Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новому водному извлечению метаболита прогестерона из образца фекалий/навоза для неинвазивного, простого, приемлемого по цене и удобного для фермеров набора на бумажной основе для раннего определения беременности у крупного рогатого скота и буйволов. В частности, настоящее изобретение относится к набору для иммунологического анализа на бумажной основе, который выявляет метаболит прогестерона 5α-прегнан-3α-ол-20-он в фекалиях животных на сроках беременности в пределах 4-6 недель. Набор, состоящий из раствора водного извлечения и устройства на бумажной основе, является стабильным при комнатной температуре и может быть использован фермерами без помощи или каких-либо технических знаний.
Сведения о предшествующем уровне техники
Животноводство играет важную роль в экономике развивающихся стран, поскольку значительная часть населения в развивающихся и слаборазвитых странах зависит от домашнего скота как источника средств к существованию. Дойные животные, такие как крупный рогатый скот и буйволы, составляют значительную долю от общего поголовья. По оценкам, поголовье самок крупного рогатого скота (коров) в Индии составляет 122,9 миллиона, а поголовье самок буйволов составляет 92,5 миллиона (19-я Перепись поголовья, 2012 г.). Кроме того, около восьми миллионов семей в Индии непосредственно вовлечены в производство молока, и почти 50 процентов производства молока приходится на сельские районы. Несмотря на огромное количество поголовья крупного рогатого скота и буйволов, животноводческий сектор Индии плохо организован и управляется ненаучно.
Своевременное выявление беременности у дойных животных, особенно крупного рогатого скота и буйволов, является важным для максимального увеличения производства молока, сокращения интервала между отелами за счет планирования размножения на самом раннем цикле течки. Из-за отсутствия мониторинга и управления воспроизводством, производство молока на одно животное является чрезвычайно низким, что приводит к потере доходов маржинальных и мелких фермеров. Кроме того, при отсутствии научного управления воспроизводством, крупный рогатый скот и буйволы страдают рядом проблем, связанных с воспроизводством, таких как длительные интервалы между отелами, анэструс (отсутствие периодических проявлений течки) и позднее половое созревание.
Традиционно, в Индии беременность определяют через 3-4 месяца после оплодотворения, используя различные методы, включая пальпацию матки, ультразвуковое исследование и измерение гормонов или биомаркеров в крови и молоке. Эти методы требуют ветеринарных знаний и сложной лабораторной инфраструктуры для проведения тестов.
Хотя определение биомаркеров или гормонов в молоке предпочтительнее, чем забор крови, это невозможно в случае домашнего скота, который прекратил давать молоко, и телок (впервые беременных животных). Кроме того, повторный забор крови у животных не рекомендуется и не поощряется из-за стресса, вызываемого анестезией (Barone, A et al. Gonadotrophin dose and timing of anaesthesia for laparoscopic artificial insemination in the puma (Felis concolor), J. Reprod. Fertil. 101 (1994) 103-108).
Кроме того, большинство наборов тестов для определения беременности, доступных в западном мире, основаны на обнаружении прогестерона в образцах крови, молока, мочи и фекалий, но эти наборы могут обнаружить беременность на сроке после трех месяцев.
Ссылка может быть сделана на работу Kumar et al 2014 (General and Comparative Endocrinology, 201: 37-44), в которой излагается репродуктивная оценка диких животных.
Ссылка может быть сделана на работу Li, et al 2012 (Biomicrofluidics, 6, 0111301-13), в которой излагает текущее состояние и будущие тенденции в микрофлюидике на бумажной основе.
Ссылка может быть сделана на работу Martinnez, et al 2007 (Chem. Int. Ed., 46, 1318-1320), в которой указывается, как устройство на бумажной основе может быть изготовлено с помощью печати.
Ссылка может быть сделана на работу Mithileshwari et al 2015 & 2014 [(Moschus chrysogaster). Theriogenology, Doi.:10.1016/j.theriogenology 2015.09.009], в которой описан мониторинг фекального прогестерона у кабарги. Исследование проводилось в рамках программы разведения диких животных как часть природоохранных мероприятий.
Ссылка может быть сделана на работу Umapathy et al 2015 (Chelonian conservation Biology 2015, 14:108-115), в котором излагается эндокринная оценка диких животных. В ходе работы оценивались различные гормоны, включая прогестерон, тестостерон и глюкокортикоиды для оценки физиологии рептилий в лесной среде обитания.
Ссылка может быть сделана на работу Umapathy et al 2013 (General and Comparative Endocrinology, 180:33-38), в которой излагается репродуктивная оценка диких животных.
Таким образом, существует потребность в преодолении давних проблем предшествующего уровня техники путем создания недорогого и неинвазивного устройства для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов.
Цели изобретения
Целью настоящего изобретения является обеспечение неинвазивного, простого и доступного набора для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов с использованием образцов навоза.
Другой целью настоящего изобретения является обеспечение полного набора, содержащего раствор для извлечения и устройство, которым могут управлять неквалифицированные специалисты, для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов.
Краткое описание изобретения
Один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, содержащее: по меньшей мере один структурированный, пористый и гидрофильный слой, на котором сформированы восковые очерчивающие паттерны для создания гидрофобных барьеров, по меньшей мере одну зону нанесения для приема биологического образца и реагента; и необязательно по меньшей мере один микрожидкостной канал для доставки биологического образца и реагента в зону реакции, при этом указанное устройство выполнено с возможностью обнаружения антигена 5α-прегнан-3α-ол-20-она при концентрации более 400 нанограмм на грамм в биологическом образце.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, при этом указанное устройство представляет собой однослойное бумажное устройство (100), имеющее три круглые зоны, выполненные с возможностью приема биологического образца и реагента, содержащее:
а. зону тестирования (101), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
b. зону положительного контроля (102), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
c. зону отрицательного контроля (103); и
d. восковой паттерн (104) на бумажном слое, при этом восковой паттерн очерчивает зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля для создания гидрофобного барьера.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, при этом указанное устройство представляет собой многослойное устройство (200), содержащее:
а. первый слой (300), выполненный с возможностью приема биологического образца и реагентов;
b. второй слой (400), выполненный с возможностью доставки биологического образца и реагентов в зону реакции;
c. третий слой (500), выполненный с возможностью доставки биологического образца в зону реакции; и
d. четвертый слой (600), выполненный с возможностью колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, в котором первый слой (300) многослойного устройства (200) содержит:
а. впускное отверстие для образца (301) для приема биологического образца; и
b. впускное отверстие для реагентов (302) для приема реагентов.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, где второй слой (400) многослойного устройства (200) содержит:
а. первую круглую зону (401) для доставки биологического образца из впускного отверстия для образца (301) в круглую зону (501) для доставки в зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
b. вторую круглую зону (402) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
c. третью круглую зону (403) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в круглую зону (503) для доставки в зону положительного контроля (602);
d. четвертую круглую зону (404) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в круглую зону (504) для доставки в зону отрицательного контроля (603);
е. перевернутый Y-образный микрожидкостной канал (405) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в зоны реакции в четвертом слое (600).
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, в котором третий слой (500) многослойного устройства (200) содержит:
а. первую круглую зону (501) для доставки биологического образца из первой круглой зоны (401) в зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
b. зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
c. вторую круглую зону (503) для доставки реагентов из третьей круглой зоны (403) в зону положительного контроля (602); и
d. третью круглую зону (504) для доставки реагентов из четвертой круглой зоны (404) в зону отрицательного контроля (603).
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, в котором четвертый слой (600) многослойного устройства (200) содержит:
а. зону тестирования (601), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
b. зону положительного контроля (602), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она, для генерации положительного контрольного сигнала, подтверждающего перенос по меньшей мере части реагента из впускного отверстия для образца (301) в зону тестирования (601); и
c. зону отрицательного контроля (603) для генерации отрицательного контроля, подтверждающего перенос по меньшей мере части реагента из впускного отверстия для образца (301) в зону тестирования (601).
