Способ получения нокаута гена CD209 в эмбрионах Bos taurus путем трансдукции зигот адено-ассоциированными вирусами, кодирующими saCas9 и соответствующую гидовую РНК Российский патент 2023 года по МПК C12N15/113 C12N15/66 C12N15/873 A01K67/27 

Область техники

Изобретение относится к области молекулярной биотехнологии и касается метода редактирования генома, в первую очередь, получения нокаута выбранных генов, в данном случае CD209. Изобретение может быть использовано для получения животных с нокаутом гена CD209, приводящим к устойчивости животных к некоторым патогенам.

Изобретение создано при финансовой поддержке Министерства Науки и Высшего образования Российской Федерации в рамках Соглашения № 075-15-2019-1661 от 31.10.2019 на базе Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины (ЦВРГТБ) ИБГ РАН.

Уровень техники

Редактирование и модификация генома – это современные подходы, которые позволяют получать животных с требуемыми характеристиками: составом молока [1, 2], объемом мышц [3, 4] или устойчивостью к инфекционным заболеваниям [5, 6]. На сегодняшний день получены генетически модифицированные представители различных видов, в том числе грызуны [7, 8], приматы [9, 10] и крупный рогатый скот [6, 11, 12]. Основной способ генетической модификации и редактирования генома животных – внесение модификаций в геном эмбрионов на ранних стадиях развития. Для достижения этой цели используют различные методики: трансплантацию генетически модифицированных in vitro ЭСК в полость бластоцисты с последующим формированием мозаичного зародыша [13, 14], или доставку реагентов для редактирования генов в развивающиеся эмбрионы путем инъекции РНК или ДНК в зиготу или ооцит [15-20] или электропорации зиготы [21-23]. Основным недостатком этих методов является то, что они требуют дорогостоящего оборудования и высокой квалификации операторов.

Генетическая модификация клеток (в том числе эмбрионов) путем трансдукции - простой метод: требуется только базовое лабораторное оборудование (CO2-инкубаторы, микроскопы); нет необходимости делать микроинъекции; вирусы, используемые для трансдукции, могут производиться в другом месте и легко транспортируются. Поэтому производство трансгенных эмбрионов может осуществляться вблизи ферм (где лаборатории зачастую оснащены лишь базовым оборудованием). Таким образом, такой подход позволит выполнить все необходимые процедуры (извлечение эмбрионов, генную модификацию и перенос эмбрионов животному) в одном месте, снизив риск повреждения эмбрионов при транспортировке.

Для доставки генетического материала в зиготу можно использовать различные типы вирусов. Для этих процедур используют ретровирусы [24], особенно лентивирусы [25], аденовирусы [26] и аденоассоциированные вирусы [27].

Аденоассоциированные вирусы (ААВ) широко используются в области получения генетически модифицированных клеток и организмов. Было показано, что ААВ служат эффективным инструментом для получения трансгенных мезенхимальных стволовых клеток свиньи [28], сперматозоидов и эмбрионов [29], нейронов взрослых мышей [30], мышиных [26, 27] и бычьих эмбрионов [27].

Аденоассоциированные вирусы имеют значительно меньшие вирионы по сравнению с ретровирусами или аденовирусами. Их небольшой (около 20 нм) размер [31, 32] облегчает проникновение вириона ААВ в зародыш.

ААВ традиционно считаются безопасной вирусной векторной платформой из-за того, что вирус-помощник необходим для возникновения инфекции в естественных условиях. Аденоассоциированный вирус может инфицировать клетку, но для цикла его размножения требуется вирус-помощник, такой как аденовирус или вирус простого герпеса. Все серотипы рекомбинантных векторов ААВ, созданных в отсутствие хелперных вирусов, рассматриваются как агенты группы риска 1 (агенты, не связанные с заболеванием у здоровых взрослых людей), если трансген не кодирует для токсического или потенциально туморогенного гена. Следовательно, многие рекомбинантные векторы ААВ можно использовать без дополнительных опасений по поводу биобезопасности [33].

В рамках данного изобретения трансдукция бычьих эмбрионов с помощью ААВ была выбрана в качестве потенциального подхода к редактированию генома. Пять различных серотипов ААВ использовали для оценки их способности доставлять генетический материал в эмбрионы крупного рогатого скота.

У млекопитающих CD209 (также известный как DC-SIGN; специфичная для дендритных клеток молекула межклеточной адгезии) является одним из ключевых белков, участвующих во многих иммунологических событиях. CD209 представляет собой лектиновый рецептор С-типа, присутствующий на поверхности макрофагов и дендритных клеток [34]. Являясь частью первой линии врожденного иммунитета, CD209 довольно не специфически распознает широкий круг возбудителей: вирусы, бактерии, грибы, протисты. Во время коэволюции в системах хозяин/патоген некоторые патогены научились использовать CD209 для дальнейшего распространения (например, CD209+ DC используются для переноса вирионов ВИЧ из места контакта на слизистой оболочке в кровоток и лимфатические узлы) и, таким образом, поражать различные типы клеток. Влияние CD209 на разные стадии инфекционного процесса показано для ВИЧ [35], вируса гепатита С [36], вируса Эбола, вируса Денге, коронавирусов, микобактерий туберкулеза [37, 38], лейшманий [39] и другими инфекционными агентами (обзор в [40]).

Один из возможных механизмов, связанных с CD209, защиты патогенов от иммунной системы был выяснен для вирусов ВИЧ и гепатита С. Было показано, что даже если обычно после связывания с CD209 патогены интернализуются в протеасомы для будущей презентации антигена, при определенных обстоятельствах (таких как наличие дополнительных рецепторов) после связывания CD209 ВГС и ВИЧ частицы могут интернализоваться в специализированные, нелизосомальные, эндосомы с низким рН [36, 41, 42]. Недавно было продемонстрировано, что мыши с нокаутом CD209 менее восприимчивы к инфекции Toxoplasma gondii: инвазия и распространение паразитов происходили медленнее, а смертность снизилась [43].

