КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2023 года по МПК C12N5/789 C12N15/63 A61K35/28 C12N5/78 C12N9/22 C12N15/85 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к способам получения популяций гемопоэтических клеток, содержащих генно-модифицированные гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) для применения в трансплантате ГСК, в том числе для лечения анемии Фанкони (АФ).

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0002] Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки США № 62/656292, поданной 11 апреля 2018 г., которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

ОПИСАНИЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА, ПРЕДСТАВЛЕННОГО В ЭЛЕКТРОННОМ ВИДЕ

[0003] Содержимое текстового файла, представленного в электронном виде с настоящим документом, полностью включено в настоящий документ посредством ссылки. Копия списка последовательностей в машиночитаемом формате (имя файла: ROPA_008_01WO_SeqList_ST25, дата записи: 11 апреля 2019 г., размер файла ~52 килобайта).

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Перенос генов в клетки-мишени, опосредованный ex vivo, представляет собой клинический прикладной способ клеточной и генной терапии. Выделение CD34-обогащенных популяций, содержащих ГСК, и их генетическая модификация ex vivo обеспечивает два основных преимущества: снижение частоты переноса генов в неспецифические клетки; и, таким образом, снижение необходимости в/количества генетических модификаторов, например, векторов для генной терапии, что, в свою очередь, снижает затраты, связанные с клиническим получением генно-модифицированных ГСК. Модельной системой для трансплантации генетически модифицированных ГСК является АФ. Способы, разработанные в контексте АФ, также можно применять при других нарушениях и состояниях.

[0005] АФ представляет собой аутосомно-рецессивное заболевание (за исключением группы комплементации FA-B, которая сцеплена с X-хромосомой), при котором медианная выживаемость пациентов составляет около 24 лет (Butturini A, et al. (1994) Blood 84:1650-1655; Kutler DI, et al. (2003) Blood 101:1249-1256). При рождении показатели анализа крови у этих пациентов обычно находятся в норме. Первым гематологическим патологическим явлением, обнаруживаемым у этих пациентов, часто является макроцитоз. Он обычно развивается в виде тромбоцитопении, анемии и панцитопении. У этих пациентов в возрасте старше 5-10 лет обычно наблюдается недостаточность костного мозга (НКМ), причем средний возраст первых проявлений гематологического заболевания составляет 7 лет. Приблизительно у 80% пациентов с АФ развиваются признаки НКМ в течение первых десяти лет жизни. На основании эпидемиологических исследований, выполненных на данный момент, при отсутствии злокачественных эпизодов до аплазии практически у всех пациентов с АФ к возрасту 40 лет развивается НКМ (Butturini A, et al. (1994) Blood 84:1650-1655; Kutler DI, et al. (2003) Blood 101:1249-1256), что является ведущей причиной смертности среди этих пациентов. Из-за сложных клинических проявлений АФ лечение этих пациентов в основном сосредоточено на улучшении следующих клинических проявлений: недостаточности костного мозга (НКМ), миелоидного лейкоза и солидных опухолей.

[0006] Лечение АФ и других заболеваний основано на эффективном энграфтменте генетически модифицированных ГСК. Соответственно, в данной области техники существует потребность в способах получения популяций клеток, содержащих генно-модифицированные ГСК, позволяющие достигать высокого уровня энграфтмента у пациентов, в том числе пациентов с АФ. Настоящее изобретение более чем удовлетворяет эту потребность.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0007] Настоящее изобретение в целом относится к областям гематологических злокачественных новообразований и трансплантатов стволовых клеток и, в частности, к производству и применению популяций стволовых клеток, обогащенных CD34⁺-клетками, для применения в генной терапии, включая как доставку, так и репарацию генов. В частности, эти CD34-обогащенные популяции клеток можно применять в генной терапии для лечения млекопитающих и, в частности, заболеваний, нарушений и дисфункций человека, связанных с нарушением регуляции продукта гена группы комплементации A (FANCA), C (FANCC) или G (FANCG) анемии Фанкони. В некоторых вариантах реализации способы согласно настоящему изобретению выполняют ex vivo, а не в организме человека per se.

[0008] В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту комбинации (i) популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, полученной из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; и (ii) популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, полученной из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцируют рекомбинантным вектором для генной терапии, кодирующим полипептид FANC, включая функциональные варианты или фрагменты или природные белки FANC (например, FANCA или FANCC или FANCG), и первый биологический образец и второй биологический образец необязательно представляют собой один и тот же биологический образец, что обеспечивает лечение анемии Фанкони.

[0009] В одном варианте реализации указанный способ включает лечение анемии Фанкони у субъекта путем получения популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях в условиях высокой жесткости, получения еще одной популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях в условиях низкой жесткости, приведения одной или обеих популяций клеток, обогащенных по CD34, в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии, и последовательного или одновременного введения указанных двух популяций клеток, обогащенных по CD34, в организм субъекта, что обеспечивает лечение анемии Фанкони. В конкретных вариантах реализации популяция(и) клеток, контактировавших с вектором для генной терапии, в результате этого подвергаются трансдукции и, таким образом, содержат полинуклеотид, кодирующий терапевтическую нуклеиновую кислоту или полипептид для лечения анемии Фанкони. В одном варианте реализации рекомбинантный вектор для генной терапии содержит самоинактивированный лентивирусный вектор, кодирующий терапевтический сегмент гена или белок FANC (например, FANCA или FANCC или FANCG), например, вектор, описанный в международной патентной заявке№ PCT/US2017/050837. В одном варианте реализации рекомбинантный вектор для генной терапии сконфигурирован для репарации эндогенного гена FANC (например, FANCA или FANCC или FANCG), например, путем доставки системы CRISPR/Cas, содержащей белок Cas или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, нРНК или онРНК, и матрицу для репарации, содержащую ген FANC или фрагмент гена FANC, перекрывающий одну или более мутаций в эндогенном гене FANC.

[0010] В одном варианте реализации настоящего изобретения предложен способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, включающий: получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, приведение одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии анемии Фанкони; и введение субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии или трансдуцируют им, что обеспечивает лечение анемии Фанкони.

[0011] В одном аспекте настоящего изобретения первый биологический образец и второй биологический образец независимо друг от друга представляют собой образцы периферической крови или костного мозга. В одном аспекте первый биологический образец и второй биологический образец представляют собой образцы периферической крови, полученные после обработки субъекта гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГКСФ), плериксафором или комбинацией ГКСФ и плериксафора.

[0012] В одном варианте реализации любой из способов дополнительно включает отбор CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости, что может включать нанесение первого биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34⁺-клетки, одно-или многократную отмывку матрицы для захвата буфером для отмывки и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 20 мл/мин.

[0013] В одном варианте реализации любой из способов дополнительно включает отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, что может включать нанесение второго биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34⁺-клетки, обеспечение возможности протекания несвязанной фракции второго биологического образца через матрицу для захвата и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 20 мл/мин.

[0014] одном аспекте настоящего изобретения популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии. В некоторых вариантах реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, в два-четыре раза превышает процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости. В некоторых вариантах реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, превышает или приблизительно равно 60%, а процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, составляет менее 60% или 15-60% или находится между 15-30%. В одном варианте реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, превышает или приблизительно равно 70%, а процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, составляет 17,5-35%. В одном варианте реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, превышает или приблизительно равно 80%, а процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, составляет менее 40% или 20-40%. В одном варианте реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, превышает или приблизительно равно 90%, а процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, составляет менее 40% или 22,5-40%.

[0015] В одном варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный вектор для генной терапии анемии Фанкони содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую в порядке от 5' к 3': (a) последовательность промотора, активного у эукариот; и (b) последовательность, кодирующую ген или полипептид FANC человека, в том числе их функциональные фрагменты и варианты; причем последовательность, кодирующая ген или полипептид FANC человека или их функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с последовательностью промотора, активного у эукариот; и ген или полипептид FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG, например, нативного FANCA, FANCC и FANCG человека или их функциональных фрагментов или вариантов. В некоторых вариантах реализации функциональный фрагмент или функциональный вариант нативного белка FANC обладает биологической активностью, по сути аналогичной активности нативного белка FANC.

[0016] В варианте реализации настоящего изобретения рекомбинантный вектор для генной терапии анемии Фанкони содержит систему редактирования генов, способную выполнять направленную репарацию эндогенного гена FANC, причем система редактирования генов содержит: белок Cas или полинуклеотид, кодирующий белок Cas; нРНК; и матрицу для репарации, содержащую последовательность, содержащую ген FANC или его фрагмент, перекрывающий одну или более мутаций в эндогенном гене FANC; причем конфигурация онРНК обеспечивает направление репарационной матрицы к гену FANC; и ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG.

[0017] В одном варианте реализации способы отбора выполняют посредством магнитного отбора на основе гранул.

[0018] В одном варианте реализации способы, описанные в настоящем документе, дополнительно включают одно- или многократное выполнение афереза периферической крови.

[0019] В одном аспекте способы, описанные в настоящем документе, приводят к прогрессивному увеличению количества генно-модифицированных клеток анемии Фанкони с течением времени.

[0020] В одном аспекте способы лечения, описанные в настоящем документе, подавляют развитие, останавливают прогрессирование и/или вызывают обратное прогрессирование гематологического проявления анемии Фанкони у субъекта, например, без ограничения, одного или более из недостаточности костного мозга, тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии.

[0021] В одном аспекте способы, описанные в настоящем документе, приводят к восстановлению одного или более гемопоэтических линий, угнетенных у субъекта до введения субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, например, без ограничения, одного или более из лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов. В конкретных вариантах реализации указанные способы приводят к замедлению или уменьшению угнетения одного или более гемопоэтических линий или к стабилизации популяций одного или более гемопоэтических линий, например, одного или более из лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов.

[0022] В одном аспекте способ приводит к стабилизации или восстановлению одного или более гематологических параметров, пониженных у субъекта до введения субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, например, уровня гемоглобина.

[0023] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ получения генетически модифицированных клеток для лечения анемии Фанкони, включающий: получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости; и приведение одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии анемии Фанкони. В некоторых вариантах реализации популяция(и) клеток, приводимая)ые) в контакт с вектором для генной терапии, подвергаются трансдукции вектором для генной терапии, в результате чего популяции клеток, содержащие трансдуцированные клетки, содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтическую нуклеиновую кислоту или полипептид, например, полипептид FANC, который может представлять собой полипептид FANC дикого типа или нативный полипептид FANC или их функциональный фрагмент или вариант.

[0024] В одном аспекте отбор одной или обеих из популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости и низкой жесткости, выполняют с использованием антител или их функциональных фрагментов, специфично связывающихся с CD34. В одном аспекте отбор выполняют с использованием скорости потока 10-20 мл/мин.

[0025] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложена система, содержащая: популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, полученную из первого биологического образца путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, полученную из второго биологического образца путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии анемии Фанкони или трансдуцируют им. В некоторых вариантах реализации популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, присутствует в первой фармацевтической композиции, содержащей один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ, а популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, присутствует во второй фармацевтической композиции, включающей один или более из фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ. В некоторых вариантах реализации как популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, так и популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, присутствуют в одной и той же фармацевтической композиции, содержащей один или более из фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ. В некоторых вариантах реализации как популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости, так и популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцированы вектором для генной терапии для лечения анемии Фанкони. В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии и/или трансдуцированные клетки содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтическую нуклеиновую кислоту или полипептид, например, полипептид FANC, который может представлять собой полипептид FANC дикого типа или нативный полипептид FANC или их функциональный фрагмент или вариант.

[0026] В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая: CD34-обогащенную популяцию клеток высокой жесткости, полученную из первого биологического образца путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; CD34-обогащенную популяцию клеток низкой жесткости, полученную из второго биологического образца путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, причем одну или обе из CD34-обогащенной популяции клеток высокой жесткости или CD34-обогащенной популяции клеток низкой жесткости трансдуцируют рекомбинантным вектором для генной терапии. В конкретных вариантах реализации вектор для генной терапии представляет собой лентивирус. В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии кодирует терапевтический сегмент гена или белок FANC (например, FANCA или FANCC или FANCG) или их функциональный вариант или фрагмент. Фармацевтическая композиция может содержать один или более из фармацевтически приемлемых вспомогательных веществ, разбавителей или носителей.

[0027] Другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения и содержатся в них.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0028] На фигуре 1 показана карта типичного рекомбинантного плазмидного вектора для генной терапии pCCL-PGK-FANCAW-82-RO.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0029] Анемия Фанкони (АФ) создает серьезные проблемы для производства лекарственных средств. При АФ, как и при других вариантах применения генной терапии ex vivo, популяция клеток-мишеней переноса генов экспрессирует белок клеточной поверхности CD34. У пациентов с АФ при анализе CD34⁺-клеток с помощью проточной цитометрии доля CD34⁺-клеток в КМ ниже по сравнению со здоровыми лицами и составляет 0,1–1,5% по сравнению с 1–3%, соответственно. Пониженное абсолютное количество CD34⁺-клеток при производстве лекарственного средства из исходного материала мПК пациента с АФ не является удивительным, с учетом хорошо известного факта ограниченного количества CD34⁺-клеток у пациентов с АФ, которое снижается с возрастом. В то же время пониженный выход и чистота CD34⁺-клеток у пациентов с АФ являются поводом для беспокойства, поскольку они непосредственно влияют на потенциальную эффективность произведенного лекарственного средства.

[0030] При стандартном обогащении CD34⁺-клеток небольшой процент CD34⁺-клеток (по отношению к общему количеству клеток) связывается с иммуномагнитными гранулами; таким образом, колонка загружается сравнительно быстро (мл/мин) и промывки проводят в жестких условиях, поскольку основным целевым показателем является чистота. Авторы настоящего изобретения знают о проблеме, заключающиеся в том, что данный подход дает неоптимальные результаты и низкий выход CD34 при использовании мПК пациентов с АФ.

[0031] Для решения проблемы ограничений стандартного протокола обогащения CD34⁺-клеток для пациентов с АФ авторы настоящего изобретения разработали новые способы получения популяций CD34⁺-клеток у пациентов с АФ, приводящие к повышенному выходу и получению эффективного лекарственного средства. Эти способы включают получение двух популяций клеток, одну из которых отбирают при стандартных условиях обогащения CD34⁺-клеток (условиях «высокой жесткости»), а другую - при условиях «низкой жесткости». Одну или обе из этих популяций клеток трансдуцируют подходящим вектором для генной терапии и вводят пациенту с АФ. Как показано в настоящем документе, новый способ приводит к благоприятным терапевтическим эффектам. Безотносительно к теоретическим представлениям, считается, что повышенное количество CD34⁺-клеток или наличие других клеток или других факторов, присутствующих в препаратах клеток с низкой чистотой CD34⁺-клеток, вносит вклад в неожиданную эффективность композиций, полученных в соответствии со способами, описанными в настоящем документе.

[0032] Соответственно, в настоящем изобретении предложены системы и способы производства и применения стволовых клеток, подвергавшихся генной модификации или генной коррекции, для генной терапии. В частности, в настоящем документе предложены способы лечения заболевания или нарушения (например, анемии Фанкони), при которых стволовые клетки субъекта отбирают посредством комбинации отбора CD34⁺ в условиях высокой жесткости и отбора CD34⁺ в условиях низкой жесткости, трансдуцируют вектором, кодирующим терапевтический агент (например, белок FANC), и вводят субъекту. Неожиданно выяснилось, что лечение комбинацией CD34⁺-клеток, отобранных в условиях высокой жесткости, и CD34⁺-клеток, отобранных в условиях низкой жесткости, трансдуцированных терапевтическими векторами, характеризующейся пониженной чистотой CD34⁺-клеток по сравнению с обычными препаратами, полученными в условиях высокой жесткости, приводило к улучшенной терапевтической эффективности.

[0033] Если не указано иное, все технические и научные термины, использованные в настоящем документе, имеют значение, широко используемое специалистами в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при реализации настоящего изобретения можно использовать способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в настоящем документе, подходящие способы и материалы описаны в настоящем документе. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие литературные источники, упомянутые в настоящем документе, в явной форме полностью включены в настоящий документ посредством ссылки В случае конфликта преимущественную силу имеет данное описание, включая определения.. Кроме того, материалы, способы и примеры, описанные в настоящем документе, являются исключительно иллюстративными и не должны считаться ограничивающими.

[0034] В одном из аспектов предложены способы и системы производства популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости и/или низкой жесткости (например, посредством магнитного отбора на основе гранул с антителами или их функциональными фрагментами, специфично связывающимися с CD34) из биологических образцов; и применения указанных популяций клеток, обогащенных по CD34, при получении медикаментов, которые можно применять при адресной генной терапии заболеваний, нарушений и дисфункций у млекопитающего, и, в частности, у человека.

[0035] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложена схема трансплантации ГСК для лечения анемии Фанкони и нарушений, связанных с продуктом гена FANC, на основе введения популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой и низкой жесткости, причем любую или обе из популяций клеток, обогащенных по CD34, приводят в контакт с вектором для генной терапии (например, трансдуцируют лентивирусным вектором, несущим сегмент гена FANCA, FANCC или FANCG) или приводят в контакт с вектором для генной терапии, индуцирующим сайт-специфическую репарацию генов FANC (например, CRISP-Cas).

[0036] В некоторых вариантах реализации биологические образцы представляют собой периферическую кровь или костный мозг, полученные от субъекта, например, субъекта, подлежащего лечению. В некоторых вариантах реализации биологические образцы представляют собой периферическую кровь, полученную после обработки субъекта ГКСФ, плериксафором или комбинацией ГКСФ и плериксафора. В одном варианте реализации один или оба из биологических образцов получают, одно- или многократно выполняя аферез периферической крови. В настоящем описании эти способы совместно называют «мобилизованным лейкоферезом».

[0037] В некоторых вариантах реализации отбор CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости включает нанесение биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34⁺-клетки, одно-или многократную отмывку матрицы для захвата буфером для отмывки и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера. В некоторых случаях биологический образец одно- или многократно, например, 2, 3, 4, 5 или 6 раз повторно наносят на матрицу для захвата. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В конкретных вариантах реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 25-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 20 мл/мин. В некоторых вариантах реализации этап отмывки включает одно-или многократную отмывку матрицы для захвата буфером для промывки. В некоторых случаях объем буфера для промывки составляет по меньшей мере 100 мл, по меньшей мере 200 мл, по меньшей мере 300 мл, по меньшей мере 400 мл, по меньшей мере 500 мл или более. В одном варианте реализации этап отмывки выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап отмывки выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В некоторых вариантах реализации буфер для промывки представляет собой физиологический раствор с фосфатным буфером (ФСБ), необязательно содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и/или, необязательно, человеческий сывороточный альбумин в концентрации, например, приблизительно 2,5% (масс/об). В некоторых вариантах реализации буфер для элюирования представляет собой физиологический раствор с фосфатным буфером (ФСБ), необязательно содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и/или, необязательно, человеческий сывороточный альбумин в концентрации, например, приблизительно 2,5% (масс/об). В некоторых вариантах реализации буфер для промывки и буфер для элюирования являются гипотоничными.

[0038] В некоторых вариантах реализации отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости включает нанесение биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34⁺-клетки, обеспечение возможности протекания несвязанной фракции биологического образца через матрицу для захвата и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 1-2 мл/мин, 2-3 мл/мин, 1-2 мл/мин, 1-2 мл/мин, 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 25-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В некоторых вариантах реализации этап нанесения выполняют при скорости потока, составляющей приблизительно 10%, приблизительно 20%, приблизительно 30%, приблизительно 40%, приблизительно 50%, приблизительно 60%, приблизительно 70%, приблизительно 80%, приблизительно 90%, или более низкой по сравнению со скоростью потока при условиях высокой жесткости, например, при скорости потока, на по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% более низкой по сравнению со скоростью потока, используемой в условиях высокой жесткости. В некоторых вариантах реализации этап отмывки включает одно-или многократную отмывку матрицы для захвата буфером для промывки. В некоторых случаях объем буфера для промывки составляет 500 мл, 400 мл, 300 мл, 200 мл, 100 мл или менее, например, менее 500 мл, менее 400 мл, менее 300 мл, менее 200 мл или менее 100 мл. В некоторых случаях этап отмывки не выполняют. В одном варианте реализации этап отмывки выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап отмывки выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В некоторых вариантах реализации буфер для промывки представляет собой физиологический раствор с фосфатным буфером (ФСБ), необязательно содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и/или, необязательно, человеческий сывороточный альбумин в концентрации, например, приблизительно 2,5% (масс/об). В некоторых вариантах реализации буфер для элюирования представляет собой физиологический раствор с фосфатным буфером (ФСБ), необязательно содержащий этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) и/или, необязательно, человеческий сывороточный альбумин в концентрации, например, приблизительно 2,5% (масс/об). В некоторых вариантах реализации буфер для промывки и буфер для элюирования являются гипотоничными.