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает микрожидкостное устройство, в котором слой имеет толщину менее 220 мкм и удерживание частиц более 10 мкм.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием микрожидкостного устройства, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а. внесение биологического образца в зону тестирования (101);
b. внесение раствора комплекса антитело-фермент в зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103);
c. внесение промывочного буфера в зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103);
d. внесение субстрата TMB в зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103); и
е. определение цвета зоны тестирования (101), зоны положительного контроля (102) и зоны отрицательного контроля (103),
при этом появление слабого цвета или отсутствие цвета в зоне тестирования подтверждает присутствие 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием устройства, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а. внесение биологического образца во впускное отверстие для образца (301);
b. внесение промывочного буфера во впускное отверстие для реагентов (302);
c. внесение субстрата TMB во впускное отверстие для реагентов (302); и
d. определение цвета зоны тестирования (601), зоны положительного контроля (602) и зоны отрицательного контроля (603),
при этом появление слабого цвета или отсутствие цвета в зоне тестирования подтверждает присутствие 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает способ получения биологического образца, включающий следующие стадии:
а. смешивание навоза с 2-гидроксипропил-циклодекстрином с последующим встряхиванием в течение 3 минут;
b. позволение дебрису и другим частицам осесть с получением прозрачного супернатанта, при этом супернатант, содержащий 5α-прегнан-3α-ол-20-он, представляет собой биологический образец.
Еще один аспект настоящего изобретения обеспечивает набор для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов, содержащий:
I. микрожидкостное устройство;
II. по меньшей мере три реагента;
III. флакон; и
IV. инструкцию по эксплуатации.
Краткое описание сопровождающих чертежей
На фигуре 1 представлено графическое изображение однослойного устройства в соответствии с вариантом осуществления изобретения.
На фигуре 2 представлено графическое изображение многослойного устройства в соответствии с вариантом осуществления изобретения.
На фигуре 3 представлена схематическая блок-схема, отражающая процесс изготовления микрожидкостных устройств на бумажной основе.
На фигуре 4A изображена бумага, используемая для стандартизации ELISA.
На фигуре 4В изображено однослойное бумажное устройство, используемое для теста на беременность.
На фигуре 5 схематично показаны принципы прямого и конкурентного прямого ELISA, используемые в устройстве.
На фигуре 6(а) изображены многослойные устройства, которые были напечатаны на однослойной бумаге, а затем сложены в складки оригами.
На фигуре 6(b) показано впускное отверстие для образца и впускное отверстие для реагентов первого слоя многослойного устройства.
На рисунке 6(c) показана зона тестирования, зона положительного контроля и зона отрицательного контроля четвертого слоя многослойного устройства.
На фигурах 7A и 7B отдельно показаны слои многослойного устройства.
На фигуре 8 представлено схематическое изображение функционирования однослойного устройства.
На фигуре 9 показаны положительные и отрицательные результаты теста, получаемые с помощью однослойного устройства.
На фигуре 10 показаны положительные и отрицательные результаты теста, получаемые с помощью многослойного устройства.
Подробное описание изобретения
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, общепринятые для специалиста в области, к которой относятся способы. Хотя на практике или при тестировании способов и композиций могут также использоваться любые способы и композиции, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, теперь описываются репрезентативные иллюстративные способы и композиции.
Когда представлен диапазон величин, следует понимать, что каждая промежуточная величина между верхним и нижним пределами диапазона и любая другая заявленная или промежуточная величина в этом указанном диапазоне охватывается способами и композициями. То, что верхний и нижний пределы меньших диапазонов могут быть независимо включены в меньшие диапазоны, также охватывается способами и композициями при условии, что в указанном диапазоне определенно исключен любой предел. Если указанный диапазон включает один или оба предела, то диапазоны, исключающие какой-либо из этих включенных пределов или оба таких предела, также включаются в способы и композиции.
Следует понимать, что определенные признаки способов, которые для ясности описаны в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть обеспечены в комбинации в одном варианте осуществления. И наоборот, различные признаки способов и композиций, которые для краткости описаны в контексте одного варианта осуществления, также могут быть предоставлены отдельно или в любой подходящей подкомбинации.
Следует отметить, что использованные в настоящем документе и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа охватывают понятие множественного числа, если из контекста явно не следует иное. Таким образом, данное утверждение следует рассматривать в качестве априорного основания для использования исключающей терминологии, например, «исключительно», «только» и т.п., в связи с перечислением элементов пунктов формулы изобретения или для использования «отрицательного» ограничения.
При чтении настоящего раскрытия для специалиста будет ясно, что каждый из отдельных вариантов осуществления, описанных и проиллюстрированных в настоящем документе, характеризуется дискретными составляющими и признаками, которые могут быть легко отделены от признаков любого из нескольких других вариантов осуществления или объединены с такими признаками без выхода за пределы объема или сущности способов настоящего изобретения. Любой описанный способ может быть осуществлен в описанной последовательности или в любой другой логически возможной последовательности.
Термин «структурированный» или «паттерн» относится к гидрофобным барьерам, созданным на субстрате, которым в настоящем изобретении является бумага. Паттерны обеспечивают пространственный контроль биологических жидкостей и реагентов. Кроме того, это обеспечивает транспорт жидкости за счет капиллярного действия в пределах областей, определяемых барьерами.
Термин «пористый» следует понимать как структуру в среде или материал, который имеет пористость, которая обеспечивает возможность транспорта жидкости за счет капиллярного всасывания. Например, структура может быть образована по своей природе микроструктурированной средой, например, материалом, подобным бумаге. Кроме того, структура представлять собой микроструктурированную структуру с микромашинной обработкой, например, поверхностную структура с микромашинной обработкой. Такие пористые материалы известны из общепринятых горизонтальных проточных анализов и диагностических наборов.
Используемый в настоящем документе термин «гидрофильный» относится к любому материалу, который имеет сильное сродство или предпочтение по отношению к биологическим образцам и реагентам. Благодаря сродству среда обеспечивает транспорт жидкости за счет капиллярного действия.
Используемый в настоящем документе термин «гидрофобный» относится к любому материалу, который лишен сродства или проявляет отталкивание по отношению к биологическим образцам и реагентам. Из-за отсутствия сродства среда не позволяет транспортировать жидкость за счет капиллярного действия.
Термин «микрожидкостной канал» относится к пути для жидкости, имеющему ширину в диапазоне от 0,5 мм до 1,5 мм. Используемый в настоящем документе термин «реагенты» относится к реагентам или химическим веществам, используемым при функционировании бумажных устройств, как описано в настоящем документе. Реагенты включают, но без ограничения, комплекс антитело-фермент, промывочный буфер и субстрат TMB.
Используемый в настоящем документе термин «биологический образец» или «образец жидкости» относится к супернатанту, полученному после обработки фекального экстракта для извлечения антигена.
Используемый в настоящем документе термин «выполненный с возможностью» относится к конфигурации для определенной цели, которая прямо или косвенно влияет на определение беременности крупного рогатого скота или буйволов с использованием описанных устройств.
Используемый в настоящем документе термин «антиген» или «5α-антиген», или «биомаркер» относится к метаболиту 5α-прегнан-3α-ол-20-ону, используемому для обнаружения беременности у крупного рогатого скота и буйволов.
Используемый в настоящем документе термин «положительный контроль» относится к обработке с помощью известной реакции таким образом, что этот положительный ответ можно сравнить с неизвестным ответом обработки.
Термин «отрицательный контроль» относится к обработке, при которой ответ не ожидается.
Термин «зона реакции» относится к гидрофильной области устройства, в которой выполняется одна или несколько стадий конкурентного прямого ELISA.
Термин «визуализация» включает определение и сравнение цвета зоны тестирования с положительной контрольной и отрицательной контрольной зоной устройств, описанных в настоящем документе. Если цвет появляется в зоне тестирования, а также в зоне положительного контроля, это означает, что образец взят от небеременного животного. Если же цвет появляется в зоне положительного контроля, но не в зоне тестирования, то это означает, что образец взят от беременного животного.