Недавно было показано, что некоторые изоформы CD209 могут влиять на развитие резистентности коров к заражению паратуберкулезом [44-46]. Более того, сообщалось, что сверхэкспрессия CD209 в бычьих макрофагах in vitro приводит к усилению аденовирусной инфекции [47]. Таким образом, получение нокаута CD209 актуально для лучшего понимания механизмов инфекции при паратуберкулезе и аденовирусах. Получение такого нокаута потенциально может позволить животным стать устойчивыми к различным инфекциям.

Краткое описание изобретения

Задачей заявляемого изобретения является разработка метода получения эмбрионов Bos taurus с нокаутом гена CD209 и получение соответствующих эмбрионов.

Задача решается тем, что с использованием ААВ, кодирующих компоненты системы CRISPR/Cas9, разработан соответствующий метод и получены эмбрионы Bos taurus с нокаутом гена CD209, для чего:

1. На основе вектора px601 (SEQ ID NO: 1) была получена плазмидная конструкция px601+CD209-sg, содержащая гидовую РНК (SEQ ID NO: 2) против соответствующего участка (3 экзона гена Bos taurus) гена CD209, под контролем U6 промотора и ОРС гена saCas9 под контролем CAG промотора.

2. Был разработан способ получения эмбрионов с нуль-аллелем гена CD209, характеризующийся следующими стадиями:

а) Сборка в клетках упаковочной линии HEK293T стока ААВ, содержащего ОРС saCas9 и гидовую РНК;

б) In vitro оплодотворение яйцеклеток Bos taurus сперматозоидами Bos taurus;

в) Инфекция эмбрионов ААВ;

г) Проведение анализа наличия сдвига рамки считывания в гене CD209 в бластоцистах (г), путем амплификации целевого участка гена CD209 с праймерами cd209-check-f (SEQ ID NO: 3) и cd209-check-r (SEQ ID NO: 4) с последующим секвенированием фрагмента с использованием праймера cd209-check-r (SEQ ID NO: 4).

Технический результат изобретения: разработан способ генетического редактирования эмбрионов Bos taurus и получены эмбрионы с нуль-аллелем гена CD209.

Краткое описание чертежей

На Фиг. 1 представлена схема взаимного расположения первых экзонов гена CD209, гидовой РНК и праймеров для анализа генотипа.

На Фиг. 2 представлены хроматограммы, полученные в результате секвенирования мозаичных эмбрионов: двоящиеся сиквенсы, соответствующий мозаичным эмбрионам в части клеток которых произошло редактирование генома.

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом:

1.  Подбор гидовой РНК для внесения разреза в ген bCD209 с целью внесения сдвина рамки считывания осуществлялся с использованием онлайн инструмента CRISPOR TEFOR (http://crispor.tefor.net/) с учетом последующего использования нуклеазы SаCas9. Была подобрана гидовая РНК (CD209-sg, последовавательности SEQ ID NO: 1) к третьему экзону гена bCD209. В результате NHEJ-репарации после их разрезания должен образовываться сдвиг рамки считывания в первом экзоне, приводящий к изменению аминокислотной последовательности белка и преждевременному образованию стоп-кодона (Фиг. 1). Выбранную сгРНК мы заклонировали в плазмидный вектор px601, предназначенный для одновременной экспрессии белка saCas9 и сгРНК. Последовательность гидовой РНК была синтезирована с использованием двух олигонуклеотидов SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.

Разрезание вектора проводили с использованием рестриктазы BbsI-HF (New England Biolabs), дефосфорилирование вектора с помощью фермента FastAP (Thermofisher Scientific), затем очистка в агарозном геле и последующее выделение с помощью набора Monarch DNA Gel Extraction Kit.

Олигонуклеотиды фосфорилировались с использованием фермента PNK kinase (Thermofisher Scientific), отжигались друг с другом и лигировались с приготовленным ранее вектором и использованием фермента T4 DNA ligase (Thermofisher Scientific). Лигазная смесь трансформировалась в компетентные клетки штамма XL1blue (Евроген). Скрининг колоний осуществлялся с использованием пцр-наборов компании Изоген и праймеров U6-forv (SEQ ID NO: 7) и реверсного праймера, использовавшегося для клонирования. По две колонии, содержащие сгРНК, наращивались в ночной культуре и выделялись с помощью набора Monarch Plasmid Miniprep Kit. Анализ полученных плазмид проводили методом секвенирования по Сэнгеру. Сиквенс полученных плазмид осуществлялся с использованием праймера U6-forv (SEQ ID NO: 7) компанией Евроген. Анализ сиквенсов проводился с использованием программного обеспечения Chromas.

2. Протестированную конструкцию, выделенную набором Maxiprep Plasmid Purification Kit (Qiagen) вместе с плазмидами Rep2-Cap и pHelper (обе – Agilent) использовали для трансфекции клеток HEK293. Рекомбинантные ААВ получали как описано в [49]. Прикрепленные клетки HEK293Т поддерживали в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы (Gibco, США), с добавлением 10% об./об. фетальной бычьей сыворотки (FBS, Biosera Europe, Франция) и пенициллина со стрептомицином. Трансфекцию проводили линейным ПЭИ (полиэтиленимин, масс. 25000) (Polysciences, США) Через 72 ч после трансфекции клетки лизировали 0,5% об./об. Triton X-100, 5 мкг/мл РНКазы А и 10 мкг/мл ДНКазы А (Calbiochem, США) в течение 1 ч при 37°С с встряхиванием. Затем осветленную и концентрированную вирусную суспензию загружали в модифицированную версию йодиксанола (Sigma Aldrich, США) со ступенчатым градиентом плотности (60%, 40% и 25%) [50] и подвергали ультрацентрифугированию в течение 1 ч при 350 000 g и 18°С. Фракцию, содержащую ААВ, подвергали диализу с использованием мембраны 100 кДа против буфера для хранения (PBS, 350 мМ NaCl, 0,1% Pluronic F-68 (Gibco)), а очищенную суспензию дополнительно концентрировали и стерилизовали [51]. Для определения титра использовали метод, основанный на использовании праймеров и флуоресцентного зонда, нацеленного на последовательности ITR (Inverted terminal Repeats) [52]. Отсутствие белковых примесей во время приготовления подтверждали окрашиванием серебром (ThermoFisher, США).

