемых с использованием данной конфигурации, представленной ниже. Как показано на фиг. 3, панель B, в случае, если используется второй биореактор 210, то вторая камера для культивирования клеток 220 располагается таким образом, чтобы соединяться с первой камерой для культивирования клеток 120 через выход первой камеры и вход второй камеры. Соединение предпочтительно является стерильным соединением. Соединение позволяет нагнетать стерильный воздух в первую камеру для культивирования клеток 120 для переноса надосадочной жидкости, содержащей экспандированные Т-клетки, во вторую камеру для культивирования клеток 220. Альтернативные методики, известные в области потоков жидкостей, можно использовать для переноса надосадочной жидкости из первой камеры для культивирования клеток 120 во вторую камеру для культивирования клеток 220. Как также показано, каждый биореактор включает в себя свои собственные резервуары для сбора жидкостей и отходов, насосы и соответствующие трубки. Однако следует понимать, что резервуары и насосы могут быть общими для биореакторов.

Система выполнена с возможностью перфузии клеток в камеру для культивирования клеток со средой, которая требуется для различных способов культивирования клеток, описанных здесь. Перфузия обеспечивает равномерное снабжение клеточной смеси питательными веществами и цитокинами наряду с достаточным газообменом и удалением отходов, что способствует формированию клеточного иммунотерапевтического продукта. Поддержание постоянного локального профиля концентрации среды и цитокинов обеспечивает более высокие выходы и потенциальную возможность ускорения процесса дифференцировки моноцитов в DC по сравнению с протоколами на основе планшетов предшествующего уровня техники. Однако сочетание адгезивных (DC) и неадгезивных (Т-клеток) типов наряду с высокой чувствительностью DC к механическим воздействиям создает проблемы для стимуляции и экспансии антигенспецифических Т-клеток, особенно в отношении потока жидкости через камеру для культивирования клеток. Таким образом, в тех вариантах осуществления, в которых среда и цитокины вводятся посредством перфузии, системы по настоящему изобретению должны быть способны снабжать клетки питательными веществами и цитокинами без удаления клеток из биореактора, а также с учетом чувствительности некоторых антигенпрезентирующих клеток к сдвигу, таких как DC. Системы и способы по изобретению направлены на оптимизацию сохранения аутокринных/паракринных сигналов, способствующих пролиферации Т-клеток, при одновременном восстановлении факторов роста и поддержании минимальной физической стимуляции DC. Для учета этого необходимо принимать во внимание направление и скорость перфузионного потока через камеру для культивирования клеток.

В некоторых аспектах скорость потока жидкости поддерживается ниже скорости оседания антигенпрезентирующих клеток. Таким образом, антигенпрезентирующие клетки останутся в культуральной камере за счет своей массы. Другими словами, антигенпрезентирующие клетки будут опускаться на дно камеры для культивирования клеток и, следовательно, останутся в камере для культивирования клеток.

Скорость потока, которая ниже скорости оседания, можно рассчитать в соответствии с уравнением 1:

v_max= [(ψd_p)]^2/150 мкг(p_клетка-p_жидкость)e^3/(1-e)

где v_max представляет собой скорость жидкости, выше которой клетки будут подниматься вверх, ψ представляет собой коэффициент формы клеток (отношение площади поверхности клеток к площади поверхности сферической частицы равного объема; следует обратить внимание, что клетки не являются идеально сферическими, и ожидается, что данный коэффициент будет ниже 1), d_p представляет собой диаметр сферической частицы с объемом, равным объему клетки, μ представляет собой вязкость жидкости, содержащей клетки, g представляет собой гравитационную постоянную, p_клетка представляет собой плотность клеток, p_жидкость представляет собой плотность жидкости, содержащей клетки, и e представляет собой фракцию интересующего объема, не занятого клетками.

Следует понимать, что в способах, описанных ниже, включающих перфузию среды, перфузию можно проводить непрерывно во время культивирования или на определенные временные точки в течение периода времени, когда клетки культивируются в любой камере для культивирования клеток, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 раз или более каждый день или неделю. Непрерывная перфузия помогает поддерживать почти постоянный объем культуры во время всего процесса. Аналогично, цитокины можно вводить на одну или более точек во время культивирования, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более раз или непрерывно. В этих вариантах осуществления непрерывная перфузия помогает поддерживать постоянный локальный профиль концентрации цитокинов, что может способствовать обеспечению более высоких выходов, и обладает способностью повышать скорость, с которой Т-клетки подвергаются стимуляции и экспансии, по сравнению со статическими методами культивирования клеток.

Параметры перфузии можно изменять в любое время культурального цикла. Примеры параметров включают, не ограничиваясь этим, среднюю скорость потока, концентрацию цитокинов и продолжительность культурального цикла. Каждый из этих параметров может оказывать влияние на эффективность стимуляции Т-клеток. Например, в недавно опубликованной работе, посвященной конструированию культуральных камер для превращения моноцитов в DC, как описано в международных патентных заявках № PCT/US2016/040042 и PCT/US2016/60701, было определено, что средние скорости перфузии, соответствующие уровням напряжения сдвига стенки 0,1 дин/см², способны продуцировать DC, которые фенотипически идентичны тем, которые генерируются с использованием обычных протоколов на основе 6- или 24-луночных планшетов. Таким образом, посредством оценки одного или более фенотипических и функциональных показателей, описанных выше, во время цикла культивирования можно отслеживать влияние одного или более параметров перфузии на эффективность, что позволяет вносить соответствующие коррективы.

Для облегчения перфузии система включает один или несколько насосов 140. Насосы могут быть функционально соединены с камерой для культивирования клеток 120 для перфузии перфузионной среды в камеру для культивирования клеток. Биореакторы 110 также могут включать в себя один или несколько резервуаров для жидкости 132. Резервуары для жидкости 132 гидравлически сообщаются с камерой для культивирования клеток 110 и могут быть функционально соединены с одним или несколькими насосами 140. Также обеспечиваются одна или несколько трубок для соединения резервуаров для жидкости с насосами и камерой для культивирования клеток. В некоторых аспектах один или более насосов конфигурированы для перекачки жидкости из резервуара для жидкости через камеру для культивирования клеток в резервуар для сбора отходов. В примерном варианте осуществления, показанном на фиг. 2, жидкость перемещается из резервуара для жидкости 132 по трубке 152 к насосу 140 и в камеру для культивирования клеток 120 через входное отверстие 136, обратно из камеры для культивирования клеток 120 через выходное отверстие 138, по трубке 154 и в резервуар для сбора отходов 134.

В некоторых вариантах осуществления каждый из резервуаров для жидкости и/или резервуаров для сбора отходов может быть выполнен в виде одного или нескольких герметичных мешков или контейнеров, гидравлически соединенных с камерой. Каждый резервуар имеет входное отверстие и выходное отверстие или выходное отверстие и вентиляционное отверстие, гидравлически соединенные с входным отверстием одной или нескольких камер для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления люэровские соединители и силиконовые прокладки, обрезанные по размеру люэровских соединителей, могут использоваться для предотвращения утечки через одно или оба входных или выходных отверстия. В некоторых вариантах осуществления герметичные резервуары могут быть соединены с камерой для культивирования клеток с помощью аппарата для сплавления стерильных трубок, которое создает гидравлическое сообщение, не подвергая какой-либо резервуар воздействию внешней среды и сохраняя стерильность. Как будет более подробно рассмотрено ниже, это позволяет осуществлять способы изобретения в закрытой системе.

Благодаря небольшому размеру и портативности раскрытых систем культивирования клеток, их можно легко использовать вместе с аппаратом для сплавления трубок. Системы по изобретению можно легко поднять, перенести и расположить рядом с аппаратом для сплавления трубок для осуществления необходимых стерильных соединений. Размер и конфигурация систем культивирования клеток также делает их совместимыми со стандартными инкубаторами. Системы культивирования клеток имеют такие размеры и конфигурацию, чтобы помещаться на одной полке внутри обычного инкубатора для проведения в нем раскрытых процессов. В один инкубатор можно поместить несколько устройств в зависимости от конфигурации. Условия в инкубаторе включают постоянную температуру 37°C и влажность 95-100%. Таким образом, выбранные материалы должны обладать целостностью, чтобы выдерживать такие условия, учитывая, что материалы (включая жидкости и биологические соединения) имеют тенденцию к расширению в таких условиях. Кроме того, в некоторых случаях условия внутри инкубатора остаются стабильными, и возможна автоматическая регистрация температуры, чтобы иметь информацию о колебаниях температуры для корреляции с любыми отклонениями в реакциях, проводимых в инкубаторе.