Используемый в настоящем документе термин «комплекс антитело-фермент» относится к антителам против 5α-прегнан-3α-ол-20-она, конъюгированным или меченным, или конъюгированным с ферментом-меткой пероксидазой хрена.
Термин «промывочный буфер» относится к буферу, используемому для промывки избытка несвязанного комплекса антитело-фермент. Можно использовать любой подходящий промывочный буфер, известный в уровне техники.
В отношении настоящего изобретения термины «образец фекалий» и «образец навоза» могут быть использованы как синонимы.
Настоящее изобретение основано на непрямом конкурентном иммуноанализе. Настоящее изобретение направлено на микрожидкостное устройство для раннего выявления беременности, которое обнаруживает более высокие значения 5α-прегнан-3α-ол-20-она у коров и буйволов по образцу их навоза.
В одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, содержащее:
а. по меньшей мере один структурированный, пористый и гидрофильный слой, на котором сформированы восковые очерчивающие паттерны для создания гидрофобных барьеров;
b. по меньшей мере одну зону нанесения для приема биологического образца и реагента; и
c. необязательно по меньшей мере один микрожидкостной канал для доставки биологического образца и реагента в зону реакции,
при этом указанное устройство выполнено с возможностью обнаружения антигена 5α-прегнан-3α-ол-20-она при концентрации более 400 нанограмм на грамм в биологическом образце.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, при этом указанное устройство представляет собой однослойное бумажное устройство (100), имеющее три круглых зоны, выполненные с возможностью приема биологического образца и реагента, содержащее:
а. зону тестирования (101), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-он для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
b. зону положительного контроля (102), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-он для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
c. зону отрицательного контроля (103); и
d. восковой паттерн (104) на бумажном слое, при этом восковой паттерн очерчивает зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля для создания гидрофобного барьера.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, при этом указанное устройство представляет собой многослойное устройство (200), содержащее:
а. первый слой (300), выполненный с возможностью приема биологического образца и реагентов;
b. второй слой (400), выполненный с возможностью доставки биологического образца и реагентов в зону реакции;
c. третий слой (500), выполненный с возможностью доставки биологического образца в зону реакции; и
d. четвертый слой (600), выполненный с возможностью колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором первый слой (300) многослойного устройства (200) содержит:
а. впускное отверстие для образца (301) для приема биологического образца; и
b. впускное отверстие для реагентов (302) для приема реагентов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором второй слой (400) многослойного устройства (200) содержит:
а. первую круглую зону (401) для доставки биологического образца из впускного отверстия для образца (301) в круглую зону (501) для доставки в зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
b. вторую круглую зону (402) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
c. третью круглую зону (403) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в круглую зону (503) для доставки в зону положительного контроля (602);
d. четвертую круглую зону (404) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в круглую зону (504) для доставки в зону отрицательного контроля (603);
е. перевернутый Y-образный микрожидкостной канал (405) для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов (302) в зоны реакции в четвертом слое (600).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором третий слой (500) многослойного устройства (200) содержит:
а. первую круглую зону (501) для доставки биологического образца из первой круглой зоны (401) в зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
b. зону хранения комплекса антитело-фермент (502);
c. вторую круглую зону (503) для доставки реагентов из третьей круглой зоны (403) в зону положительного контроля (602); и
d. третью круглую зону (504) для доставки реагентов из четвертой круглой зоны (404) в зону отрицательного контроля (603).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором четвертый слой (600) многослойного устройства (200) содержит:
а. зону тестирования (601), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
b. зону положительного контроля (602), содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она, для генерации положительного контрольного сигнала, подтверждающего перенос по меньшей мере части реагента из впускного отверстия для образца (301) в зону тестирования (601); и
c. зону отрицательного контроля (603) для генерации отрицательного контроля, подтверждающего перенос по меньшей мере части реагента из впускного отверстия для образца (301) в зону тестирования (601).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором структурированный, пористый и гидрофильный слой имеет толщину менее 220 мкм и удерживание частиц более 10 мкм.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором структурированный, пористый и гидрофильный слой имеет толщину в диапазоне от 205 мкм до 220 мкм.
Для многослойного жидкостного устройства общая толщина гидрофильного слоя находится в диапазоне от (205 × 4) мкм до (220 × 4) мкм.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором структурированный, пористый и гидрофильный слой имеет удерживание частиц в диапазоне от 10 мкм до 25 мкм.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечено микрожидкостное устройство, в котором биологический образец получают из навоза крупного рогатого скота или буйволов.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечен способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием микрожидкостного устройства, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а. внесение биологического образца в зону тестирования (101);
b. внесение раствора комплекса антитело-фермент в зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103);
c. внесение промывочного буфера в зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103);
d. внесение субстрата TMB в зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103); и
е. определение цвета зоны тестирования (101), зоны положительного контроля (102) и зоны отрицательного контроля (103),
при этом появление слабого цвета или отсутствие цвета в зоне тестирования подтверждает присутствие 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечен способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием устройства, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а. внесение биологического образца во впускное отверстие для образца (301);
b. внесение промывочного буфера во впускное отверстие для реагентов (302);
c. внесение субстрата TMB во впускное отверстие для реагентов (302); и
d. определение цвета зоны тестирования (601), зоны положительного контроля (602) и зоны отрицательного контроля (603),
при этом появление слабого цвета или отсутствие цвета в зоне тестирования подтверждает присутствие 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечен способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием устройства, при этом биологический образец получают из навоза крупного рогатого скота или буйволов.
Еще один вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ получения биологического образца, включающий следующие стадии:
i. смешивание навоза с 2-гидроксипропил-циклодекстрином с последующим встряхиванием в течение 3 минут;
ii. позволение дебрису и другим частицам осесть с получением прозрачного супернатанта, при этом супернатант, содержащий 5α-прегнан-3α-ол-20-он, представляет собой биологический образец.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения обеспечен набор для раннего выявления беременности крупного рогатого скота и буйволов, содержащий:
I. микрожидкостное устройство,
II. по меньшей мере три реагента;
III. флакон; и
IV. инструкцию по эксплуатации.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечен набор для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов, в котором реагентами являются промывочный буфер, субстрат TMB и 2-гидроксипропил-циклодекстрин.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения обеспечен набор для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов, в котором реагент дополнительно содержит раствор комплекса антитело-фермент.
Настоящее изобретение обеспечивает способ водной экстракции метаболита (5α-прегнан-3α-ол-20-она), присутствующего в образцах фекалий крупного рогатого скота и буйволов, который является легко экстрагируемым потенциальным биомаркером для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов. 5α-Прегнан-3α-ол-20-он был впервые использован для раннего выявления беременности после экстракции из образца фекалий крупного рогатого скота и буйволов с использованием водного раствора. Способ извлечения метаболита из образца фекалий также является новым по сравнению со способами, известными в данной области. Разработанный неинвазивный набор микрожидкостного устройства на бумажной основе может с высокой точностью обнаруживать беременность у крупного рогатого скота и буйволов уже на 4-6 неделях.
В настоящем изобретении используют антитела, разработанные против 5α-прегнан-3α-ол-20-она, способы изготовления микрожидкостного устройства на бумажной основе и недорогой, быстрый и неинвазивный способ определения беременности на ранних стадиях у крупного рогатого скота и буйволов.
Авторы настоящей заявки впервые идентифицировали метаболит (5α-прегнан-3α-ол-20-он, в дальнейшем называемый в настоящем документе как 5α-антиген), присутствующий в образцах фекалий беременного крупного рогатого скота и буйволов. Кроме того, были получены антитела против этого метаболита прогестерона (5α-антигена), был стандартизирован иммуноферментный анализ (EIA) и измерены количества 5α-антигена в образцах фекалий для широкого круга домашних и диких животных. На основании измерений было определено пороговое значение (которое указывает на беременность крупного рогатого скота и буйволов), которое использовали для разработки способа экстракции и микрожидкостных устройств на бумажной основе.