3. Получение яйцеклеток

Ооциты были выделены из яичников, полученных на местных скотобойнях. Полученные после забоя и разделки туши яичники транспортировали в лабораторию в течение 3-4 часов при температуре 38.5^оС. Выделение ооцит-кумулюсных комплексов (содержащих ооциты и вспомогательные клетки кумулюса) из яичников проводили путём аспирации в результате пунктирования крупных фолликулов. Аспирацию производили с помощью предварительно нагретой до температуры 38.5^оС среды G-MOPS (Vitrolife, Швеция) посредством инсулиновых шприцов (объёмом 1 мл) с иглой 30G.

Полученные ооциты затем были подвергнуты процедуре созревания in vitro (IVM - in vitro maturation) для достижения стадии метафазы второго деления мейоза, что необходимо для возможности оплодотворения ооцитов. Для этого ооцит-кумулюсные комплексы помещали в среду BO-IVM medium (IVF Bioscience, UK), покрытую слоем парафинового масла (Sage, USA) для предотвращения испарения и изменения осмолярности среды, и культивировали при температуре 38.5^оС в увлажненной температуре в атмосфере 6.5% CO2 и 5%O2 в пластиковых чашках Петри диаметром 60 мм.

4. Подготовка сперматозоидов

Для проведения экстракорпорального оплодотворения была использована криоконсервированная сперма. Для криоконсервации свежую сперму, полученную путём донирования, помещали в 0,2 мл лунки, изготовленные во фторопластовой плате, помещенному над поверхностью жидкого азота. Плату со спермой инкубировали над жидким азотом над высотой 5 см в течение 1,5-2 минут после чего погружали непосредственно в жидкий азот. После удаления платы из жидкого азота, гранулы спермы собирали и помещали для хранения в сосуд Дьюара.

Криоконсервированную сперму размораживали при температуре 37^оС в течение 1 минуты, а затем центрифугировали в градиенте плотности (80% Percoll SpermGrad (Vitrolife, Швеция)) объёмом 3 мл в течение 10 минут при 700g. После центрифугирования осадок отмывали с помощью буферного раствора SpermRinse buffer medium SpermGrad (Vitrolife, Швеция), с добавлением 5 МЕ/мл гепарина в течение 5 минут при 350g.

5. Экстракорпоральное оплодотворение

Для проведения экстракорпорального оплодотворения сперматозоиды (в концентрации ~1*10⁶-2*10⁶ в мл) и ооцит-кумулюсные комплексы помещали в среду BO-IVF medium (IVF Bioscience, UK) на 15 часов для оплодотворения. Затем эмбрионы трижды отмывали в среде BO-IVF medium (IVF Bioscience, UK). Процедуру жкстракорпорального оплодотворения производили в CO₂-инкубаторе при температуре 38.5°C в увлажненной атмосфере, содержащей 6.5%CO₂ и 5%O₂.

6. Трансдукция эмбрионов и культивирование

Культивирование эмбрионов производили в CO₂-инкубаторе при температуре 38.5°C в увлажненной атмосфере, содержащей 6.5%CO₂, эмбрионы культивировали в среде BO-IVC medium (IVF Bioscience, UK), покрытой слоем парафинового масла (Sage, USA) для предотвращения испарения и изменения осмолярности среды. Культивирование эмбрионов осуществляли до стадии бластоцисты (170-180 часов культивирования) без смены среды.

Трансдукцию эмбрионов осуществляли с помощью аденоассоциированных вирусов. Для этого в среду для культивирования эмбрионов (в тот момент, когда эмбрионы находились на стадии зиготы) добавляли вирионы ААВ в концентрации 5*10⁹ вирусных геномов в расчёте на 100 мкл культуральной среды.

7. Анализ генотипа эмбрионов. На 7 день после трансдукции эмбрионы отмывали от среды в TE-буфере (10 мМ Tris, 1 мМ ЭДТА), лизировали в 5 мкл буфера для лизиса бластоцист (0,1 М Tris-HCl, 0,1 M KCl, 0,02% Gelatin, 0,45% Tween-20, 0,125 mg Proteinase K) в течение 20 минут при температуре 56 градусов, а затем 10 минут при температуре 95 градусов. Используя лизат в качестве матрицы, амплифицировали целевой фрагмент с использованием 10 пМ праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4 и Phire Tissue Direct PCR Master Mix (Thermofisher) по протоколу: денатурация 98°С - 30 сек; далее следовало 35 циклов: 98°С - 5 сек, 63°С - 5 сек; 72°С - 10 сек; и последний синтез 72°С - 1 мин. После прохождения реакции ПЦР-смесь очищали в 1,5% агарозном геле, полученный продукт выделяли набором Monarch DNA Gel Extraction Kit, секвенировали в компании Евроген и использованием праймера SEQ ID NO:4. Полученные сиквенсы можно подразделить на две категории: сиквенсы дикого типа, последовательность в которых соответствует дикому типу, и двоящиеся сиквенсы, демонстрирующие мозаицизм эмбриона (Фиг. 2).