Следовательно, любая подача мощности не должна изменять среду внутри инкубатора. Например, некоторые насосы генерируют тепло. Следовательно, в одном варианте осуществления насосы размещаются отдельно от биореакторов, но все еще имеют гидравлические и функциональные сообщения с реакторами. В другом варианте осуществления насосы непосредственно присоединены к биореакторам и расположены внутри инкубатора, но не нагреваются или функционально соединены с теплоотводом и/или вентилятором для отвода тепла. В еще одном варианте осуществления насосы функционируют c циклическим графиком нагрузки для уменьшения количества вырабатываемого тепла. Независимо от конфигурации насосы функционально связаны с биореакторами и, в свою очередь, с камерами для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления система также включает нагреватель для контролирования температуры резервуара для культивирования клеток и, необязательно, резервуара для жидкости. При такой конфигурации инкубатор не требуется, и система может работать автономно, имея только источник электроэнергии. Если в системе отсутствует нагреватель, то ее можно эксплуатировать внутри инкубатора для культивирования клеток.

Дополнительные детали, касающиеся автоматизированных систем культивирования клеток на основе перфузии, таких как маломасштабная система культивирования эндотелиальных клеток со встроенным хранилищем реагентов и перфузией, обеспечиваемой встроенным одноразовым перистальтическим насосом, и более крупная культуральная система для получения дендритных клеток из моноцитов с использованием камер с нижними поверхностями из полистирола, можно найти в международных патентных публикациях WO 2017/004169; WO 2017/079674; и WO 2018/005521; а также в заявке на патент США с серийным номером 16/539916; каждый документ в полном объеме включен здесь посредством ссылки.

Системы или устройства по изобретению являются модульными и могут гидравлически соединяться с другими подобными устройствами последовательно (т. е. с протеканием жидкости из одного устройства в другое) и/или параллельно, и также могут быть конфигурированы таким образом, чтобы физически соединяться друг с другом, или иметь возможность физического размещения внутри связанного устройства, такого как инкубатор. Модульная конструкция системы позволяет гибко включать и выключать модули в зависимости от желаемого процесса, который должен быть включен в систему.

Флюидные устройства по изобретению, включающие биореакторы, содержащие камеры для культивирования клеток, могут обеспечиваться в микрофлюидном варианте осуществления (т. е. в котором один или несколько каналов или камер имеют размер в диапазоне от примерно 1 мкм до примерно 999 мкм) или макрофлюидном варианте осуществления (в котором все каналы или камеры в нем имеют размеры примерно 1 мм или более), или в обоих вариантах осуществления.

Флюидные устройства могут дополнительно включать в себя дополнительные каналы или компартменты для жидкостей, прокладки или уплотнения, зоны смешивания, клапаны, насосы, вентиляционные отверстия, каналы для сжатого газа, электрические проводники, реагенты, порты и трубки, как того требует конкретная конструкция. Они также могут содержать один или более контрольных модулей, передатчики, приемники, процессоры, микросхемы памяти, аккумуляторы, дисплеи, кнопки, регуляторы, двигатели, пневматические приводы, антенны, электрические соединители и т.п. Устройства предпочтительно содержат только материалы, нетоксичные для клеток млекопитающих и совместимые со стерилизацией с использованием спирта и/или нагревания или других средств, таких как воздействие гамма-излучения или газообразного этиленоксида.

Материалы для оборудования выбираются с соответствующей химической совместимостью при различных температурах и давлении, специфичных для каждого процесса. Кроме того, выбор насосов, включенных в устройство, таких как шприцевые, перистальтические, нагнетательные и роторные насосы, варьируется по скорости потока от нл до мл и по давлению от 10 до 10000 фунт/кв. дюйм в зависимости от требований к потоку и давлению для различных функций.

Системы по изобретению могут также включать один или более резервуаров или лунок для раствора образца, или другое устройство для подачи образца в устройство через различные входные отверстия модулей, которые гидравлически сообщаются с входным каналом. Резервуары и лунки, используемые для загрузки одного или более образцов во флюидное устройство по настоящему изобретению, включают, не ограничиваясь этим, шприцы, картриджи, флаконы, пробирки Эппендорфа и материалы для культивирования клеток (например, 96-луночные планшеты).

Там, где это применимо, поверхности устройств можно сделать более гидрофильными, например, посредством воздействия плазмы, или их можно покрыть одним или несколькими гелями, покрытиями для химической функционализации, белками, антителами, протеогликанами, гликозаминогликанами, цитокинами или клетками. Флюидные устройства по изобретению предпочтительно лишены утечек жидкости в рабочих условиях и способны функционировать в стерильных условиях в течение периода времени от дней до недель. Флюидные устройства по изобретению также включают механизм отбора образцов, который позволяет удалять жидкость из системы для тестирования без введения в систему нового материала или загрязняющих веществ.

В некоторых аспектах, по меньшей мере, часть системы культивирования клеток содержит компоненты одноразового использования, некоторые или все из которых могут быть размещены в корпусе многоразового использования. В других аспектах все компоненты системы являются одноразовыми. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления система культивирования клеток включает компонент отслеживания образцов для мониторинга и документирования материала пациента.

По меньшей мере, одна стадия, и в некоторых случаях несколько или все стадии производственного процесса контролируются на предмет показателей продукта (например, чистоты и полиморфных форм) с использованием различных инструментов процессно-аналитической технологии (PAT) или миниатюрных систем микрообъемного анализа (micro-ТАС).

Как описано выше, системы культивирования клеток по настоящему изобретению способны контролировать направление и поток жидкостей и объектов внутри системы. В системах по изобретению может использоваться управление потоком по давлению, например, с использованием клапанов и насосов, для управления потоком клеток, реагентов и т. д. в одном или нескольких направлениях и/или в одном или нескольких каналах флюидного устройства. Однако также могут быть использованы другие методы, самостоятельно или в сочетании с насосами и клапанами, такие как регулирование электроосмотического потока, электрофорез и диэлектрофорез (Fulwyer, Science 156, 910 (1974); Li and Harrison, Analytical Chemistry 69, 1564 (1997); Fiedler et al. Analytical Chemistry 70, 1909-1915 (1998); патент США № 5656155).

Системы по изобретению также могут включать или быть функционально связанными с одной или более систем управления для контролирования движением жидкости через систему; мониторинга и контролирования различных параметров, таких как температура, внутри систем; а также для детектирования присутствия клеточных иммунотерапевтических продуктов, количества продукта (прямо или опосредованно), скорости конверсии и т. д. Система также может быть оснащена многочисленными классами программного обеспечения, такими как эффективный мониторинг и контроль технологического процесса в режиме реального времени, позволяя осуществлять контроль с обратной связью, а также процессы, которые позволяют интегрировать и масштабировать данные реакции и результаты очистки, полученные с помощью системы.

В некоторых вариантах осуществления система включает комбинацию микро-, милли- или макрофлюидных модулей и трубок, которые являются взаимозаменяемыми с точки зрения размеров канала, геометрии потока и взаимосвязей между различными модулями устройства. Каждый модуль и трубка могут предназначаться для определенной функции. В одном варианте осуществления все модули в системе предназначены для культивирования клеток и стимуляции Т-клеток. В других вариантах осуществления модули в системе предназначены для выполнения различных функций, таких как обработка ткани, получение дендритных клеток, культивирование клеток, концентрирование и/или очистка, и все они интегрированы для непрерывного получения иммунотерапевтического продукта. Предусматриваются как гомогенные, так и гетерогенные процессы, которые подходят для проточного применения. Эти процессы разработаны и оптимизированы с учетом исходных материалов и рабочих условий, таких как температура, давление и скорость потока, чтобы система не засорялась во время проточного процесса.

Газонепроницаемые камеры для культивирования клеток

В некоторых вариантах осуществления камеры для культивирования клеток в закрытой системе изготовлены из газонепроницаемого материала. Газонепроницаемый материал является биосовместимым и представляет собой материал, к которому будут адгезировать дендритные клетки. В одном примере осуществления газонепроницаемый материал включает полистирол, который, как описано выше, является пригодным для обогащения моноцитов из гетерогенной суспензии РВМС. Вся камера для культивирования клеток, изготовленная из газонепроницаемого материала, обеспечивает большую площадь поверхности, к которой могут адгезировать клетки, и повышает стерильность системы.

Газонепроницаемая камера для культивирования клеток может быть по существу такой же, как камера 120, показанная на фиг. 2, и может иметь любой объем, форму, размер и физические характеристики, описанные выше, за исключением того, что дополнительная поверхность 124 и все остальные поверхности камеры 120 выполнены из того же материала, что и нижняя поверхность 122. В некоторых вариантах осуществления верхняя, нижняя и все боковые стенки камеры 120 являются газонепроницаемыми. Нижняя поверхность газонепроницаемой камеры для культивирования клеток может иметь площадь, сравнимую с площадью обычных луночных планшетов, таких как 6- и 24-луночные планшеты (9,5 см² и 3,8 см² соответственно). Также следует понимать, что площадь поверхности может быть меньше или даже намного больше, чем у обычных луночных планшетов (например, иметь площадь поверхности, сравнимую со стандартными чашками и колбами для культивирования клеток), например, иметь площадь поверхности примерно от 2,0 см² до примерно 200 см², например, примерно 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 100,0, 125,0, 150,0, 175,0 и 200,0 см², и любую площадь поверхности между указанными значениями.