Настоящее изобретение представляет технический прогресс по сравнению с существующими способами раннего определения беременности крупного рогатого скота и буйволов. Достижения характеризуются следующими особенностями:
(а) приемлемостью по цене: разработанное устройство очень недорогостоящее, и его могут позволить себе даже мелкие фермеры или селекционеры в сельской местности;
(b) чувствительностью и специфичностью: разработанное устройство является высокочувствительным и очень специфичным к определенному антигену (5α-прегнан-3α-ол-20-он). Никаких ложноположительных или ложноотрицательных результатов не наблюдалось. Специфическое антитело, разработанное для этого анализа, имеет 100% точность в формате ELISA. Точность такого же антитела в формате устройства на бумажной основе составляет 78-92%;
(c) удобством для пользователя: разработанное устройство представляет собой оперативное решение для определения ранней беременности крупного рогатого скота и буйволов. Его могут использовать даже маржинальные и мелкие фермеры. Инструкции по эксплуатации просты в исполнении и не требуют обучения;
(d) быстротой и надежностью: результаты теста могут быть получены немедленно. Кроме того, устройство не требует какого-либо специального складского оборудования;
(e) отсутствием оборудования: для работы устройства не требуются сложные приборы;
(f) доставкой тем, кто в нем нуждается: устройство легко транспортировать и использовать. Следовательно, устройство может быть легко доставлено в сельские районы, где они требуются.
Изобретательский подход, используемый в настоящем изобретении, привел к разработке устройств/наборов, которые помогут мелким и маржинальным фермерам во всем мире.
Прежде чем устройства, наборы и способы настоящего раскрытия будут описаны более подробно, следует понимать, что изобретение не ограничивается конкретными вариантами осуществления и может варьироваться. Также, следует понимать, что используемая здесь терминология предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения, поскольку объем устройств, наборов и композиций будет ограничиваться только прилагаемой формулой изобретения.
Устройства на бумажной основе
В одном варианте осуществления настоящего изобретения на пористых гидрофильных субстратах сформирован паттерн с гидрофобными барьерами для обеспечения недорогих, портативных и технически простых платформ для проведения иммуноанализов биологических жидкостей. Одним из примеров такого полезного гидрофильного субстрата для анализов является бумага, которая является недорогой, коммерчески легкодоступной, одноразовой, быстро впитывает жидкости и не требует осторожного обращения.
На бумаге или любом другом пористом гидрофильном субстрате сформирован паттерн с гидрофобными барьерами, которые обеспечивают пространственный контроль биологических жидкостей и обеспечивают транспорт жидкости за счет капиллярного действия в пределах областей, определенных барьерами. Гидрофобные барьеры могут быть выполнены из любого подходящего материала, такого как, но без ограничения, воск, который обеспечивает по существу непроницаемый барьер по всей толщине пористого гидрофильного субстрата в пределах обозначенных областей.
Соответствующие антигены иммобилизуют на бумажных субстратах, и бумага может быть биофункционализирована для подготовки устройства. Кроме того, паттерны могут быть напечатаны на однослойной бумаге, а затем надлежащим образом сложены в паттерн, подобный оригами, чтобы подготовить устройство. Альтернативно, каждую бумагу можно напечатать отдельно, а затем наложить друг на друга для подготовки устройства.
Бумага, используемая для микрожидкостного устройства
Микрожидкостное устройство может быть изготовлено с использованием подходящего материала. В одном варианте осуществления настоящего изобретения используемый материал представляет собой фильтровальную бумагу, такую как фильтровальная бумага 4 Whatmann® толщиной 0,210 мм и удерживающая частицы 20-25 микрометров. Неисчерпывающие репрезентативные примеры других подходящих фильтровальных бумаг, которые можно использовать в настоящем изобретении, представлены в таблице 1.
(Cole-Parmer)
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения любую бумагу, имеющую удерживание частиц более 10 мкм и толщиной менее 220 мкм, можно использовать для изготовления устройства по настоящему изобретению.
Изготовление устройств на бумажной основе
Дизайны устройств на бумажной основе создают с использованием программного обеспечения для автоматизированного проектирования. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения для дизайна однослойного устройства используют программу CorelDRAW® (разработанную и продаваемую фирмой Corel Corporation).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения дизайн напечатан на фильтровальной бумаге Whatmann® сорта-4 (производимой фирмой GE Healthcare) с использованием твёрдочернильного воскового принтера (Xerox ColorQube 8570N).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения дизайн устройства представлен на фигуре 1. Дизайн напечатан на бумаге с координатной сеткой размером 2,5 см на 2,5 см (100). Созданы три зоны реакции, каждая диаметром 4 мм. Тремя зонами реакции являются: зона тестирования (101), зона положительного контроля (102) и зона отрицательного контроля (103). За исключением зон реакции, вся поверхность устройства покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения дизайн устройства представлен на фигуре 2. Дизайн напечатан на бумаге с координатной сеткой размером 10 см на 2,5 см (200) и сложен пополам два раза с получением квадратов размером 2,5 см на 2,5 см каждый, что представляет один слой устройства на бумажной основе.
В другом варианте настоящего изобретения зоны реакции являются гидрофильными, что позволяет протекать реакции между реагентами и образцом.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения структурированный бумажный субстрат нагревают, помещая его на нагревательную плиту парафинированной стороной вверх при температуре 120°С на одну минуту, и охлаждают до комнатной температуры. Это позволяет восковому материалу плавиться и просачиваться вертикально (вниз) к другой стороне бумаги. Кроме того, расплавленный воск также растекается по горизонтальной оси бумаги, создавая более широкую линию бумаги, образуя таким образом гидрофобную границу, которая определяет размеры зон реакции.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения изготовление устройств на бумажной основе выполняют одностадийным способом, в котором дизайн CAD создают на бумаге Whatmann®.
На фигуре 3 представлена схематическая блок-схема, показывающая процесс изготовления устройства.
Биофункционализация и иммобилизация антигенов
Вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ биофункционализации бумажного субстрата.
Настоящее изобретение также раскрывает биофункционализацию слоев устройства, когда зоны реакции обрабатывают 0,5% раствором низкомолекулярного хитозана. Устройства либо окунают в ванну с хитозаном, либо 3 мкл хитозана вносят в зоны реакции. После сушки зон реакции до полусухого состояния (приблизительно через 5 мин) зоны реакции обрабатывают 0,5%-ным раствором глутаральдегида, либо путем окунания в ванну с глутаральдегидом, либо путем добавления 3 мкл глутальдегида в зоны реакции. Затем устройство сушат при комнатной температуре в течение приблизительно одного часа.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения иммобилизацию 5α-прегнан-3α-ол-20-она (5α-антигена) проводят с использованием бумаги, покрытой хитозаном и полиэтиленимином (PEI).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения 5α-антиген, конъюгированный с BSA, иммобилизуют на бумажные устройства.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения стадию блокирования во время иммобилизации выполняют с помощью блокирующего буфера.
Извлечение 5α-антигена из образца фекалий
Авторы настоящей заявки идентифицировали один из основных метаболитов прогестерона, 5α-прегнан-3α-ол-20-он (5α-антиген), в образцах фекалий крупного рогатого скота и буйволов. После этого были созданы антитела против уже охарактеризованного 5α-антигена.
Авторы настоящей заявки выявили, что концентрация антигена для беременных животных в образцах фекалий в 0,5-2 раза больше, чем у небеременных животных. Разработанные устройства для раннего выявления беременности основаны на иммобилизации пороговой концентрации антигена.