Пример 1. Получение эмбрионов Bos taurus с редактированным геном CD209 в части клеток. По результатам секвенирования по Сэнгеру были обнаружены 3 эмбриона из 22 проверенных, содержащих инсерции и делеции в области PAM-сайта. Сиквенсы этих эмбрионов представлены на фигуре 2. Инсерции и делеции произошли на расстоянии в три нуклеотида от PAM сайта (самом вероятном месте разрезания SaCas9). В первом эмбрионе произошла делеция delTTGAACAG и инсерция insAT, во втором эмбрионе делеция delTTG и инсерция insA, в третьем эмбрионе делеция delGAACCAG и инсерция insATAG.

Список литературы:

1. Clark A.J. Genetic modification of milk proteins // Am. J. Clin. Nutr. 1996. Vol. 63, №4. P. 633-638.

2. Shepelev M.V., Kalinichenko S.V., Deykin A.V., Korobko I.V. Production of Recombinant Proteins in the Milk of Transgenic Animals: Current State and Prospects // Acta Naturae. 2018. Vol. 10, №3. P. 40-47.

3. Tabebordbar M., Zhu K., Cheng J.K.W., Chew W.L., Widrick J.J., Yan W.X., Maesner C., Wu E.Y., Xiao R., Ran F.A., Cong L., Zhang F., Vandenberghe L.H., Church G.M., Wagers A.J. In vivo gene editing in dystrophic mouse muscle and muscle stem cells // Science. 2016. Vol. 351, №6271. P. 407-411.

4. Bengtsson N.E., Hall J.K., Odom G.L., Phelps M.P., Andrus C.R., Hawkins R.D., Hauschka S.D., Chamberlain J.R., Chamberlain J.S. Muscle-specific CRISPR/Cas9 dystrophin gene editing ameliorates pathophysiology in a mouse model for Duchenne muscular dystrophy // Nat. Commun. 2017. Vol.8, №14454.

5. Xu K., Zhou Y., Mu Y., Liu Z., Hou S., Xiong Y., Fang L., Ge C., Wei Y., Zhang X., Xu C., Che J., Fan Z., Xiang G., Guo J., Shang H., Li H., Xiao S., Li J., Li K. CD163 and pAPNdouble-knockout pigs are resistant to PRRSV and TGEV and exhibit decreased susceptibility to PDCoV while maintaining normal production performance // Elife. 2020. Vol.9, №e57132. 

6. Yuan M., Zhang J., Gao Y., Yuan Z., Zhu Z., Wei Y., Wu T., Han J., Zhang Y. HMEJ-based safe-harbor genome editing enables efficient generation of cattle with increased resistance to tuberculosis // J. Biol. Chem. 2021. Vol.296, №100497.

7. Anderson K.R., Haeussler M., Watanabe C., Janakiraman V., Lund J., Modrusan Z., Stinson J., Bei Q., Buechler A., Yu C., Thamminana S.R., Tam L., Sowick M.A., Alcantar T., O'Neil N., Li J., Ta L., Lima L., Roose-Girma M., Rairdan X., Durinck S., Warming S. CRISPR off-target analysis in genetically engineered rats and mice // Nat Methods. 2018. Vol.15. Р. 512–514. 

8. Bruter A.V., Korshunova D.S., Kubekina M.V., Sergiev P.V., Kalinina A.A., Ilchuk L.A., Silaeva Y.Y., Korshunov E.N., Soldatov V.O., Deykin A.V. Novel transgenic mice with Cre-dependent co-expression of GFP and human ACE2: a safe tool for study of COVID-19 pathogenesis // Transgenic Res. 2021. Vol.30. Р. 289–301. 

9. Chan A.W., Chong K.Y., Martinovich C., Simerly C., Schatten G. Transgenic monkeys produced by retroviral gene transfer into mature oocytes // Science. 2001. Vol.291. Р. 309–312. 

10. Qiu P., Jiang J., Liu Z., Cai Y., Huang T., Wang Y., Liu Q., Nie Y., Liu F., Cheng J., Li Q., Tang Y.C., Poo M.M., Sun Q., Chang H.C. BMAL1 knockout macaque monkeys display reduced sleep and psychiatric disorders // Natl. Sci. Rev. 2019. Vol.6. Р. 87–100. 

11. Sun Z., Wang M., Han S., Ma S., Zou Z., Ding F., Li X., Li L., Tang B., Wang H., Li N., Che H., Dai Y. Production of hypoallergenic milk from DNA-free beta-lactoglobulin (BLG) gene knockout cow using zinc-finger nucleases mRNA // Sci. Rep. 2018. Vol.8, №15430. 

12. Proudfoot C., Carlson D.F., Huddart R., Long C.R., Pryor J.H., King T.J., Lillico S.G., Mileham A.J., McLaren D.G., Whitelaw C.B., Fahrenkrug S.C.  Genome edited sheep and cattle // Transgenic Res. 2015. Vol.24. Р. 147–153. 

13. Sumiyama K., Matsumoto N., Garçon-Yoshida J., Ukai H., Ueda H.R., Tanaka Y. Easy and efficient production of completely embryonic-stem-cell-derived mice using a micro-aggregation device // PloS. one. 2018. Vol.13.e0203056. 

14. Tachibana M., Sparman M., Ramsey C., Ma H., Lee H.S., Penedo M.C., Mitalipov S. Generation of chimeric rhesus monkeys // Cell. 2012. Vol.148. Р. 285–295. 

15. Whitworth K.M., Benne J.A., Spate L.D., Murphy S.L., Samuel M.S., Murphy C.N., Richt J.A., Walters E., Prather R.S., Wells K.D. Zygote injection of CRISPR/Cas9 RNA successfully modifies the target gene without delaying blastocyst development or altering the sex ratio in pigs // Transgenic Res. 2017. Vol.26.Р. 97–107. 

16. Tan M., van Tol H., Mokry M., Stout T., Roelen B. Microinjection induces changes in the transcriptome of bovine oocytes // Sci. Rep. 2020. Vol.10, №11211. 