В систему, описанную выше, необходимо внести определенные изменения, если камера является непроницаемой для газа. Например, в таких вариантах осуществления, когда газ не проходит через одну из поверхностей камеры для культивирования клеток, то газообмен между клетками и средой должен быть облегчен другим способом. Камера для культивирования клеток имеет один или несколько входов 126 и 136 и один или несколько выходов 128 и 138. Входные и выходные отверстия могут быть гидравлически соединены с трубкой, которая герметизирована с соответствующим отверстием. Таким образом, входы и выходы могут соединяться с резервуаром для перфузионной жидкости и резервуаром для отработанной жидкости с соответствующими насосами для перемещения перфузионной жидкости через камеру. Входы и выходы могут располагаться на любой поверхности камеры. В некоторых вариантах они расположены в верхней части камеры. Трубка предпочтительно представляет собой трубку с высокой проницаемостью. Для осуществления газообмена среда может обмениваться газом до входа в камеру и после выхода из камеры через трубку с высокой проницаемостью. Таким образом, газ эффективно поступает в камеру через один или несколько входов и удаляется через один или несколько выходов. Входные отверстия или соединенные с ними трубки могут включать в себя фильтр, такой как 0,2-мкм фильтр, для фильтрации жидкости или воздуха, поступающих в камеру для культивирования клеток.

На поток газа оказывает влияние скорость перфузии, параметры которой можно контролировать, как описано выше. За счет газообмена через трубку с высокой проницаемостью система поддерживает возможность достижения требуемых уровней газообмена без необходимости того, чтобы камера была газопроницаемой. Способы культивирования клеток можно осуществлять в полностью газонепроницаемой камере, имеющей входы 126 и 136 и выходы 128 и 138 для перфузии и потока газа. В вариантах осуществления способов газонепроницаемые камеры для культивирования клеток можно использовать для культивирования клеток посредством загрузки клеток в камеру и их перфузии протеканием среды для культивирования клеток в камеру и из нее через входные и выходные отверстия. Перфузионный поток обеспечивает питательные вещества, а также газообмен в клеточной культуре. Поскольку поток через камеру является ламинарным, то для некоторых способов может потребоваться дополнительное встряхивание, например, для сбора клеток. Однако, учитывая размер и конфигурацию раскрытых систем, при необходимости всю систему можно разместить на орбитальном шейкере.

Другое преимущество газонепроницаемых вариантов осуществления заключается в том, что их проще изготовить, поскольку они содержат меньше различных деталей и материалов. Их можно сделать большими или маленькими по мере необходимости. Газонепроницаемая камера может быть выполнена цельной или состоять из нескольких частей. Например, она может быть сформирована из цельного куска материала с помощью обычных производственных процессов или аддитивных производственных процессов, таких как 3D-печать. В вариантах осуществления множество элементов, каждый из которых изготовлен из газонепроницаемого материала, соединяют друг с другом с использованием способов, известных в данной области техники, таких как механическое соединение, соединение клеем и растворителем и сварка, такая как ультразвуковая сварка.

Взаимозаменяемость камер для культивирования клеток

Системы культивирования клеток по настоящему изобретению выполнены с возможностью соединения с камерами для культивирования клеток различных размеров и форм. Система культивирования клеток может включать резервуар для жидкости, резервуар для отходов и один или несколько насосов для управления потоком жидкости в резервуары и из них. Система культивирования клеток также имеет зону, конфигурированную для вмещения одной или нескольких камер для культивирования клеток различных форм и размеров. Одна или несколько трубок гидравлически соединяют резервуар для жидкости, камеры для культивирования клеток и резервуар для отходов. Насосы предназначены для перемещения жидкости по трубкам.

Различные размеры камер для культивирования клеток можно использовать для разных целей или в сочетании друг с другом. Размер можно выбрать на основе желаемого выхода клеток или различных пропорций необходимых реагентов. Например, небольшие размеры картриджей могут быть пригодными для исследовательских целей, доклинических применений или разработки процессов. Большие картриджи представляют собой вариант с большей емкостью и аналогичной конфигурацией.

Высота одной или более камер для культивирования клеток может варьироваться. Например, и не ограничиваясь этим, примерный диапазон высот камеры для культивирования клеток включает высоту от 0,5 мм до 100 мм, например 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0, 10,0, 15,0, 20,0, 25,0, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0, 100,0 мм или более, или любую высоту между указанными значениями. В некоторых вариантах осуществления высота камеры может быть сравнима с высотой жидкости в культурах, которые обычно получают в 6- и 24-луночных планшетах, например, от 2 до 6 мм, с объемом примерно от 0,8 мл до 6 мл. В других вариантах осуществления камеры для культивирования клеток будут иметь больший размер, например, от 10 мм до 50 мм, с поверхностью для культивирования примерно 50 см². В некоторых вариантах осуществления камера для культивирования клеток имеет емкость примерно от 1 мл до примерно 100 мл и может составлять примерно 5, 10, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80 или 90 мл или между указанными значениями. В других вариантах осуществления камера для культивирования клеток имеет объем примерно от 100 мл до примерно 1000 мл, например, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 или 1000 мл. В конкретном варианте осуществления камера для культивирования клеток имеет емкость 210 мл.

Взаимозаменяемость картриджей в соответствии с настоящим изобретением позволяет увеличивать масштаб во время процедуры выращивания клеток с использованием одной и той же системы. Это позволяет избежать необходимости переключения на другую систему культивирования клеток для продолжения выращивания клеток. Например, для получения партии размером примерно 2 млрд. клеток система может начать работать с небольшого картриджа емкостью примерно 25 мл, и затем масштабироваться до большого картриджа емкостью примерно 210 мл. Такая взаимозаменяемость означает, что в одной и той же системе можно выполнять больше компонентов процесса, от активации до розлива и конечной обработки. В зависимости от требований конкретного протокола система может функционировать, например, с двумя большими (примерно 210 мл) камерами для культивирования клеток, двумя небольшими (примерно 25 мл) камерами для культивирования клеток или по одной из них. Поскольку каждый вход и выход могут быть соединены с камерой любого размера, то систему можно увеличивать или уменьшать по мере необходимости.

Вновь обращаясь к фиг. 1, система 900 включает в себя платформу 950, конфигурированную для вмещения одной или нескольких камер для культивирования клеток 820 и 920. Независимо от формы или размера, камеры для культивирования клеток могут быть соединены трубками 940. Таким образом, камеры для культивирования клеток различных форм и размеров совместимы с системой. Камеры для культивирования клеток могут располагаться на платформе в различных конфигурациях, например, рядом друг с другом или уложенные друг на друга. В вариантах осуществления трубки 940 сформированы как одно целое с камерой. Трубка и корпус камеры могут быть соединены вместе с использованием тех же способов изготовления, которые обсуждались выше. В одном варианте осуществления камера для культивирования клеток изготавливается, по меньшей мере, с вырезанием части материала на боковых и/или верхних стенках для обеспечения возможности образования одного или нескольких входов или выходов. В примерной конструкции трубка может быть отдельно вставлена в отверстия для образования уплотнения с резервуаром. Следует понимать, что вышеуказанные конфигурации представляют собой только примеры и что другие конфигурации для соединения камеры и одной или нескольких трубок также являются предполагаемыми вариантами осуществления настоящего изобретения.

Взаимозаменяемость частично облегчается за счет использования стерильных трубных сообщений для соединения различных резервуаров и камер системы. Стерильные трубки предпочтительно соединяют с помощью аппарата для сплавления стерильных трубок. Как правило, аппарат для сплавления стерильных трубок представляет собой устройство, которое может вместить две трубки, закрепить их на месте, и затем разрезать их горячим лезвием, повторно выровнять их заново таким образом, чтобы первая трубка и вторая трубка были выровнены, и сплавить два обрезанных конца вместе, когда лезвие втянуто. Аппараты для сплавления стерильных трубок для применения в настоящем изобретении могут представлять собой любые имеющиеся в продаже аппараты для сплавления стерильных трубок, включая SCD® IIB производства Terumo BCT, Inc. (Lakewood, CO); Vante® 3690 производства Vante BioPharm (Tucson, AZ); и TCD® производства Genesis BPS™ (Ramsey, NJ).

Как будет более подробно описано ниже, в некоторых вариантах осуществления система является функционально закрытой. Закрытая система поддерживается за счет того, что все переносы осуществляются с помощью спаивания стерильных трубок. Например, клетки можно хранить в стерильном мешке, который затем соединяется со стерильной камерой для культивирования клеток. Клетки могут быть перенесены в камеру для культивирования клеток при сохранении стерильности. Возможность стыкуемости трубок позволяет выполнять посев, промывание и сбор клеток в одном и том же устройстве в стерильных условиях. С помощью аппарата для спаивания стерильных трубок не нужно отсоединять один мешок перед соединением с другим.