Другой вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает способ извлечения 5α-антигена из образцов фекалий крупного рогатого скота и буйволов. Для извлечения антигена из образца фекалий используют 2-гидроксипропил-β-циклодекстрин (2HPβCD).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения для извлечения 5α-антигена образец фекалий отбирают во флакон и добавляют раствор 2HPβCD. Флакон умеренно встряхивают в течение двух минут и дают отстояться до тех пор, пока не станет виден прозрачный супернатант. Этот супернатант можно использовать в качестве биологического образца для раннего выявления беременности.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения 5α-антиген, который определяет беременность крупного рогатого скота, извлекают из образцов фекалий с использованием нового подхода. Для извлечения порогового уровня антигена используют 10 мМ (2-гидроксипропил)-β-циклодекстрин (2HPβCD).
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения для извлечения 5α-антигена используют одностадийный процесс, включающий только один реагент. Для извлечения антигена во флакон отбирают 0,2 г образца фекалий и добавляют 3 мл 10 мМ раствора 2HPβCD. Флакон умеренно встряхивают в течение 2 минут и дают отстояться до появления прозрачного супернатанта. Супернатант содержит пороговое количество 5α-антигена, которое можно использовать в качестве биологического образца для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов.
Иммуноанализы, выполняемые с использованием антигена
В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитела вырабатываются против антигена 5α-прегнан-3α-ол-20-она, который используют для выполнения прямого дот-блот иммуноанализа. В анализе антиген иммобилизуют на биоактивированной бумаге с последующим добавлением специфических антител, меченных пероксидазой хрена с образованием комплекса антитело-фермент. В этом способе присутствие 5α-антигена в различной концентрации выявляют по цветовой шкале градиента. Несколько стратегий разрабатывали для системы обнаружения, которая включает основанное на HRP изменение цвета TMB-Ultra Sensitive. Помимо TMB, также используют наночастицы золота (GNP) (размер в диапазоне 20-40 нм), конъюгированные с антителами посредством химии EDC/NHS. Специфическое связывание биоконъюгированного GNP с целевым метаболитом приводит к агрегации GNP с последующим испусканием более высокой длины волны света. Это явление обнаруживается невооруженным глазом по цветовому градиенту, что также подтверждает беременность у крупного рогатого скота с использованием измерителя/маркера цветового кодирования.
В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения, основанном на сэндвич-ELISA, раннее выявление беременности у животных подтверждают путем иммобилизации захватывающего антитела на биоактивированной бумаге, и образцу позволяют протекать через зоны обнаружения вместе с обнаруживающим антителом, которое конъюгировано с ферментом HRP или GNP.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения специфический 5α-антиген метаболита прогестерона, выделенный из образцов навоза крупного рогатого скота, и антитела, вырабатываемые против этого антигена, использовали для проведения конкурентного прямого иммуноанализа. В этом анализе стандартный антиген, конъюгированный с BSA, иммобилизовали на биоактивированной бумаге. В нормальном случае, когда в образце нет антигена, при последующем добавлении специфических антител, меченных HRP, а затем субстрата, можно наблюдать изменение цвета с белого на синий. Если образец содержит 5α-антиген в разной концентрации, то имеется конкуренция между антигеном, присутствующим в образце и иммобилизованным на биофункционализированной бумаге, за комплекс антитело-HRP или AEC. Эта конкуренция приводит к цветовому градиенту.
На фигуре 4A показаны бумажные устройства, используемые для стандартизации ELISA. Схематическое изображение принципа иммуноанализа показано на фигуре 5. Оптимизация концентрации антитела
Была проведена обширная работа по оптимизации концентрации антитела. Концентрация антитела была оптимизирована от соотношения 1:1 до 1:51200. Было обнаружено, что разведение 1: 30000 лучше всего подходит для устройства на бумажной основе для определения порогового уровня 5α-антигена и других молекул прегнана, которые присутствуют при концентрации более 900 нг/г у беременных животных.
Оценка различных субстратов
После обширных экспериментов было установлено, что субстрат TMB является наиболее подходящим для колориметрического определения в настоящем изобретении. Ниже кратко описаны недостатки других субстратов:
• TMB-Ultra Sensitive: этот субстрат образует растворимый субстрат, который быстро деградирует;
• TMB-Western Blot: он образует нерастворимый и стабильный продукт, который стабилен в течение более длительного времени. Однако эта форма TMB менее чувствительна, и для проявления цвета требуется больше времени;
• ABTS: этот субстрат образует растворимый субстрат, который быстро деградирует;
• OPD: этот субстрат образует растворимый субстрат, который быстро деградирует;
• DAB: этот субстрат образует растворимый субстрат, который быстро деградирует.
Однослойное устройство на бумажной основе
В одном варианте осуществления настоящего изобретения дизайн однослойного устройства на бумажной основе содержит три зоны реакции, каждая из которых имеет диаметр 4 мм. Три зоны реакции представляют собой зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля. За исключением зон реакции, вся поверхность устройства покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. Зоны реакции являются гидрофильными, что позволяет протекать реакции между реагентами и образцом.
В другом варианте осуществления настоящего изобретения дизайн однослойного устройства на бумажной основе напечатан на квадратной бумаге размером 2,5 см на 2,5 см (100). Создают три зоны реакции, каждая из которых имеет диаметр 4 мм. Эти три зоны реакции представляют собой зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103). За исключением зон реакции, вся поверхность устройства покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. Зоны реакции являются гидрофильными, что позволяет протекать реакции между реагентами и образцом. Однослойное устройство на бумажной основе включает элементы, описанные на фигуре 1.
Многослойное устройство типа оригами на бумажной основе
В одном варианте осуществления настоящего изобретения микрожидкостное устройство представляет собой многослойное устройство, содержащее первый слой, выполненный с возможностью приема биологического образца и реагентов, второй слой, выполненный с возможностью доставки биологического образца и реагента в зону реакции, третий слой, выполненный с возможностью доставки биологического образца в зону реакции, и четвертый слой, выполненный с возможностью колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она.
В другом варианте осуществления первый слой (300) состоит из двух зон ввода. Первая зона ввода (301) диаметром 3 мм предназначена для ввода образца. Вторая зона ввода (302) диаметром 5 мм предназначена для внесения реагентов в устройство. За исключением зон ввода, вся поверхность первого слоя покрыта гидрофобным материалом, предпочтительно воском. Зоны ввода являются гидрофильными, что позволяет реагентам и образцу просачиваться в следующий слой за счет микрожидкостного капиллярного действия.
В еще одном варианте осуществления второй слой (400) состоит из перевернутого Y-образного микрожидкостного канала (405) для доставки реагентов в зоны реакции в четвертом слое (600) через зону хранения комплекса антитело-фермент (AEC) в третьем слое (500). Круглая зона приема образца (404), имеющая диаметр 3 мм в этой секции, предназначена для поступления напрямую жидкости образца в зону хранения комплекса антитело-фермент. Размер всех круговых секций, соединенных с жидкостными каналами, составляет 4 мм. За исключением микрожидкостного канала (405) и круглых зон (401, 402, 403 и 404), вся поверхность первого слоя покрыта гидрофобным материалом, предпочтительно воском. «Y»-образные микрожидкостные каналы (405), соединенные с круглыми зонами (402, 403 и 404), и круглая зона приема образца (401) являются гидрофильными, что позволяет реагентам и образцу просачиваться в следующий слой посредством микрожидкостного капиллярного действия.
В еще одном варианте осуществления третий слой (500) содержит зону хранения комплекса антитело-фермент (AEC). В этом слое имеются три круглых зоны хранения комплекса антитело-фермент (502, 503 и 504), каждая из которых имеет диаметр 4 мм. Впускное отверстие для приема образца (501) имеет диаметр 3 мм. Одна из круглых зон хранения комплекса антитело-фермент (502) соединяется посредством микрожидкостного канала со впускным отверстием для приема образца (501), образуя таким образом структуру в форме гантели. Эта структура в форме гантели позволяет образцу перемещаться в зону хранения комплекса антитело-фермент (502) и, следовательно, в зону тестирования (601) в четвертом слое. Круглые зоны (501, 502, 503 и 504) расположены над круглыми зонами (401, 402, 403 и 404) во втором слое, что позволяет жидкости из второго слоя просачиваться в третий слой.