[0039] В некоторых вариантах реализации отбор выполняют посредством магнитного отбора на основе гранул. В одном варианте реализации антитела или их функциональные фрагменты, специфично связывающиеся с CD34, применяют для отбора, например, магнитного отбора на основе гранул. В некоторых случаях отбор выполняют с использованием скорости потока 10-20 мл/мин. В некоторых случаях скорость потока составляет 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 мл/мин или более, или равна любому значению между указанными величинами.

[0040] В различных вариантах реализации популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии, популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии; или как популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, так и популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии. В конкретных вариантах реализации вектор представляет собой вирус, липосому или липидную или липидоподобную наночастицу. В некоторых случаях вирус представляетсобой лентивирус, аденоассоциированный вирус, аденовирус или спумавирус.

[0041] В некоторых вариантах реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, в два-четыре раза превышает процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.

[0042] В различных вариантах реализации способов или систем в соответствии с настоящим изобретением рекомбинантный вектор для генной терапии содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую в порядке от 5'к 3': (a) последовательность промотора, активного у эукариот; и (b) последовательность, кодирующую полипептид гена FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант, причем последовательность, кодирующая полипептид гена FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с последовательностью промотора, активного у эукариот. В некоторых вариантах реализации ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG.

[0043] В одном варианте реализации способ подавляет развитие, останавливает прогрессирование и/или вызывает обратное прогрессирование гематологического проявления заболевания или нарушения (например, анемии Фанкони) у субъекта; причем гематологическое проявление анемии Фанкони необязательно выбрано из одного или более из недостаточности костного мозга (НКМ), тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии. В одном варианте реализации способ приводит к прогрессирующему увеличению количества генно-модифицированных клеток анемии Фанкони (или клеток субъекта, страдающего другим заболеванием или нарушением, например, миелопролиферативным нарушением или иммунодефицитным нарушением) с течением времени. В одном варианте реализации способ приводит к восстановлению одного или более гематологических параметров (например, уровня гемоглобина), угнетенных у субъекта до введения субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.

[0044] В одном варианте реализации способ приводит к восстановлению одного или более гемопоэтических линий, угнетенных у субъекта до введения субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости; причем указанный один или более из гемопоэтических линий может содержать одно или более из лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов. В некоторых случаях достигается восстановление специфических популяций клеток. Восстановление можно отслеживать различными способами, известными в данной области техники, например, проточной сортировкой клеток, цитометрией или микроскопией.

[0045] Кроме того, в настоящем изобретении предложены композиции и системы для применения в любом из вариантов реализации указанных способов. В настоящем изобретении предложены популяции клеток, обогащенные по CD34, для применения в составе медикамента, включая популяции клеток, обогащенные по CD34 и трансдуцированные вектором для генной терапии, например, вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок FANC человека или его функциональный вариант или фрагмент, но не ограничиваясь ими.

[0046] В настоящем документе термины «высокая жесткость» или «условия высокой жесткости» относятся к способу обогащения популяции клеток, которые должны привести к значительному обогащению клетками, экспрессирующими конкретный биологический маркер, например, CD34. Например, обогащение CD34 в условиях «высокой жесткости» при клиническом применении приводит к среднему: 61,6% и медианному: 65,7% выходу CD34⁺-клеток и к средней: 88,5% и медианной: 95,9% относительной чистоте (N=166) (Clin Lab. 2016 Jul 1;62(7):1243-1248 (PMID: 28164638)). «Высокая жесткость» относится к процессу, целью которого является значительное обогащение клетками сравнительно редкого типа, CD34⁺, которые обычно составляют 0,2-2% от клеточного продукта при мобилизованном лейкоферезе или сборе костного мозга. Целью обогащения продукта мобилизованного лейкофереза или сбора костного мозга CD34⁺-клетками в условиях высокой жесткости является увеличение конечного процентного содержания CD34⁺ с 0,2-2% до > 80%. Для этого после начального нанесения биологического образца на матрицу для захвата выполняют повторную замену буфера, в настоящем документе называемую «отмывкой», с целью удаления клеток, слабо или неспецифично связанных с матрицей для захвата. В общем случае клетки удаляют с матрицы для захвата и вновь наносят при каждом цикле отмывки. Удаление и повторное нанесение можно выполнять вручную с помощью пипетки из пробирок или автоматически с помощью насоса и системы трубок. Например, при использовании Quad Technologies MagCloudz®, сопряженного с системой магнитного разделения клеток Dynabeads®, комплексы клеток и магнитных частиц отделяют в пробирках на магнитном стенде, а отмывки выполняют вручную. При использовании системы Miltenyi Biotec CliniMACS® заранее установленная автоматизированная программа наносит комплексы клеток и магнитных частиц на магнитную колонку в наборе трубое, а отмывки/повторное нанесение выполняют с помощью системы клапанного насоса. В некоторых вариантах реализации отбор в условиях высокой жесткости можно выполнять на различных приборах, включая, без ограничений, Miltenyi Biotec MACSQuant Tyto®, Quad Technologies MagCloudz®, систему разделения клеток GE Sepax®, систему разделения клеток Terumo Elutra®, сепаратор клеток COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Fresenius-Kabi Lovo®, систему Miltenyi Biotec CliniMACS® или систему CliniMACS Prodigy®. Отбор можно выполнять в лаборатории или на месте ухода за пациентом. Подробные способы получения и обогащения клеток и популяций клеток, в том числе типичные способы отбора CD34⁺-клеток с использованием условий высокой жесткости, описаны, например, в международной патентной публикации № WO 2016/118780. Иллюстративный способ отбора, который можно применять для отбора в условиях высокой жесткости, предложен в патенте США № 8727132.

[0047] В протоколе обогащения в условиях высокой жесткости биологический образец, содержащий CD34⁺-клетки, метят CD34-метящим реагентом, например, непосредственно конъюгированными иммуномагнитными гранулами. Биологический образец можно суспендировать в любой подходящей жидкости, например, без ограничений, физиологическом растворе с фосфатным буфером (ФСБ), необязательно содержащем этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА), при рН и изотоничности буфера, совместимых с жизнеспособностью клеток. В некоторых случаях жидкость также содержит человеческий сывороточный альбумин в подходящей концентрации, например, приблизительно 2,5%. При использовании технологии сортировки магнитно-активированных клеток (MACS) биологический образец после мечения наносят на колонку, содержащую магнитно-чувствительный или ферромагнитный материал. При использовании системы MACS магнитно-чувствительный или ферромагнитный материал колонки удерживает клетки-мишени, не влияя на способность неспецифических клеток выходить из колонки с протоком. Такие магнитно-чувствительные или ферромагнитные материалы включают железо, сталь, кобальт, никель и другие ферромагнитные редкоземельные металлы или их сплавы. Специалистам в данной области техники следует принимать во внимание, что такие материалы могут легко намагничиваться и размагничиваться. В некоторых вариантах реализации биологический образец повторно пропускают через магнитно-чувствительный или ферромагнитный материал один или более раз. После загрузки колонки связанные клетки отмывают, элюируют и/или повторно наносят на колонку при медленной скорости для увеличения чистоты обогащенной фракции. Подходящие буферы для промывки включают ФСБ, содержащий (необязательно) ЭДТА и (необязательно) человеческий сывороточный альбумин. Компоненты меченого биологического образца, удаляемые на этапах отмывки, собирают в пакет для отходов или «неспецифических компонентов». После подходящих этапов отмывки клетки, обогащенные в условиях высокой жесткости, элюируют в пакет для клеток-мишеней.

[00048] В настоящем документе термины «низкая жесткость» или «условия низкой жесткости» относятся к способу обогащения популяции клеток, который должен приводить к обогащению клетками, экспрессирующими конкретный биологический маркер, например, CD34, сохраняя более высокий выход обогащенной популяции клеток по сравнению с выходом, достигаемым при отборе в условиях высокой жесткости, за счет обогащения клеток, экспрессирующих биологический маркер, по сравнению с другими клетками в биологическом образце, т.е., за счет ограниченного обогащения. Кратность обогащения в условиях высокой жесткости по определению выше, чем в условиях низкой жесткости. Кратность обогащения клеток, например, CD34⁺-клеток, в популяции клеток, обогащенных (по CD34 или другому маркеру) в условиях высокой жесткости, в некоторых случаях в 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75 или 4 раза превышает кратность обогащения CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенных (по CD34 или другому маркеру) в условиях низкой жесткости. В одном варианте реализации кратность обогащения клеток, например, CD34⁺-клеток, в популяции клеток, обогащенных (по CD34 или другому маркеру) в условиях высокой жесткости, в 2-4 раза превышает кратность обогащения CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенных (по CD34 или другому маркеру) в условиях низкой жесткости. В некоторых вариантах реализации отбор в условиях низкой жесткости можно выполнять на различных приборах, включая, без ограничений, Miltenyi Biotec MACSQuant Tyto®, Quad Technologies MagCloudz®, систему разделения клеток GE Sepax®, систему разделения клеток Terumo Elutra®, сепаратор клеток COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Fresenius-Kabi Lovo®, систему Miltenyi Biotec CliniMACS® или систему CliniMACS Prodigy®. Отбор можно выполнять в лаборатории или на месте ухода за пациентом.

[0049] В протоколе обогащения в условиях низкой жесткости биологический образец, содержащий CD34⁺-клетки, метят CD34-метящим реагентом, например, непосредственно конъюгированными иммуномагнитными гранулами. При использовании технологии сортировки магнитно-активированных клеток (MACS) биологический образец после мечения наносят на колонку, содержащую магнитно-чувствительный или ферромагнитный материал, при пониженной скорости потока по сравнению с условиями высокой жесткости. Как и при обогащении в условиях высокой жесткости, магнитно-чувствительный или ферромагнитный материал удерживает клетки-мишени, не влияя на способность неспецифических клеток выходить из колонки с протоком. В некоторых вариантах реализации биологический образец повторно пропускают через магнитно-чувствительный или ферромагнитный материал один или более раз. После загрузки колонки при обогащении в условиях низкой жесткости связанные клетки отмывают в условиях пониженной жесткости. Затем связанные клетки элюируют в пакет для сбора.

[0050] В типичном варианте реализации обогащение в условиях низкой жесткости выполняют путем модификации стандартной операционной процедуры системы MACS таким образом, что программа «режима истощения», предназначенная для достижения истощения, характерного для условий высокой жесткости (т.е. удаления клеток-мишеней), вместо этого обеспечивает обогащение в условиях низкой жесткости. Работа системы MACS в режиме истощения приводит к связыванию клеток-мишеней в биологическом образце с магнитно-чувствительным или ферромагнитным материалом в колонке при использовании медленной загрузки колонки и этапов отмывки пониженной жесткости по сравнению с работой в режиме обогащения. Неспецифические клетки вымываются из системы MACS в смыв или так называемый «целевой» пакет. Затем программа режима истощения переключает выходной клапан на перенаправление жидкости в так называемый «нецелевой» пакет, а затем размагничивает колонку. Непрерывная подача жидкости через размагниченную колонку приводит к элюированию популяции клеток, обогащенной по CD34⁺ в условиях низкой жесткости, в так называемый «нецелевой» пакет, в который при использовании этого способа собирают клетки-мишени.

[0051] Специалистам в данной области техники понятно, что данный способ обогащения в условиях низкой жесткости можно выполнять на различных приборах, включая, без ограничений, Miltenyi Biotec MACSQuant Tyto®, Quad Technologies MagCloudz®, систему разделения клеток GE Sepax®, систему разделения клеток Terumo Elutra®, сепаратор клеток COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Fresenius-Kabi Lovo®, систему Miltenyi Biotec CliniMACS® или систему CliniMACS Prodigy®. Специалисты в данной области техники могут без излишних экспериментов перепрограммировать программное обеспечение такой системы MACS таким образом, чтобы выходной клапан перенаправлял поток с исходного этапа связывания в пакет для отходов или «нецелевой» пакет (а не целевой пакет) и перенаправлял элюированную популяцию, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, в «целевой» пакет. Затем фактически выполняют обогащение в условиях низкой жесткости в режиме разделения без обычных этапов отмывки традиционных программ MACS.

[0052] «Вектор» в настоящем документе относится к макромолекуле или ассоциации макромолекул, содержащей или ассоциированной с полинуклеотидом, которую можно использовать для опосредования доставки полинуклеотида в клетку. Типичиные векторы включают, например, плазмиды, вирусные векторы (например, ретровирусные векторы, например, лентивирусные векторы), липосомы и другие носители для доставки генов.

[0053] Термин “LV” представляет собой сокращение от «лентивирус» и может использоваться для обозначения самого вируса или его производных. Этот термин охватывает все подтипы, а также как природные, так и рекомбинантные формы, если не предусмотрено обратное.

[0054] В настоящем документе термин «ген» или «кодирующая последовательность» относится к нуклеотидной последовательности in vitro или in vivo, кодирующей продукт гена. В некоторых случаях ген состоит или главным образом состоит из кодирующей последовательности, т.е. последовательности, кодирующей продукт гена. В других случаях ген содержит дополнительную, некодирующую последовательность. Например, ген может содержать или не содержать области перед кодирующей областью или после нее, например, 5'-нетранслируемые (5' UTR) или «лидерные» последовательности, и 3'-UTR, или «трейлерные» последовательности, а также промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

[0055] В настоящем документе термин «терапевтический ген» относится к гену, который при экспрессии придает благоприятный эффект клетке или ткани, в которой он присутствует, или млекопитающему, в организме которого экспрессируется указанный ген. Примеры благоприятных эффектов включают облегчение признака или симптома состояния или заболевания, предотвращение или подавление состояния или заболевания или придание желательной характеристики. Терапевтические гены включают гены, корректирующие генетический дефект в клетке или организме млекопитающего.

[0056] В настоящем документе трансген представляет собой ген, доставляемый в клетку вектором.

[0057] В настоящем документе термин «продукт гена» относится к желательному продукту экспрессии полинуклеотидной последовательности, например, полипептиду, пептиду, белку или интерферирующей РНК, включая малую интерферирующую РНК (миРНК), микроРНК или короткую шпилечную РНК (кшРНК). В некоторых вариантах реализации продукт гена представляет собой продукт терапевтического гена, который при экспрессии придает благоприятный эффект клетке или ткани, в которой он присутствует, или млекопитающему, в организме которого экспрессируется указанный ген.

[0058] В настоящем документе термины «полипептид», «пептид» и «белок» относятся к полимерам любой длины, состоящим из аминокислот. Эти термины также охватывают аминокислотный полимер, модифицированный, например, путем образования дисульфидной связи, гликозилирования, липидирования, ПЭГилирования, фосфорилирования или конъюгирования с метящим компонентом.

[0059] Под термином «содержащий» подразумевают, что указанные элементы являются необходимыми для, например, композиции, способа, набора и т.д., однако для формирования, например, композиции, способа, набора и т.п., охватываемых формулой изобретения, можно включать и другие элементы. Например, экспрессирующая кассета, «содержащая» ген, кодирующий терапевтический полипептид, функционально связанный с промотором, представляет собой экспрессирующую кассету, которая может включать другие элементы, кроме указанного гена и промотора, например, последовательность полиаденилирования, энхансерные элементы, другие гены, линкерные домены и т.д. Например, способ получения или лечения, «включающий» получение популяции клеток, обогащенной по CD34, представляет собой способ, который может включать другие этапы, кроме получения популяции клеток, обогащенной по CD34, например, введение агента для мобилизации стволовых клеток, введение терапевтического средства для индукции ремиссии или совместное введение лекарственного средства в виде комбинации.

[0060] Не следует считать, что термин «содержащий» или «содержит», используемый в настоящем документе по отношению к условиям низкой жесткости, допускает применение дополнительного отбора в условиях высокой жесткости к одному и тому же образцу на одном и том же этапе отбора. Следует понимать, что выполнение отбора как в условиях низкой жесткости, так и в условиях высокой жесткости приведет к отбору с высокой степенью жесткости, тогда как определение отбора в условиях низкой жесткости в настоящем документе явным образом исключает отбор в условиях высокой жесткости. Получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях с низкой жесткости, путем отбора клеток CD34⁺ в условиях низкой жесткости может включать другие этапы способа в неограничивающей форме, при условии, что между загрузкой биологического образца на колонку и элюированием с колонки популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, колонку не промывают в условиях высокой жесткости.

[0061] Под термином «состоящий по существу из» подразумевают ограничение сущности, например, состава, способа, набора и т.д., описываемого указанными материалами или этапами, которые не оказывают существенного влияния на основные и новые характеристики, например, композиции, способа, набора и т.д. Например, экспрессирующая кассета, «состоящая по существу из» гена, кодирующего терапевтический полипептид, функционально связанный с промотором, и последовательность полиаденилирования, может содержать дополнительные последовательности, например, линкерные последовательности, при условии, что они не оказывают существенного влияния на транскрипцию или трансляцию гена. В качестве еще одного примера вариантный или мутантный полипептидный фрагмент, «состоящий по существу из» указанной последовательности, содержит аминокислотную последовательность, представляющую собой указанную последовательность плюс-минус приблизительно 10 аминокислотных остатков на границах последовательности, основанной на полноразмерном наивном полипептиде, из которого она была получена, например, на 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1 остаток меньше указанного пограничного аминокислотного остатка, или на 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков больше указанного пограничного аминокислотного остатка.

[0062] Под термином «состоящий из» подразумевают исключение из композиции, способа или набора любого элемента, этапа или ингредиента, не указанных в формуле изобретения. Например, экспрессирующая кассета, «состоящая из» гена, кодирующего терапевтический полипептид, функционально связанного с промотором, и посттранскрипционного регуляторного элемента, состоит только из промотора, полинуклеотидной последовательности, кодирующей терапевтический полипептид, и посттранскрипционного регуляторного элемента. В качестве еще одного примера полипептид, «состоящий из» указанной последовательности, содержит только указанную последовательность.

[0063] В настоящем документе термины «клетки костного мозга» или «стволовые клетки костного мозга» относятся как к клеткам, полученным непосредственно из костного мозга, например, путем биопсии, так и к клеткам, полученным из периферической крови и возникшим в костном мозге, например, после мобилизации.

[0064] Термин «экспрессирующий вектор» в настоящем документе включает вектор, например, плазмиду, мини-кольцевую последовательность, вирусный вектор, липосому и т.п., обсуждавшийся выше или известный в данной области техники, содержащий полинуклеотид, кодирующий рассматриваемый продукт гена и используемый для воздействия на экспрессию продукта гена в заданной клетке-мишени. Экспрессирующий вектор также содержит регуляторные элементы, функционально связанные с кодирующей областью для облегчения экспрессии продукта гена в мишени. Комбинацию регуляторных элементов, например, промоторов, энхансеров, UTR, последовательностей, обеспечивающих адресное действие микроРНК и т.д., и гена или генов, с которыми они функционально связаны в целях экспрессии, иногда называют «экспрессирующей кассетой». Многие из таких регуляторных элементов известны и доступны в данной области техники или могут быть легко сконструированы из компонентов, доступных в данной области техники.

[0065] Термин «промотор» в настоящем документе охватывает последовательность ДНК, которая направляет связывание РНК-полимеразы и тем самым способствует синтезу РНК, т.е. минимальную последовательность, достаточную для управления транскрипцией. Промоторы и соответствующая экспрессия белка или полипептида могут быть универсальными, что означает сильную активность в широком диапазоне клеток, тканей и видов, или специфичными для типа клеток, ткани или вида. Промоторы могут быть «конститутивными», что означает постояную активность, или «индуцибельными», что означает, что промотор может активироваться или инактивироваться в присутствии или в отсутствие биотических или абиотических факторов. Нуклеотидные конструкты или векторы согласно настоящему изобретению также включают энхансерные последовательности, которые могут прилегать или не прилегать к последовательности промотора. Энхансерные последовательности влияют на промотор-зависимую экспрессию гена и могут располагаться в 5'- или 3'-областях нативного гена.

[0066] Термин «энхансер» в настоящем документе включает цис-действующий элемент, стимулирующий или ингибирующий транскрипцию соседних генов. Энхансер, ингибирующий транскрипцию, также называют «сайленсером». Энхансеры могут функционировать (т.е. могут быть ассоциированы с кодирующей последовательностью) в любой ориентации, на расстояниях до нескольких пар тысяч оснований (т.п.о.) от кодирующей последовательности и из положения после транскрибируемой области.

[0067] Термин «сигнальная последовательность терминации» в настоящем документе охватывает любой генетический элемент, вызывающий прекращение транскрипции РНК-полимеразой, например, сигнальную последовательность полиаденилирования.

[0068] Термин «функционально связанный» в настоящем документе относится к взаимной близости генетических элементов, например, промотора, энхансера, сигнальной последовательности терминации, последовательности полиаденилирования и т.д., причем взаимосвязь элементов позволяет им действовать ожидаемым образом. Например, промотор функционально связан с кодирующей областью, если промотор способствует инициации транскрипции или экспрессии кодирующей последовательности. Между промотором и кодирующей областью могут присутствовать промежуточные остатки, при условии сохранения этой функциональной взаимосвязи.