Вышеприведенное описание было сосредоточено на компонентах системы и различных возможных конфигурациях. Следующее описание нацелено на некоторых процессы, которые могут быть осуществлены с использованием систем изобретения.

Процессы CAR-T и TCR в закрытой системе

Системы культивирования клеток, описанные выше, применимы для способов получения Т-клеток, трансдуцированных CAR-T и TCR. Визуальное представление последовательности операций CAR-T/TCR приведено на фиг. 4. Раскрытую систему можно использовать для выполнения нескольких стадий рабочего процесса в закрытой системе, включая генетическую модификацию, размножение клеток, промывание и концентрирование клеток, и формуляцию клеточной композиции. Ранее известные способы, используемые в промышленности для получения Т-клеток, трансдуцированных CAR-T и TCR, не применяются в закрытой системе. Обычно используемые Т-колбы из полистирола необходимо открывать и закрывать для выполнения переносов, и поэтому они подвержены потенциальной возможности контаминации. В настоящем изобретении используются закрытые и взаимозаменяемые картриджи, изготовленные из твердого полистирола, что позволяет легко переформатировать протоколы, разработанные для Т-колб, для выполнения в раскрытой стерильной системе.

В некоторых вариантах осуществления способ по изобретению включает протекание среды для культивирования клеток в культуральную камеру с Т-клетками и перфузию Т-клеток для их трансдукции реагентом для трансдукции, например, таким как неактивный вирус, экспрессирующий CAR или TCR. Перфузионная жидкость может включать активирующий реагент для экспансии клеток. В некоторых вариантах осуществления реагенты для трансдукции и/или активации предварительно смешивают с клетками, и в других вариантах осуществления они происходят из отдельного стерильного мешка или резервуара. Мешки могут быть соединены с использованием аппаратов для стерильного сплавления, описанных выше, и реагенты могут поступать в мешок под действием силы тяжести или с помощью насоса. В некоторых вариантах осуществления камеры для культивирования клеток заполнены полностью с небольшим свободным пространством или без него.

Клетки выращивают примерно до 3 суток, в течение которых им дают возможность принять CAR, TCR, и их подпитывают перфузионной средой. Клетки образуют осадок в камере, и скорость перфузии поддерживается достаточно низкой, чтобы предотвратить вытекание клеток из картриджа. Трансдуцированные клетки экспандируют в культуральной камере, и затем их переносят в более крупную культуральную камеру, соединенную стерильной трубкой, для дальнейшей экспансии. Используя способы по изобретению, экспансия в течение 7 суток в небольшом картридже (емкостью 25 мл) можно получить от 500 млн. до 1 млрд. Т-клеток, и в большом картридже (емкостью 210 мл) можно получить от 1 до 3 млрд. Т-клеток.

Соединение с перфузионным мешком отсоединяется и присоединяется мешок для сбора клеток. Затем клетки сливают в мешок для сбора клеток. В вариантах осуществления мешок с буфером можно присоединить теми же способами и использовать для выполнения одного или более промываний клеток перед их удалением в мешок для сбора. Объем жидкости, в которой находятся клетки, можно увеличить или уменьшить посредством слива одной жидкости, добавления другой и ресуспендирования клеток в новом объеме жидкости. В некоторых вариантах осуществления систему можно осушить для удаления скопившейся молочной кислоты. По мере роста клеточной культуры накапливается молочная кислота, которую невозможно удалить достаточно быстро только за счет перфузии. Решение состоит в том, чтобы слить среду для уменьшения общего объема (возможно, на 90-95%), не удаляя клетки, и затем залить свежей средой. В некоторых вариантах осуществления среду можно заменить другой средой для культивирования клеток или средой для криоконсервации.

Камеры для культивирования клеток соединены в закрытую систему, так что весь способ выполняется в закрытой среде без необходимости подвергать среду воздействию воздуха при открытии любого из резервуаров при переносе. Как уже упоминалось, все соединения и разъединения в данном способе можно выполнить с использованием аппарата для сплавления стерильных трубок.

В отличие от предшествующего уровня техники раскрытый способ активации, трансдукции и экспансии осуществляется в закрытой стерильной системе. Благодаря взаимозаменяемости, описанной выше, пользователь может увеличить количество экспандированных клеток до 10-20 млрд., и все это в закрытой среде. В некоторых вариантах осуществления способы можно использовать для подготовки партии к производству в более крупной биореакторной системе. При обычном производстве CAR-T необходимы партии из 10 млрд. клеток или более. С использованием раскрытых систем и способов по настоящему изобретению можно выполнять предшествующие стадии активации, трансдукции и начальной экспансии до переноса 1 млрд. клеток или более в более крупную систему для размножения, такую как XURI™, доступную от GE Healthcare (Chicago, IL). Эта возможность делает системы очень совместимыми с реагентами немагнитной активации.

На фиг. 5 и 6 показан пример сравнения экспансии Т-клеток, проведенной с использованием раскрытой в настоящее время системы, известной как BATON™ от Flaskworks, LLC (Boston, MA), и другой коммерчески доступной платформы для экспансии Т-клеток G-REX® от WilsonWolf (St. Paul, MN). На фиг. 5 приведен график кратной экспансии при использовании BATON™ в течение 9 суток с PBMC, стимулированными DYNABEADS® от Thermo Fisher (Waltham, MA), при проведении в картридже емкостью 25 мл. Стабильная кратная экспансия, достигаемая с использованием BATON™, сравнима с системой G-REX®.

На фиг. 6 показано количество клеток на сутки 0 и сутки 7 при использовании обеих систем. С использованием BATON™ получали примерно 1 млрд. клеток из 40 млн. Т-клеток за 7 суток в картридже емкостью 210 мл в соответствии с настоящим изобретением. Фенотип преимущественно представляет клетки центральной памяти. Как дополнительно показано на фиг. 7, фенотипические профили в системах BATON™ и G-REX® сопоставимы. На фиг. 7 также сравниваются колбы T75 производства Corning Inc. (Corning, NY). Как показано, BATON™ и G-REX® генерировали эквивалентные соотношения CD4/CD8 на сутки 9.

Как показано на фиг. 8, цитотоксичность Т-клеток, полученных с использованием системы BATON™, сравнима с цитотоксичностью клеток, полученных с использованием системы G-REX®. Эффекторные клетки экспандировали в течение 9 суток, и клетками-мишенями были Т-клетки Jurkat. Клетки смешивали в соотношении эффектор/мишень 10:1 и инкубировали при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 ч. Среда представляла собой RPMI 1640 (АТСС) + 15% FBS. На сутки 5 и сутки 7 клетки из всех трех групп были сравнимы по цитотоксичности.

Процесс с неоантигеном в закрытой системе

Раскрытые системы также пригодны в рабочем процессе для получения Т-клеток, нацеленных на неоантиген. Получение данной группы терапевтических средств включает сокультивирование антигенпрезентирующих клеток, стимулированных библиотеками опухолеспецифических пептидов, и аутологичных Т-клеток. Получение клеток, презентирующих неоантиген, является более сложным, чем получение CAR-T. В отличие от CAR/TCR, в способе по настоящему изобретению можно использовать библиотеку мишеней, а не только одну мишень. Для этого требуются определенные возможности, обеспеченные раскрытыми системами по настоящему изобретению, которые были недоступными в системах предшествующего уровня техники.

Система по настоящему изобретению генерирует свежие дендритные клетки из моноцитов пациента. Система также конфигурирована для сокультивирования дендритных клеток с РВМС или Т-клетками пациента и доставки стимулированных Т-клеток. Система может выполнять несколько циклов сокультивирования со свежеполученными дендритными клетками, чтобы избежать конкурирующих эффектов между различными антигенами. Параллельный процессинг дендритных клеток и Т-клеток для облегчения этого процесса будет более подробно описан ниже. Типичные уровни доз для неоантигенной терапии составляют примерно 200 млн. Т-клеток, с которыми может работать раскрытая система в небольшом (примерно 25 мл) или в большом (примерно 210 мл) картридже.

В отличие от способов предшествующего уровня техники, системы по изобретению облегчают все вышеперечисленное в закрытой среде. В способе используются взаимосвязанные камеры для культивирования клеток в системе по настоящему изобретению. Очищенные моноциты вносят в одну из камер для культивирования клеток, и очищенные Т-клетки вводят в другую. Моноциты перфузируют с культуральной средой для получения дендритных клеток, которые затем приводят в контакт с антигенным материалом, содержащим опухолеспецифические пептиды. Это дает зрелые дендритные клетки, презентирующие опухолеспецифические пептиды. Т-клетки переносят в камеру, содержащую зрелые дендритные клетки, для сокультивирования их с Т-клетками. Сокультивирование продуцирует Т-клетки, нацеленные на неоантиген. После одного цикла стимуляции посредством сокультивирования Т-клетки можно удалить и необязательно перенести во вторую камеру, содержащую свежеполученные зрелые дендритные клетки, для проведения второго сокультивирования. Вторая партия дендритных клеток может быть получена асинхронно из дендритных клеток, образовавшихся в первой камере.