В другом варианте осуществления четвертый слой (600) содержит три биофункционализированные зоны реакции. Три зоны реакции имеют диаметр 4 мм. Тремя зонами реакции являются зона тестирования (601), зона положительного контроля (602) и зона отрицательного контроля (603). За исключением зон реакции, вся поверхность устройства покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. Зоны реакции являются гидрофильными, что позволяет протекать реакции между реагентами и образцом.
Микрожидкостное устройство по настоящему изобретению обеспечивает быстрое выявление беременности более доступным и приемлемым способом у огромной популяции в зависимости от выращивания скота. Разработанное устройство является недорогостоящим и обеспечивает быстрое и объективное определение беременности на сроках беременности 4-6 недель. Кроме того, с устройством могут работать как полуквалифицированные, так и неквалифицированные обычные люди. Следовательно, устройство будет иметь прямое влияние на увеличение общего производства молока и уровень жизни мелких и маржинальных фермеров.
ПРИМЕРЫ
Следующие ниже примеры конкретно описывают способ, с помощью которого должно быть осуществлено изобретение. Эти примеры не предназначены для включения всех аспектов объекта, раскрытого в настоящем документе, а скорее для иллюстрации репрезентативных способов и результатов. Эти примеры не предназначены для исключения эквивалентов и вариаций настоящего изобретения, которые очевидны для специалиста в данной области.
Пример 1: Однослойное устройство на бумажной основе
Разработан однослойный микрожидкостной набор на бумажной основе для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов. Дизайн однослойного устройства создавали с использованием программного обеспечения для автоматизированного проектирования. В частности, программу CorelDRAW® (разработанная и продаваемая фирмой Corel Corporation) использовали для дизайна однослойного устройства. Дизайн устройства представлен на фигуре 1. После этого дизайн печатали на фильтровальной бумаге Whatmann® сорта 4 (производства GE Healthcare) с использованием твердочернильного воскового принтера (Xerox ColorQube 8570N).
Как показано на фигуре 1, дизайн печатали на квадратной бумаге размером 2,5 на 2,5 см (100). Создавали три зоны реакции, каждая диаметром 4 мм. Эти три зоны реакции представляют собой зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103). За исключением этих трех зон реакции, всю поверхность устройства покрывали слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. Зоны реакции являются гидрофильными, что позволяет протекать реакции между реагентами и образцом.
После формирования воскового рисунка бумажную основу нагревали путем помещения ее на нагревательную плиту парафинированной стороной вверх при температуре 120°С на две минуты и охлаждали до комнатной температуры. Это позволило восковому материалу расплавиться и просачиваться вертикально (вниз) к другой стороне бумаги. Кроме того, расплавленный воск также растекался по горизонтальной оси бумаги, создавая более широкую линию бумаги, формируя таким образом гидрофобную границу, определяющую размеры зон реакции.
Для биофункционализации однослойного устройства зоны реакции обрабатывали 0,5% раствором низкомолекулярного хитозана. Устройство либо окунали в ванну с хитозаном, либо в зоны реакции добавляли 3 мкл хитозана. После того, как зоны реакции были высушены до полусухого состояния (приблизительно через 5 мин), зоны реакции обрабатывали 0,5% раствором глутаральдегида либо путем окунания в ванну с глутаральдегидом, либо путем добавления 3 мкл глутаральдегида в зоны реакции. Затем устройство сушили при комнатной температуре в течение приблизительно одного часа.
После полного высыхания 3 мкл 5α-антигена, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (BSA), иммобилизовали в зоне тестирования (101) и зоне положительного контроля (102). После этого выполняли стадию блокирования путем обработки всех трех зон 5 мкл блокирующего буфера (0,1М PBS с 5% BSA). Концентрацию антител в разведении 1:30000 использовали для определения порогового уровня 5α-антигена, обнаруженного в образце фекалий крупного рогатого скота. Однослойное устройство можно применять для обнаружения 5α-антигена в образце фекалий крупного рогатого скота и буйволов.
Пример 2: Многослойное устройство на бумажной основе
Разработан многослойный микрожидкостной набор на бумажной основе для раннего выявления беременности у крупного рогатого скота и буйволов. Многослойное устройство содержит четыре слоя. Дизайн слоев создавали с использованием программного обеспечения для автоматизированного проектирования. В частности, для дизайна однослойного устройства использовали программу CorelDRAW® (разработанную и продаваемую фирмой Corel Corporation). Дизайн устройства представлен на фигуре 2. Каждый слой печатали на фильтровальной бумаге Whatmann® сорта 4 (производства GE Healthcare) с использованием твердочернильного воскового принтера (Xerox ColorQube 8570N). Как показано на фигуре 2, дизайн печатали на бумаге размером 10 см на 2,5 см (200) и складывали пополам два раза с получением квадратов размером 2,5 см на 2,5 см каждый, что представляет собой один слой устройства на бумажной основе.
Первый слой
Первый слой (300) состоит из двух зон ввода. Первая зона ввода (301) диаметром 3 мм предназначена для ввода образца. Вторая зона ввода (302) диаметром 5 мм предназначена для внесения в устройство реагентов. За исключением зон ввода, вся поверхность первого слоя покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. Зоны ввода являются гидрофильными, что позволяет реагентам и образцу просачиваться в следующий слой за счет микрожидкостного капиллярного действия.
Второй слой
Второй слой (400) содержит перевернутый Y-образный микрожидкостной канал (405) для доставки реагентов в зоны реакции в четвертом слое (600) через зону хранения комплекса антитело-фермент (AEC) в третьем слое (500). Круглая зона приема образцов (404), имеющая диаметр 3 мм в этой секции, предназначена для непосредственного поступления жидкости пробы в зону хранения комплекса антитело-фермент. Размер всех круглых секций, соединенных с жидкостными каналами, составляет 4 мм в диаметре. За исключением микрожидкостного канала (405) и круглых зон (401, 402, 403 и 404), вся поверхность второго слоя покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. «Y»-образные микрожидкостные каналы (405), соединенные с круглыми зонами (402, 403 и 404), и круглая зона приема образца (401) являются гидрофильными, что позволяет реагентам и образцам просачиваться в следующий слой за счет микрожидкостного капиллярного действия. Все круглые вводы соединены через жидкостные каналы шириной 1 мм и длиной 6 мм.
Третий слой
Третий слой (500) содержит зону хранения комплекса антитело-фермент (AEC). В этом слое имеются три круговые зоны хранения комплекса антитело-фермент (502, 503 и 504), каждая из которых имеет диаметр 4 мм. Впускное отверстие для приема образца (501) имеет диаметр 3 мм. Одна из круговых зон хранения комплекса антитело-фермент (502) соединена с помощью микрожидкостного канала со впускным отверстием для приема образца (501), образуя таким образом структуру в форме гантели. Микрожидкостный канал имеет ширину 1 мм и длину 4 мм. Эта структура в форме гантели позволяет образцу перемещаться в зону хранения комплекса антитело-фермент (502) и, следовательно, в зону тестирования (601) в четвертом слое. Круговые зоны (501, 502, 503 и 504) расположены над круговыми зонами (401, 402, 403 и 404) во втором слое, что позволяет жидкости из второго слоя просачиваться в третий слой.
Четвертый слой
Четвертый слой (600) содержит три биофункционализированные зоны реакции. Эти три зоны реакции имеют диаметр 4 мм. Эти три зоны реакции представляют собой зону тестирования (601), зону положительного контроля (602) и зону отрицательного контроля (603). За исключением зон реакции, вся поверхность четвертого слоя покрыта слоем гидрофобного материала, предпочтительно воском. Эти зоны реакции являются гидрофильными, что позволяет протекать реакции между реагентами и образцом.
