Способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин с использованием молекулярно-генетических данных Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, к биотехнологии, медицинской генетике и может быть использовано для прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин.

Артериальная гипертензия (АГ) - хроническое заболевание, при котором артериальное давление повышено и представляет собой основной фактор риска развития сердечно-сосудистых заболеваний [Wermelt JA, Schunkert H. Management der arteriellen Hypertonie [Management of arterial hypertension]. Herz. 2017;42(5):515-526. doi:10.1007/s00059-017-4574-1].

АГ определяется как артериальное давление, равное или превышающее 140/90 мм.рт.ст. и относится к наиболее распространенным заболеваниям, являющимся причиной около 7,5 миллионов смертей в год (около 13% всех смертей) во всем мире [Артериальная гипертензия у взрослых. Клинические рекомендации 2020 // Российский кардиологический журнал. - 2020. - Т. 25(3). - C. 149-218.]. По данным ВОЗ, гипертония является основным фактором риска развития различных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ), почечную недостаточность, когнитивные нарушения и т. д. По оценкам, около 22% (около 1 миллиарда человек) взрослого населения старше 25 лет во всем мире страдают от артериальной гипертонии [Bryan, W. 2018 ESC/ESH Guidelines for the management of arterial hypertension/ W. Bryan [et al.] // European Heart Journal. - 2018. - Vol. 39. - P. 3021-3104.].

Этиология и патогенез артериальной гипертензии активно изучаются как российскими, так и зарубежными исследователями. Известными факторами риска развития АГ являются возраст, половая принадлежность, высокий уровень потребления соли, дислипидемия, абдоминальное ожирение, вредные привычки, частые стрессовые ситуации, низкая физическая активность, а также генетические факторы [Lee HA, Park H. Diet-Related Risk Factors for Incident Hypertension During an 11-Year Follow-Up: The Korean Genome Epidemiology Study. Nutrients. 2018;10(8):1077. Published 2018 Aug 13. doi:10.3390/nu10081077].

Изучению молекулярно-генетических основ АГ на основе анализа ассоциаций однонуклеотидного полиморфизма отдельных генов-кандидатов (или групп генов-кандидатов) с развитием заболевания посвящено значительное количество работ как зарубежных, так и отечественных ученых. При этом следует отметить, что полученные данные неоднозначны, нередко противоречивы и имеют низкую воспроизводимость. Это определяет необходимость продолжения исследований молекулярно-генетических основ артериальной гипертензии, с использованием новых подходов активно развивающихся в настоящее время системной генетики и сетевой медицины.

Нами были специально отобраны полиморфные локусы генов-кандидатов, связанные с развитием артериальной гипертензии по данным полно-геномных исследований (Churnosov M, Abramova M, Reshetnikov E, et al. Polymorphisms of hypertension susceptibility genes as a risk factors of preeclampsia in the Caucasian population of central Russia. Placenta. 2022;129:51-61. doi:10.1016/j.placenta.2022.09.010). В основу отбора полиморфных локусов для данной работы были положены следующие критерии: статистически значимые при уровне p≤5×10^-8 связи с АГ (или; встречаемость редкого аллеля 0,05 и более; наличие функциональных эффектов (связь с эпигенетическими характеристиками, транскрипцией генов согласно базы данных HaploReg, версия программы 4.1).

В Российской Федерации исследования вовлеченности данных о полиморфизме генов CERS5, HFE, TBX2 и RGL3 в формирование предрасположенности к артериальной гипертензии у женщин единичны и фрагментарны, а данные о роли комбинации генотипов генов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3 в развитие артериальной гипертензии у женщин отсутствуют.

Для оценки сложившейся патентной ситуации был выполнен поиск по охранным документам за период с 1990 по 2023 гг. Анализ документов производился по направлению: способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин в зависимости от данных о полиморфных локусах CERS5, HFE, TBX2 и RGL3. Источник информации: сайт Федерального института промышленной собственности http://fips.ru.

В изученной научно-медицинской и доступной патентной литературе авторами не было обнаружено способа прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин на основе данных о SNP х SNP взаимодействий и на основе данных о полиморфных локусах CERS5, HFE, TBX2 и RGL3.