В вариантах осуществления зрелые дендритные клетки генерируют в первой камере, и затем Т-клетки добавляют в первую камеру и сокультивируют. Затем Т-клетки из первой камеры перемещают во вторую камеру, где их сокультивируют со свежеполученными дендритными клетками, которые подвергаются стимуляции тем же или другим набором пептидов. Затем экспандированные Т-клетки можно переместить обратно в первую камеру, где ожидает еще одна партия свежих зрелых дендритных клеток, стимулированных тем же или другим набором пептидов.

Т-клетки можно переносить обратно и между двумя соединенными камерами любое число раз по желанию. Это может быть особенно пригодным для стимуляции DC несколькими различными пептидами. Например, если имеется библиотека примерно из 20 пептидов, с помощью которых необходимо стимулировать DC, то попытка стимуляции DC всеми пептидами сразу приведет к недостаточной стимуляции за счет конкурирующих эффектов между пептидами. Некоторые пептиды обладают большим эффектом и/или аффинностью, чем другие. Стимуляцию можно выполнить постадийно, например, сначала стимуляцию партии DC пятью пептидами при первом сокультивировании, и затем стимуляцию следующей партии DC пятью другими пептидами при втором сокультивировании и так далее. В других вариантах осуществления можно проводить несколько циклов стимуляции с использованием одной небольшой группы пептидов. В неограничивающих вариантах осуществления Т-клетки можно переносить 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 или 25 раз. Каждое сокультивирование может включать DC, стимулированные одинаковыми или разными пептидами.

Способ целиком осуществляется в закрытой системе по настоящему изобретению, тем самым обеспечивается сохранение стерильности в течение всего способа. Как и в других раскрытых способах, сообщения между культуральными камерами могут обеспечиваться стерильными трубками, которые соединяются с помощью аппарата для сплавления стерильных трубок. Это поддерживает такую стерильность среды для культивирования клеток, которая обеспечивается в стерильном резервуаре. В различных вариантах осуществления Т-клетки можно переносить между камерами в одном и том же устройстве или между камерами в разных устройствах.

После завершения сокультивирования жидкость сливают из камеры, и нацеленные на неоантиген Т-клетки можно промыть буфером и ресуспендировать в криоконсерванте и/или собрать в мешок для сбора, который также соединен закрытым образом.

На фиг. 9 представлена блок-схема способа сокультивирования свежекультивированных дендритных клеток и РВМС или Т-клеток в закрытой системе по настоящему изобретению. Используя стерильные сплавленные соединения, раскрытая система культивирования клеток обеспечивает автоматизированный посев, культивирование и сбор клеток. Как показано в последовательности операций, моноциты засеваются на сутки 0 и дифференцируются в дендритные клетки в течение суток 0-6. На сутки 6 добавляют аллогенные РВМС или Т-клетки. Дендритные клетки обеспечивают экспансию Т-клеток из РВМС. Экспандированные Т-клетки собирают на сутки 13.

Экспандированные Т-клетки, полученные с помощью раскрытых способов, проявляют устойчивую цитотоксическую активность. Результаты примера, выполненного с использованием данной последовательности операций, приведены на фиг. 10. Соотношение мишеневых CD 8+ Т-клеток и клеток Jurkat составляло 1:1, при этом эксперименты проводили с использованием 1-3 млн. собранных клеток. Клетки Jurkat перед анализом окрашивали PKH67. Клетки инкубировали в течение 1 суток и после анализа все клетки окрашивали CD3 и аннексином V. Образовавшиеся мертвые клетки Jurkat показаны на фиг. 10.

Параллельный процессинг дендритных клеток и Т-клеток

Для процесса формирования клеточного иммунотерапевтического продукта требуется сокультивирование двух типов клеток. В раскрытых системах по настоящему изобретению эти клетки можно получать параллельно для более эффективной генерации антигенспецифических Т-клеток. Вкратце, дендритные клетки получают из моноцитов и подвергают созреванию приведением в контакт с антигенным материалом, и Т-клетки активируют, и затем сокультивируют с DC. В способах предшествующего уровня техники для этого способа потребовалось бы выполнение нескольких операций, выполняемых вручную. Однако система по настоящему изобретению может продуцировать две партии клеток параллельно в закрытой системе. При использовании систем, раскрытых здесь, дендритные клетки продуцируются в одной камере и параллельно Т-клетки стимулируются в другой сообщающейся камере. Моноциты перфузируют в первую камеру для получения DC, которые приводят в контакт с антигенным материалом для их созревания. Активированные Т-клетки из другой сообщающейся камеры протекают в первую камеру для контактирования с DC и дальнейшего культивирования Т-клеток. Как и в других способах, камеры соединяются стерильной трубкой, так что способ выполняется в практически закрытой системе. Т-клетки можно собрать, переливая их в резервуар для сбора, и/или перенести в среду для криоконсервации, оставаясь при этом в конфигурации закрытой системы.

Далее следует обратиться к фиг. 11, на которой показана общая схема процесса получения иммунотерапевтических продуктов на основе клеток. Стадии получения клеточного терапевтического продукта в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения включают сокультивирование стимулированных антиген-презентирующих клеток (например, DC) с клетками, содержащими Т-клетки, в биореакторе, включающем камеру для культивирования клеток. Во время культивирования образуется надосадочная жидкость, содержащая терапевтические продукты на основе экспандированных Т-клеток. В некоторых аспектах для получения количества антигенспецифических Т-клеток, достаточного для того, чтобы вызвать терапевтический ответ у пациента, Т-клетки необходимо подвергнуть дополнительному культивированию в одной или нескольких дополнительных камерах для культивирования клеток. Для осуществления такого дополнительного культивирования, должен иметь место перенос надосадочной жидкости из культуральной камеры, в которой была получена надосадочная жидкость, в последующую камеру для культивирования клеток, содержащую свежий запас антигенпрезентирующих клеток. Перенос надосадочной жидкости между камерами для культивирования клеток может включать введение потока газа в первую камеру для культивирования клеток, который переносит надосадочную жидкость, содержащую первый клеточный продукт, через флюидный соединитель в новую камеру для культивирования клеток. Кроме того, во время каждой из стадий культивирования в камеры можно перфузировать перфузионную жидкость, содержащую, например, среду и цитокины. В некоторых аспектах перфузионная жидкость протекает через камеры по вертикальному пути потока для гарантии того, что клетки остаются внутри камеры во время культивирования. К системе можно присоединить одну или несколько последующих камер для культивирования клеток, где каждая камера содержит новую партию аутологичных антигенпрезентирующих клеток, подвергнутых импульсному антигенному пептидному воздействию.

Для стимуляции и экспансии антигенспецифических Т-клеток процесс начинается с сокультивирования клеток, включающих Т-клетки, с антигенпрезентирующими клетками (APC), полученными от одного и того же субъекта, в камере для культивирования клеток. В конкретном варианте осуществления клетки, содержащие Т-клетки, включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), и APC включают DC. Клетки, содержащие Т-клетки, и APC можно доставить в камеру для культивирования клеток в соотношении (клетки, содержащие Т-клетки:APC) примерно от 1000:1 до 1:1000, например, не ограничиваясь этим, 1000:1, 900:1, 800:1, 700:1, 600:1, 500:1, 400:1, 300:1, 200:1, 100:1, 75:1, 50:1, 25:1, 20:1, 15:1, 10:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1: 6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20, 1:50, 1:75; 1:100, 1:200: 1:300, 1:400, 1:500, 1:600, 1:700, 1:800, 1:900, 1:1000, или любое соотношение между указанными значениями. В одном аспекте соотношение 10:1 является предпочтительным.

Для инициации стимуляции и экспансии Т-клеток в результате взаимодействия APC с клетками, содержащими Т-клетки, необходимо стимулировать APC. Это можно сделать при использовании одной или нескольких стимулирующих молекул. В некоторых вариантах осуществления стимулирующая молекула не является опухолеспецифической. В других вариантах осуществления стимулирующая молекула является опухолеспецифической. Например, стимулирующая молекула может быть выбрана из одной или нескольких характеристик опухоли субъекта, таких как различные антигенные пептиды. В некоторых вариантах осуществления стимулирующую молекулу предпочтительно добавляют только в начале культурального цикла. Стимулирующую молекулу можно добавить в течение периода примерно из нескольких минут, часа, нескольких часов или дольше. В одном предпочтительном варианте стимулирующие молекулы добавляют в течение примерно часа.