Для биофункционализирования четвертого слоя зоны реакции обрабатывали 0,5% раствором низкомолекулярного хитозана. Слой либо окунали в ванну с хитозаном, либо в зоны реакции добавляли 3 мкл хитозана. После того, как зоны реакции были наполовину высушены (приблизительно через 5 мин), зоны реакции обрабатывали 0,5% раствором глутаральдегида либо путем окунания в ванну с глутаральдегидом, либо путем добавления 3 мкл глутаральдегида в зоны реакции. Затем устройство сушили при комнатной температуре в течение приблизительно одного часа. После полного высыхания 3 мкл 5α-антигена, конъюгированного с бычьим сывороточным альбумином (BSA), иммобилизовали в зоне тестирования (601) и зоне положительного контроля (602). После этого выполняли стадию блокирования путем обработки всех трех зон 5 мкл блокирующего буфера.
Концентрацию антител в разведении 1:30000 использовали для определения порогового уровня 5α-антигена, обнаруженного в образце фекалий крупного рогатого скота. Все образцы, реагенты и комплекс антитело-фермент прошли через все бумажное волокно и в конечном итоге достигли реакции на последнем слое. Устройства были напечатаны на однослойной бумаге, а затем сложены в складки оригами с получением окончательных устройств.
На фигуре 6(а) изображено многослойное устройство, которое напечатано на однослойной бумаге, а затем сложено в складки оригами. На фигуре 6(b) изображены впускное отверстие для образца и впускное отверстие для реагента первого слоя многослойного устройства. На фигуре 6(c) изображены зона тестирования, зона положительного контроля и зона отрицательного контроля четвертого слоя многослойного устройства. На фигурах 7A и 7B отдельно показаны уровни многослойного устройства.
Пример 3: Извлечение антигена из образца фекалий
Антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она в образце фекалий крупного рогатого скота и буйволов является метаболитом, который определяет наличие беременности у крупного рогатого скота. Для извлечения порогового уровня указанного антигена применяли новый подход с использованием 10 мМ (2-гидроксипропил)-β -циклодекстрина (2HPβCD).
Подход характеризуется одностадийным процессом с участием только одного реагента для извлечения 5α-антигена. Для извлечения антигена 0,2 г образца фекалий отбирали во флакон и добавляли 3 мл 10 мМ раствора 2HPβCD. Флакон умеренно встряхивали в течение 2 минут, а затем оставляли отстаиваться до тех пор, пока не наблюдался прозрачный супернатант. Этот супернатант образца содержит пороговое количество антигена для определения беременности крупного рогатого скота или буйволов. Этот одностадийный процесс с использованием только одного химического вещества может выполняться даже неквалифицированным человеком в сельской местности.
Пример 4: Функционирование однослойного устройства на бумажной основе
Однослойное устройство на бумажной основе использовали для определения того, содержит ли образец фекалий крупного рогатого скота или буйвола пороговое количество 5α-антигена, которое будет определять наличие беременности у крупного рогатого скота или буйволов. Схематический вид функционирования однослойного устройства представлен на фигуре 8.
Использовали однослойное устройство на бумажной основе (100), показанное на фигуре 1. Экстрагированный в примере 3 супернатант образца объемом 3 мл вносили в зону тестирования (101). Во все три зоны вносили 3 мкл раствора комплекса антитело-фермент (реагент 1): зону тестирования (101), зону положительного контроля (102) и зону отрицательного контроля (103). Комплекс антитело-фермент представляет собой антитело 5α-прегнан-3α-ол-20-она, конъюгированное с пероксидазой хрена (HRP). После этого во все три зоны устройства вносили 10 мкл промывочного буфера (реагент 2). Промывочный буфер состоял из (0,15 М NaCl, 0,05% Tween 20). Под бумажными устройствами держали промокательную бумагу для впитывания смывной жидкости. Наконец, 3 мкл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB) (субстрат; реагент 3) вносили в три зоны устройства.
Результаты отображаются на устройстве в виде синего цвета, как показано на фигуре 9. Если цвет появляется как в зоне тестирования, так и в контрольной зоне, это означает, что образец взят от небеременного животного. Если цвет появляется только в зоне положительного контроля, при этом в зоне тестирования цвет отсутствует или наблюдается бледный цвет, это указывает на то, что указанный образец взят от беременного животного. Цвет зоны тестирования может быть дополнительно сопоставлен с инструкцией по эксплуатации, прилагаемой к устройству, чтобы подтвердить статус беременности крупного рогатого скота или буйвола.
Пример 5: Функционирование многослойного устройства на бумажной основе
Многослойное устройство на бумажной основе использовали для определения того, содержит ли образец фекалий крупного рогатого скота или буйвола пороговое количество 5α-антигена, которое будет определять наличие беременности у крупного рогатого скота или буйволов.
Использовали многослойное устройство (200), показанное на фигуре 2. Извлеченный в примере 3 образец супернатанта объемом 3 мкл вносили во впускное отверстие для образца в устройстве (301). 20 мкл промывочного буфера (реагент 1) вносили во впускное отверстие для реагентов в устройстве (302). Далее, 3 мкл субстрата (TMB; реагент 2) вносили во впускное отверстие для реагентов в устройстве (302).
Результаты отображались на устройстве в виде синего цвета, как показано на фигуре 10. Если цвет появляется как в зоне тестирования, так и в контрольной зоне, это означает, что образец взят от небеременного животного. Если цвет появляется только в зоне положительного контроля, при этом цвет отсутствует или наблюдается слабый цвет в зоне тестирования, это означает, что образец взят от беременного животного. Цвет зоны тестирования может быть дополнительно сопоставлен с инструкциями по эксплуатации, прилагаемыми к устройству, чтобы подтвердить статус беременности у крупного рогатого скота или буйвола.
В приведенной ниже таблице 2 представлено общее количество тестов, проведенных для однослойных устройств и многослойных микрожидкостных устройств по настоящему изобретению, а также полученные результаты.
жит.
Результаты подтверждают очень высокую точность микрожидкостного устройства по настоящему изобретению для применения в раннем обнаружении беременности у крупного рогатого скота и буйволов.
Для выявления беременности с помощью других неинвазивных процедур, таких как анализ мочи, имеется несколько недостатков. Во-первых, сбор мочи затруднен, так как он должен быть рассчитан по времени. Кроме того, сбор мочи у крупного рогатого скота или буйволов сложен, так как требуется пристальное наблюдение за животными. Также в случае агрессивного скота еще сложнее подойти к нему и собрать образец мочи. Более того, концентрация гормона широко варьируется в течение дня, так как секреция гормона колеблется, что приводит к ошибочным фактическим значениям. Кроме того, поскольку концентрация гормона в моче сравнительно низкая, для анализа требуется высокочувствительный метод, требующий большего количества антител и реагента для обнаружения, что может увеличить стоимость.
Существует несколько преимуществ микрожидкостного устройства по настоящему изобретению, в котором используют образец навоза для раннего выявления беременности, по сравнению с другими неинвазивными процедурами с использованием образца мочи. Сбор образца навоза занимает гораздо меньше времени, чем сбор образца мочи, и пристального наблюдения за животным не требуется. Сбор образцов намного проще, любой может собирать образцы навоза в любое время без помощи фермера. Никаких навыков не требуется. Кроме того, образец навоза обеспечивает общую среднюю концентрацию гормона за предыдущий день, поэтому нет никаких изменений в течение дня. Кроме того, поскольку метаболит гормона накапливается в течение всего дня, концентрация гормона и производных гормона намного выше, тем самым чувствительность не снижается.
ПРЕИМУЩЕСТВА ИЗОБРЕТЕНИЯ
• В настоящем изобретении используют образцы навоза для выявления беременности, что является неинвазивной процедурой, и результаты получают для срока в пределах одного месяца беременности у крупного рогатого скота и буйволов.
• Это приемлемое по цене устройство на бумажной основе, которое легко использовать для обнаружения на месте в сельской местности.
• Для тестирования или использования устройства не требуется квалифицированного специалиста.