[0069] Термин «гетерологичный» в настоящем документе означает происхождение от объекта, генотипически отличного от остальной части объекта, с которым выполняется сравнение. Например, полинуклеотид, внедренный с помощью методик генной инженерии в плазмиду или вектор, происходящий от другого вида, является гетерологичным полинуклеотидом. В качестве другого примера промотор, удаленный из своей нативной кодирующей последовательности и функционально связанный с кодирующей последовательностью, с которой он не бывает связан в естественных условиях, является гетерологичным промотором. Таким образом, например, LV-вектор, содержащий гетерологичную нуклеиновую кислоту, кодирующую продукт гетерологичного гена, представляет собой LV-вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, обычно не присутствующую в природном LV дикого типа, а кодируемый продукт гетерологичного гена представляет собой продукт гена, обычно не кодируемый природным LV дикого типа.

[0070] Термин «эндогенный», используемый в настоящем документе по отношению к нуклеотидной молекуле или продукту гена, относится к нуклеотидной последовательности, например, гену или генетическому элементу, или продукту гена, например, РНК, белку, встречающимся в природе в вирусе или клетке-хозяине или ассоциированному с ними.

[0071] Термин «нативный» в настоящем документе относится к нуклеотидной последовательности, например, гену, или продукту гена, например, РНК, белку, присутствующему в вирусе или клетке дикого типа. Термин «вариант» в настоящем документе относится к мутанту или варианту эталонной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, например, нативной полинуклеотидной или полипептидной последовательности, т.е. характеризующемуся менее чем 100% идентичностью эталонной полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Другими словами, вариант содержит различие по меньшей мере по одной аминокислоте (например, аминокислотную замену, аминокислотную вставку, аминокислотную делецию) от эталонной полинуклеотидной последовательности, например, нативной полинуклеотидной или полипептидной последовательности. Например, вариант может представлять собой полинуклеотид, характеризующийся 70% или большей идентичностью полноразмерной нативной полинуклеотидной последовательности, например, 75% или 80% или большей идентичностью, например, 85%, 90% или 95% или большей, например, 98% или 99% идентичностью полноразмерной нативной полинуклеотидной последовательности. В качестве еще одного примера, вариант может представлять собой полипептид, характеризующийся 70% или большей идентичностью полноразмерной нативной полипептидной последовательности, например, 75% или 80% или большей идентичностью, например, 85%, 90% или 95% или большей, например, 98% или 99% идентичностью полноразмерной нативной полипептидной последовательности. Варианты также могут включать вариантные фрагменты эталонной, например, нативной последовательности, характеризующиеся 70% или большей идентичностью последовательности фрагменту эталонной, например, нативной последовательности, например, 75% или 80% или большей идентичностью, например, 85%, 90% или 95% или большей, например, 98% или 99% идентичностью нативной последовательности.

[0072] В настоящем документе термины «биологическая активность» и «биологически активный» относятся к активности, приписываемой конкретному биологическому элементу в клетке. Например, «биологическая активность» «иммуноглобулина», «антитела» или их фрагмента или варианта относится к способности связывать антигенную детерминанту и тем самым способствовать иммунологической функции. В качестве еще одного примера, биологическая активность полипептида или его функционального фрагмента или варианта относится к способности полипептида или его функционального фрагмента или его варианта выполнять свои нативные функции, например, связывание, ферментативную активность и т.д. В качестве третьего примера, биологическая активность регуляторного элемента гена, например, промотора, энхансера, последовательности Козака и т.п., относится к способности регуляторного элемента или его функционального фрагмента или варианта регулировать, т.е. стимулировать, усиливать или активировать трансляцию и, соответственно, экспрессию гена, с которым он функционально связан.

[0073] Термины «введение» или «внедрение» в настоящем документе относятся к доставке популяции клеток в организм субъекта, например, путем внутриартериального или внутривенного переливания популяции клеток в кровь субъекта. Популяцию клеток можно вводить в различных растворах, например, физиологическом растворе. В некоторых вариантах реализации используемый раствор является изотоничным по отношению к крови субъекта и забуференным.

[0074] Термин «трансформация» обычно используют для обозначения процесса введения гетерологичной ДНК в бактерию или другую клетку, или в клетки, экспрессирующие онкоген и поэтому перешедшие в режим непрерывного роста, например, опухолевые клетки. Вектор, используемый для «трансформации» клетки, может представлять собой плазмиду, вирус или другой носитель.

[0075] Обычно клетку называют «трансдуцированной», «инфицированной»; «трансфицированный» или «трансформированной» в зависимости от средств, используемых для введения, внедрения или вставки гетерологичной ДНК (т.е. вектора) в клетку. Термины «трансдуцированный», «трансфицированный» и «трансформированный» могут использоваться в настоящем документе взаимозаменяемо, независимо от способа введения гетерологичной ДНК.

[0076] Термин «клетка-хозяин» в настоящем документе относится к клетке, трансдуцированной, инфицированной, трансфицированной или трансформированной вектором. Вектор может представлять собой плазмиду, вирусную частицу, фаг и т.д. Условия культивирования, например, температура, pH и т.п., являются условиями, которые ранее использовались с клеткой-хозяином, выбранной для экспрессии, и очевидны для специалистов в данной области техники. Следует принимать во внимание, что термин «клетка-хозяин» относится к исходной трансдуцированной, инфицированной, трансфицированной или трансформированной клетке и ее потомству.

[0077] Термины «лечение», «обработка» и т.п. используются в настоящем документе для общего обозначения получения желательного фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения заболевания или его симптома, например, снижения вероятности возникновения заболевания или его симптома у субъекта, и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения от заболевания и/или нежелательного эффекта, связанного с заболеванием, или замедления прогрессирования заболевания. «Лечение» в настоящем документе охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего и включает: (а) предотвращение возникновения заболевания у субъекта, который может быть предрасположен к заболеванию, но которому еще не поставлен диагноз этого заболевания; (b) подавление заболевания, т.е. остановку его развития; или (c) облегчение заболевания, т.е. стимуляцию регресса заболевания. Терапевтический агент можно вводить до, во время или после начала заболевания или травмы. Особый интерес представляет лечение продолжающегося заболевания, при котором лечение стабилизирует или уменьшает нежелательные клинические симптомы у пациента. Такое лечение желательно выполнять до полной потери функции пораженных тканей. Терапию у субъекта можно выполнять во время симптоматической стадии заболевания, а в некоторых случаях после симптоматической стадии заболевания. В некоторых вариантах реализации субъекту вводят терапевтическое средство после генетического теста, выявившего у субъекта мутацию, ассоциированную с заболеванием или являющуюся причиной этого заболевания, например, АФ.

[0078] Термины «индивид», «хозяин», «субъект» и «пациент» используются в настоящем документе взаимозаменяемо и относятся к млекопитающему, включая человека и приматов, не являющихся человеком, в том числе обезьян и людей; млекопитающих, используемых в спортивных целях (например, лошадей); сельскохозяйственных животных-млекопитающих (например, овец, коз и т. Д.); домашних животных-млекопитающих (собак, кошек и т.д.); и грызунов (например, мышей, крыс и т.д.), но не ограничиваясь ими.

[0079] Термин «фрагмент» в настоящем документе применительно к полипептиду обычно представляет собой полипептид длиной по меньшей мере 10 аминокислотных остатков, чаще по меньшей мере 20 остатков и предпочтительно по меньшей мере 30 (например, 50) остатков, однако меньший, чем полная, интактная последовательность. Фрагменты можно получать способами, известными специалистам в данной области техники, например, путем ферментативного расщепления природного или рекомбинантного белка, методиками рекомбинантных ДНК с использованием экспрессирующего вектора, кодирующего определенный фрагмент, или путем химического синтеза. Способность фрагмента-кандидата связываться с конкретной последовательностью ДНК можно оценить способами, описанными в настоящем документе. Очищенные фрагменты или антигенные фрагменты можно применять для выделения регуляторных областей или для создания новых регуляторных ферментов (например, с использованием множества функциональных фрагментов из различных ферментов), а также для создания антител, причем все эти варианты применения осуществляют с использованием стандартных протоколов, известных специалистам в данной области техники. В настоящем документе термин «функциональный фрагмент» означает не только пептидные фрагменты, сохраняющие биологическую активность, но и пептидные фрагменты, сохраняющие специфичность связывания с конкретной нуклеотидной последовательностью.

[0080] «Функциональный фрагмент» антитела против CD34 представляет собой фрагмент, способный связываться с молекулами CD34 на поверхности клеток с достаточным сродством и специфичностью для обеспечения селекции или обогащения по CD34⁺-клеткам.

[0081] Термины "идентичный" или процент идентичности," в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидов относятся к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, являющимися одинаковыми или содержащими определенный процент одинаковых нуклеотидов или аминокислотных остатков при сравнении и выравнивании для максимального соответствия. Для определения процента идентичности последовательности выравнивают с целью оптимального сравнения (например, в первую аминокислотную или нуклеотидную последовательность можно ввести пробелы для оптимального выравнивания со второй аминокислотной или нуклеотидной последовательностью). Затем выполняют сравнение аминокислотных остатков или нуклеотидов в соответствующих положениях. Если положение в первой последовательности занято тем же аминокислотным остатком или нуклеотидом, что и соответствующее положение во второй последовательности, то молекулы идентичны по этому положению. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией количества идентичных положений, общих для этих последовательностей (т.е. % идентичности = количество идентичных положений/общее количество положений (например, перекрывающихся положений) × 100). В некоторых вариантах реализации две последовательности имеют одинаковую длину.

[0082] Типичной компьютерной программой для выполнения оптимального выравнивания с учетом штрафов за пробелы является пакет GCG Wisconsin Bestfit (Университет Висконсина, США; Devereux et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12: 387). Примеры другого программного обеспечения, которое может выполнять сравнение последовательностей, включают, в числе прочего, пакет BLAST (см. Ausubel et al. (1999) ibid – Ch. 18), FASTA (Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410), набор инструментов сравнения GENEWORKS, можно использовать программу GCG Bestfit и BLAST 2 Sequences (см. FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; FEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8). Можно использовать масштабируемую матрицу оценок сходства, которая присваивает оценки каждому попарному сравнению на основе химического сходства или эволюционного расстояния. Примером такой матрицы является матрица BLOSUM62 - матрица по умолчанию для набора программ BLAST. Программы GCG Wisconsin могут использовать либо общедоступные значения по умолчанию, либо настраиваемую таблицу сравнения символов, при наличии таковой (дополнительные сведения см. в руководстве пользователя).

[0083] Термин «практически идентичный» в контексте двух нуклеиновых кислот или полипептидов относится к двум или более последовательностям или подпоследовательностям, характеризующимся по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94 %, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% идентичностью или по меньшей мере 99% идентичностью (например, согласно определению с использованием одного из способов, изложенных ниже).

[0084] Если контекст не указывает на иное, «вариант» представляет собой полипептид или его фрагмент, содержащий одну или более неконсервативных или консервативных аминокислотных замен по сравнению со вторым полипептидом (также называемым «производным»); или полипептид или его фрагмент, модифицированный путем ковалентного присоединения второй молекулы, например, присоединения гетерологичного полипептида или гликозилирования, ацетилирования, фосфорилирования и т.п. Определение «вариант» дополнительно включает, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот (например, неприродных аминокислот и т.п.), полипептиды с незамещенными связями, а также другие модификации, известные в данной области техники, как природного, так и неприродного происхождения.

[0085] Ниже описаны различные композиции и способы согласно настоящему изобретению. Хотя в настоящем документе приведены примеры конкретных композиций и способов, следует понимать, что при практической реализации изобретения применимы и подходят любые альтернативные композиции и способы. Кроме того, следует понимать, что оценку экспрессирующих конструктов и способов согласно настоящему изобретению можно выполнить с использованием процедур, стандартных в данной области техники.

[0086] При реализации настоящего изобретения используют, если не указано иное, обычные методики клеточной биологии, молекулярной биологии (включая рекомбинантные методики), микробиологии, биохимии и иммунологии, находящиеся в пределах компетенции специалистов в данной области техники. Такие способы полностью описаны в литературе, например, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook et al., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology” (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds.); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J. M. Miller & M. P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F. M. Ausubel et al., eds., 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis et al., eds., 1994); and “Current Protocols in Immunology” (J.E. Coligan et al., eds., 1991), каждая из которых явным образом включена в настоящий документ посредством ссылки.

[0087] Некоторые аспекты настоящего изобретения описаны ниже со ссылкой на примеры приложений для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, взаимосвязи и способы изложены для обеспечения полного понимания изобретения. Однако специалист в соответствующей области техники легко поймет, что изобретение можно реализовать без одной или более указанных конкретных деталей или с помощью других способов. Настоящее изобретение не ограничивается проиллюстрированным порядком действий или событий, поскольку некоторые действия могут происходить в другом порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события требуются для реализации методологии в соответствии с настоящим изобретением.

[0088] Терминология, используемая в настоящем документе, предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для ограничения изобретения. Используемые в настоящем документе формы единственного числа также подразумевают включение форм множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Кроме того, в той степени, в которой термины «включающий», «включает», «имеющий», «имеет», «с» или их варианты используются в подробном описании и/или формуле изобретения, подразумевается, что такие термины являются включительными, аналогично термину «содержащий».

[0089] Термин «примерно» или «приблизительно» означает нахождение в пределах приемлемого диапазона ошибки для конкретного значения, определенного специалистом в данной области техники, которое зависит, в частности, от способа измерения или определения значения, т.е. ограничений измерительной системы. Например, «примерно» может означать в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения в соответствии с практикой в данной области техники. В качестве альтернативы, «приблизительно» может означать диапазон до 20%, предпочтительно - до 10%, более предпочтительно - до 5%, и еще более предпочтительно - до 1% от заданного значения. В качестве альтернативы, в частности, в отношении биологических систем или процессов, данный термин может означать «в пределах порядка величины», предпочтительно в пределах 5-кратного, и более предпочтительно - в пределах 2-кратного значения. Если конкретные значения описаны в заявке и формуле изобретения, если не указано иное, следует использовать термин «приблизительно», означающий нахождение в пределах допустимого диапазона ошибок для конкретного значения.

[0090] Все публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Подразумевается, что настоящее описание заменяет любое описание включенной публикации в той степени, в которой существует противоречие.

[0091] Кроме того, следует отметить, что формулу изобретения можно составить, исключая из нее любой необязательный элемент. По существу, подразумевают, что это положение служит первоначальной основой использования такой исключающей терминологии, как «исключительно», «только» и т.п. в связи с повторным упоминанием элементов формулы изобретения, или использования "негативного" ограничения.

[0092] Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, приведены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

[0093] Если не указано иное, все термины, используемые в настоящем документе, имеют то же значение, что и для специалиста в данной области техники, и при реализации настоящего изобретения используют обычные способы микробиологии и технологии рекомбинантных ДНК, известные специалистам в данной области техники.

Способы получения, трансдукции и применения популяций клеток, обогащенных по CD34⁺

[0094] В одном из аспектов настоящего изобретения предложены способы получения популяций клеток, обогащенных по CD34⁺-клетками, включая генетически модифицированные CD34⁺-клетки. В некоторых вариантах реализации указанные способы включают получение двух популяций клеток, обогащенных по CD34, одну из которых получают в условиях низкой жесткости, а другую получают в условиях высокой жесткости. Как показано в настоящем документе, применение комбинации популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, и популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, успешно приводит к неожиданно эффективному восстановлению стволовых CD34⁺-клеток у субъекта.

[0095] В еще одном аспекте настоящего изобретения предложены способы лечения субъекта, страдающего заболеванием или нарушением, путем введения субъекту терапевтически эффективного количества одной или более популяций клеток, обогащенных по CD34⁺-клетками, включая генно-модифицированные CD34⁺-клетки, причем генно-модифицированные CD34⁺-клетки кодируют терапевтическое средство, эффективное при лечении указанного заболевания или нарушения. В конкретных вариантах реализации терапевтический агент представляет собой полипептид или полинуклеотид, например, РНК. В конкретных вариантах реализации популяции клеток, обогащенные по CD34, получают из CD34-клеток, полученных от субъекта, подвергаемого лечению.

[0096] В некоторых вариантах реализации способов, описанные в настоящем документе, получают две популяции клеток, обогащенные по CD34⁺-клетками, включая популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости. Эти две популяции клеток можно хранить по отдельности или объединять для получения смешанной популяции клеток, включающей как клетки, обогащенные по CD34 в условиях высокой жесткости, так и клетки, обогащенные по CD34 в условиях низкой жесткости. В конкретных вариантах реализации одну или обе из указанных двух популяций клеток трансдуцируют вектором для генной терапии, например, LV-вектором, кодирующим FANCA или его функциональный фрагмент, или вариант.

[0097] В конкретных вариантах реализации клетки могут быть получены от млекопитающего любого вида, например, от грызунов (например, мышей, крыс, песчанок, белок), кролика, кошки, собаки, козы, овцы, свиньи, лошади, крупного рогатого скота, приматов, человека. В некоторых вариантах реализации клетки могут быть получены из установленных линий клеток или могут являться первичными клетками, причем термины «первичные клетки», «первичные линии клеток» и «первичные культуры» используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения клеток и культур клеток, полученных от субъекта и способных расти in vitro в течение ограниченного количества пересевов культуры, т. е. делений. Например, первичные культуры представляют собой культуры, которыемогли подвергаться пересеву 0 раз, 1 раз, 2 раза, 4 раза, 5 раз, 10 раз или 15 раз, но недостаточное количество раз для прохождения через стадию кризиса. Обычно первичные линии клеток согласно настоящему изобретению поддерживают в течение менее чем 10 пересевов in vitro.

[0098] В некоторых вариантах реализации способы включают получение популяций клеток, обогащенных по CD34, из биологического образца, полученного от субъекта. В одном варианте реализации биологический образец представляет собой образец костного мозга. В еще одном варианте реализации биологический образец представляет собой периферическую кровь.

[0099] В конкретных вариантах реализации биологический образец, например, периферическую кровь, получают от субъекта после мобилизации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК). В одном варианте реализации ГСК и/или клети-предшественники мобилизуют, обрабатывая субъекта ГКСФ или его аналогом, например, в количестве и в течение времени, достаточного для того, чтобы вызвать мобилизацию ГСК у пациента. ГСК и клетки-предшественники (ГСКП) в периферической крови можно мобилизовать перед отбором биологического образца. ГСК и ГСКП периферической крови можно мобилизовать любым способом, известным в данной области техники. ГСК и ГСКП периферической крови можно мобилизовать, обрабатывая субъекта любым(и) агентом(ами), описанными в настоящем документе или известными в данной области техники, которые увеличивают количество ГСК и/или ГСКП, циркулирующих в периферической крови субъекта. Подразумевается, что в настоящем документе упоминания ГСК и ГСКП охватывают как ГСК, так и ГСКП, если не указано иное. Например, в конкретных вариантах реализации периферическую кровь мобилизуют, обрабатывая субъекта одним или более из цитокинов или факторов роста (например, ГКСФ, лигандом KIT (KL), ИЛ-1, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11, лигандом Flt3, SCF, тромбопоэтином или ГМКСФ (например, сарграмостимом)). Различные виды ГКСФ, которые можно использовать в способах мобилизации периферической крови, включают филграстим и ГКСФ продленного действия - пэгфилграстим. В конкретных вариантах реализации периферическую кровь мобилизуют путем обработки субъекта одним или более хемокинами (например, воспалительным белком макрофагов-1a (MIP1a/CCL3)), лигандами рецепторов хемокинов (например, лигандами рецептора-2 хемокинов GROl3 и GR013M), аналогами рецепторов хемокинов (например, аналогами белка фактора-1a, продуцируемого стромальными клетками (SDF- 1a), например, CTCE-0021, CTCE-0214 или SDF-1a, например, Met-SDF-113), или антагонистами рецепторов хемокинов (например, антагонистами рецептора-4 хемокинов (с C-X-C-мотивом) (CXCR4), например, AMD3100). В конкретных вариантах реализации периферическую кровь мобилизую путем обработки субъекта одним или более из антител против сигнальных агентов-интегринов (например, антителом, блокирующим функции очень позднего антигена 4 (VLA-4), или антителом против молекулы адгезии клеток сосудов 1 (VCAM-1)). В конкретных вариантах реализации периферическую кровь мобилизуют путем обработки субъекта одним или более цитотоксическими лекарственными средствами, например, циклофосфамидом, этопозидом или паклитакселом. В конкретных вариантах реализации периферическую кровь можно мобилизовать путем введения субъекту одного или более агентов, перечисленных выше, в течение определенного периода времени. Например, субъекта можно обработать одним или более агентами (например, ГКСФ) посредством инъекции (например, подкожной, внутривенной или внутрибрюшинной) один раз в день или два раза в день в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 или 14 дней до сбора ГКСП. В конкретных вариантах реализации ГКСП собирают в течение 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 14, 16, 18, 20 или 24 часов после введения последней дозы агента, используемого для мобилизации ГКСП в периферической крови. В конкретных вариантах реализации ГКС и ГКСП мобилизуют путем обработки субъекта двумя или более агентами различного типа, описанными выше или известными в данной области техники, например, фактором роста (например, ГКСФ) и антагонистом рецептора хемокина (например, антагонистом рецептора CXCR4, например, AMD3100), или фактором роста (например, ГКСФ или KL) и антителом против агента-интегрина (например, антителом, блокирующим функцию VLA-4). В одном варианте реализации ГСК и/или клетки-предшественники мобилизуют путем обработки субъекта ГКСФ или его аналогом. В одном варианте реализации ГКСФ представляет собой филграстим. В одном варианте реализации ГСК и/или клетки-предшественники мобилизуют путем обработки субъекта плериксафором. В определенном варианте реализации ГСК и/или клетки-предшественники мобилизуют с использованием комбинации филграстима и плериксафора, только филграстима или только плериксафора. В конкретных вариантах реализации различные типы мобилизующих агентов вводят одновременно или последовательно. Дополнительную информацию относительно способов мобилизации периферической крови см., например, в статьях Craddock et al., 1997, Blood 90(12):4779-4788; Jin et al., 2008, Journal of Translational Medicine 6:39; Pelus, 2008, Curr. Opin. Hematol. 15(4):285-292; Papayannopoulou et al., 1998, Blood 91(7):2231-2239; Tricot et al., 2008, Haematologica 93(11):1739-1742; и Weaver et al., 2001, Bone Marrow Transplantation 27(2):S23-S29).