Сокультивирование APC и Т-клеток происходит в культуральной среде. Примеры культуральных сред включают, не ограничиваясь этим, среду RPMI и среду Cellgenix®. Любую другую подходящую культуральную среду, известную в данной области техники, можно использовать в соответствии с вариантами осуществления настоящего изобретения. Цитокины, такие как IL-4 и GM-CSF, также можно добавить в культуральную среду.

Обычно недостаточно провести только одно сокультивирование. Раскрытая система позволяет выделить Т-клетки в виде суспензии. В данном случае Т-клетки можно повторно стимулировать свежими дендритными клетками, и можно провести несколько сокультивирований в закрытой системе. В способах параллельного процессинга по настоящему изобретению картриджи можно соединить в цепочку, и клетки можно перемещать из одного картриджа в другой. В один реактор, содержащий зрелые, адгезированные DC, загружают РВМС и подвергают циклу стимуляции с перфузией среды и цитокинов. При параллельном процессинге экспандированные Т-клетки могут непрерывно подвергаться воздействию свежих DC, продуцированных в первой камере для культивирования клеток, за счет стимуляции антигенными пептидами. Процесс стимуляции может продолжаться столько времени, сколько это необходимо, чтобы генерировать достаточно большое количество клеток для получения терапевтической дозы Т-клеток.

Соединение многих камер вместе посредством стерильного соединения может включать в себя конфигурацию из многочисленных камер, как обсуждалось выше при пояснении фиг. 3. Соединение позволяет нагнетать стерильный воздух в первую камеру для культивирования клеток для переноса надосадочной жидкости, содержащей экспандированные Т-клетки, во вторую камеру для культивирования клеток. В некоторых вариантах осуществления один или несколько биореакторов могут быть предусмотрены в системе, содержащей модули для выполнения различных других процессов до, одновременно с или после процесса, имеющего место в камерах для культивирования клеток в биореакторах.

Один картридж можно переместить в мешок для сбора клеток или в новый картридж посредством стерильного сплавления и герметизации. В некоторых вариантах осуществления дендритные клетки могут быть получены, и затем собраны, подвергнуты криоконсервации и использованы по требованию. Между тем, система может независимо запускать второй картридж для генерации свежих дендритных клеток.

В некоторых аспектах используются подходы компьютерного моделирования для оптимизации взаимодействия Т-клеток с антигенпрезентирующими клетками. Вычислительные модели в соответствии с настоящим изобретением учитывают влияние перфузии и оптимальное время, необходимое для стимуляции, и включают подходы, основанные как на взаимодействии частиц, так и на основе кинетических параметров. Примеры подходов, основанных на взаимодействии частиц и на основе кинетических параметров, известны в данной области техники, некоторые из которых описаны в настоящем документе. Например, в отношении подходов, основанных на взаимодействии частиц, Day и Lythe описывают время, необходимое Т-клетке, чтобы найти APC на поверхности лимфатического узла, используя следующее уравнение, где D представляет собой коэффициент диффузии Т-клетки, и b представляет собой радиус APC, расположенной в центре сферического лимфатического узла радиусом R. См. Day et al., Mathematical Models and Immune Cell Biology; 2011:

В отношении подходов, основанных на кинетических параметрах, Valitutti разработал модель взаимодействия между Т-клетками и антигенпрезентирующими клетками, как показано на фиг. 9. Valitutti et al., FEBS Lett. 2010. Однако такие взаимодействия не моделировались в контексте культуральной камеры или биореактора.

Посредством включения подходов, основанных на взаимодействии частиц, а также подходов, основанных на кинетических параметрах, в вычислительных моделях по настоящему изобретению можно провести автоматизированное определение и мониторинг оптимальной скорости перфузии перфузионной жидкости (например, среды, насыщенной цитокинами) для максимизации вероятности контактирования двух типов клеток друг с другом в камере для культивирования клеток, могут быть достигнуты.

Например, в некоторых вариантах осуществления обеспечивается система культивирования клеток, которая включает камеру для культивирования клеток и центральный процессор, включающий запоминающее устройство, содержащее инструкции, выполняемые центральным процессором. В некоторых аспектах инструкции побуждают систему принять первые входные данные, включающие размер камеры для культивирования клеток, принять вторые входные данные, включающие первую концентрацию клеток первого типа и вторую концентрацию клеток второго типа в одной или более жидкостей, которые будут введены в камеру для культивирования клеток, и рассчитать на основе первых и вторых входных данных скорость перфузии жидкости для перфузии, которая будет введена в камеру для культивирования клеток, что максимизирует вероятность контактирования первого типа клеток и клеток второго типа друг с другом внутри камеры для культивирования клеток. Дополнительные детали, касающиеся компьютерных систем для осуществления способов по настоящему изобретению в системах для культивирования клеток, представлены ниже.

В некоторых аспектах система также включает в себя один или несколько насосов, функционально соединенных с одним или несколькими резервуарами для перфузионной жидкости и функционально соединенных с центральным блоком процессинга, так что центральный блок процессинга также управляет скоростью перфузии перфузионной жидкости посредством контролирования одним или более насосами.

Рециркуляция среды

Среда для культивирования клеток и добавки (такие как цитокины) являются дорогостоящими, и использованная среда часто содержит остаточные питательные вещества, которые необоснованно выбрасываются. Признавая это, раскрытые системы обеспечивают способы повторного возвращения части частично использованной среды и ее рециркуляцию. В некоторых способах по изобретению клетки культивируют в одной из описанных камер для культивирования клеток, где среда для культивирования клеток протекает через камеру для культивирования клеток. Обычно жидкость протекает во входное отверстие и вытекает из выходного отверстия. Часть среды для культивирования клеток, которая уже прошла через камеру для культивирования клеток и вышла из выходного отверстия, возвращается обратно в камеру для культивирования клеток во время процесса культивирования клеток.

Для определения того, сколько и/или какая часть использованной среды может быть возвращена в камеру для культивирования клеток, изобретение включает измерение одного или более параметров, таких как содержание питательных веществ или pH использованной среды перед рециркуляцией. Измеряемыми питательными веществами могут быть глюкоза, лактат, растворенный кислород или клеточные метаболиты. Представляющий интерес параметр анализируется, и процессор определяет, насколько параметр соответствует предварительно определенному пороговому значению, который указывает, что он может быть повторно использован. Если это так, то среду отправляют обратно в камеру для культивирования клеток.

Использованную среду можно рециркулировать саму по себе, или ее можно объединить с болюсом свежей среды. Если, с другой стороны, использованная среда не соответствует заранее определенному пороговому значению, то она отбрасывается. В некоторых вариантах осуществления клапан функционирует для направления использованной среды в резервуар для отходов или обратно в камеру для культивирования клеток.

В различных вариантах осуществления рециркуляцию можно проводить с любой частотой. Например, один или несколько датчиков могут анализировать использованную среду через равные промежутки времени, например, каждую секунду, каждую минуту, каждые 10 мин, каждый час и т.д. В других вариантах осуществления один или несколько датчиков могут функционировать непрерывно, анализируя среду по мере ее прохождения через линию отходов. В некоторых вариантах осуществления рециркуляция управляется посредством обратной связи от внешних фильтров или датчиков, которые контролируют отработанную среду, чтобы определить, можно ли ее использовать повторно или она уже израсходована. В некоторых вариантах осуществления в систему включается встроенный датчик для контроля отработанного материала и определения возможности его повторного использования.

Рециркуляция позволяет достичь цели обеспечения газообмена между внешней частью камеры для культивирования клеток и клетками, содержащимися внутри, при одновременном снижении количества среды, которая будет расходоваться в процессе, по сравнению с процессом, в котором среда перфузировалась напрямую без рециркуляции.

Скорость рециркуляции можно модулировать на основе необходимого газообмена и поступления питательных веществ. Например, в процессе культивирования клеток, когда Т-клетки размножаются от небольшого количества до значительно большего количества, то начальную стадию культивирования можно проводить при перфузии с низкой скоростью потока со 100% рециркуляцией. Это связано с тем, что питательных веществ в закрытом контуре перфузии достаточно для небольшого числа клеток, и скорость потока установлена на уровне, достаточном для обеспечения достаточного газообмена (поступление кислорода, выход CO₂). Затем, когда клетки начинают экспандировать, их потребность в питательных веществах и газообмене возрастает. Рост контролируется и может служить основой для принятия решений, связанных с увеличением скорости перфузионного потока (для увеличения газообмена) и изменением степени рециркуляции (рециркуляция только части среды и добавление новой среды постепенно увеличивающимися фракциями). В принципе, это можно сделать в динамическом и автоматическом режиме.