• Набор является приемлемым по цене и может храниться при комнатной температуре.
• Устройство является полезным для фермеров для выявления беременности на ранней стадии и планирования ведения беременности и искусственного осеменения по мере необходимости, что должно привести как к улучшению репродуктивной функции, так и к увеличению производства молока, что принесет фермерам экономическую выгоду.
• Раннее выявление беременности будет иметь сильное социально-экономическое влияние на фермеров и молочную промышленность.
• Разработанное устройство легко утилизируется и, следовательно, является экологически безопасным.
Настоящее изобретение раскрывает набор и новый способ извлечения метаболита прогестерона из образца фекалий/навоза. Настоящее изобретение также раскрывает микрожидкостное устройство на бумажной основе для обнаружения метаболита прогестерона для раннего определения беременности у крупного рогатого скота и буйволов. Изобретение также раскрывает антитела, разработанные против указанного метаболита, способ извлечения, способы изготовления микрожидкостных устройств на бумажной основе и способы недорогого, быстрого и неинвазивного определения беременности на ранних стадиях у крупного рогатого скота и буйволов. 4 н. и 13 з.п. ф-лы, 10 ил., 2 табл.
1. Микрожидкостное устройство для обнаружения беременности крупного рогатого скота и буйволов, содержащее:
а) по меньшей мере один структурированный, пористый и гидрофильный слой, на котором сформированы восковые очерчивающие паттерны для создания гидрофобных барьеров;
b) по меньшей мере одну зону нанесения для приема биологического образца и реагента; и
c) по меньшей мере один микрожидкостный канал для доставки биологического образца и реагента в зону реакции,
при этом указанное устройство выполнено с возможностью обнаружения антигена 5α-прегнан-3α-ол-20-она при концентрации более 400 нанограмм на грамм в биологическом образце.
2. Микрожидкостное устройство по п. 1, где указанное устройство представляет собой однослойное бумажное устройство, имеющее три круглые зоны, выполненные с возможностью приема биологического образца и реагента, содержащее:
а) зону тестирования, содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
b) зону положительного контроля, содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
c) зону отрицательного контроля; и
d) восковой паттерн на слое бумаги, при этом восковой паттерн очерчивает зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля для создания гидрофобного барьера.
3. Микрожидкостное устройство по п. 1, где указанное устройство представляет собой многослойное устройство, содержащее:
а) первый слой, выполненный с возможностью приема биологического образца и реагентов;
b) второй слой, выполненный с возможностью доставки биологического образца и реагентов в зону реакции;
c) третий слой, выполненный с возможностью доставки биологического образца в зону реакции; и
d) четвертый слой, выполненный с возможностью колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она.
4. Микрожидкостное устройство по п. 3, где первый слой многослойного устройства содержит:
а) впускное отверстие для образца для приема биологического образца; и
b) впускное отверстие для реагентов для приема реагентов.
5. Микрожидкостное устройство по п. 3, в котором второй слой многослойного устройства содержит:
а) первую круглую зону для доставки биологического образца из впускного отверстия для образца в круглую зону для доставки в зону хранения комплекса антитело-фермент;
b) вторую круглую зону для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов в зону хранения комплекса антитело-фермент;
c) третью круглую зону для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов в круглую зону для доставки в зону положительного контроля;
d) четвертую круглую зону для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов в круглую зону для доставки в зону отрицательного контроля;
е) перевернутый Y-образный микрожидкостный канал для доставки реагентов из впускного отверстия для реагентов в зоны реакции в четвертом слое.
6. Микрожидкостное устройство по п. 3, где третий слой многослойного устройства содержит:
а) первую круглую зону для доставки биологического образца из первой круглой зоны в зону хранения комплекса антитело-фермент;
b) зону хранения комплекса антитело-фермент;
c) вторую круглую зону для доставки реагентов из третьей круглой зоны в зону положительного контроля; и
d) третью круглую зону для доставки реагентов из четвертой круглой зоны в зону отрицательного контроля.
7. Микрожидкостное устройство по п. 3, где четвертый слой многослойного устройства содержит:
а) зону тестирования, содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она для колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она;
b) зону положительного контроля, содержащую иммобилизованный антиген 5α-прегнан-3α-ол-20-она, для генерации положительного контрольного сигнала, подтверждающего перенос по меньшей мере части реагента из впускного отверстия для образца в зону тестирования; и
c) зону отрицательного контроля для генерации отрицательного контроля, подтверждающего перенос по меньшей мере части реагента из впускного отверстия для образца в зону тестирования.
8. Микрожидкостное устройство по п. 1, где слой имеет толщину менее 220 мкм и удерживание частиц более 10 мкм.
9. Микрожидкостное устройство по п. 1, где биологический образец получают из навоза крупного рогатого скота или буйволов.
10. Способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием микрожидкостного устройства по п. 2, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а) внесение биологического образца в зону тестирования;
b) внесение раствора комплекса антитело-фермент в зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля;
c) внесение промывочного буфера в зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля;
d) внесение субстрата тетраметилбензидина (ТМВ) в зону тестирования, зону положительного контроля и зону отрицательного контроля; и
е) определение цвета зоны тестирования, зоны положительного контроля и зоны отрицательного контроля,
при этом отсутствие цвета в зоне тестирования подтверждает присутствие 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце.
11. Способ по п. 10, в котором биологический образец получают из навоза крупного рогатого скота или буйволов.
12. Способ колориметрического обнаружения 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце с использованием устройства по п. 3, при этом указанный способ включает следующие стадии:
а) внесение биологического образца во впускное отверстие для образца;
b) внесение промывочного буфера во впускное отверстие для реагентов;
c) внесение субстрата TMB во впускное отверстие для реагента; и
d) определение цвета зоны тестирования, зоны положительного контроля и зоны отрицательного контроля,
при этом отсутствие цвета в зоне тестирования подтверждает присутствие 5α-прегнан-3α-ол-20-она в биологическом образце.
13. Способ по п. 12, в котором биологический образец получают из навоза крупного рогатого скота или буйволов.
14. Способ по п. 13, в котором биологический образец получают следующими стадиями:
- смешивание навоза с 2-гидроксипропил-циклодекстрином с последующим встряхиванием в течение 3 мин;
- позволение дебрису и другим частицам осесть с получением прозрачного супернатанта, при этом супернатант, содержащий 5α-прегнан-3α-ол-20-он, представляет собой биологический образец.
15. Набор для обнаружения беременности крупного рогатого скота и буйволов, включающий:
- микрожидкостное устройство по п. 1,
- по меньшей мере три реагента;
- флакон; и
- инструкцию по эксплуатации.
16. Набор по п. 15, в котором реагенты представляют собой промывочный буфер, субстрат TMB и 2-гидроксипропил-циклодекстрин.
17. Набор по п. 16, в котором реагент дополнительно содержит раствор комплекса антитело-фермент.
| WO 2007117155 A1, 18.10.2007 | |||
| GB, 20170417, vol | |||
| Печь для сжигания твердых и жидких нечистот | 1920 |
|
SU17A1 |
| Очаг для массовой варки пищи, выпечки хлеба и кипячения воды | 1921 |
|
SU4A1 |
| МИКРОЖИДКОСТНАЯ РЕЗИСТЕНТНАЯ СЕТЬ И МИКРОЖИДКОСТНОЕ УСТРОЙСТВО | 2012 |
|
RU2599657C2 |
| МИКРОЖИДКОСТНОЕ УСТРОЙСТВО | 2009 |
|
RU2500478C2 |
| УСТРОЙСТВО ДЛЯ АНАЛИЗОВ И СПОСОБ ВЫПОЛНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ | 2009 |
|
RU2527686C2 |
| Lei Ge; Shoumei Wang; Xianrang Song; Shenguang Ge; Jinghua Yu, "3D Origami-based multifunction-integrated immunodevice: low-cost and multiplexed sandwich chemiluminescence immunoassay on microfluidic | |||