Из области техники известен патент RU №2456608 (опубл. 20.07.2012) Способ прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин. Изобретение относится к медицине, конкретно к диагностике в кардиологии, и касается способа прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин. Выделяют геномную ДНК из периферической венозной крови пациентов и выявляют генотипы полиморфизмов rs2266782 гена флавиновой монооксигеназы 3 типа, rs1056836 гена цитохрома Р-450 1В1 и rs1799930 гена N-ацетилтрансферазы 2 типа. Оценивают характер употребления алкоголя, факт курения и наличие контакта с вредными химическими веществами. Затем каждому из указанных факторов присваивают соответствующие цифровые значения, после чего по уравнению логистической регрессии с рассчитанными для каждого фактора коэффициентами регрессии рассчитывают натуральный логарифм отношения шансов возникновения гипертонической болезни у пациента. Затем рассчитывают вероятность отнесения пациента к группе с низким - от 1 до 10%, средним - от 11 до 19% или высоким - более 20% риском возникновения гипертонической болезни. Способ обеспечивает существенное повышение точности прогнозирования риска возникновения гипертонической болезни у мужчин посредством совместной оценки комплекса генетических и средовых факторов риска заболевания и использования метода логистического регрессионного анализа. Недостаток метода заключается в том, что он рассматривает риск развития гипертонической болезни только у мужчин, а согласно литературным данным гипертоническая болезнь развивается чаще у женщин [Эпидемиология артериальной гипертонии в России. Результаты федерального мониторинга 2003-2010 гг. /Р.Г. Оганов [и др.] //Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2011. - №1. - С. 9-13], Кроме того, не рассматриваются гены-кандидаты, связанные с воспалительным механизмом развития гипертонической болезни и ее течения и не определяются риски развития ассоциированных клинических состояний, т.е. III стадии. Недостаток указанного способа также в том, что не рассматриваются сочетания полиморфных маркеров генов-кандидатов с риском развития артериальной гипертензии у женщин.

Из области техники известен патент RU №2505814 (опубл. 27.01.2014) Способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у тубаларов- коренных жителей республики Алтай. Изобретение относится к медицине, в частности к способу прогнозирования риска развития артериальной гипертензии (АГ) у тубаларов коренных жителей Республики Алтай. Способ включает учет возраста, образовательного статуса, наличия или отсутствия курения, ожирения (ОЖ), гиперхолестеринемии (ГХС), злоупотребление солью, массы тела по индексу Кетле: нормальная (НМТ), избыточная (ИМТ), окружности талии (ОТ), отношения окружности талии к окружности бедер (ИТБ), уровень холестерина липопротеидов низкой плотности (ХС-ЛПНП) и индекс атерогенности (ИА), наличия гипертриглицеридемии (ГТГ), гиперурикемии, социальные факторы: семейное положение, доход и генетические маркеры: группы крови систем резус и MN. Затем для каждого фактора устанавливают прогностический коэффициент (ПК) в баллах. При значении суммы ПК (+6) баллов и выше прогнозируют предрасположенность к развитию АГ у тубаларов - коренных жителей Республики Алтай. Использование заявленного способа позволяет выявить риск развития АГ в более ранние сроки - до поражения органов-мишеней и формирования стойкой гипертонической болезни. Однако данный способ не является достаточно информативным, так как не включает генетические маркеры и применим только для коренных жителей Республики Алтай (тубаларов).

Известен патент RU № 2624480 (опубл. 04.07.2017) на изобретение Способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии на основе комбинаций генов матриксных металлопротеиназ. Изобретение относится к области медицинской диагностики. Предложен способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у индивидуумов русской национальности, уроженцев Центрального Черноземья, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови и анализ полиморфизмов генов. При выявлении сочетания генетических вариантов матриксных металлопротеиназ: генотипа АА rs1320632 ММР-8 и аллеля С rs11225395 ММР-8 прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии. Изобретение позволяет на доклиническом этапе формировать среди индивидуумов группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития заболевания.

Известен патент RU №2664428 (опубл. 17.08.2018) Способ прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин на основе генетических факторов. Изобретение относится к области медицинской диагностики и предназначено для прогнозирования риска развития эссенциальной гипертензии у женщин. Проводят анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ ММР-1 и ММР-3 и прогнозируют высокий риск развития эссенциальной гипертензии у женщин при выявлении сочетания генотипа 1G/1G по локусу rs1799750 ММР-1 и генотипа 6A/6А по локусу rs3025058 ММР-3. Изобретение обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития эссенциальной гипертензии у женщин русской национальности, уроженок Центрального Черноземья. Недостатком является ограниченность его применения, т.к. используется только анализ полиморфизмов генов матриксных металлопротеиназ.

Задачей настоящего исследования является расширение арсенала методов диагностики, а именно создание способа прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин на основе данных о полиморфных локусах CERS5, HFE, TBX2 и RGL3.

Технический результат использования изобретения - получение критериев оценки риска развития артериальной гипертензии у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона РФ и не имеющих родства между собой, на основе данных о полиморфных локусах CERS5, HFE, TBX2 и RGL3, включающий:

- выделение ДНК из периферической венозной крови;

- анализ полиморфных локусов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3;

- прогнозирование высокого риска развития артериальной гипертензии у женщин при выявлении комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TG RGL3.