В вариантах осуществления камера для культивирования клеток включает один или несколько датчиков, функционально соединенных с камерой для культивирования клеток. Система может быть выполнена с различными конфигурациями датчиков для мониторинга различных параметров и интеграции с контролирующей системой. Датчики могут быть способны измерять один или несколько параметров в камере для культивирования клеток, таких как рН, растворенный кислород, общая биомасса, диаметр клеток, концентрация глюкозы, концентрация лактата и концентрация клеточных метаболитов. Система может быть оснащена готовыми одноразовыми датчиками для глюкозы и лактата, которые отбирают перфузионную жидкость и передают данные. В некоторых вариантах картриджи являются оптически прозрачными и могут быть сопряжены с методами измерения, такими как оптическая плотность или комбинационное рассеяние света. В некоторых вариантах датчики могут быть функционально соединены с линией отходов или резервуаром для отходов и конфигурированы для измерения одного или нескольких параметров жидкой среды, протекающей по ним. В некоторых аспектах один или более датчиков функционально соединены с компьютерной системой, имеющей центральный процессор для выполнения инструкций, так что возможен автоматический мониторинг и регулировка параметров. Система может быть конфигурирована для автоматического перенаправления жидкости обратно в камеру через входное отверстие, если жидкость соответствует по определенному параметру. В некоторых вариантах осуществления контрольно-измерительные приборы взаимодействуют со структурой системы управления, используя компьютеры, сети и графические пользовательские интерфейсы для управления технологическими процессами, а также другие периферийные устройства для взаимодействия с оборудованием технологического предприятия. Трубка для отходов может иметь клапан, который может направлять жидкость в то или иное место, например, в зависимости от того, имеет ли жидкость достаточный уровень питательных веществ. Дополнительные подробности, касающиеся компьютерных систем для реализации способов настоящего изобретения с использованием камер для культивирования клеток, представлены ниже.

Конфигурация систем

Аспекты настоящего раскрытия, описанные здесь, такие как контроль за движением жидкости через систему, как описано выше, и мониторинг и контролирование различных параметров, могут выполняться с использованием любого типа вычислительного устройства, такого как компьютер или программируемый логический контроллер (PLC), который включает в себя процессор, например, центральный процессор или любую комбинацию вычислительных устройств, где каждое устройство выполняет, по меньшей мере, часть процесса или способа. В некоторых вариантах осуществления системы и способы, описанные здесь, можно выполнять с помощью портативного устройства, например, умного планшета, смартфона или специального устройства, созданного для данной системы.

Способы по настоящему раскрытию можно осуществлять с использованием программного обеспечения, аппаратных средств, микропрограммного обеспечения, аппаратного обеспечения или комбинации любого из них. Преимущества, реализующие функции, также могут быть физически расположены в разных местах, в том числе могут быть распределены таким образом, что части функций реализуются в разных физических местах (например, устройство для обработки изображений в одной комнате и основная рабочая станция в другой, или в отдельных зданиях, например, с беспроводным подключением или проводным соединением).

Процессоры, пригодные для выполнения компьютерной программы, включают, например, микропроцессоры как общего, так и специального назначения, и любой один или несколько процессоров любого типа цифрового компьютера. Как правило, процессор будет получать инструкции и данные из постоянного запоминающего устройства или оперативного запоминающего устройства, или из обоих. Элементами компьютера являются процессор для выполнения инструкций и одно или несколько запоминающих устройств для хранения инструкций и данных. Как правило, компьютер также будет включать в себя или быть оперативно соединенным для приема данных или передачи данных, или того и другого, на одно или несколько энергонезависимых запоминающих устройств большой емкости для хранения данных, например, магнитных, магнитооптических дисков или оптических дисков. Носители информации, подходящие для осуществления инструкций и данных компьютерных программ, включают все формы энергонезависимой памяти, включая, например, полупроводниковые запоминающие устройства (например, EPROM, EEPROM, твердотельный накопитель (SSD) и устройства флэш-памяти); магнитные диски (например, внутренние жесткие диски или съемные диски); магнитооптические диски; и оптические диски (например, CD и DVD диски). Процессор и запоминающее устройство могут быть дополнены или включены в логическую схему специального назначения.

Для обеспечения взаимодействия с пользователем предмет изобретения, описанный здесь, может быть реализован на компьютере, имеющем устройство ввода-вывода, например, CRT, LCD, LED, или проекционное устройство для отображения информации пользователю и устройство ввода или вывода, такое как клавиатура и указывающее устройство (например, мышь или шаровой манипулятор), с помощью которых пользователь может вводить данные в компьютер. Другие виды устройств также можно использовать для обеспечения взаимодействия с пользователем. Например, обратная связь, предоставляемая пользователю, может представлять собой любую форму сенсорной обратной связи (например, визуальную обратную связь, слуховую обратную связь или тактильную обратную связь), и ввод от пользователя может быть получен в любой форме, включая акустический, речевой или тактильный ввод.

Предмет изобретения, описанный здесь, может быть реализован в вычислительной системе, которая включает в себя внутренний компонент (например, сервер баз данных), компонент промежуточного программного обеспечения (например, сервер приложений) или внешний компонент (например, клиентский компьютер, имеющий графический пользовательский интерфейс или веб-браузер, через который пользователь может взаимодействовать с реализацией предмета изобретения, описанного здесь), или любую комбинацию таких внутренних, промежуточных и внешних компонентов. Компоненты системы могут быть связаны между собой через сеть с помощью любой формы или средства передачи цифровых данных, например, коммуникационной сети. Примеры коммуникационных сетей включают в себя сотовую сеть (например, 3G или 4G), локальную сеть (LAN) и глобальную сеть (WAN), например, Интернет.

Предмет изобретения, описанный здесь, может быть реализован в виде одного или более компьютерных программных продуктов, таких как одна или более компьютерных программ, материально воплощенных в носителе информации (например, в энергонезависимом машиночитаемом носителе) для выполнения или управления работой устройства для обработки данных (например, программируемого процессора, компьютера или нескольких компьютеров). Компьютерная программа (также известная как программа, программное обеспечение, программное приложение, app, макрос или код) может быть написана на любом языке программирования, включая компилируемые или интерпретируемые языки (например, C, C++, Perl), и может быть развернута в любой форме, в том числе как отдельная программа или как модуль, компонент, подпрограмма или другая единица, подходящая для использования в вычислительной среде. Системы и способы по изобретению могут включать в себя инструкции, написанные на любом подходящем языке программирования, известном в данной области техники, включая, помимо прочего, C, C++, Perl, Java, ActiveX, HTML5, Visual Basic или JavaScript.

Компьютерная программа не обязательно соответствует файлу. Программа может храниться в файле или части файла, содержащей другие программы или данные, в отдельном файле, предназначенном для данной программы, или в нескольких скоординированных файлах (например, файлах, в которых хранится один или несколько модулей, подпрограммах и т. д., или частях кода). Компьютерная программа может быть развернута для выполнения на одном компьютере или на нескольких компьютерах в одном месте или распределена по нескольким местам и соединена коммуникационной сетью.

Файл может представлять собой цифровой файл, например, хранящийся на жестком диске, SSD, компакт-диске или другом материальном, энергозависимом носителе. Файл может быть отправлен с одного устройства на другое по сети (например, в виде пакетов, отправляемых с сервера клиенту, например, через карту сетевого интерфейса, модем, беспроводную карту и т.п.).

Запись файла в соответствии с вариантами осуществления изобретения включает преобразование материального, энергозависимого, машиночитаемого носителя, например, добавлением, удалением или перестановкой областей (например, с суммарным зарядом или дипольным моментом в паттерны намагниченности посредством считывающих/пишущих головок), паттерны затем представляют новые сочетания информации об объективных физических феноменах, желательных для пользователя и пригодных для него. В некоторых вариантах осуществления запись включает физическое преобразование материала в материальный, энергозависимый, машиночитаемый носитель (например, с определенными оптическими свойствами, чтобы оптические устройства для чтения/записи могли затем считывать новое и пригодное сочетание информации, например, запись на компакт-диске). В некоторых вариантах осуществления запись файла включает в себя преобразование физического устройства флэш-памяти, такого как устройство флэш-памяти NAND, и сохранение информации посредством преобразования физических элементов в массиве ячеек памяти, который состоит из транзисторов с плавающим затвором. Способы записи файла хорошо известны в данной области техники и, например, могут выполнены вручную или автоматически программой или командой сохранения из программного обеспечения или командой записи из языка программирования.

Подходящие вычислительные устройства обычно включают в себя запоминающее устройство, по меньшей мере, один графический пользовательский интерфейс, по меньшей мере, одно устройство для отображения и обычно включают в себя средства связи между устройствами. Массовая память иллюстрирует тип машиночитаемого носителя, а именно компьютерный носитель информации. Компьютерные носители данных могут включать энергозависимые, энергонезависимые, съемные и несъемные носители, реализованные в любом методе или технологии для хранения информации, такой как машиночитаемые инструкции, структуры данных, программные модули или другие данные. Примеры компьютерных носителей данных включают RAM, ROM, EEPROM, флэш-память или другую технологию памяти, CD-ROM, цифровые универсальные диски (DVD) или другие оптические носители, магнитные кассеты, магнитную ленту, запоминающие устройства на магнитных дисках или другие магнитные запоминающие устройства, метки или чипы радиочастотной идентификации или любой другой носитель, который можно использовать для хранения нужной информации и к которому может получить доступ вычислительное устройство.