[00100] В некоторых вариантах реализации периферическую кровь получают через шприц или катетер, введенный в вену субъекта. Например, периферическую кровь можно собирать с помощью аппарата для афереза. Кровь течет из вены через катетер в аппарат для афереза, который отделяет лейкоциты, включая ГСКП, от остальной крови, а затем возвращает остальную кровь в тело пациента. Аферез можно выполнять в течение нескольких дней (например, от 1 до 5 дней), пока не будет собрано достаточное количество ГСКП.

[00101] В некоторых вариантах реализации костный мозг получают из заднего гребня подвздошной кости субъекта путем пункционной аспирации (см., например, Koda et al., 1984, J. Clin Invest. 73:1377-1384).

[00102] В некоторых вариантах реализации можно определить уровень гематокрита в биологическом образце. Уровень гематокрита можно определить путем центрифугирования образца в камере для обработки с целью выделения эритроцитов в образце в отдельный слой, что обеспечивает возможность определения объема осажденных клеток. Следует понимать, что в качестве вспомогательной меры при определении уровня гематокрита можно объединить образец с антикоагулянтом, и что такой антикоагулянт можно добавлять в камеру для обработки до или во время центрифугирования. В качестве альтернативы, уровень гематокрита можно определить путем измерения оптических свойств образца. Например, для анализа образца можно использовать спектрометр. Следует понимать, что можно использовать известные спектроскопические способы определения уровня гематокрита любого типа, например, рамановскую спектроскопию и/или методики светорассеяния.

[00103] В некоторых вариантах реализации из биологического образца удаляют эритроциты, например, перед получением одной или более популяций клеток, обогащенных CD34⁺-клетками, из биологического образца. В некоторых вариантах реализации клетки, оставшиеся после выполнения методики удаления, промывают. В еще одном варианте реализации к отмытым клеткам добавляют неспецифический IgG. В некоторых вариантах реализации неспецифический IgG представляет собой флебогамму.

[00104] Две популяции клеток, обогащенные CD34⁺-клетками, можно получить путем отбора популяции клеток по CD34⁺-клетками в условиях высокой жесткости и отбора еще одной популяции клеток по CD34⁺-клеткам в условиях низкой жесткости, тем самым получая две популяции клеток, одна из которых представляет собой популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, а другая - популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости. Способы, используемые для отбора CD34⁺-клеток, могут представлять собой положительный отбор, отрицательный отбор или их комбинацию. В некоторых вариантах реализации биологический образец, полученный от субъекта, делят на два образца, причем один образец используют для получения популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, а другой образец используют для получения популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости.

[00105] В других вариантах реализации биологический образец, полученный от субъекта, сначала подвергают отбору по CD34⁺ в условиях низкой жесткости для получения популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, а затем часть популяции, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, подвергают отбору CD34⁺ в условиях высокой жесткости для получения популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости. Отбор можно применять последовательно, например, отбор клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, можно применять первым, а затем выполнить дальнейший отбор из полученной популяции по обогащенным CD34-клеткам, в условиях высокой жесткости.

[00106] В других случаях сначала можно применить отбор по обогащенным CD34-клеткам в условиях высокой жесткости, а затем отбор по обогащенным CD34-клеткам из остаточной популяции в условиях низкой жесткости. В некоторых случаях популяции клеток можно разделять таким образом, что отбор в условиях низкой или высокой жесткости применяют к части клеток, ранее подвергнутых отбору в условиях низкой или высокой жесткости. В некоторых случаях один биологический образец разделяют на два или более образцов перед отбором по обогащенным CD34-клеткам в условиях низкой или высокой жесткости.

[00107] В некоторых случаях два или более биологических образца смешивают вместе перед отбором, включая, например, образцы мобилизованного костного мозга, полученные в разное время, например, с интервалом в 1, 2, 3, 4 или более дней или с интервалом в 1, 2 или 3 недели, или с интервалом в 1, 2 или 3 месяца, или с интервалом в несколько лет, включая другие временные интервалы. В некоторых случаях смешивают биологические образцы от разных субъектов, например, аутологичный биологический образец и образец от аллогенного донора. В каждом случае предполагается отбор с высокой или низкой строгостью до или после смешивания или разделения биологических образцов или обогащенных популяций клеток во всех возможных перестановках. В некоторых вариантах реализации способ включает получение популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; и получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости.

[00108] В некоторых вариантах реализации процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, в 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4 раза, или, в некоторых случаях, в 5, 6, 7 или 8 раз превышает процентное содержание CD34⁺-клеток в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости.

[00109] Описанными способами можно достичь различных выходов и чистоты CD34+-клеток. В некоторых случаях отбор CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, с выходом CD34⁺-клеток, составляющим по меньшей мере приблизительно 10%, 20%, 30%, 40%, 50%. 60%, 70%, 80% или более по сравнению с исходным биологическим образцом, или равным любому значению между ними; и/или с чистотой, составляющей по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более от общего количества клеток в обогащенном образце, или равной любому значению между ними. В некоторых случаях отбор CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, с выходом CD34⁺-клеток, составляющим приблизительно от 10 до 20%, от 20 до 30% или от 30 до 40% по сравнению с исходным биологическим образцом, или равным любому значению между ними; и/или с чистотой, составляющей по меньшей мере приблизительно 20%, 30%, 40%, 50% от общего количества клеток в обогащенном образце, или равной любому значению между ними. В конкретных вариантах реализации отбор CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, с выходом CD34⁺-клеток, составляющим по меньшей мере приблизительно 20% по сравнению с исходным биологическим образцом, и/или с чистотой, составляющей по меньшей мере приблизительно 20% или по меньшей мере приблизительно > 30% от общего количества клеток в обогащенном образце.

[00110] В некоторых случаях отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, с выходом CD34⁺-клеток, составляющим по меньшей мере приблизительно 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% или более по сравнению с исходным биологическим образцом, или равным любому значению между ними; и с чистотой, составляющей по меньшей мере приблизительно 5%, 10%, 15%, 25%, 40%, 50% или более от общего количества клеток в обогащенном образце, или равной любому значению между ними. В некоторых случаях отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, с выходом CD34⁺-клеток, составляющим более 30%, приблизительно от 30 до 40%, от 40 до 50% или от 50 до 60% по сравнению с исходным биологическим образцом, или равным любому значению между ними; или с чистотой, составляющей по меньшей мере приблизительно 3%, 5%, 8%, 10%, от общего количества клеток в обогащенном образце, или равной любому значению между ними. В конкретных вариантах реализации отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, с выходом CD34⁺-клеток, составляющим более 35% по сравнению с исходным биологическим образцом, и/или с чистотой, составляющей менее 30%, менее 25%, менее 20%, менее 10% или менее 5% от общего количества клеток в обогащенном образце. В конкретных вариантах реализации отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости приводит к получению популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, с чистотой 1-30%, 1-20%, 1-10%, 10-30%, 10-20% или 20-30% от общего количества клеток в обогащенном образце. В некоторых вариантах реализации популяции клеток, обогащенные по CD34 в условиях низкой жесткости, дополнительно содержат по меньшей мере нейтрофилы и В-клетки.

[00111] В конкретных вариантах реализации отбор в условиях высокой и низкой жесткости выполняют путем положительного отбора, например, с использованием агента, связывающего CD34⁺-клетки. В конкретных вариантах реализации указанный агент находится в растворе, тогда как в других вариантах реализации указанный агент прикреплен к твердой поверхности. В некоторых вариантах реализации указанный агент связан с поверхностью магнитной гранулы. В некоторых вариантах реализации указанный агент представляет собой антитело против CD34 или его функциональный фрагмент.

[00112] В некоторых вариантах реализации отбор в условиях высокой жесткости и/или в условиях низкой жесткости можно выполнять на различных приборах, включая, без ограничений, Miltenyi Biotec MACSQuant Tyto®, Quad Technologies MagCloudz®, систему разделения клеток GE Sepax®, систему разделения клеток Terumo Elutra®, сепаратор клеток COBE Spectra®, системы SynGen LAB® или WASH®, Fresenius-Kabi Lovo®, систему Miltenyi Biotec CliniMACS® или систему CliniMACS Prodigy®. Отбор можно выполнять в лаборатории или на месте ухода за пациентом. Подробные способы получения и обогащения клеток и популяций клеток, в том числе типичные способы отбора CD34⁺-клеток с использованием условий высокой жесткости, описаны, например, в международной патентной публикации № WO 2016/118790. Иллюстративный способ отбора, который можно применять для отбора в условиях высокой жесткости, предложен в патенте США № 8727132.

[00113] В одном варианте реализации прибор представляет собой устройство с замкнутым контуром, которое включает вход для материалов (например, образца, буферов, газа), по меньшей мере одну камеру для обработки с возможностями центрифугирования и инкубирования клеток, замкнутый контур из трубок, насос и селектор клеток-мишеней. Управляющее программное обеспечение позволяет устройству выделять, генетически модифицировать и получать составы клеток-мишеней ex vivo, в конкретных вариантах реализации, непосредственно из образца субъекта. В конкретных вариантах реализации процесс отбора можно завершить в течение 30 часов, в течение 25 часов или в течение 20 часов с минимальным вмешательством пользователя или без него. В конкретных вариантах реализации весь процесс завершается в течение 72 часов или 64 часов. В конкретных вариантах реализации минимальное вмешательство пользователя означает, что между вводом образца в устройство и извлечением генетически модифицированных клеток в составе для введения субъекту пользователь взаимодействует с устройством не более 20, 15, 10 или 5 раз и/или взаимодействует с устройством в течение не более 12 часов, 10 часов, 8 часов, 5 часов, 4 часов или 3 часов. Примеры взаимодействий со стороны пользователя могут включать одно или более из следующего: подключение набора стерильных трубок; проверка обслуживания закрытой стерильной системы; определение необходимости повторного выполнения этапа (например, осаждения); проверка успешного завершения этапа; разрешение начать новый этап после проверки качества процесса; обеспечение реагентов для ввода в устройство; и определение и/или расчет объемов для добавления или удаления. Взаимодействия можно спланировать после получения образца по времени, в течение которого пользователь готовится к взаимодействию или фактически взаимодействует с устройством.

[00114] В некоторых вариантах реализации одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, получают с использованием прибора CliniMACS®, например, прибора CliniMACS® ^plus, который является прибором с программным управлением, выполняющим аферез ГСК. Прибор CliniMACS® ^plus и соответствующее оборудование и реагенты доступны для приобретения в Miltenyi Biotec GmbH, Бергиш-Гладбах, Германия). Используемое оборудование или реагенты включают антиген/реагент CliniMACS® CD34, который представляет собой раствор, содержащий конъюгат антитела, состоящий из IgG мыши, моноклонального антитела против эпитопа II класса антигена CD34 человека, химически конъюгированного с гранулами декстрана, содержащими ядро из оксида/гидроксида железа, который применяют для отбора или обогащения CD34⁺-клеток; CliniMACS® Tubing, который представляет собой набор стерильных одноразовых трубок с двумя колонками для разделения клеток для обработки до 0,6×10⁹ CD34⁺-клеток из количества числа клеток, не превышающего 60×10⁹ лейкоцитов (стандартного размера) или до 1,2×10⁹ CD34⁺-клеток из общего количества клеток, не превышающего 120×10⁹ лейкоцитов (крупного размера); и буфер CliniMACS® ФСБ/EDTA Buffer, который представляет собой стерильный изотонический физиологический раствор с фосфатным буфером и 1 мМ ЭДТА, используемый в качестве внешней промывочной и транспортной жидкости для выполнения афереза ГСК in vitro. Промывки можно выполнять с использованием буфера CliniMACS, содержащего ФСБ и 2,5% человеческого сывороточного альбумина. Процедуры использования системы CliniMACS® представлены в руководствах пользователя CliniMACS, доступных на веб-сайте Miltenyi, включая, например, руководство пользователя CliniMACS® для системы реагентов CliniMACS® CD34, полученное 8 апреля 2019 г. и находящееся по адресу https://www.miltenyibiotec.com/_Resources/Persistent/2c28c84939f4ce793b29c9f2e897c0bb1a334c47/User%20Manual%20for%20the%20CliniMACS%20CD34%20Reagent%20System.pdf. В одном варианте реализации популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, получают путем мечения клеток с использованием реагента CD34 с последующим отбором CD34⁺-клеток с использованием стандартной программы обогащения CD34 CliniMACS®. В одном варианте реализации популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, получают с использованием модифицированной версии программы истощения CliniMACS®. Согласно этому варианту реализации клетки метят с использованием реагента CD34, но запускают модифицированную программу истощения. После загрузки меченых клеток при включенном магните пакет для сбора клеток удаляют, а собранные клетки не используют для трансплантации. Вместо этого магнит выключают и на прибор наносят буфер для элюирования, что приводит к элюированию собираемых CD34⁺-клеток. В некоторых вариантах реализации прибор в режиме истощения загружается медленнее по сравнению с режимом отбора (мл/мин), и промывки осуществляются у условиях пониженной жесткости.

[00115] В некоторых вариантах реализации одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцируют вектором, например, вектором для генной терапии, кодирующим терапевтический агент, например, путем приведения одной либо обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, в контакт с вектором. В некоторых вариантах реализации клетки контактируют с вектором в течение приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 1,5 часов, приблизительно 2 часов, приблизительно 2,5 часов, приблизительно 3 часов, приблизительно 3,5 часов, приблизительно 4 часов, приблизительно 5 часов, приблизительно 6 часов, приблизительно 7 часов, приблизительно 8 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 16 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 20 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 60 часов. В некоторых вариантах реализации клетки трансдуцируют в течение менее чем 60 часов, менее чем 48 часов, менее чем 36 часов или менее чем 24 часов. В определенных вариантах реализации клетки могут контактировать с вектором один или более раз, например, один, два, три или более трех раз, и клетки инкубируют с агентом(ами) в течение некоторого времени после каждого события контакта, например, в течение 16-24 часов, после чего среду заменяют свежей средой и продолжают культивирование клеток. Контакт клеток с вектором может происходить в любой культуральной среде и в любых условиях культивирования, которые способствуют выживанию клеток. Культура может содержать факторы роста, на которые реагируют клетки. Факторы роста в настоящем документе представляют собой молекулы, способные стимулировать выживание, рост и/или дифференцировку клеток в культуре либо в интактной ткани посредством специфического воздействия на трансмембранный рецептор. Факторы роста включают полипептиды и неполипептидные факторы.

[00116] В некоторых вариантах реализации клетки приводят в контакт с эффективным количеством вектора для генной терапии, достаточным для достижения детектируемых уровней кодируемого терапевтического агента. В конкретных вариантах реализации терапевтический агент представляет собой полипептид или полинуклеотид, который можно применять или который эффективен при лечении заболевания или нарушения. В конкретных вариантах реализации терапевтический агент представляет собой полипептид, характеризующийся нарушенной регуляцией или мутацией в клетках, полученных от субъекта, например, полипептид FANC для лечения АФ. Эффективное количество легко определить эмпирически, например, путем определения присутствия или уровня терапевтического агента, путем определения влияния на жизнеспособность или функцию клеток и т.д. Как правило, экспрессия терапевтического агента возрастает в 2 раза или более, например, в 3 раза, 4 раза или 5 раз или более, в некоторых случаях 10-кратно, 20-кратно или 50-кратно или более, например, 100-кратно в трансдуцированных клетках по сравнению с нетрансдуцированными клетками.

[00117] Векторы для генной терапии согласно настоящему изобретению охватывают любой удобный вектор для генной терапии, который находит применение для доставки полинуклеотидных последовательностей в клетки млекопитающих. Например, вектор может содержать одноцепочечную или двуцепочечную нуклеиновую кислоту, например, одноцепочечную или двуцепочечную ДНК. Например, вектор для генной терапии может представлять собой ДНК, например, депротеинизпрованную ДНК, например, плазмиду, мини-кольцевую структуру и т.д. Вектор может содержать одноцепочечную или двуцепочечную РНК, включая модифицированные формы РНК. В еще одном примере вектор для генной терапии может представлять собой РНК, например, мРНК или модифицированную мРНК.

[00118] В конкретных вариантах реализации вектор для генной терапии может являться вирусным вектором, полученным из вируса, например, аденовируса, аденоассоциированного вируса, лентивируса (LV), вируса герпеса, альфавируса или ретровируса, например, вируса лейкоза мышей Молони (M-MuLV), вируса саркомы мышей Молони (MoMSV), вируса саркомы мышей Харви (HaMuSV), вируса опухоли молочной железы мышей (MuMTV), вируса лейкоза гиббонов (GaLV), вируса лейкоза кошек (FLV), спумавируса, вируса лейкоза мышей Френда, вируса стволовых клеток мыши (MSCV) или вируса саркомы Рауса (RSV). Хотя варианты реализации, охватывающие применение LV, подробно описаны ниже, ожидается, что квалифицированный специалист должен принимать во внимание, что аналогичные знания и навыки в данной области можно применять и к другим векторам для генной терапии, кроме LV. В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии представляет собой самоограничивающий LV.

[00119] В частности, определенные способы, описанные в настоящем документе, относятся к трансдукции одной или обеих популяций стволовых клеток или клеток-предшественников, например, гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) или гемопоэтических клеток-предшественников (также называемых в настоящем документе «гемопоэтические клетки-предшественники») вектором для генной терапии, кодирующим и/или экспрессирующим терапевтический полипептид, например, FANCA, причем одну популяцию получают селекцией в условиях высокой жесткости, а другую популяцию получают селекцией в условиях низкой жесткости. В одном варианте реализации популяции клеток обогащены по CD34⁺-клеткам. В одном варианте реализации ГСК или гемопоэтические предшественники получают от субъекта с пониженной или отсутствующей активностью одного или более белков, кодируемых FANCA. В одном варианте реализации у субъекта есть АФ-A. В одном варианте реализации эндогенный ген FANCA в ГСК удален и/или мутирован.

[00120] В одном варианте реализации трансдукция клетки вектором для генной терапии приводит к интеграции в геном клетки экспрессирующей кассеты, содержащей промотор, функционально связанный с полинуклеотидной последовательностью, кодирующей терапевтический агент в векторе для генной терапии. В некоторых вариантах реализации трансдукция клетки вектором для генной терапии приводит к экспрессии терапевтического агента, например, биологически активного белка FANCA.

[00121] Например, биологически активный белок FANCA является частью ядерного комплекса АФ. В некоторых вариантах реализации доставку гена FANCA осуществляют посредством вирусного вектора. В одном варианте реализации доставку гена FANCA осуществляют посредством лентивирусного вектора. В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор представляет собой PGK-FANCA.WPRE*LV. Предполагается, что после трансдукции клеток костного мозга (КМ) или стволовых клеток или клеток-предшественников пациентов с АФ-A лентивирусным вектором (LV) FANCA, причем терапевтический вектор встраивается в геном клеток. После встраивания терапевтический белок (например, белок FANCA человека) экспрессируется клетками. Трансдуцированные клетки АФ подвергаются генетической коррекции и, таким образом, способны активировать путь АФ посредством моноубиквитинилирования FANCD2 и FANCI. Затем эти белки могут мигрировать в области повреждения ДНК и, взаимодействуя с другими белками репарации ДНК, способствовать репарации ДНК в этих клетках, как это происходит в здоровых клетках.

[00122] Как обсуждается в настоящем документе, рассматриваемые способы и композиции находят применение при экспрессии трансгена, например, FANCA, в клетках животного. Например, рассматриваемые композиции можно применять в исследованиях, например, для определения влияния гена на жизнеспособность и/или функцию клеток. В качестве другого примера, рассматриваемые композиции можно применять в медицине, например, для лечения нарушения, например, АФ.

[00123] Соответственно, в настоящем изобретении предложены способы лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение или назначение субъекту комбинации полученной популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, как описано в настоящем документе, причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцируют рекомбинантным вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтический агент, или содержащую экспрессирующую кассету, которая экспрессирует терапевтический агент, причем терапевтический агент эффективен при лечении заболевания или нарушения. В конкретных вариантах реализации заболевание представляет собой АФ, а терапевтический агент представляет собой полипептид группы комплементации A анемии Фанкони (FANCA) или его функциональный вариант или фрагмент.