Новизна и изобретательский уровень заключаются в том, что из уровня техники не известна возможность прогнозирования развития артериальной гипертензии у женщин на основе данных о комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TG RGL3.

Способ осуществляют следующим образом:

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляют методом фенольно-хлороформной экстракции [Miller, S.A. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells / S.A. Miller, D.D. Dykes, H.F. Polesky // Nucleic. Acids. Res. - 1988. - Vol. 16, № 3. - P. 1215] в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови с ЭДТА добавляют 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl₂, 10мМ трис-HCl (pH=7,6). Полученную смесь перемешивают и центрифугируют при 4°С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливают, к осадку добавляют 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензируют. Затем прибавляют 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубируют образец при 37°С в течение 16 часов.

На втором этапе из полученного лизата последовательно проводят экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производят отбор водной фазы. ДНК осаждают из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. После лиофилизации полученную ДНК растворяют в бидистиллированной, деионизованной воде и хранят при -20°С.

Анализ полиморфных локусов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3 осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на термоциклере CFX-96 Real-Time System (Bio-Rad) c использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров и зондов.

Генотипирование исследуемых образцов осуществлялось с использованием программного обеспечения «CFX-Manager™» методом дискриминации аллелей по величинам относительных единиц флуоресценции (ОЕФ).

Метод MDR в его модификации MB-MDR [Mbmdr: an R package for exploring gene-gene interactions associated with binary or quantitative traits / M.L. Calle, V. Urrea, N. Malats, K. Van Steen // Bioinformatics. - 2010. - Vol. 26, № 17. - P. 2198-2199] применялся для изучения интерлокусных взаимодействий, ассоциированных с артериальной гипертензии ом. Рассматривались двух-, трех-, четырех-, пяти- и шестилокусные модели. Расчеты проводили с ковариатами в программе MB-MDR (версия 2.6) в программной среде R. Наиболее значимые модели интерлокусных взаимодействий, связанных с артериальной гипертензии ом, отбирались на основе поправки Бонферрони (при этом рассматривалось число возможных комбинаций изучаемых SNPs генов CERS5, HFE, TBX2 и RGL3 при 2-, 3-, 4- , 5- и 6-локусных моделях). В дальнейший анализ (валидация моделей с помощью пермутационного теста) включались модели межлокусных взаимодействий, соответствующие следующим критериям: 2-х локусные модели - p<1,78*10^-3 (<0,05/28), 3-х локусные модели - p<8,92*10^-4 (<0,05/56), 4-х локусные модели - p<7,14*10^-4 (<0,05/70), 5-ти локусные модели - p<8,92*10^-4 (<0,05/56), 6-ти локусные модели - p<1,78*10^-3 (<0,05/28). Для отобранных в соответствии с вышеуказанными критериями наиболее значимых моделей SNP×SNP взаимодействий, ассоциированных с артериальной гипертензии у женщин, выполнялся пермутационный тест (проводилось 1000 пермутаций). Статистически значимым считали p_perm≤0,001. Отдельные комбинации генотипов, связанные с риском развития артериальной гипертензии у женщин определялись методом MB-MDR при p<0,05.

Возможность использования предложенного способа для оценки прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин подтверждает анализ результатов наблюдений 584 пациенток (таблица 1).

Изучаемые группы включали индивидуумов русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой. Выборки формировались в соответствии с критериями включения и исключения. Критерии включения в группу больных ГБ: 1. Наличие артериальной гипертензии; 2. Русская национальность; 3. Уроженцы Центрально-Черноземного региона РФ. Критерии исключения: 1. Наличие симптоматических или вторичных гипертензий, печеночная недостаточность, почечная недостаточность; 2. Родство с лицами, включенными в исследование; 3. Отказ от участия в исследовании. Критерии включения в контрольную группу: 1. Русская национальность; 2. Уроженцы Центрально-Черноземного региона РФ; 3. Уровень систолического артериального давления <140 мм.рт.ст. и диастолического АД <90 мм.рт.ст. Критерии исключения: 1. Наличие у индивидуума метаболического синдрома, сердечно-сосудистых, аутоиммунных, онкологических заболеваний; 2. Родство с лицами, включенными в исследование; 3. Отказ от участия в исследовании.

Диагноз артериальной гипертензии устанавливался в соответствии с рекомендациями Всероссийского научного общества кардиологов, на основании результатов клинического и лабораторно-инструментального обследования [Диагностика и лечение артериальной гипертензии [Текст]: рос. рекомендации (четвертый пересмотр) / Рос. мед. о-во по артериальной гипертонии, Всерос. науч. о-во кардиологов; Е.И. Чазова, Л.Г. Ратова, С.А. Бойцов [и др.]. - Москва, 2010. - 34 с.]. Общеклиническое, лабораторное, клинико-инструментальное обследование пациентов проводилось в неврологическом и кардиологическом отделениях областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода. В контрольную группу включались лица, проходившие профилактический осмотр в поликлинике областной клинической больницы Святителя Иоасафа г. Белгорода. Все пациентки включались в исследование после подписания информированного согласия на использование полученных данных для научно-исследовательских целей. Протокол исследования одобрен этическим комитетом медицинского института Белгородского государственного национального исследовательского университета.