17. Su X., Chen W., Cai Q., Liang P., Chen Y., Cong P., Huang J. Production of non-mosaic genome edited porcine embryos by injection of CRISPR/Cas9 into germinal vesicle oocytes // J. Genet. Genomics. 2019. Vol.46. Р. 335–342. 

18. Brinster R.L., Chen H.Y., Warren R., Sarthy A., Palmiter R.D. Regulation of metallothionein - thymidine kinase fusion plasmids injected into mouse eggs // Nature. 1982. Vol.296. Р. 39–42.

19. Delerue F., Ittner L.M. Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes // Jo. V. E. 2017. Vol.124, №55765. 

20. Palmiter R.D., Brinster R.L., Hammer R.E., Trumbauer M.E., Rosenfeld M.G., Birnberg N.C., Evans R.M. Dramatic growth of mice that develop from eggs microinjected with metallothionein-growth hormone fusion genes // Nature. 1982. Vol.300. Р. 611–615. 

21. Hashimoto M., Takemoto T. Electroporation enables the efficient mRNA delivery into the mouse zygotes and facilitates CRISPR/Cas9-based genome editing // Sci. Rep. 2015. Vol.5, №11315.

22. Qin W., Dion S.L., Kutny P.M., Zhang Y., Cheng A.W., Jillette N.L., Malhotra A., Geurts A.M., Chen Y.G., Wang H. Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing in Mice by Zygote Electroporation of Nuclease // Genetics. 2015. Vol.200. Р. 423–430. 

23. Chen S., Lee B., Lee A.Y., Modzelewski A.J., He L. Highly Efficient Mouse Genome Editing by CRISPR Ribonucleoprotein Electroporation of Zygotes // J. Biol. Chem. 2016. Vol.291. Р. 14457–14467. 

24. Haskell R.E., Bowen R.A. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Reprod. Dev. 1995. Vol.40. Р.386–390. 

25. Xu Y.N., Uhm S.J., Koo B.C., Kwon M.S., Roh J.Y., Yang J.S., Choi H.Y., Heo Y.T., Cui X.S., Yoon J.H., Ko D.H., Kim T., Kim N.H. Production of transgenic Korean native cattle expressing enhanced green fluorescent protein using a FIV-based lentiviral vector injected into MII oocytes // J. Genet. Genomics. 2013. Vol.40. Р. 37–43.

26. Yoon Y., Wang D., Tai P., Riley J., Gao G., Rivera-Pérez J.A. Streamlined ex vivo and in vivo genome editing in mouse embryos using recombinant adeno-associated viruses // Nat. Commun. 2018. Vol.9, №412.

27. Mizuno N., Mizutani E., Sato H., Kasai M., Ogawa A., Suchy F., Yamaguchi T.,  Nakauchi, H. Intra-embryo Gene Cassette Knockin by CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing with Adeno-Associated Viral Vector // iScience. 2018. Vol. 9. Р. 286–297.

28. Stiehler M., Duch M., Mygind T., Li H., Ulrich-Vinther M., Modin C., Baatrup A., Lind M., Pedersen F.S., Bünger C.E. Optimizing viral and non-viral gene transfer methods for genetic modification of porcine mesenchymal stem cells // Adv. Exp. Med. Biol. 2006. Vol.585. Р. 31–48.

29. Zeng W., Tang L., Bondareva A., Honaramooz A., Tanco V., Dores C., Megee S., Modelski M., Rodriguez-Sosa J.R., Paczkowski M., Silva E., Wheeler M., Krisher R.L., Dobrinski I. Viral transduction of male germline stem cells results in transgene transmission after germ cell transplantation in pigs // Biol. Reprod. 2013. Vol. 88, №27.

30. Chan K.Y., Jang M.J., Yoo B.B., Greenbaum A., Ravi N., Wu W.L., Sánchez-Guardado L., Lois C., Mazmanian S.K., Deverman B.E., Gradinaru V.  Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems // Nat. Neurosci. 2017. Vol.20. Р. 1172–1179.

31. Naso M.F., Tomkowicz B., Perry W.L. 3^rd, Strohl W.R. Adeno-Associated Virus (AAV) as a Vector for Gene Therapy // BioDrugs. 2017. Vol.31. Р. 317–334.

32. Wu Z., Yang H., Colosi P. Effect of genome size on AAV vector packaging // Mol. Ther. 2010. Vol. 18. Р. 80–86.

33. Dismuke D.J., Tenenbaum L., Samulski R.J. Biosafety of recombinant adeno-associated virus vectors // Curr. Gene Ther. 2013. Vol. 13. Р. 434–452.

34. McGreal E.P., Miller J.L., Gordon S. Ligand recognition by antigen-presenting cell C-type lectin receptors // Curr. Opin. Immunol. 2005. Vol. 17. Р. 18–24.

35. Geijtenbeek T.B., Kwon D.S., Torensma R., van Vliet S.J., van Duijnhoven G.C., Middel J., Cornelissen I.L., Nottet H.S., KewalRamani V.N., Littman D.R., Figdor C.G., van Kooyk Y. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells // Cell. 2000. Vol. 100. Р. 587–597.

36. Ludwig I.S., Lekkerkerker A.N., Depla E., Bosman F., Musters R.J., Depraetere S., van Kooyk Y., Geijtenbeek T.B. Hepatitis C virus targets DC-SIGN and L-SIGN to escape lysosomal degradation // J. Virol. 2004. Vol. 78. Р. 8322–8332.

37. Geijtenbeek T.B., Van Vliet S.J., Koppel E.A., Sanchez-Hernandez M., Vandenbroucke-Grauls C.M., Appelmelk B., Van Kooyk Y. Mycobacteria target DC-SIGN to suppress dendritic cell function // J. Exp. Med. 2003. Vol. 197. Р.7–17.