[00124] В конкретных вариантах реализации способ включает: (а) получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; (b) получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, (с) трансдукцию одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, рекомбинантным вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтический агент; и (d) введение или назначение субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцируют рекомбинантным вектором для генной терапии, а терапевтический агент эффективен при лечении заболевания или нарушения. В конкретных вариантах реализации заболевание представляет собой АФ, а терапевтический агент представляет собой полипептид группы комплементации A анемии Фанкони (FANCA) или его функциональный вариант или фрагмент. В некоторых вариантах реализации пациенту вводят все клетки, полученные из каждой из двух популяций клеток. Дозы клеток каждой из двух популяций клеток могут быть одинаковыми или разными, например, содержащими большее общее количество клеток и большее общее количество CD34⁺-клеток из популяции, полученной в условиях низкой жесткости. В некоторых вариантах реализации клетки, первоначально полученные от пациента, делят на две приблизительно равные популяции, причем одну популяцию обрабатывают в условиях отбора CD34 + в условиях высокой жесткости, а другую - в условиях отбора CD34 + в условиях низкой жесткости, что может привести к получению приблизительно в 2 раза большего количества CD34⁺-клеток и в 5-10 раз большего общего количества клеток в результате отбора в условиях низкой жесткости.

[00125] В конкретных вариантах реализации любого из способов лечения, описанных в настоящем документе, первый биологический образец и второй биологический образец независимо друг от друга представляют собой периферическую кровь или костный мозг. В некоторых вариантах реализации первый биологический образец и второй биологический образец представляют собой периферическую кровь, полученную после обработки субъекта ГКСФ, плериксафором или комбинацией ГКСФ и плериксафора.

[00126] В конкретных вариантах реализации способов лечения, описанных в настоящем документе, отбор CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости включает загрузку первого биологического образца на колонку, связывающую CD34⁺-клетки, одно- или многократную промывку загруженной колонки с использованием буфера для отмывки и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из колонки с использованием элюирующего буфера. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 25-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 20 мл/мин.

[00127] В конкретных вариантах реализации способов лечения, описанных в настоящем документе, отбор CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости включает загрузку второго биологического образца на колонку, связывающую CD34⁺-клетки, обеспечение возможности протекания второго биологического образца через колонку и элюирование популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из колонки с использованием элюирующего буфера. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 20-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 5-10 мл/мин, 5-15 мл/мин, 15-20 мл/мин, 25-25 мл/мин или 25-30 мл/мин. В одном варианте реализации этап нанесения выполняют при скорости потока 10-20 мл/мин. В одном варианте реализации этап элюирования выполняют при скорости потока 20 мл/мин.

[00128] В конкретных вариантах реализации способов лечения, описанных в настоящем документе, популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, подвергают трансдукции, и/или популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, подвергают трансдукции.

[00129] В некоторых вариантах реализации рассматриваемые способы приводят к терапевтическому благоприятному эффекту, например, предотвращению развития нарушения, прекращению прогрессирования нарушения, обратному прогрессированию нарушения и т.д. Например, в одном варианте реализации нарушение представляет собой АФ. В еще одном варианте реализации заболевание или нарушение представляет собой НКМ. В одном варианте реализации нарушение представляет собой тромбоцитопению. В еще одном варианте реализации нарушение представляет собой лейкопению. В одном варианте реализации нарушение представляет собой панцитопению. В одном варианте реализации нарушение представляет собой нейтропению. В еще одном варианте реализации нарушение представляет собой анемию. В некоторых вариантах реализации рассматриваемый способ включает этап обнаружения достижения терапевтического благоприятного эффекта. Квалифицированный специалист должен принимать во внимание, что такие меры терапевтической эффективности применимы к конкретному заболеванию, подлежащему модификации, и знать соответствующие способы обнаружения, которые следует использовать для измерения терапевтической эффективности.

[00130] Как более подробно описано в разделе «Примеры», клинические данные, полученные с использованием клеток костного мозга, мобилизованных в биологические образцы периферической крови и введенных в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, неожиданно продемонстрировали ускоренную кинетику селективного энграфтмента in vivo по сравнению с другими пациентами с АФ, подвегравшимися трансплантации с использованием способов согласно известному уровню техники. В конкретных вариантах реализации способы и композиции согласно настоящему изобретению применяют для лечения АФ.

[00131] Соответственно, в настоящем изобретении предложены способы лечения АФ или одного или более из гематологических проявлений АФ. В одном варианте реализации гематологическое проявление АФ выбрано из одного или более из следующих нарушений: недостаточности костного мозга (НКМ), тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии. В конкретном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой НКМ, которая проявляется в детстве у большинства пациентов с АФ. В одном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой тромбоцитопению. В еще одном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой лейкопению. В одном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой панцитопению. В одном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой нейтропению. В еще одном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой анемию. В одном варианте реализации гематологическое проявление представляет собой комбинацию двух или более из НКМ, тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии.

[00132] Целью настоящего изобретения также является репарация эндогенных генов FANC (например, FANCA, FANCC и/или FANCG) с использованием системы редактирования генов CRISPR/Cas или ее аналогов. Cas9-опосредованная репарация генов, связанных с анемией Фанкони, была продемонстрирована in vitro, например, в статье Obsorn et al. Fanconi anemia gene editing by the CRISPR/Cas9 system. Hum Gene Ther. 2015 Feb;26(2):114-26. В настоящем изобретении предложены способы лечения анемии Фанкони и способ получения генетически модифицированных клеток, которые приводят к повышению эффективности репарации in vivo и улучшенному восстановлению костного мозга. В некоторых случаях система редактирования генов восстанавливает единичный нуклеотидный полиморфизм, делецию, вставку, инсерционно-делеционную мутацию или другой генетический дефект. В некоторых случаях репарация направлена на кодирующую область гена, интрон или область, расположенную до или после гена, например, регуляторную область генома, расположенную проксимальнее или дистальнее гена, связанного с заболеванием или нарушением.

[00133] В одном варианте реализации способов согласно настоящему изобретению предложен способ лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, включающий: получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, из первого биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости; получение популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, из второго биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости, приведение одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии анемии Фанкони; и введение субъекту популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, причем одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, приводят в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии; причем вектор для генной терапии содержит систему редактирования генов, способную осуществлять направленную репарацию эндогенного гена, что обеспечивает лечение анемии Фанкони. В некоторых случаях система редактирования генов представляет собой систему CRISPR-Cas (например, CRISPR-Cas9).

[00134] В некоторых вариантах реализации система редактирования генов содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую продукт гена Cas, Cas9 или spCas (например, мРНК, кДНК, плазмиду или т.п.), функционально связанную с промотором. В некоторых вариантах реализации система редактирования генов содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую белок Cas, Cas9 или spCas. В некоторых случаях вектор для генной терапии представляет собой липосому или липидную наночастицу или другую липидную или липидоподобную систему доставки. В некоторых случаях вектор для генной терапии представляет собой вирус, например, лентивирус, аденовирус или аденоассоциированный вирус. В некоторых вариантах реализации система редактирования генов содержит направляющую РНК, например, одиночную направляющую РНК (онРГК), и, необязательно, матрицу для репарации. Матрица для репарации и направляющая РНК в некоторых случаях представляют собой разные молекулы, а в некоторых случаях - одну и ту же молекулу. Матрица для репарации и направляющая РНК могут быть ковалентно или нековалентно связаны. В некоторых случаях направляющая РНК заранее загружена в белок Cas, Cas9 или spCas. В некоторых случаях доставка компонентов системы редактирования генов происходит посредством единственного вектора для генной терапии. В некоторых случаях доставка системы редактирования генов происходит с применением разных векторов для генной терапии. Можно использовать несколько векторов для генной терапии. Например, без ограничений, множественные генетические поражения можно лечить одним и тем же или разными векторами для генной терапии. В некоторых случаях репарация двух или более генов FANC происходит одновременно. В некоторых случаях один вектор для генной терапии приводят в контакт с популяциями клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, а другой вектор для генной терапии приводят в контакт с популяциями клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости. В некоторых случаях два вектора для генной терапии идентичны. В некоторых случаях один вектор для генной терапии содержит трансген для лечения нарушения, связанного с данным геном (например, FANCA), а другой вектор для генной терапии содержит систему редактирования генов.

[00135] В некоторых случаях вектор для генной терапии обеспечивает трансген для репарации или репарирует ген, отличный от гена, связанного с заболеванием или нарушением. Например, без ограничений, вектор для генной терапии может усиливать или подавлять экспрессию иммунных эффекторных генов, может изменять маркеры клеточной поверхности, может предоставлять альтернативные молекулы ГКГС или может кодировать гены иммуноглобулинов. В частности, предполагается, что в некоторых случаях вектор или векторы для генной терапии обеспечивают применение трансплантата аллогенного или несоответствующего донора, например, путем изменения иммунных маркеров (например, генов HLA или ГКГС) или вызывая экспрессию иммунных эффекторных генов.

[00136] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или нарушения у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту комбинации популяции клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, обе из которых получены из одного или более биологических образцов, полученных от субъекта, причем CD34-клетки, полученные от субъекта, содержат одну или более из генных мутаций, ассоциированных с заболеванием или нарушением или являющихся их причиной, и одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, или популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, подвергают редактированию генов для репарации одной или более из мутаций генов перед введением популяций клеток субъекту. В некоторых вариантах реализации редактирование гена выполняют путем приведения одной или обеих популяций клеток, обогащенных по CD34, в контакт с белком Cas (например, Cas9 или spCas); направляющей РНК (например, одиночной направляющей РНК, онРНК); и матрицей для репарации. В конкретных вариантах реализации заболевание представляет собой АФ, и репарируемая мутация гена является мутацией в гене группы комплементации A анемии Фанкони (FANCA).

[00137] В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии, описанный в настоящем документе, содержит полинуклеотид, содержащий промотор, функционально связанный с последовательностью, кодирующей терапевтический агент, т.е. кодирующей последовательностью. В настоящем документе термин «функционально связанный» означает, что промотор способен управлять экспрессией последовательности, кодирующей терапевтический агент.

[00138] В некоторых вариантах реализации полинуклеотид содержит один или более энхансеров. Энхансеры представляют собой элементы нуклеиновых кислот, которые, как известно в данной области техники, усиливают транскрипцию и могут быть расположены где угодно в ассоциации с геном, который они регулируют, например, до или после него, внутри интрона и т. д. Любой энхансерный элемент можно использовать в полинуклеотидных кассетах и векторах для генной терапии согласно настоящему изобретению при условии, что они усиливают экспрессию гена при использовании в комбинации с промотором.

[00139] Кодирующая последовательность, подлежащая экспрессии в клетках, может представлять собой любую полинуклеотидную последовательность, например, ген или кДНК, кодирующую продукт гена, например, полипептид или терапевтическое средство на основе РНК (миРНК, антисмысловую РНК, рибозим, кшРНК и т.д.). Кодирующая последовательность может быть гетерологичной по отношению к последовательности промотора, с которой она функционально связана, т.е. не являться функционально связанной с ней в естественных условиях. В качестве альтернативы, кодирующая последовательность может быть эндогенной по отношению к последовательности промотора, с которой она функционально связана, т.е. являться связанной с указанным промотором в естественных условиях. Продукт гена может действовать внутри клетки млекопитающего или вне ее, например, он может секретироваться. Например, если трансген является терапевтическим геном, кодирующая последовательность может представлять собой любой ген, кодирующий желательный продукт гена или его функциональный фрагмент или вариант, который можно применять в качестве терапевтического средства для лечения заболевания или нарушения. В различных вариантах реализации трансген кодирует FANCA человека.

[00140] В одном варианте реализации настоящего изобретения кодирующую последовательность трансгена модифицируют или подвергают «оптимизации кодонов» для усиления экспрессии путем замены редко встречающихся кодонов на более часто встречающиеся кодоны. Кодирующая последовательность - это часть последовательности мРНК, которая кодирует аминокислоты для трансляции. Во время трансляции каждый из 61 тринуклеотидного кодона транслируется в одну из 20 аминокислот, что приводит к вырожденности или избыточности генетического кода. Однако различные типы клеток и различные виды животных используют тРНК (каждая из которых несет антикодон), кодирующие одни и те же аминокислоты, с разной частотой. Если последовательность гена содержит кодоны, которые редко представлены соответствующими тРНК, рибосомный аппарат трансляции может замедляться, что препятствует эффективной трансляции. Экспрессию можно улучшить посредством «оптимизации кодонов» для конкретного вида животного, при которой кодирующую последовательность модифицируют таким образом, чтобы она кодировала ту же белковую последовательность, но с использованием кодонов, которые широко встречаются и/или используются в интенсивно экспрессируемых белках человека (Cid-Arregui et al., 2003; J. Virol. 77: 4928). В одном из аспектов настоящего изобретения кодирующую последовательность трансгена модифицируют путем замены кодонов, редко экспрессируемых у млекопитающих или приматов, на кодоны, часто экспрессируемые у приматов. Например, в некоторых вариантах реализации кодирующая последовательность, кодируемая трансгеном, кодирует полипептид, характеризующийся по меньшей мере 85% идентичностью последовательности с полипептидом, кодируемым последовательностью, описанной выше или в настоящем документе, например, по меньшей мере 90% идентичностью последовательности, например, по меньшей мере 95% идентичностью последовательности, по меньшей мере 98% идентичностью, по меньшей мере 99% идентичностью, причем по меньшей мере один кодон кодирующей последовательности характеризуется повышенной частотой тРНК у человека по сравнению с соответствующим кодоном в последовательности, описанной выше или в настоящем документе.

[00141] В дополнительном варианте реализации настоящего изобретения кодирующую последовательность трансгена модифицируют с целью усиления экспрессии путем терминации или удаления открытых рамок считывания (ОРС), не кодирующих желательный трансген. Открытая рамка считывания (ОРС) представляет собой нуклеотидную последовательность, следующую за стартовым кодоном и не содержащую стоп-кодона. ОРС могут находиться в прямой или обратной ориентации и могут находится «в рамке считывания» или «вне рамки считывания» по сравнению с рассматриваемым геном. Такие открытые рамки считывания обладают потенциалом для экспрессии в экспрессирующей кассете вместе с рассматриваемым геном и могут приводить к нежелательным эффектам. В одном аспекте настоящего изобретения кодирующую последовательность трансгена модифицировали путем удаления открытых рамок считывания за счет дальнейшего изменения использования кодонов. Это можно выполнить путем удаления стартовых кодонов (ATG) и введения стоп-кодонов (TAG, TAA или TGA) в обратной ориентации или за пределами рамок рамки считывания при сохранении аминокислотной последовательности и поддержании интенсивно используемых кодонов в рассматриваемом гене (т.е. избегая кодонов, встречающихся с частотой < 20%). В настоящем изобретении кодирующую последовательность трансгена можно оптимизировать посредством оптимизации кодонов и удаления ОРС, не относящихся к трансгену, либо с использованием обеих методик. Для специалиста в данной области очевидно, что предпочтительным является удаление или минимизация ОРС, не относящихся к трансгену, после оптимизации кодонов, что позволяет удалить ОРС, введенные во время оптимизации кодонов.

[00142] Настоящее изобретение включает плазмиды, содержащие экспрессирующую кассету или кассету для переноса, описанную в настоящем документе. В конкретных вариантах реализации плазмида представляет собой pCCL-PGK-FANCA-WPRE* (SEQ ID NO: 24), и/или плазмида содержит экспрессирующую кассету из pCCL-PGK-FANCA-WPRE (SEQ ID NO: 25).

[00143] В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии или кассета для переноса генов, содержащаяся в нем, содержат один или более из дополнительных элементов, например, один или несколько элементов, выбранных из: 5' LTR, 3' LTR, cPPT, CTS, RRE, энхансерных последовательностей и сигналов упаковки. В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии или кассета для переноса гена представляет собой любой вектор или кассету, описанные в международной патентной публикации № WO 2018/049273 A1, описание которой полностью включено в настоящий документ для всех целей. Полинуклеотидные последовательности, кодирующие полипептид группы комплементации анемии Фанкони (FANC), включают последовательности, описанные в патенте США № 5952190, описание которого полностью включено в настоящий документ для всех целей.

[00144] Последовательность RRE повышает эффективность переноса генов. В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, последовательность RRE содержит или состоит из любой из следующих последовательностей или последовательностей, характеризующихся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующим последовательностям (все последовательности отображаются в ориентации от 5'-конца к 3'-концу):

AGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCT (SEQ ID NO: 1);

GATCTTCAGACCTGGAGGAGGAGATATGAGGGACAATTGGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAAAAATTGAACCATTAGGAGTAGCACCCACCAAGGCAAAGAGAAGAGTGGTGCAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTTTGTTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGCGCAGCGTCAATGACGCTGACGGTACAGGCCAGACAATTATTGTCTGGTATAGTGCAGCAGCAGAACAATTTGCTGAGGGCTATTGAGGCGCAACAGCATCTGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATCAAGCAGCTCCAGGCAAGAATCCTGGCTGTGGAAAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTGGGGATTTGGGGTTGCTCTGGAAAACTCATTTGCACCACTGCTGTGCCTTGGAATGCTAGTTGGAGTAATAAATCTCTGGAACAGATTTGGAATCACACGACCTGGATGGAGTGGGACAGAGAAATTAACAATTACACAAGCTTAATACACTCCTTAATTGAAGAATCGCAAAACCAGCAAGAAAAGAATGAACAAGAATTATTGGAATTAGATAAATGGGCAAGTTTGTGGAATTGGTTTAACATAACAAATTGGCTGTGGTATATAAAATTATTCATAATGATAGTAGGAGGCTTGGTAGGTTTAAGAATAGTTTTTGCTGTACTTTCTATAGTGAATAGAGTTAGGCAGGGATATTCACCATTATCGTTTCAGACCCACCTCCCAACCCCGAGGGGACCCGACAGGCCCGAAGGAATAGAAGAAGAAGGTGGAGAGAGAGACAGAGACAGATCCATTCGATTAGTGAACGGATC (SEQ ID NO: 26); или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 2649-2882 или SEQ ID NO: 24, или полинуклеотидов 1296-2153 из SEQ ID NO: 25.

[00145] Лидерная область ретровируса содержит сигнал упаковки (Ψ), участвующий в упаковке генома ретровируса в вирусный капсид. Считалось, что LV-векторы требуют наличия приблизительно 300 п.н. гена Gag в этой области. В настоящее время эта последовательность Gag уменьшена до 40 п.н. (фигура 65). В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, последовательность ψ представляет собой последовательность ψ ВИЧ-1, или последовательность ψ содержит или состоит из любой из следующих последовательностей или последовательностей, характеризующихся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующим последовательностям:

CTCTCTCGACGCAGGACTCGGCTTGCTGAAGCGCGCACGGCAAGAGGCGAGGGGCGGCGACTGGTGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGCGTC (SEQ ID NO: 2);

TGAGTACGCCAAAAATTTTGACTAGCGGAGGCTAGAAGGAGAGA (SEQ ID NO: 27); или

последовательности, содержащей или состоящей из полинуклеотидов 2031-2156 из SEQ ID NO: 24, или полинуклеотидов 889-933 из SEQ ID NO: 25.

[00146] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, укороченная 5' LTR ВИЧ-1 содержит или состоит из любой из следующих последовательностей или последовательностей, характеризующихся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью любой из следующих последовательностей:

[00147] GGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 3);

[00148] GTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCCC (SEQ ID NO: 28); или

последовательности, содержащей или состоящей из полинуклеотидов 1586-9495 из SEQ ID NO: 24, или полинуклеотидов 934-1295 из SEQ ID NO: 25.

[00149] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, самоинактивирующаяся 3' LTR ВИЧ-1 содержит или состоит из любой из следующих последовательностей или последовательностей, характеризующихся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующим последовательностям: .

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 4);

TGGAAGGGCTAATTCACTCCCAACGAAGACAAGATCTGCTTTTTGCTTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGAGTGCTTCAAGTAGTGTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCA (SEQ ID NO: 29); или

последовательности, содержащей или состоящей из полинуклеотидов 9262-9495 из SEQ ID NO: 24, или полинуклеотидов 8056-8289 из SEQ ID NO: 25.

[00150] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, немедленный ранний промотор цитомегаловируса (ЦМВ) человека содержит или состоит из любой из следующих последовательностей, их функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью любой из следующих последовательностей:

GTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCT (SEQ ID NO: 5);

ACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGC (SEQ ID NO: 30) или

последовательности, содержащей или состоящей из полинуклеотидов 1586-1789 из SEQ ID NO: 24, или полинуклеотидов 1-577 из SEQ ID NO: 25.