В группу больных включались индивидуумы с уровнем систолического артериального давления ≥140 мм.рт.ст. и/или диастолического АД ≥90 мм.рт.ст. Измерение показателей АД проводилось аускультативным методом по Короткову, результатом считали среднее значение трех последовательных измерений. При нахождении на стационарном лечении измерение уровня артериального давления осуществлялось ежедневно.

Для всех пациентов, включенных в исследование, заполнялась специальная анкета-опросник, разработанная профессором Полониковым А.В. (Курский государственный медицинский университет). Анкета включала анамнестические, лабораторные и инструментальные данные, сведения об образе жизни пациента, наличии у него профессиональных вредностей. Кроме того, в анкетах регистрировались данные о наличии у пациентов таких средовых факторов риска артериальной гипертензии, как ожирение, высокий уровень употребления алкоголя, курение, особенности питания (в том числе, употребление жирной пищи, «солевой аппетит», регулярность употребления овощей и фруктов), подверженность стрессам и уровень физических нагрузок.

Все исследования проводились под контролем этического комитета медицинского факультета Белгородского государственного университета с информированного согласия пациенток на использование материалов лечебно-диагностических мероприятий, связанных с заболеванием, для научно-исследовательских целей и протоколировались по стандартам этического комитета Российской Федерации.

При изучении SNP х SNP взаимодействий наиболее значимой четырехлокусной моделью, вовлеченную в формирование артериальной гипертензии у женщин, является rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3 (p_perm≤0,001). С развитием заболевания наиболее значимая ассоциация выявлена для комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TG RGL3 (beta =1,13, p=0,025), имеющей рисковую направленность.

В качестве примеров конкретного применения разработанного способа проведено генетическое обследование женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрального Черноземья РФ и не имеющих родства между собой: проведено генетическое исследование по локусам rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3.

У пациентки С. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3, была выявлена комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TG RGL3, что позволило отнести пациентку в группу больных с повышенным риском развития артериальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение подтвердило диагноз артериальной гипертензии у пациентки.

У пациентки Ф. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3, была выявлена комбинации генотипов rs7302981 GA CERS5 × rs1799945 CG HFE × rs8068318 TT TBX2 × rs167479 TG RGL3, что позволило отнести пациентку в группу пациенток с низким риском развития артериальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз у пациентки.

У пациентки И. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3 была выявлена комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 GG HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TT RGL3 , что позволило отнести пациентку в группу больных с низким риском развития артериальной гипертензии. Дальнейшее наблюдение не подтвердило диагноз артериальной гипертензии у пациентки.

У пациентки Я. была взята венозная кровь, проведено генотипирование ДНК-маркеров, при анализе вовлеченности полиморфных локусов rs7302981 гена CERS5, rs1799945 гена HFE, rs8068318 гена TBX2, rs167479 гена RGL3 была выявлена комбинации генотипов rs7302981 GG CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 TT TBX2 × rs167479 TG RGL3, что позволило отнести пациентку в группу индивидуумов с низким риском развития артериальной гипертензии. При дальнейшем наблюдении диагноз артериальной гипертензии у пациентки Я. не подтвердился.

Применение данного способа позволит на доклиническом этапе формировать среди женщин группы риска и своевременно реализовывать в этих группах необходимые лечебно-профилактические мероприятия по предупреждению развития артериальной гипертензии.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, биотехнологии и медицинской генетике, и может быть использовано для прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин. Из периферической венозной крови выделяют ДНК. Проводят анализ полиморфных локусов CERS5, HFE, TBX2 и RGL3. При выявлении комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TG RGL3 прогнозируют высокий риск развития артериальной гипертензии у женщин. Способ обеспечивает получение новых критериев оценки риска развития артериальной гипертензии у женщин русской национальности, являющихся уроженками Центрально-Черноземного региона РФ и не имеющих родства между собой, на основе данных о полиморфных локусах CERS5, HFE, TBX2 и RGL3. 1 табл., 4 пр.

Способ прогнозирования риска развития артериальной гипертензии у женщин с использованием молекулярно-генетических данных, включающий выделение ДНК из периферической венозной крови, анализ полиморфных локусов CERS5, HFE, TBX2 и RGL3, прогнозирование высокого риска развития артериальной гипертензии у женщин при выявлении комбинации генотипов rs7302981 AA CERS5 × rs1799945 CC HFE × rs8068318 CC TBX2 × rs167479 TG RGL3.