Как будет понятно специалистам в данной области техники, необходимая или наиболее подходящая для выполнения способов по изобретению компьютерная система или машины, используемые в вариантах осуществления изобретения, могут включать один или несколько процессоров (например, центральный процессор (CPU)) графический процессор (GPU) или оба), основную память и статическую память, которые взаимодействуют друг с другом через шину.

В примерном варианте осуществления, показанном на фиг. 12, система 600 может включать в себя компьютер 649 (например, ноутбук, настольный компьютер или планшет). Компьютер 649 может быть конфигурирован для коммуникации по сети 609. Компьютер 649 включает в себя один или несколько процессоров 659 и запоминающее устройство 663, а также механизм ввода/вывода 654. Когда в способах по изобретению используется структура клиент/сервер, то операции по изобретению можно выполнять с использованием сервера 613, который включает в себя один или более процессоров 621 и запоминающее устройство 629, способных получать данные, инструкции и т. д., или предоставлять результаты через интерфейсный модуль 625 или предоставлять результаты в виде файла 617. Сервер 613 может быть задействованным по сети 609 через компьютер 649 или терминал 667, или сервер 613 может быть напрямую подключен к терминалу 667, включая один или более процессоров 675 и запоминающее устройство 679, а также механизм ввода/вывода 671.

Система 600 или машины в соответствии с примерными вариантами осуществления изобретения могут дополнительно включать в себя для любого из входов/выходов 649, 637 или 671 блок дисплея (например, жидкокристаллический дисплей (LCD) или монитор с электронно-лучевой трубкой (CRT)). Компьютерные системы или машины в соответствии с некоторыми вариантами осуществления могут также включать в себя буквенно-цифровое устройство для ввода (например, клавиатуру), устройство управления курсором (например, мышь), дисковый накопитель, устройство для формирования сигнала (например, динамик), сенсорный экран, акселерометр, микрофон, сотовую радиочастотную антенну и устройство сетевого интерфейса, которым может быть, например, карта сетевого интерфейса (NIC), карта Wi-Fi или модем для сотовой связи.

Запоминающее устройство 663, 679 или 629 согласно примерным вариантам осуществления изобретения может включать в себя машиночитаемый носитель, на котором хранится один или более наборов инструкций (например, программное обеспечение), воплощающих любую одну или несколько методологий или функций, описанных здесь. Программное обеспечение может также полностью или, по меньшей мере, частично находиться в основной памяти и/или в процессоре во время его выполнения компьютерной системой, где основная память и процессор также представляют собой машиночитаемый носитель. Программное обеспечение может дополнительно передаваться или приниматься по сети через устройство сетевого интерфейса.

Включение по ссылке

Ссылки и цитаты на другие документы, такие как патенты, патентные заявки, патентные публикации, журналы, книги, документы, веб-контент, были сделаны по тексту всего данного раскрытия. Все такие документы настоящим включены здесь посредством ссылки во всей их полноте для всех целей.

Эквиваленты

Несмотря на то, что настоящее изобретение было описано в сочетании с некоторыми вариантами осуществления, любой специалист после прочтения вышеприведенного описания сможет осуществить различные изменения, замены эквивалентов и другие изменения в композициях и способах, изложенных здесь.

Группа изобретений относится к системе и способу культивирования клеток. Система культивирования клеток содержит: первую зону для резервуара для жидкости, содержащей среду для культивирования клеток; вторую зону для резервуара для отходов; один или несколько насосов; по меньшей мере первую и вторую газонепроницаемые камеры для культивирования; подложку для вмещения и поддержания первой и второй камер для культивирования клеток одновременно и одну или несколько газопроницаемых трубок. Способ культивирования клеток включает: обеспечение системы культивирования клеток; загрузку резервуара для жидкости в первую зону и резервуара для отходов во вторую зону; загрузку первой камеры для культивирования клеток первого размера и/или формы на первую часть подложки; загрузку второй камеры для культивирования клеток второго размера и/или формы на вторую часть подложки; протекание среды для культивирования клеток в первую камеру для культивирования клеток; и перенос надосадочной жидкости из первой камеры для культивирования клеток во вторую камеру для культивирования клеток. Группа изобретений обеспечивает усовершенствованную автоматизированную технологию производства продуктов клеточной иммунотерапии, позволяя снизить риск контаминации. 2 н. и 11 з.п. ф-лы, 12 ил.

1. Система культивирования клеток, содержащая:

первую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для жидкости, содержащей среду для культивирования клеток;

вторую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для отходов;

один или несколько насосов, гидравлически соединенных с резервуаром для жидкости;

по меньшей мере первую газонепроницаемую камеру для культивирования клеток и вторую газонепроницаемую камеру для культивирования клеток;

подложку, конфигурированную для вмещения и поддержания первой и второй камер для культивирования клеток одновременно; и

одну или несколько газопроницаемых трубок, которые гидравлически соединяют резервуар для жидкости по меньшей мере с одним из одного или несколькими насосами, по меньшей мере один из одного или нескольких насосов - с первой и/или второй камерой для культивирования клеток, первую и/или вторую камеру для культивирования клеток - с резервуаром для отходов, и первую и вторую камеры для культивирования клеток - друг с другом.

2. Система культивирования клеток по п.1, в которой подложка содержит множество различных отверстий в подложке, которые расположены таким образом, что подложка конфигурирована для одновременного вмещения и поддержания нескольких камер для культивирования клеток различных форм и/или размеров.

3. Система культивирования клеток по п.1, дополнительно содержащая резервуар для жидкости, расположенный в первой зоне, и резервуар для отходов, расположенный во второй зоне.

4. Система культивирования клеток по п.1, в которой первая часть подложки конфигурирована для вмещения первой камеры для культивирования клеток первого размера и/или формы, и вторая часть подложки конфигурирована для вмещения второй камеры для культивирования клеток второго размера и/или формы, которая отличается от размера и/или формы первой камеры для культивирования клеток.

5. Система культивирования клеток по п.1, в которой каждая камера для культивирования клеток гидравлически соединена с отдельным насосом.

6. Система культивирования клеток по п.1, дополнительно содержащая процессор, функционально соединенный с одним или несколькими насосами, и один или несколько датчиков, функционирующих для измерения показателя жидкости в системе культивирования клеток, где процессор выполнен с возможностью управления одним или несколькими насосами на основе измеренного показателя.

7. Способ культивирования клеток, где способ включает:

обеспечение системы культивирования клеток, включающей первую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для жидкости, содержащего среду для культивирования клеток, вторую зону, конфигурированную для вмещения резервуара для отходов, один или нескольких насосов, гидравлически соединенных с резервуаром для жидкости, по меньшей мере первую газонепроницаемую камеру для культивирования клеток и вторую газонепроницаемую камеру для культивирования клеток, и подложку, конфигурированную для вмещения и поддержания первой и второй газонепроницаемых камер для культивирования клеток одновременно;

загрузку резервуара для жидкости в первую зону и резервуара для отходов во вторую зону;

загрузку упомянутой первой камеры для культивирования клеток первого размера и/или формы на первую часть подложки;

загрузку упомянутой второй камеры для культивирования клеток второго размера и/или формы на вторую часть подложки;

соединение резервуара для жидкости, одного или нескольких насосов, первой и второй камер для культивирования клеток и резервуара для отходов газопроницаемой трубкой;

протекание среды для культивирования клеток в первую камеру для культивирования клеток через входное отверстие первой газонепроницаемой камеры для культивирования клеток; и

перенос надосадочной жидкости из первой камеры для культивирования клеток во вторую камеру для культивирования клеток.

8. Способ по п.7, в котором подложка содержит множество различных отверстий в подложке, которые расположены таким образом, что подложка конфигурирована для одновременного вмещения и поддерживания нескольких камер для культивирования клеток различных форм и/или размеров.

9. Способ по п.7, в котором каждая из первой и второй камер для культивирования клеток гидравлически соединена с отдельным насосом.

10. Способ по п.7, в котором система культивирования клеток дополнительно содержит процессор, функционально соединенный с одним или несколькими насосами, и один или несколько датчиков, функционирующих для измерения показателя жидкости в системе культивирования клеток, где процессор управляет одним или более насосов на основе измеренного показателя.

11. Способ по п.7, в котором после завершения культивирования клеток в первой и второй камерах для культивирования клеток собирают культивированные клетки в каждой из первой и второй камер для культивирования клеток.

12. Способ по п.11, в котором культивированные клетки в каждой из первой и второй камер для культивирования клеток собирают в один и тот же резервуар для сбора.

13. Способ по п.11, в котором культивированные клетки в каждой из первой и второй камер для культивирования клеток собирают в разные резервуары для сбора.