[00151] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, промотор вируса саркомы Рауса (ВСР) содержит или состоит из любой из следующих последовательностей, их функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью любой из следующих последовательностей:

TTAATGTAGTCTTATGCAATACTCTTGTAGTCTTGCAACATGGTAACGATGAGTTAGCAACATGCCTTACAAGGAGAGAAAAAGCACCGTGCATGCCGATTGGTGGAAGTAAGGTGGTACGATCGTGCCTTATTAGGAAGGCAACAGACGGGTCTGACATGGATTGGACGAACCACTGAATTGCCGCATTGCAGAGATATTGTATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACG (SEQ ID NO: 31).

[00152] Отмечено, что cPPT, облегчающий ядерную транслокацию прединтеграционных комплексов, вместе с CTS, участвующей в отделении обратной транскриптазы, улучшает титр вируса (Zennou, et al. 2000; Follenzi et al. 2000). В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, центральный полипуриновый тракт и центральная последовательность терминации ВИЧ-1 (cPPT/CTS) содержит или состоит из любой из следующих последовательностей, их функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью любой из следующих последовательностей:

TTTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTT (SEQ ID NO: 6);

TTTAAAAGAAAAGGGGGGATTGGGGGGT (SEQ ID NO:12);

AAAAGAAAAGGGGGGA (SEQ ID NO: 32);

TTGGGGGGTACAGTGCAGGGGAAAGAATAGTAGACATAATAGCAACAGACATACAAACTAAAGAATTACAAAAACAAATTACAAAAATTCAAAATTTTATCGATCACGAGACTAGCCTCGA (SEQ ID NO: 33) или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 3378-3495 из SEQ ID NO: 24, или нуклеотидов 2176-2312 из SEQ ID NO: 25.

[00153] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, промотор фосфоглицераткиназы 1 человека (hPGK) содержит или состоит из любой из следующих последовательностей, их функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью любой из следующих последовательностей:

GGGGTTGGGGTTGCGCCTTTTCCAAGGCAGCCCTGGGTTTGCGCAGGGACGCGGCTGCTCTGGGCGTGGTTCCGGGAAACGCAGCGGCGCCGACCCTGGGTCTCGCACATTCTTCACGTCCGTTCGCAGCGTCACCCGGATCTTCGCCGCTACCCTTGTGGGCCCCCCGGCGACGCTTCCTGCTCCGCCCCTAAGTCGGGAAGGTTCCTTGCGGTTCGCGGCGTGCCGGACGTGACAAACGGAAGCCGCACGTCTCACTAGTACCCTCGCAGACGGACAGCGCCAGGGAGCAATGGCAGCGCGCCGACCGCGATGGGCTGTGGCCAATAGCGGCTGCTCAGCAGGGCGCGCCGAGAGCAGCGGCCGGGAAGGGGCGGTGCGGGAGGCGGGGTGTGGGGCGGTAGTGTGGGCCCTGTTCCTGCCCGCGCGGTGTTCCGCATTCTGCAAGCCTCCGGAGCGCACGTCGGCAGTCGGCTCCCTCGTTGACCGAATCACCGACCTCTCTCCCCAG (SEQ ID NO: 7); или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 3541-4051 из SEQ ID NO: 24, или нуклеотидов 2335-2845 из SEQ ID NO:25.

[00154] В некоторых вариантах реализации экспрессирующие кассеты и векторы для генной терапии, описанные в настоящем документе, дополнительно содержат один или более из дополнительных элементов, например, промотор и/или энхансер ЦМВ, последовательность полиА SV40, сайт инициации (ориджин) репликации, например, последовательность ori SV40, или любой из элементов, описанных в настоящем документе.

[00155] В конкретных вариантах экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, энхансер ЦМВ человека содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности: GACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATG (SEQ ID NO: 9).

[00156] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, сигнал поли(A) вируса обезьян 40 (SV40) содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности:

AACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTA (SEQ ID NO: 10); или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 8361-8482 из SEQ ID NO: 25.

[00157] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, сайт инициации репликации SV40 содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности:

ATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC (SEQ ID NO: 11);

GGCCTCCAAAAAAGCCTCCTCACTACTTCTGGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCCTCTGCATAAATAAAAAAAATTAGTCAGCCATGGGGCGGAGAATGGGCGGAACTGGGCGGAGTTAGGGGCGGGATGGGCGGAGTTAGGGGCGGGA (SEQ ID NO: 34); или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 8502-8657 из SEQ ID NO: 25.

[00158] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, сигнал dNEF, присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности:

GAATTCGAGCTCGGTACCTTTAAGACCAATGACTTACAAGGCAGCTGTAGATCTTAGCCACTTTTTAAAAGAAAAGGGGGGAC (SEQ ID NO: 13).

[00159] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, последовательность KanR, присутствующая в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCGGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGTCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAAGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCGACGACGGGCGTTCCTTGCGCGGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGTCTATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCACGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGTCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTTGTGCTTTACGGTATCGCCGCGCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGA (SEQ ID NO: 14).

[00160] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, последовательность RNA-OUT, присутствующая в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

GTAGAATTGGTAAAGAGAGTCGTGTAAAATATCGAGTTCGCACATCTTGTTGTCTGATTATTGATTTTTGGCGAAACCATTTGATCATATGACAAGATGTGTATCTACCTTAACTTAATGATTTTGATAAAAATCATTAGG (SEQ ID NO: 35); или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 9731-9871 из SEQ ID NO: 25.

[00161] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, терминатор rrnG (терминатор транскрипции оперона rrnG рибосомной РНК E.coli (Albrechtsen et al., 1991)), присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности:

GCATTGGCGCAGAAAAAAATGCCTGATGCGACGCTGCGCGTCTTATACTCCCACATATGCCAGATTCAGCAACGGATACGGCTTCCCCAACTTGCCCACTTCCATACGTGTCCTCCTTACCAGAAATTTATCCTTAA (SEQ ID NO: 15)

[00162] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, ori (сайт инициации репликации высококопийной ColE1/pMB1/pBR322/pUC), присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности:

TTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAA (SEQ ID NO: 16)

GGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGA (SEQ ID NO: 37); или

последовательности, содержащей или состоящей из нуклеотидов 9731-9871 из SEQ ID NO: 24 или нуклеотидов 8700-9714 из SEQ ID NO: 25.

[00163] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, сайт связывания CAP, присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности: TAATGTGAGTTAGCTCACTCAT (SEQ ID NO: 17).

[00164] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, lac-промотор E.coli, присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности: TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTG (SEQ ID NO: 18).

[00165] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, оператор lac, присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности: TTGTGAGCGGATAACAA (SEQ ID NO: 19).

[00166] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, T3-промотор (промотор РНК-полимеразы бактериофага T3), присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности: AATTAACCCTCACTAAAGG (SEQ ID NO: 20).

[00167] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, T7-промотор (промотор РНК-полимеразы бактериофага T7), присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности: CCTATAGTGAGTCGTATTA (SEQ ID NO: 21).

[00168] В некоторых вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, ori f1 (сайт инициации репликации бактериофага f1), присутствующий в любых экспрессирующих кассетах или векторах для генной терапии, описанных в настоящем документе, содержит или состоит из следующей последовательности, ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности:

ACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATT (SEQ ID NO: 22).

[00169] Как обсуждается в настоящем документе, экспрессирующие кассеты и векторы для генной терапии согласно настоящему изобретению могут содержать сигнал экспорта РНК. Типичные последовательности экспорта РНК включают WPRE, но не ограничиваются им. WPRE значительно усиливает экспрессию трансгена в клетках-мишенях за счет повышения стабильности РНК в трансгене независимо от промотора и вектора (Zuffrey et al, 1999). В то же время он может экспрессировать укороченный белок из 60 аминокислот, происходящий от гена WHV X, вовлеченного в развитие рака печени (Kingsman et al, 2005). Таким образом, большинство доклинических протоколов и клинических исследований включают мутированную версию элемента WPRE (Zanta-Boussif et al, 2009). С другой стороны, использование двух элементов SV40-USE в векторах SIN-LV оказалось более эффективным по сравнению с последовательностью WPRE при подавлении сквозного транскрипционного считывания (Schambach et al, 2007). Точнее, WPRE, описанный в настоящем документе, представляет собой химерный wPRE, несущий 589 нуклеотидов модифицированного WPRE, полученного Акселем Шамбахом (нуклеотиды 1-589) (WO 2008136670 A2), и 88 нуклеотидов исходного WPRE (нуклеотиды 590-677) (Zuffrey et al., 1999). Приведенные в настоящем документе данные показывают, что этот химерный WPRE работает лучше, чем исходный wPRE. Последовательность химерного wPRE включает следующую последовательность, ее функциональный фрагмент или последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью следующей последовательности:

CGAGCATCTTACCGCCATTTATTCCCATATTTGTTCTGTTTTTCTTGATTTGGGTATACATTTAAATGTTAATAAAACAAAATGGTGGGGCAATCATTTACATTTTTAGGGATATGTAATTACTAGTTCAGGTGTATTGCCACAAGACAAACATGTTAAGAAACTTTCCCGTTATTTACGCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGATATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTGTGTGGATATGCTGCTTTAATGCCTCTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTACGGCTTTCGTTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCCGTCAACGTGGCGTGGTGTGCTCTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGCTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAACTCCTTTCTGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCGATCGCCACGGCAGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTAGGTTGCTGGGCACTGATAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAGGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCCTG (SEQ ID NO:23).

[00170] В конкретных вариантах реализации мутированная последовательность WPRE содержит или состоит из WPRE*, который соответствует нуклеотидам 8502-9178 SEQ ID NO: 24 или нуклеотидам 7293-7888 из SEQ ID NO: 25, или характеризуется по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью этой области SEQ ID NO: 24 или SEQ ID NO: 25.

[00171] Квалифицированный специалист должен принимать во внимание другие комбинации элементов, как описанные в настоящем документе, так и известные в данной области техники.

[00172] Кроме того, специалист в данной области техники должен знать, что экспрессирующие кассеты и векторы для генной терапии необязательно могут содержать другие элементы, включая сайты рестрикции для облегчения клонирования и регуляторные элементы для конкретного вектора для генной терапии, но не ограничиваясь ими.

[00173] В некоторых аспектах настоящего изобретения рассматриваемые полинуклеотидные кассеты используют для доставки гена в клетки, например, для определения эффекта, который ген оказывает на жизнеспособность и/или функцию клеток, для лечения клеточного нарушения и т.д. В различных вариантах реализации доставка вирусного вектора к клеткам может происходить in vitro, ex vivo или in vitro. Соответственно, в некоторых аспектах настоящего изобретения композиция, обеспечивающая экспрессию трансгена в клетках млекопитающих, представляет собой вектор для генной терапии, где вектор для генной терапии включает полинуклеотидную кассету, например, кассету для переноса гена согласно настоящему изобретению.

[00174] Генетическая коррекция ГСК пациентов с АФ с последующей аутологичной трансплантацией этих клеток (гемопоэтическая генная терапия) является хорошей альтернативой для пациентов с АФ, особенно для пациентов, у которых нет HLA-идентичного брата или сестры. В одном варианте реализации гемопоэтическая генная терапия является предпочтительной схемой лечения для пациента, у которого нет HLA-идентичного брата или сестры. В еще одном варианте реализации гемопоэтическая генная терапия представляет собой схему лечения пациента, у которого есть HLA-идентичный брат или сестра.

[00175] В конкретных вариантах реализации любого из способов, описанных в настоящем документе, вектор для генной терапии содержит полинуклеотидную последовательность, кодирующую белок FAC, а клетки, трансудированные с помощью вектора, вводят субъекту для лечения АФ.

[00176] Поскольку большинство пациентов с АФ принадлежат к группе комплементации FA-A (Casado et al., 2007, Levitus et al., 2004,Taniguchi et al., 2006), был разработан вектор, несущий функциональный ген FANCA. Включение мутированного посттранскрипционного регуляторного элемента вируса гепатита сурков (WPRE*), характеризующегося отсутствием остаточных открытых рамок считывания Schambach A et al. Gene Ther. 2006; 13: 641-645) будет использоваться для повышения уровня экспрессии и стабильности терапевтического гена.

[00177] В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная кассета содержит:

(i) последовательность промотора фосфоглицераткиназы (PGK) или ее функциональный вариант или фрагмент;

(ii) последовательность, кодирующую белок FANCA человека или его функциональный фрагмент или вариант; и:

(iii) посттранскрипционный регуляторный элемент последовательности вируса гепатита сурков (WPRE).

[00178] В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная кассета содержит:

(i) последовательность промотора фосфоглицераткиназы (PGK) человека;

(ii) последовательность, кодирующую белок FANCA человека; и:

(iii) мутантную последовательность WPRE.

[00179] В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная кассета содержит:

а) 5'-LTR, необязательно модифицированную 5'-LTR;

b) последовательность cPPT;

c) последовательность промотора PGK, необязательно последовательность промотора PGK человека;

d) последовательность, кодирующую белок FANCA человека, необязательно последовательность кДНК или последовательность с оптимизированными кодонами;

e) мутантную последовательность WPRE; и

а) 3'-LTR, необязательно модифицированную 3'-LTR.

[00180] В одном варианте реализации модифицированный WPRE называют WPRE*. WPRE* представляет собой модифицированный WPRE, в котором отсутствует открытая рамка считывания (см., например, Schambach et al, 2006 Gene Ther. 13:641-645).

[00181] Поскольку большинство пациентов с АФ принадлежат к группе комплементации FA-A (Casado et al., 2007, Levitus et al., 2004,Taniguchi et al., 2006), в конкретных вариантах реализации кодируемым продуктом терапевтического гена является FANCA, хотя в настоящем изобретении предусмотрена возможность доставки белков АФ из других групп комплементации и, таким образом, их кодирование в экспрессирующих кассетах экспрессии, описанных в настоящем документе, например, вместо FANCA.

[00182] В конкретных вариантах реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, полинуклеотидная последовательность, кодирующая кодон-оптимизированный FANCA, представляет собой последовательность кДНК FANCA человека, содержащую или состоящую из следующей последовательности или ее функционального фрагмента или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью следующей последовательности:

ATGTCCGACTCGTGGGTCCCGAACTCCGCCTCGGGCCAGGACCCAGGGGGCCGCCGGAGGGCCTGGGCCGAGCTGCTGGCGGGAAGGGTCAAGAGGGAAAAATATAATCCTGAAAGGGCACAGAAATTAAAGGAATCAGCTGTGCGCCTCCTGCGAAGCCATCAGGACCTGAATGCCCTTTTGCTTGAGGTAGAAGGTCCACTGTGTAAAAAATTGTCTCTCAGCAAAGTGATTGACTGTGACAGTTCTGAGGCCTATGCTAATCATTCTAGTTCATTTATAGGCTCTGCTTTGCAGGATCAAGCCTCAAGGCTGGGGGTTCCCGTGGGTATTCTCTCAGCCGGGATGGTTGCCTCTAGCGTGGGACAGATCTGCACGGCTCCAGCGGAGACCAGTCACCCTGTGCTGCTGACTGTGGAGCAGAGAAAGAAGCTGTCTTCCCTGTTAGAGTTTGCTCAGTATTTATTGGCACACAGTATGTTCTCCCGTCTTTCCTTCTGTCAAGAATTATGGAAAATACAGAGTTCTTTGTTGCTTGAAGCGGTGTGGCATCTTCACGTACAAGGCATTGTGAGCCTGCAAGAGCTGCTGGAAAGCCATCCCGACATGCATGCTGTGGGATCGTGGCTCTTCAGGAATCTGTGCTGCCTTTGTGAACAGATGGAAGCATCCTGCCAGCATGCTGACGTCGCCAGGGCCATGCTTTCTGATTTTGTTCAAATGTTTGTTTTGAGGGGATTTCAGAAAAACTCAGATCTGAGAAGAACTGTGGAGCCTGAAAAAATGCCGCAGGTCACGGTTGATGTACTGCAGAGAATGCTGATTTTTGCACTTGACGCTTTGGCTGCTGGAGTACAGGAGGAGTCCTCCACTCACAAGATCGTGAGGTGCTGGTTCGGAGTGTTCAGTGGACACACGCTTGGCAGTGTAATTTCCACAGATCCTCTGAAGAGGTTCTTCAGTCATACCCTGACTCAGATACTCACTCACAGCCCTGTGCTGAAAGCATCTGATGCTGTTCAGATGCAGAGAGAGTGGAGCTTTGCGCGGACACACCCTCTGCTCACCTCACTGTACCGCAGGCTCTTTGTGATGCTGAGTGCAGAGGAGTTGGTTGGCCATTTGCAAGAAGTTCTGGAAACGCAGGAGGTTCACTGGCAGAGAGTGCTCTCCTTTGTGTCTGCCCTGGTTGTCTGCTTTCCAGAAGCGCAGCAGCTGCTTGAAGACTGGGTGGCGCGTTTGATGGCCCAGGCATTCGAGAGCTGCCAGCTGGACAGCATGGTCACTGCGTTCCTGGTTGTGCGCCAGGCAGCACTGGAGGGCCCCTCTGCGTTCCTGTCATATGCAGACTGGTTCAAGGCCTCCTTTGGGAGCACACGAGGCTACCATGGCTGCAGCAAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAACTCGTGCCTTTTGAGTCTCCCCGGTACCTGCAGGTGCACATTCTCCACCCACCCCTGGTTCCCAGCAAGTACCGCTCCCTCCTCACAGACTACATCTCATTGGCCAAGACACGGCTGGCCGACCTCAAGGTTTCTATAGAAAACATGGGACTCTACGAGGATTTGTCATCAGCTGGGGACATTACTGAGCCCCACAGCCAAGCTCTTCAGGATGTTGAAAAGGCCATCATGGTGTTTGAGCATACGGGGAACATCCCAGTCACCGTCATGGAGGCCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTACGTGTCCCACTTCCTCCCCGCCCTGCTCACACCTCGAGTGCTCCCCAAAGTCCCTGACTCCCGTGTGGCGTTTATAGAGTCTCTGAAGAGAGCAGATAAAATCCCCCCATCTCTGTACTCCACCTACTGCCAGGCCTGCTCTGCTGCTGAAGAGAAGCCAGAAGATGCAGCCCTGGGAGTGAGGGCAGAACCCAACTCTGCTGAGGAGCCCCTGGGACAGCTCACAGCTGCACTGGGAGAGCTGAGAGCCTCCATGACAGACCCCAGCCAGCGTGATGTTATATCGGCACAGGTGGCAGTGATTTCTGAAAGACTGAGGGCTGTCCTGGGCCACAATGAGGATGACAGCAGCGTTGAGATATCAAAGATTCAGCTCAGCATCAACACGCCGAGACTGGAGCCACGGGAACACATTGCTGTGGACCTCCTGCTGACGTCTTTCTGTCAGAACCTGATGGCTGCCTCCAGTGTCGCTCCCCCGGAGAGGCAGGGTCCCTGGGCTGCCCTCTTCGTGAGGACCATGTGTGGACGTGTGCTCCCTGCAGTGCTCACCCGGCTCTGCCAGCTGCTCCGTCACCAGGGCCCGAGCCTGAGTGCCCCACATGTGCTGGGGTTGGCTGCCCTGGCCGTGCACCTGGGTGAGTCCAGGTCTGCGCTCCCAGAGGTGGATGTGGGTCCTCCTGCACCTGGTGCTGGCCTTCCTGTCCCTGCGCTCTTTGACAGCCTCCTGACCTGTAGGACGAGGGATTCCTTGTTCTTCTGCCTGAAATTTTGTACAGCAGCAATTTCTTACTCTCTCTGCAAGTTTTCTTCCCAGTCACGAGATACTTTGTGCAGCTGCTTATCTCCAGGCCTTATTAAAAAGTTTCAGTTCCTCATGTTCAGATTGTTCTCAGAGGCCCGACAGCCTCTTTCTGAGGAGGACGTAGCCAGCCTTTCCTGGAGACCCTTGCACCTTCCTTCTGCAGACTGGCAGAGAGCTGCCCTCTCTCTCTGGACACACAGAACCTTCCGAGAGGTGTTGAAAGAGGAAGATGTTCACTTAACTTACCAAGACTGGTTACACCTGGAGCTGGAAATTCAACCTGAAGCTGATGCTCTTTCAGATACTGAACGGCAGGACTTCCACCAGTGGGCGATCCATGAGCACTTTCTCCCTGAGTCCTCGGCTTCAGGGGGCTGTGACGGAGACCTGCAGGCTGCGTGTACCATTCTTGTCAACGCACTGATGGATTTCCACCAAAGCTCAAGGAGTTATGACCACTCAGAAAATTCTGATTTGGTCTTTGGTGGCCGCACAGGAAATGAGGATATTATTTCCAGATTGCAGGAGATGGTAGCTGACCTGGAGCTGCAGCAAGACCTCATAGTGCCTCTCGGCCACACCCCTTCCCAGGAGCACTTCCTCTTTGAGATTTTCCGCAGACGGCTCCAGGCTCTGACAAGCGGGTGGAGCGTGGCTGCCAGCCTTCAGAGACAGAGGGAGCTGCTAATGTACAAACGGATCCTCCTCCGCCTGCCTTCGTCTGTCCTCTGCGGCAGCAGCTTCCAGGCAGAACAGCCCATCACTGCCAGATGCGAGCAGTTCTTCCACTTGGTCAACTCTGAGATGAGAAACTTCTGCTCCCACGGAGGTGCCCTGACACAGGACATCACTGCCCACTTCTTCAGGGGCCTCCTGAACGCCTGTCTGCGGAGCAGAGACCCCTCCCTGATGGTCGACTTCATACTGGCCAAGTGCCAGACGAAATGCCCCTTAATTTTGACCTCTGCTCTGGTGTGGTGGCCGAGCCTGGAGCCTGTGCTGCTCTGCCGGTGGAGGAGACACTGCCAGAGCCCGCTGCCCCGGGAACTGCAGAAGCTACAAGAAGGCCGGCAGTTTGCCAGCGATTTCCTCTCCCCTGAGGCTGCCTCCCCAGCACCCAACCCGGACTGGCTCTCAGCTGCTGCACTGCACTTTGCGATTCAACAAGTCAGGGAAGAAAACATCAGGAAGCAGCTAAAGAAGCTGGACTGCGAGAGAGAGGAGCTATTGGTTTTCCTTTTCTTCTTCTCCTTGATGGGCCTGCTGTCGTCACATCTGACCTCAAATAGCACCACAGACCTGCCAAAGGCTTTCCACGTTTGTGCAGCAATCCTCGAGTGTTTAGAGAAGAGGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTTTCAGTTGACAGAGAGTGACCTCAGGCTGGGGCGGCTCCTCCTCCGTGTGGCCCCGGATCAGCACACCAGGCTGCTGCCTTTCGCTTTTTACAGTCTTCTCTCCTACTTCCATGAAGACGCGGCCATCAGGGAAGAGGCCTTCCTGCATGTTGCTGTGGACATGTACTTGAAGCTGGTCCAGCTCTTCGTGGCTGGGGATACAAGCACAGTTTCACCTCCAGCTGGCAGGAGCCTGGAGCTCAAGGGTCAGGGCAACCCCGTGGAACTGATAACAAAAGCTCGTCTTTTTCTGCTGCAGTTAATACCTCGGTGCCCGAAAAAGAGCTTCTCACACGTGGCAGAGCTGCTGGCTGATCGTGGGGACTGCGACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGCTGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGA(SEQ ID NO: 8); или