38. Tailleux L., Pham-Thi N., Bergeron-Lafaurie A., Herrmann J.L., Charles P., Schwartz O., Scheinmann P., Lagrange P.H., de Blic J., Tazi A., Gicquel B., Neyrolles O. DC-SIGN induction in alveolar macrophages defines privileged target host cells for mycobacteria in patients with tuberculosis // PLoS. Med. 2005.Vol. 2, №e381.

39. Caparrós E., Serrano D., Puig-Kröger A., Riol L., Lasala F., Martinez I., Vidal-Vanaclocha F., Delgado R., Rodríguez-Fernández J.L., Rivas L., Corbí A.L., Colmenares M.. Role of the C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN in Leishmania interaction with host phagocytes // Immunobiology. 2005. Vol. 210. Р. 185–193.

40. Rahimi N. C-type Lectin CD209L/L-SIGN and CD209/DC-SIGN: Cell Adhesion Molecules Turned to Pathogen Recognition Receptors // Biology. 2020. Vol. 10, №1.

41. Kwon D.S., Gregorio G., Bitton N., Hendrickson W.A., Littman D.R. DC-SIGN-mediated internalization of HIV is required for trans-enhancement of T cell infection // Immunity. 2002. Vol.16. Р. 135–144.

42. Miyauchi K., Kim Y., Latinovic O., Morozov V., Melikyan G.B. HIV enters cells via endocytosis and dynamin-dependent fusion with endosomes // Cell. 2009. Vol. 137. P. 433–444.

43. Njiri O.A., Zhang X., Zhang Y., Wu B., Jiang L., Li Q., Liu W., Chen T. CD209 C-Type Lectins Promote Host Invasion, Dissemination, and Infection of Toxoplasma gondii // Front Immunol. 2020.Vol.11, №656.

44. Kumar S., Kumar S., Singh R.V., Chauhan A., Kumar A., Bharati J., Singh S.V. Association of genetic variability in CD209 gene with bovine paratuberculosis disease: a case-control study in the Indian cattle population // Anim. Biotechnol. 2020. Vol.28. Р.1–8.

45. Gopi B., Singh R.V., Kumar S., Kumar S., Chauhan A., Kumar A., Singh S.V. Single-nucleotide polymorphisms in CLEC7A, CD209 and TLR4 gene and their association with susceptibility to paratuberculosis in Indian cattle // J. Genet. 2020. Vol.99, №14.

46. Canive M., Casais R., Jimenez J.A., Blanco-Vazquez C., Amado J., Garrido J.M., Juste R.A., Alonso-Hearn M. Correlations between single nucleotide polymorphisms in bovine CD209, SLC11A1, SP110 and TLR2 genes and estimated breeding values for several traits in Spanish Holstein cattle // Heliyon. 2020. Vol.6, №e04254.

47. Günther P.S., Mikeler E., Hamprecht K., Schneider-Schaulies J., Jahn G., Dennehy K.M. CD209/DC-SIGN mediates efficient infection of monocyte-derived dendritic cells by clinical adenovirus 2C isolates in the presence of bovine lactoferrin // J. Gen. Virol. 2011. Vol.92. Р.1754–1759.

48. Danilov K.A., Vassilieva S.G., Polikarpova A.V., Starikova A.V., Shmidt A.A., Galkin I.I., Tsitrina A.A., Egorova T.V., Orlov S.N., Kotelevtsev Y.V. In vitro assay for the efficacy assessment of AAV vectors expressing microdystrophin // Exp. Cell Res. 2020. Vol.392, №112033.

49. Buclez P.O., Dias Florencio G., Relizani K., Beley C., Garcia L., Benchaouir R.. Rapid, scalable, and low-cost purification of recombinant adeno-associated virus produced by baculovirus expression vector system // Mol. Ther. Methods. Clin. Dev.  2016. Vol.3, №16035.

50. Zolotukhin S., Byrne B.J., Mason E., Zolotukhin I., Potter M., Chesnut K., Summerford C., Samulski R.J., Muzyczka N. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield // Gene Ther. 1999. Vol.6. Р.973–985.

51. Aurnhammer C., Haase M., Muether N., Hausl M., Rauschhuber C., Huber I., Nitschko H., Busch U., Sing A., Ehrhardt A., Baiker A. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences // Hum. Gene Ther. Methods. 2012. Vol.23. Р.18–28.

--->

Перечень последовательностей

DTD Version: V1_3

File Name: CD209 в эмбрионах Bos taurus .xml

Software Name: WIPO Sequence

Software Version: 2.1.2

Production Date: 2022-11-03

General Information:

Current application / IP Office: RU

Current application / Applicant file reference: non

Applicant name: Федеральное государственное бюджетное учреждение

науки Институт биологии гена Российской академии наук

Applicant name / Language: ru

Applicant name / Name Latin: Institute of Gene Biology Russian

Academy of Sciences

Invention title: Способ получения нокаута гена CD209 в эмбрионах Bos

taurus путем трансдукции зигот аденоассоциированными вирусами,

кодирующими saCas9 и соответствующую гидовую РНК ( ru )

Sequence Total Quantity: 7

Sequences:

Sequence Number (ID): 1

Length: 7446

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..7446

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcgtcg

ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa

ctccatcact 120

aggggttcct gcggcctcta gactcgaggc gttgacattg attattgact

agttattaat 180

agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc

gttacataac 240

ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg

acgtcaataa 300

tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa

tgggtggagt 360

atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca

agtacgcccc 420

ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac

atgaccttat 480

gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc

atggtgatgc 540

ggttttggca gtacatcaat gggcgtggat agcggtttga ctcacgggga

tttccaagtc 600

tccaccccat tgacgtcaat gggagtttgt tttggcacca aaatcaacgg

gactttccaa 660

aatgtcgtaa caactccgcc ccattgacgc aaatgggcgg taggcgtgta

cggtgggagg 720

tctatataag cagagctctc tggctaacta ccggtgccac catggcccca

aagaagaagc 780

ggaaggtcgg tatccacgga gtcccagcag ccaagcggaa ctacatcctg

ggcctggaca 840

tcggcatcac cagcgtgggc tacggcatca tcgactacga gacacgggac

gtgatcgatg 900

ccggcgtgcg gctgttcaaa gaggccaacg tggaaaacaa cgagggcagg

cggagcaaga 960

gaggcgccag aaggctgaag cggcggaggc ggcatagaat ccagagagtg

aagaagctgc 1020

tgttcgacta caacctgctg accgaccaca gcgagctgag cggcatcaac

ccctacgagg 1080

ccagagtgaa gggcctgagc cagaagctga gcgaggaaga gttctctgcc

gccctgctgc 1140

acctggccaa gagaagaggc gtgcacaacg tgaacgaggt ggaagaggac

accggcaacg 1200

agctgtccac caaagagcag atcagccgga acagcaaggc cctggaagag

aaatacgtgg 1260

ccgaactgca gctggaacgg ctgaagaaag acggcgaagt gcggggcagc

atcaacagat 1320

tcaagaccag cgactacgtg aaagaagcca aacagctgct gaaggtgcag

aaggcctacc 1380

accagctgga ccagagcttc atcgacacct acatcgacct gctggaaacc

cggcggacct 1440

actatgaggg acctggcgag ggcagcccct tcggctggaa ggacatcaaa

gaatggtacg 1500

agatgctgat gggccactgc acctacttcc ccgaggaact gcggagcgtg

aagtacgcct 1560

acaacgccga cctgtacaac gccctgaacg acctgaacaa tctcgtgatc

accagggacg 1620

agaacgagaa gctggaatat tacgagaagt tccagatcat cgagaacgtg

ttcaagcaga 1680

agaagaagcc caccctgaag cagatcgcca aagaaatcct cgtgaacgaa

gaggatatta 1740

agggctacag agtgaccagc accggcaagc ccgagttcac caacctgaag

gtgtaccacg 1800

acatcaagga cattaccgcc cggaaagaga ttattgagaa cgccgagctg

ctggatcaga 1860

ttgccaagat cctgaccatc taccagagca gcgaggacat ccaggaagaa

ctgaccaatc 1920

tgaactccga gctgacccag gaagagatcg agcagatctc taatctgaag

ggctataccg 1980

gcacccacaa cctgagcctg aaggccatca acctgatcct ggacgagctg

tggcacacca 2040

acgacaacca gatcgctatc ttcaaccggc tgaagctggt gcccaagaag

gtggacctgt 2100

cccagcagaa agagatcccc accaccctgg tggacgactt catcctgagc

cccgtcgtga 2160

agagaagctt catccagagc atcaaagtga tcaacgccat catcaagaag

tacggcctgc 2220

ccaacgacat cattatcgag ctggcccgcg agaagaactc caaggacgcc

cagaaaatga 2280

tcaacgagat gcagaagcgg aaccggcaga ccaacgagcg gatcgaggaa

atcatccgga 2340

ccaccggcaa agagaacgcc aagtacctga tcgagaagat caagctgcac

gacatgcagg 2400

aaggcaagtg cctgtacagc ctggaagcca tccctctgga agatctgctg

aacaacccct 2460

tcaactatga ggtggaccac atcatcccca gaagcgtgtc cttcgacaac

agcttcaaca 2520

acaaggtgct cgtgaagcag gaagaaaaca gcaagaaggg caaccggacc

ccattccagt 2580

acctgagcag cagcgacagc aagatcagct acgaaacctt caagaagcac

atcctgaatc 2640

tggccaaggg caagggcaga atcagcaaga ccaagaaaga gtatctgctg

gaagaacggg 2700

acatcaacag gttctccgtg cagaaagact tcatcaaccg gaacctggtg

gataccagat 2760

acgccaccag aggcctgatg aacctgctgc ggagctactt cagagtgaac

aacctggacg 2820

tgaaagtgaa gtccatcaat ggcggcttca ccagctttct gcggcggaag

tggaagttta 2880

agaaagagcg gaacaagggg tacaagcacc acgccgagga cgccctgatc

attgccaacg 2940

ccgatttcat cttcaaagag tggaagaaac tggacaaggc caaaaaagtg

atggaaaacc 3000

agatgttcga ggaaaagcag gccgagagca tgcccgagat cgaaaccgag

caggagtaca 3060

aagagatctt catcaccccc caccagatca agcacattaa ggacttcaag

gactacaagt 3120

acagccaccg ggtggacaag aagcctaata gagagctgat taacgacacc

ctgtactcca 3180

cccggaagga cgacaagggc aacaccctga tcgtgaacaa tctgaacggc

ctgtacgaca 3240

aggacaatga caagctgaaa aagctgatca acaagagccc cgaaaagctg

ctgatgtacc 3300

accacgaccc ccagacctac cagaaactga agctgattat ggaacagtac

ggcgacgaga 3360

agaatcccct gtacaagtac tacgaggaaa ccgggaacta cctgaccaag

tactccaaaa 3420

aggacaacgg ccccgtgatc aagaagatta agtattacgg caacaaactg

aacgcccatc 3480

tggacatcac cgacgactac cccaacagca gaaacaaggt cgtgaagctg

tccctgaagc 3540

cctacagatt cgacgtgtac ctggacaatg gcgtgtacaa gttcgtgacc

gtgaagaatc 3600

tggatgtgat caaaaaagaa aactactacg aagtgaatag caagtgctat

gaggaagcta 3660

agaagctgaa gaagatcagc aaccaggccg agtttatcgc ctccttctac

aacaacgatc 3720

tgatcaagat caacggcgag ctgtatagag tgatcggcgt gaacaacgac

ctgctgaacc 3780

ggatcgaagt gaacatgatc gacatcacct accgcgagta cctggaaaac

atgaacgaca 3840

agaggccccc caggatcatt aagacaatcg cctccaagac ccagagcatt

aagaagtaca 3900

gcacagacat tctgggcaac ctgtatgaag tgaaatctaa gaagcaccct

cagatcatca 3960

aaaagggcaa aaggccggcg gccacgaaaa aggccggcca ggcaaaaaag

aaaaagggat 4020

cctacccata cgatgttcca gattacgctt acccatacga tgttccagat

tacgcttacc 4080

catacgatgt tccagattac gcttaagaat tcctagagct cgctgatcag

cctcgactgt 4140

gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct

tgaccctgga 4200

aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc

attgtctgag 4260

taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg

aggattggga 4320

agagaatagc aggcatgctg gggaggtacc gagggcctat ttcccatgat

tccttcatat 4380

ttgcatatac gatacaaggc tgttagagag ataattggaa ttaatttgac

tgtaaacaca 4440

aagatattag tacaaaatac gtgacgtaga aagtaataat ttcttgggta

gtttgcagtt 4500

ttaaaattat gttttaaaat ggactatcat atgcttaccg taacttgaaa

gtatttcgat 4560

ttcttggctt tatatatctt gtggaaagga cgaaacaccg gagaccacgg

caggtctcag 4620

ttttagtact ctggaaacag aatctactaa aacaaggcaa aatgccgtgt

ttatctcgtc 4680

aacttgttgg cgagattttt gcggccgcag gaacccctag tgatggagtt

ggccactccc 4740

tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg

acgcccgggc 4800

tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcaggg

gcgcctgatg 4860

cggtattttc tccttacgca tctgtgcggt atttcacacc gcatacgtca

aagcaaccat 4920

agtacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg

cgcagcgtga 4980

ccgctacact tgccagcgcc ttagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct

tcctttctcg 5040

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta

gggttccgat 5100

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgattt gggtgatggt

tcacgtagtg 5160

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg

ttctttaata 5220

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaactctat ctcgggctat

tcttttgatt 5280

tataagggat tttgccgatt tcggtctatt ggttaaaaaa tgagctgatt

taacaaaaat 5340

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttt atggtgcact

ctcagtacaa 5400

tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc

gctgacgcgc 5460

cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc

gtctccggga 5520

gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga

aagggcctcg 5580

tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag

acgtcaggtg 5640

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa

atacattcaa 5700

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat

tgaaaaagga 5760

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg

gcattttgcc 5820

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa

gatcagttgg 5880

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt

gagagttttc 5940

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt

ggcgcggtat 6000

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat

tctcagaatg 6060

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg

acagtaagag 6120

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta

cttctgacaa 6180

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat

catgtaactc 6240

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag

cgtgacacca 6300

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa

ctacttactc 6360

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca

ggaccacttc 6420

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc

ggtgagcgtg 6480

gaagccgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt

atcgtagtta 6540

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc

gctgagatag 6600

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat

atactttaga 6660

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt

tttgataatc 6720

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac

cccgtagaaa 6780

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc

ttgcaaacaa 6840

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca

actctttttc 6900

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta

gtgtagccgt 6960

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct

ctgctaatcc 7020

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg

gactcaagac 7080

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc

acacagccca 7140

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta

tgagaaagcg 7200

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg

gtcggaacag 7260

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt

cctgtcgggt 7320

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg

cggagcctat 7380

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg

ccttttgctc 7440

acatgt

7446

Sequence Number (ID): 2

Length: 26

Molecule Type: RNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..26

> mol_type, other RNA

> organism, Bos taurus

Residues:

gatgctcact caccttgaac cagagt

26

Sequence Number (ID): 3

Length: 22

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..22

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

tgaacacaag gagccagatg ac

22

Sequence Number (ID): 4

Length: 20

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..20

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gcactgaccc tgagccaaat

20

Sequence Number (ID): 5

Length: 25

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

caccgcctca aactgtgtag tggtc

25

Sequence Number (ID): 6

Length: 25

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..25

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

aaacgaccac tacacagttt gaggc

25

Sequence Number (ID): 7

Length: 21

Molecule Type: DNA

Features Location/Qualifiers:

- source, 1..21

> mol_type, other DNA

> organism, synthetic construct

Residues:

gagggcctat ttcccatgat t

21

<---

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии и включает в себя плазмиду, полученную на основе вектора px601 и кодирующую белок SaCas9 и гидовую РНК против фрагмента последовательности 3 экзона гена Bos taurus CD209, предназначенную для сборки аденоассоциированных вирусов, а также способ получения эмбрионов Bos taurus и их последующей трансдукции полученными аденоассоциированными вирусами для получения мозаичных нокаутов по гену CD209. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 пр.

1. Плазмидная конструкция для сборки аденоассоциированных вирусов, полученная на основе вектора px601, имеющего последовательность SEQ ID NO: 1, кодирующая ОРС гена saCas9 под контролем CAG промотора и гидовую РНК последовательностью SEQ ID NO: 2 против 3 экзона гена Bos taurus гена CD209 под контролем U6 промотора.

2. Способ получения эмбрионов Bos taurus, несущих нуль-аллель гена CD209, характеризующийся следующими стадиями:

a) трансфекция клеток HEK293, включающая сборку с помощью плазмидной конструкции по п. 1 в клетках упаковочной линии HEK293T стока аденоассоциированных вирусов, кодирующих ОРС saCas9 и гидовую РНК;

b) in vitro оплодотворение яйцеклеток Bos taurus сперматозоидами Bos taurus;

c) инфекция эмбрионов аденоассоциированными вирусами из пункта (а);

d) проведение анализа наличия сдвига рамки считывания в гене CD209 в бластоцистах, путем амплификации целевого участка гена CD209 с праймерами cd209-check-f последовательностью SEQ ID NO: 3 и cd209-check-r последовательностью SEQ ID NO: 4 с последующим секвенированием фрагмента с использованием праймера cd209-check-r последовательностью SEQ ID NO: 4.