ATGTCCGACTCGTGGGTCCCGAACTCCGCCTCGGGCCAGGACCCAGGGGGCCGCCGGAGGGCCTGGGCCGAGCTGCTGGCGGGAAGGGTCAAGAGGGAAAAATATAATCCTGAAAGGGCACAGAAATTAAAGGAATCAGCTGTGCGCCTCCTGCGAAGCCATCAGGACCTGAATGCCCTTTTGCTTGAGGTAGAAGGTCCACTGTGTAAAAAATTGTCTCTCAGCAAAGTGATTGACTGTGACAGTTCTGAGGCCTATGCTAATCATTCTAGTTCATTTATAGGCTCTGCTTTGCAGGATCAAGCCTCAAGGCTGGGGGTTCCCGTGGGTATTCTCTCAGCCGGGATGGTTGCCTCTAGCGTGGGACAGATCTGCACGGCTCCAGCGGAGACCAGTCACCCTGTGCTGCTGACTGTGGAGCAGAGAAAGAAGCTGTCTTCCCTGTTAGAGTTTGCTCAGTATTTATTGGCACACAGTATGTTCTCCCGTCTTTCCTTCTGTCAAGAATTATGGAAAATACAGAGTTCTTTGTTGCTTGAAGCGGTGTGGCATCTTCACGTACAAGGCATTGTGAGCCTGCAAGAGCTGCTGGAAAGCCATCCCGACATGCATGCTGTGGGATCGTGGCTCTTCAGGAATCTGTGCTGCCTTTGTGAACAGATGGAAGCATCCTGCCAGCATGCTGACGTCGCCAGGGCCATGCTTTCTGATTTTGTTCAAATGTTTGTTTTGAGGGGATTTCAGAAAAACTCAGATCTGAGAAGAACTGTGGAGCCTGAAAAAATGCCGCAGGTCACGGTTGATGTACTGCAGAGAATGCTGATTTTTGCACTTGACGCTTTGGCTGCTGGAGTACAGGAGGAGTCCTCCACTCACAAGATCGTGAGGTGCTGGTTCGGAGTGTTCAGTGGACACACGCTTGGCAGTGTAATTTCCACAGATCCTCTGAAGAGGTTCTTCAGTCATACCCTGACTCAGATACTCACTCACAGCCCTGTGCTGAAAGCATCTGATGCTGTTCAGATGCAGAGAGAGTGGAGCTTTGCGCGGACACACCCTCTGCTCACCTCACTGTACCGCAGGCTCTTTGTGATGCTGAGTGCAGAGGAGTTGGTTGGCCATTTGCAAGAAGTTCTGGAAACGCAGGAGGTTCACTGGCAGAGAGTGCTCTCCTTTGTGTCTGCCCTGGTTGTCTGCTTTCCAGAAGCGCAGCAGCTGCTTGAAGACTGGGTGGCGCGTTTGATGGCCCAGGCATTCGAGAGCTGCCAGCTGGACAGCATGGTCACTGCGTTCCTGGTTGTGCGCCAGGCAGCACTGGAGGGCCCCTCTGCGTTCCTGTCATATGCAGACTGGTTCAAGGCCTCCTTTGGGAGCACACGAGGCTACCATGGCTGCAGCAAGAAGGCCCTGGTCTTCCTGTTTACGTTCTTGTCAGAACTCGTGCCTTTTGAGTCTCCCCGGTACCTGCAGGTGCACATTCTCCACCCACCCCTGGTTCCCAGCAAGTACCGCTCCCTCCTCACAGACTACATCTCATTGGCCAAGACACGGCTGGCCGACCTCAAGGTTTCTATAGAAAACATGGGACTCTACGAGGATTTGTCATCAGCTGGGGACATTACTGAGCCCCACAGCCAAGCTCTTCAGGATGTTGAAAAGGCCATCATGGTGTTTGAGCATACGGGGAACATCCCAGTCACCGTCATGGAGGCCAGCATATTCAGGAGGCCTTACTACGTGTCCCACTTCCTCCCCGCCCTGCTCACACCTCGAGTGCTCCCCAAAGTCCCTGACTCCCGTGTGGCGTTTATAGAGTCTCTGAAGAGAGCAGATAAAATCCCCCCATCTCTGTACTCCACCTACTGCCAGGCCTGCTCTGCTGCTGAAGAGAAGCCAGAAGATGCAGCCCTGGGAGTGAGGGCAGAACCCAACTCTGCTGAGGAGCCCCTGGGACAGCTCACAGCTGCACTGGGAGAGCTGAGAGCCTCCATGACAGACCCCAGCCAGCGTGATGTTATATCGGCACAGGTGGCAGTGATTTCTGAAAGACTGAGGGCTGTCCTGGGCCACAATGAGGATGACAGCAGCGTTGAGATATCAAAGATTCAGCTCAGCATCAACACGCCGAGACTGGAGCCACGGGAACACATTGCTGTGGACCTCCTGCTGACGTCTTTCTGTCAGAACCTGATGGCTGCCTCCAGTGTCGCTCCCCCGGAGAGGCAGGGTCCCTGGGCTGCCCTCTTCGTGAGGACCATGTGTGGACGTGTGCTCCCTGCAGTGCTCACCCGGCTCTGCCAGCTGCTCCGTCACCAGGGCCCGAGCCTGAGTGCCCCACATGTGCTGGGGTTGGCTGCCCTGGCCGTGCACCTGGGTGAGTCCAGGTCTGCGCTCCCAGAGGTGGATGTGGGTCCTCCTGCACCTGGTGCTGGCCTTCCTGTCCCTGCGCTCTTTGACAGCCTCCTGACCTGTAGGACGAGGGATTCCTTGTTCTTCTGCCTGAAATTTTGTACAGCAGCAATTTCTTACTCTCTCTGCAAGTTTTCTTCCCAGTCACGAGATACTTTGTGCAGCTGCTTATCTCCAGGCCTTATTAAAAAGTTTCAGTTCCTCATGTTCAGATTGTTCTCAGAGGCCCGACAGCCTCTTTCTGAGGAGGACGTAGCCAGCCTTTCCTGGAGACCCTTGCACCTTCCTTCTGCAGACTGGCAGAGAGCTGCCCTCTCTCTCTGGACACACAGAACCTTCCGAGAGGTGTTGAAAGAGGAAGATGTTCACTTAACTTACCAAGACTGGTTACACCTGGAGCTGGAAATTCAACCTGAAGCTGATGCTCTTTCAGATACTGAACGGCAGGACTTCCACCAGTGGGCGATCCATGAGCACTTTCTCCCTGAGTCCTCGGCTTCAGGGGGCTGTGACGGAGACCTGCAGGCTGCGTGTACCATTCTTGTCAACGCACTGATGGATTTCCACCAAAGCTCAAGGAGTTATGACCACTCAGAAAATTCTGATTTGGTCTTTGGTGGCCGCACAGGAAATGAGGATATTATTTCCAGATTGCAGGAGATGGTAGCTGACCTGGAGCTGCAGCAAGACCTCATAGTGCCTCTCGGCCACACCCCTTCCCAGGAGCACTTCCTCTTTGAGATTTTCCGCAGACGGCTCCAGGCTCTGACAAGCGGGTGGAGCGTGGCTGCCAGCCTTCAGAGACAGAGGGAGCTGCTAATGTACAAACGGATCCTCCTCCGCCTGCCTTCGTCTGTCCTCTGCGGCAGCAGCTTCCAGGCAGAACAGCCCATCACTGCCAGATGCGAGCAGTTCTTCCACTTGGTCAACTCTGAGATGAGAAACTTCTGCTCCCACGGAGGTGCCCTGACACAGGACATCACTGCCCACTTCTTCAGGGGCCTCCTGAACGCCTGTCTGCGGAGCAGAGACCCCTCCCTGATGGTCGACTTCATACTGGCCAAGTGCCAGACGAAATGCCCCTTAATTTTGACCTCTGCTCTGGTGTGGTGGCCGAGCCTGGAGCCTGTGCTGCTCTGCCGGTGGAGGAGACACTGCCAGAGCCCGCTGCCCCGGGAACTGCAGAAGCTACAAGAAGGCCGGCAGTTTGCCAGCGATTTCCTCTCCCCTGAGGCTGCCTCCCCAGCACCCAACCCGGACTGGCTCTCAGCTGCTGCACTGCACTTTGCGATTCAACAAGTCAGGGAAGAAAACATCAGGAAGCAGCTAAAGAAGCTGGACTGCGAGAGAGAGGAGCTATTGGTTTTCCTTTTCTTCTTCTCCTTGATGGGCCTGCTGTCGTCACATCTGACCTCAAATAGCACCACAGACCTGCCAAAGGCTTTCCACGTTTGTGCAGCAATCCTCGAGTGTTTAGAGAAGAGGAAGATATCCTGGCTGGCACTCTTTCAGTTGACAGAGAGTGACCTCAGGCTGGGGCGGCTCCTCCTCCGTGTGGCCCCGGATCAGCACACCAGGCTGCTGCCTTTCGCTTTTTACAGTCTTCTCTCCTACTTCCATGAAGACGCGGCCATCAGGGAAGAGGCCTTCCTGCATGTTGCTGTGGACATGTACTTGAAGCTGGTCCAGCTCTTCGTGGCTGGGGATACAAGCACAGTTTCACCTCCAGCTGGCAGGAGCCTGGAGCTCAAGGGTCAGGGCAACCCCGTGGAACTGATAACAAAAGCTCGTCTTTTTCTGCTGCAGTTAATACCTCGGTGCCCGAAAAAGAGCTTCTCACACGTGGCAGAGCTGCTGGCTGATCGTGGGGACTGCGACCCAGAGGTGAGCGCCGCCCTCCAGAGCAGACAGCAGGCTGCCCCTGACGCTGACCTGTCCCAGGAGCCTCATCTCTTCTGATGA (SEQ ID NO: 36).

[00183] Настоящее изобретение включает плазмиды, содержащие экспрессирующую кассету или кассету для переноса, описанную в настоящем документе. В конкретных вариантах реализации плазмида представляет собой pCCL-PGK-FANCA-WPRE* или pCCL-PGK-FANCAW-82-RO (SEQ ID NO: 25).

[00184] В некоторых вариантах реализации вектор для генной терапии представляет собой самоограничивающийся LV. В конкретном варианте реализации любой из экспрессирующих кассет и векторов для генной терапии, описанных в настоящем документе, кассета для переноса представляет собой pCCL-SIN-cPPT/CTS–hPGK-hFANCA-WPRE согласно настоящему изобретению и содержит или состоит из следующей последовательности или последовательности, характеризующейся не менее чем 80%, не менее чем 85%, не менее чем 90%, не менее чем 95 %, не менее чем 98% или не менее чем 99% идентичностью SEQ ID NO: 24. SEQ ID NO: 24 соответствует плазмиде pCCL-PGK-FANCA-WPRE*. SEQ ID NO: 25 соответствует плазмиде pCCL-PGK-FANCAW-82-RO.

[00185] В одном варианте реализации доставку гена FANCA осуществляют посредством лентивирусного (LV) вектора. Описанные в настоящем документе LV FANCA используют самоинактивирующийся лентивирусный вектор (LV). В одном варианте реализации LV FANCA содержит промотор гена фосфоглицераткиназы человека (PGK). Свойства безопасности этого вектора заметно улучшены по сравнению с уже используемыми в клиниках гамма-ретровирусными векторами, которые несут сильные вирусные промоторы.

[00186] В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор представляет собой PGK-FANCA.WPRE*LV, который содержит кассету для переноса гена, содержащую последовательности, описанные в SEQ ID NO: 24. Фрагмент кассеты для экспрессии гена PGK-FANCA-WPRE*LV содержит промотор PGK человека, кодирующую последовательность кДНК FANCA, и WPRE*; и соответствует нуклеотидам 3541-9178 из SEQ ID NO: 24. Фрагмент кассеты для переноса PGK-FANCA-WPRE*LV содержит область от приблизительно 5'-LTR (U5) до приблизительно 3'-LTR (U5) указанной последовательности. Что касается SEQ ID NO: 24, нуклеотиды 1586-1789 SEQ ID NO: 24 содержат немедленный ранний промотор ЦМВ человека. Нуклеотиды 2031-2156 SEQ ID NO: 24 содержат сигнал упаковки psi ВИЧ1. Нуклеотиды 2649-2882 SEQ ID NO: 24 содержат RRE-элемент HIV1. Нуклеотиды 3378-3495 SEQ ID NO: 24 содержат элемент cPPT/CTS ВИЧ. Нуклеотиды 3541-4051 SEQ ID NO: 24 содержат промотор hPGK. Нуклеотиды 4078-8445 SEQ ID NO: 24 содержат кДНК FANCA-A человека. Нуклеотиды 8502-9178 SEQ ID NO: 24 содержат мутированный элемент WPRE. Нуклеотиды 9262-9495 SEQ ID NO: 24 содержат дельта U 3'-LTR ВИЧ.

[00187] В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор представляет собой pCCL-PGK-FANCAW-82-RO, который содержит кассету для переноса гена, содержащую последовательности, описанные в SEQ ID NO: 25. Фрагмент кассеты для экспрессии гена pCCL-PGK-FANCAW-82-RO содержит промотор PGK человека, кодирующую последовательность кДНК FANCA, и WPRE*; и соответствует нуклеотидам 2335-7888 из SEQ ID NO: 25. Фрагмент кассеты для переноса pCCL-PGK-FANCAW-82-RO содержит область от приблизительно 5'-LTR (U5) до приблизительно 3'-LTR (U5) указанной последовательности. Что касается SEQ ID NO: 25, нуклеотиды 1-577 SEQ ID NO: 25 содержат немедленный ранний промотор ЦМВ человека. Нуклеотиды 889-933 SEQ ID NO: 25 содержат сигнал упаковки psi ВИЧ1. Нуклеотиды 1296-253 SEQ ID NO: 25 содержат RRE-элемент HIV1. Нуклеотиды 2176-2191 SEQ ID NO: 25 содержат элемент cPPT/CTS ВИЧ. Нуклеотиды 2335-2845 SEQ ID NO: 25 содержат промотор hPGK. Нуклеотиды 2872-7242 SEQ ID NO: 25 содержат кДНК FANCA-A человека. Нуклеотиды 7293-7888 SEQ ID NO: 25 содержат мутированный элемент WPRE. Нуклеотиды 8056-8289 SEQ ID NO: 25 содержат дельта U 3'-LTR ВИЧ.

[00188] В еще одном варианте реализации лентивирусный вектор содержит следующие элементы: (i) каркас лентивирусного вектора, полученный из исходного pCCLsin-cppt-hPGK-eGFP-WPRE (Dull et al, 1998; J.Virol 72 (11), 9873-9880). В каркасе pCCL используется гетерологичная 5'-LTR ЦМВ-ВИЧ для получения высоких уровней транскрипции вирусной РНК в клетках-продуцентах. Такая гетерологичная LTR делает конструкцию независимой от необходимости использования белка Tat ВИЧ для продуцирования частиц rHIV и, следовательно, является признаком безопасности. Область U3 3'-LTR содержит делецию 400 п.н., описанную в (Zufferey et al. J Virol, 1998), которая придает вектору свойства самоинактивации; (ii) кДНК гена FANCA, оптимизированного под кодоны человека (номер доступа в GenBank 4368 п.н.: X_99226 или согласно описанию в настоящем документе), кодирующую белок FANCA (1455 АК) под контролем промотора PGK человека. Этот промотор уже известен своей стабильной активностью in vivo и улучшенными свойствами безопасности по сравнению с другими промоторами, уже применяемыми в генной терапии; и (iii) мутированную версию посттранскрипционного регуляторного элемента (WPRE) вируса гепатита сурка, в которой удалена 3'-область последовательности, кодирующей белок X, и любые остаточные ОРС, описанную Schambach et al (Gene therapy, 2006; 13, 641-645), или WPRE*.

[00189] В некоторых вариантах реализации описанные в настоящем документе LV FANCA используют самоинактивирующийся лентивирусный вектор (LV). В одном варианте реализации LV FANCA содержит промотор гена фосфоглицераткиназы человека (PGK). Свойства безопасности этого вектора заметно улучшены по сравнению с уже используемыми в клиниках гамма-ретровирусными векторами, которые несут сильные вирусные промоторы. В одном варианте реализации доставку гена FANCA осуществляют посредством лентивирусного вектора. В некоторых вариантах реализации лентивирусный вектор представляет собой PGK-FANCA.WPRE*LV.

[00190] Векторы для генной терапии, инкапсулирующие полинуклеотидные кассеты согласно настоящему изобретению, можно получать с использованием стандартной методологии. Например, в случае вирионов LV, экспрессирующий LV-вектор согласно настоящему изобретению можно ввести в клетку-продуцент с последующим введением LV-конструкта помощника, причем конструкт-помощник содержит кодирующие области LV, способные экспрессироваться в клетке-продуценте и дополняющие функции LV-помощника, отсутствующие в LV-векторе. Затем выполняют введение вируса-помощника и/или дополнительных векторов в клетку-продуцент, где вирус-помощник и/или дополнительные векторы обеспечивают вспомогательные функции, способные поддерживать эффективную продукцию LV-вируса. Затем клетки-продуценты культивируют с целью продукции LV. Эти действия выполняют с использованием стандартной методологии. В конкретных вариантах реализации плазмиды, изображенные на фигурах 38-41, используют для получения векторов для генной терапии.

[00191] Можно использовать любой подходящий способ получения вирусных векторных частиц для доставки рассматриваемых полинуклеотидных кассет, включая способы, описанные ниже в примерах, но не ограничиваясь ими. Любую концентрацию инфекционных частиц вирусного вектора, подходящую для эффективной трансдукции клеток млекопитающих, можно получить для приведения в контакт с клетками млекопитающих in vitro или in vivo. Например, можно получить состав вирусных частиц 10⁸ инфекционных единиц на мл или более, например, 5×10⁸ инфекционных единиц на мл; 10⁹ инфекционных единиц на мл; 5×10⁹ инфекционных единиц на мл , 10¹⁰ инфекционных единиц на мл , 5×10¹⁰ инфекционных единиц на мл; 10¹¹ инфекционных единиц на мл; 5×10¹¹ инфекционных единиц на мл; 10¹² инфекционных единиц на мл; 5×10¹² инфекционных единиц на мл; 10¹³ инфекционных единиц на мл; 1,5×10¹³ инфекционных единиц на мл; 3×10¹³ инфекционных единиц на мл; 5×10¹³ инфекционных единиц на мл; 7,5×10¹³ инфекционных единиц на мл; 9×10¹³ инфекционных единиц на мл; 1×10¹⁴ инфекционных единиц на мл , 5×10¹⁴ инфекционных единиц на мл или более, но обычно не более 1×10¹⁵ инфекционных единиц на мл .

[00192] При получении рассматриваемых LV-векторов для генной терапии можно использовать любые клетки-хозяева для продуцирования LV-вирионов, включая, например, клетки млекопитающих (например, клетки 293), клетки насекомых (например, клетки SF9), микроорганизмы и дрожжи. Клетки-хозяева также могут являться упаковывающими клетками, причем гены rep и cap LV стабильно поддерживаются в клетке-хозяине или клетках-продуцентах, которые стабильно поддерживают и упаковывают геном LV-вектора. Типичные упаковывающие клетки и клетки-продуценты происходят от клеток SF-9, 293, A549 или HeLa. LV-векторы очищают и получают в виде составов с использованием стандартных способов, известных в данной области техники.

[00193] В некоторых вариантах реализации настоящее изобретение включает клетку, содержащую кассету для экспрессии гена, кассету для переноса гена или вектор для генной терапии, описанные в настоящем документе. В родственных вариантах реализации клетку трансдуцируют вектором для генной терапии, содержащим экспрессирующую кассету, описанную в настоящем документе, или клетка содержит экспрессирующую кассету, описанную в настоящем документе, встроенную в геном клетки. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку, используемую для продукции вирусного вектора для генной терапии, например, упаковывающую клетку.

[00194] В других вариантах реализации клетка представляет собой клетку, подлежащую доставке субъекту в целях введения субъекту генного продукта, кодируемого экспрессирующей кассетой. Таким образом, в некоторых вариантах реализации клетка является аутологичной по отношению к субъекту, подлежащему лечению, или получена от субъекта, подлежащего лечению. В других вариантах реализации клетка является аллогенной по отношению к субъекту, подлежащего лечению, или получена от донора, отличного от субъекта, подлежащего лечению. В конкретных вариантах реализации клетка представляет собой клетку млекопитающего, например, клетку человека. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку крови, эритроцит, гемопоэтическую клетку-предшественник, клетку костного мозга, например, клетку костного мозга после истощения определенного ростка, гемопоэтическую стволовую клетку (например, CD34⁺) или детерминированную гемопоэтическую эритроидную клетку-предшественник. В конкретных вариантах реализации клетка представляет собой CD34⁺-клетку, полученную от субъекта, подлежащего лечению с использованием указанной клетки после ее трансдукции вектором для генной терапии, описанным в настоящем документе. В конкретном варианте реализации клетка представляет собой CD34⁺-клетку АФ, полученную от субъекта с диагнозом АФ.

[00195] В некоторых вариантах реализации способы, описанные в настоящем документе, приводят к терапевтическому благоприятному эффекту, например, предотвращению развития нарушения, прекращению прогрессирования нарушения, обратному прогрессированию нарушения и т.д. Например, в одном варианте реализации нарушение представляет собой НКМ. В одном варианте реализации нарушение представляет собой тромбоцитопению. В еще одном варианте реализации нарушение представляет собой лейкопению. В одном варианте реализации нарушение представляет собой панцитопению. В одном варианте реализации нарушение представляет собой нейтропению. В еще одном варианте реализации нарушение представляет собой анемию. В некоторых вариантах реализации рассматриваемый способ включает этап обнаружения достижения терапевтического благоприятного эффекта. Квалифицированный специалист должен принимать во внимание, что такие меры терапевтической эффективности применимы к конкретному заболеванию, подлежащему модификации, и знать соответствующие способы обнаружения, которые следует использовать для измерения терапевтической эффективности.

[00196] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение включает способ лечения заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, одна или обе из которых контактировали с вектором для генной терапии, например, вирусным вектором, экспрессирующим продукт терапевтического гена в клетках. В конкретных вариантах реализации одна или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, являются аутологичными по отношению к субъекту. В некоторых вариантах реализации клетки представляют собой эритроидные клетки, например, гемопоэтические стволовые клетки или детерминированные гемопоэтические эритроидные клетки-предшественники. В некоторых вариантах реализации клетка представляет собой клетку костного мозга, например, клетку костного мозга после истощения определенного ростка. В конкретных вариантах реализации способ применяют для лечения АФ, а вирусный вектор представляет собой LV, содержащий описанный в настоящем документе экспрессирующий конструкт, содержащий промотор PGK человека, функционально связанный с кДНК или кодирующей последовательностью гена FANCA, и описанный в настоящем документе мутантный wPRE. В конкретных вариантах реализации клетки вводят субъекту парентерально, например, посредством внутривенной инъекции.

[00197] В еще одном варианте реализации настоящее изобретение включает способ лечения АФ у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту эффективного количества популяции аутологичных клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяции стволовых клеток, обогащенной CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцированных LV-вектором, экспрессирующим кДНК FANCA в клетках, причем LV-вектор содержит промотор PGK человека, функционально связанный с кДНК или кодирующей последовательностью FANCA, и описанную в настоящем документе мутированную последовательность wPRE. В конкретных вариантах реализации клетки представляют собой гемопоэтические стволовые клетки или детерминированные гемопоэтические эритроидные клетки-предшественники, например, клетки костного мозга. В конкретных вариантах реализации клетки вводят субъекту парентерально, например, посредством внутривенной инъекции.

[00198] Ожидается, что экспрессия трансгена с использованием рассматриваемого трансгена будет устойчивой. Соответственно, в некоторых случаях экспрессию трансгена, например, обнаруженную путем измерения уровня продукта гена, путем измерения терапевтической эффективности и т.д., можно наблюдать через два месяца или менее после введения, например, через 4, 3 или 2 недели или менее после введения, например, через 1 неделю после введения рассматриваемой композиции. Кроме того, ожидается, что экспрессия трансгена будет сохраняться с течением времени. Соответственно, в некоторых случаях экспрессию трансгена, например, обнаруженную путем измерения уровня продукта гена, путем измерения терапевтической эффективности и т.д., можно наблюдать через 2 месяца или более после введения рассматриваемой композиции, например, через 4, 6, 8 или 10 месяцев или более, в некоторых случаях - через 1 год или более, например, через 2, 3, 4 или 5 лет, в некоторых случаях - более чем через 5 лет.

[00199] В некоторых вариантах реализации способ включает этап обнаружения экспрессии трансгена в клетках или в организме субъекта, причем экспрессия усиливается по сравнению с экспрессией с полинуклеотидной кассеты, не содержащей один или более из улучшенных элементов согласно настоящему изобретению. Как правило, экспрессия усиливается в 2 раза или более по сравнению с экспрессией с эталона, т.е. контрольной полинуклеотидной кассеты, например, известной в данной области техники, например, в 3, 4 или 5 или более раз, в некоторых случаях в 10, 20 или 50 или более раз, например, в 100 раз, на что указывает, например, более раннее обнаружение, более высокие уровни продукта гена, более сильное функциональное воздействие на клетки и т. д.

[00200] В некоторых вариантах реализации доза клеток, которую пациенты получают путем вливания, равна дозе, полученной в процессе трансдукции. В различных предпочтительных вариантах реализации пациенту вливают по меньшей мере приблизительно 1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸ или более клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости/кг массы тела пациента. В различных предпочтительных вариантах реализации пациенту вливают по меньшей мере приблизительно 1×10¹, 1×10², 1×10³, 1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶, 1×10⁷, 1×10⁸ или более клеток, обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах реализации пациенту вливают от 1×10⁶ до 4x10⁶ клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости/кг массы тела пациента. В других вариантах реализации пациенту вливают 3×10⁵ и 4×10⁶ клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах реализации пациенту вливают от 1×10⁶ до 4×10⁶ клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости/кг массы тела пациента. В других вариантах реализации пациенту вливают 3×10⁶ и 4×10⁶ клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости/кг массы тела пациента. В некоторых вариантах реализации клетки вливают пациенту в виде однократной дозы. В других вариантах реализации клетки вливают пациенту в виде многократных доз (например, популяции клеток, обогащенные по CD34 в условиях высокой и низкой жесткости, последовательно вводят один или более раз). Трансдуцированные клетки можно вливать непосредственно после завершения процесса трансдукции. В конкретных вариантах реализации трансдуцированные клетки хранят или замораживают перед применением, тогда как в некоторых вариантах реализации их вводят субъекту немедленно или вскоре после трансдукции, например, в течение одного часа, двух часов, четырех часов или восьми часов.

[00201] После встраивания терапевтический белок (например, белок FANCA человека) экспрессируется клетками. Трансдуцированные клетки АФ подвергаются генетической коррекции и, таким образом, способны активировать путь АФ посредством моноубиквитинилирования FANCD2 и FANCI. Эти белки мигрируют в области повреждения ДНК и, взаимодействуя с другими белками репарации ДНК, способствуют репарации ДНК в этих клетках, как это происходит в здоровых клетках.

[00202] Как более подробно описано в разделе «Примеры», доклинические данные, полученные in vitro с использованием образцов КМ от пациентов-людей с АФ, уже продемонстрировали эффективность LV FANCA для коррекции фенотипа этих клеток.

[00203] В одном варианте реализации вводят по меньшей мере от 1 to 4 × 10⁶ CD34⁺-клеток после коррекции (например, ГСК, трансдуцированных FANCA) на килограмм массы тела пациента, например, для восстановления гемопоэза у пациента с АФ бе. В некоторых вариантах реализации трансдуцированные клетки вливают или вводят пациенту непосредственно после трансдукции. В других вариантах реализации трансдуцированные клетки замораживают перед вливанием или введением пациенту.

[00204] Генетическая коррекция ГСК пациентов с АФ с последующей аутологичной трансплантацией этих клеток (гемопоэтическая генная терапия) является хорошей альтернативой для пациентов с АФ, особенно для пациентов, у которых нет HLA-идентичного брата или сестры. В одном варианте реализации гемопоэтическая генная терапия является предпочтительной схемой лечения для пациента, у которого нет HLA-идентичного брата или сестры. В еще одном варианте реализации гемопоэтическая генная терапия является предпочтительной схемой лечения для пациента, у которого есть HLA-идентичный брат или сестра.

Композиции и составы

[00205] Некоторые аспекты настоящего изобретения относятся к системе или комбинации популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, любая или обе из которых трансдуцированы вектором для генной терапии. Некоторые варианты реализации включают комбинацию популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости и обогащенных CD34 в условиях низкой жесткости, любая или обе из которых трансдуцированы лентивирусным вектором, содержащим ген FANC человека, например, FANCA, FANCC или FANCG, или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок FANC, включая его функциональные варианты и фрагменты. Некоторые варианты реализации включают комбинацию популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости и обогащенных по CD34 в условиях низкой жесткости, любую или обе из которых подвергали редактированию или репарации гена, например, с помощью системы редактирования генов на основе CRISPR, TALEN, белка с доменом цинкового пальца или мегануклеазы. Некоторые варианты реализации включают комбинацию популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости и обогащенных CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцированных лентивирусным (или другим вирусным) вектором, содержащим трансген, ассоциированный с заболеванием или состоянием, например, иммунодефицитным нарушением.

[00206] В некоторых аспектах настоящего изобретения предложены составы для лечения заболевания или состояния. Составы могут содержать популяцию(и) клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости и/или популяцию(и) клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, вместе с физиологически приемлемым носителем или фармацевтически приемлемым носителем, описанным в настоящем документе. Составы могут содержать популяцию(и) клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяцию(и) клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, причем одна или обе популяции клеток трансдуцированы вектором для генной терапии и экспрессируют или способны экспрессировать терапевтический агент, вместе с физиологически приемлемым носителем или фармацевтически приемлемым носителем, описанным в настоящем документе.

[00207] Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции и составы, содержащие одну или обе из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, вектор для генной терапии, описанный в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель или вспомогательное вещество. Рассматриваемую популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, и/или популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, можно объединять с фармацевтически приемлемыми носителями, разбавителями и реагентами, пригодными для получения состава, который в общем случае является безопасным, нетоксичным и желательным и включает вспомогательные вещества, приемлемые для применения у приматов. Примеры таких вспомогательных веществ, носителей или разбавителей включают воду, физиологический раствор, растворы Рингера, раствор декстрозы и 5% человеческий сывороточный альбумин, но не ограничиваются ими. В составы также можно включать дополнительные активные вещества. Растворы или суспензии, используемые для составов, могут включать стерильный разбавитель, например, воду для инъекций, физиологический раствор, диметилсульфоксид (ДМСО), нелетучие масла, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные соединения, например, бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, например, аскорбиновую кислоту или бисульфит натрия; хелатирующие соединения, например, этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА); буферные соединения, например, ацетаты, цитраты или фосфаты; детергенты, например, Tween 20, для предотвращения агрегации; и соединения для регулирования тоничности, например, хлорид натрия или декстрозу. pH можно регулировать с помощью кислот или оснований, например, соляной кислоты или гидроксида натрия. В конкретных вариантах реализации составы стерильны.

[00208] В некоторых вариантах реализации обогащенные CD34 популяции клеток получают в соответствии с действующим изданием надлежащей производственной практики. Производство в соответствии с действующим изданием надлежащей производственной практики означает, что состав, изготовленный для введения, достаточно безопасен для его введения человеку в соответствии с нормативно-правовыми положениями и государственными разрешениями. Как правило, нормативно-правовые положения и разрешения требуют соответствия состава заранее утвержденным критериям приемлемости в отношении подлинности, концентрации, качества и чистоты. Критерии приемлемости включают численные пределы, диапазоны или другие подходящие меры результатов испытаний, используемые для определения соответствия состава действующему изданию надлежащей производственной практики. В требуемых характеристиках изложены аналитические процедуры, используемые для проверки соответствия критериям приемлемости. Составы можно оценивать сериями. Серия - это определенное количество состава, испытанное на соответствие критериям приемлемости.

[00209] Составы можно помещать в контейнер, упаковку или дозатор, например, шприц, например, предварительно заполненный шприц, вместе с инструкциями по введению.

[00210] При необходимости или наличии преимуществ этого составы могут включать местный анестетик, например, лидокаин, для облегчения боли в месте инъекции.

[00211] Терапевтически эффективное количество клеток в составах может составлять более 102 клеток, более 103 клеток, более 104 клеток, более 105 клеток, более 106 клеток, более 107 клеток, более 10⁸ клеток, более 109 клеток, более 1010 клеток или более 1011 клеток.

[00212] В составах, описанных в настоящем документе, клетки обычно находятся в объеме, равном литру или менее, 500 мл или менее, 250 мл или менее или 100 мл или менее. Следовательно, плотность вводимых клеток обычно превышает 104 клеток/мл, 107 клеток/мл или 10⁸ клеток/мл.

[00213] Описанные в настоящем документе составы можно изготовить для введения, например, путем инъекции, вливания, перфузии или лаважа. Терапевтически эффективные количества для введения могут включать более 102 клеток, более 103 клеток, более 104 клеток, более 105 клеток, более 106 клеток, более 107 клеток, более 108 клеток, более 109 клеток, более 1010 клеток или более 1011 клеток. В конкретных вариантах реализации минимальная доза составляет 2×106 клеток/кг массы тела пациента.

[00214] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем документе, содержит терапевтически эффективное количество одной или обеих из популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях высокой жесткости, и популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости, описанных в настоящем документе, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем и/или вспомогательным веществом, например, физиологическим раствором, физиологическим раствором с фосфатным буфером, фосфатом и аминокислотами, полимерами, полиолами, углеводами, буфервми, консервантами и другими белками. Примеры аминокислот, полимеров, углеводов и т.п. представляют собой соединения октилфеноксиполиэтоксиэтанола, моностеаратные соединения полиэтиленгликоля, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, сахарозу, фруктозу, декстрозу, мальтозу, глюкозу, маннит, декстран, сорбит, инозит, галактит, ксилит, лактозу, трегалозу, бычий или человеческий сывороточный альбумин, цитрат, ацетат, растворы Рингера и Хэнка, цистеин, аргинин, карнитин, аланин, глицин, лизин, валин, лейцин, поливинилпирролидон, полиэтилен и гликоль. Этот состав предпочтительно стабилен в течение не менее шести месяцев при 4°C.

[00215] В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция, предложенная в настоящем документе, содержит буфер, например, физиологический раствор с фосфатным буфером (ФСБ) или фосфат натрия/сульфат натрия, трис-буфер, глициновый буфер, стерильную воду и другие буферы, известные специалисту в данной области техники, например, описанные в статье Good et al. (1966) Biochemistry 5:467. pH буфера, содержащего фармацевтическую композицию, содержащую ген-супрессор опухолей в системе доставки на основе аденовирусного вектора, может находиться в диапазоне от 6,5 до 7,75, предпочтительно от 7 до 7,5 и наиболее предпочтительно - от 7,2 до 7,4.

[00216] Все публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки для раскрытия и описания способов и/или материалов, в связи с которыми цитируются публикации. Подразумевается, что настоящее описание заменяет любое описание включенной публикации в той степени, в которой существует противоречие.

[00217] Кроме того, следует отметить, что формулу изобретения можно составить, исключая из нее любой необязательный элемент. По существу, подразумевают, что это положение служит первоначальной основой использования такой исключающей терминологии, как «исключительно», «только» и т.п. в связи с повторным упоминанием элементов формулы изобретения, или использования "негативного" ограничения.

[00218] Публикации, обсуждаемые в настоящем документе, приведены исключительно для их описания до даты подачи настоящей заявки. Кроме того, представленные даты публикации могут отличаться от фактических дат публикации, которые могут нуждаться в независимом подтверждении.

[00219] Поскольку FA-A является наиболее частой группой комплементации у пациентов с АФ (Casado et al., 2007,Taniguchi et al., 2006), векторы, экспрессирующие ген FANCA и/или маркерный ген EGFP, находятся в центре внимания в разделе «Примеры»; однако для аналогичного лечения других групп комплементации можно использовать другие гены FANCA.

[00220] Настоящее изобретение дополнительно описано в следующих примерах, которые не ограничивают сущность изобретения, описанную в формуле изобретения.

Примеры

Пример 1

Лечение пациентов с использованием популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой и низкой жесткости

[00221] Пациент 1 поступил в медицинское учреждение с анемией Фанкони. После этого пациент 1 прошел мобилизацию с использованием ГКСФ и плериксафора, а затем - два сбора клеток путем афереза в течение двух последовательных дней. По сравнению с другими пациентами с АФ, участвовавшими в том же клиническом исследовании, пациент 1 характеризовался умеренной мобилизацией CD34-клеток, о чем свидетельствует анализ циркулирующих CD34-клеток в периферической крови, причем кинетика мобилизации была аналогична кинетике у других пациентов. После двух сборов путем афереза собранные ГСКП разделили на два биологических образца периферической крови.

[00222] Отбор CD34 в условиях высокой жесткости: Первый биологический образец обогащали путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости с использованием системы Miltenyi Biotec CliniMACS® в режиме обогащения с помощью реагента Miltenyi Biotec CD34 для обогащения, как описано в патенте США № 8727132. Отбор CD34 в условиях высокой жесткости привел к 29,0% выходу CD34⁺-клеток и относительной чистоте, равной 36%.

[00223] Отбор CD34 в условиях низкой жесткости: Второй биологический образец обогащали путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости с использованием модификации режима истощения системы Miltenyi Biotec CliniMACS®. Вкратце, второй биологический образец метили с использованием реагента Miltenyi Biotec CD34. Затем образец загружали на колонку с использованием программы режима истощения для данного прибора. После загрузки образца наливом с включенным магнитом пакет для сбора клеток (используемый при нормальной работе прибора для сбора клеток-мишеней) удаляли и не использовали для трансплантации стволовых клеток. Присоединяли «пакет для неспецифических клеток», затем выключали магнит и наносили элюирующий буфер на прибор, что привело к элюированию CD34⁺-клеток в пакет для неспецифичных клеток. Популяцию клеток, собранную в пакет для неспецифичных клеток, хранили и обозначали как популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости. Отбор CD34 в условиях низкой жесткости привел к 54,5% выходу CD34⁺-клеток при относительной чистоте, равной 5,8%. Низкая чистота обусловлена присутствием гемопоэтических клеток других видов, которые не были отделены от CD34⁺-клеток в процессе отбора. Сводные результаты приведены в таблицах 1A и 1B.

Таблица 1A: До обогащения CD34

Таблица 1B: После обогащения CD34

Начальное количество клеток и чистота CD34⁺-клеток и полученные популяции клеток у пациента с анемией Фанкони-A

Aph: аферез

TNC: Общее количество ядросодержащих клеток

Низк.: Модифицированная программа истощения CliniMACS

Выс.: Стандартная программа обогащения CD34 CliniMACS

[00224] Впоследствии как популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, так и популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, по отдельности трансдуцировали рекомбинантным вектором для генной терапии (PGK-FANCA-WPRE*) (SEQ ID NO: 25), кодирующим продукт гена FANCA, и полученные генетически модифицированные клетки обозначали как продукт 1.1 и продукт 1.2, соответственно.

[00225] Продукт 1.1 и продукт 1.2 смешивали друг с другом, а затем вводили пациенту 1 путем непрерывного внутривенного вливания в течение 10-30 минут, контролируя клинические показатели.

[00226] Пациент 1 продемонстрировал самую быструю или почти самую быструю кинетику селективного энграфтмента in vivo среди всех пациентов с АФ, подвергшихся трансплантации в участвующих учреждениях. Ранние тенденции стабилизации гемопоэтических линий, которые были угнетены у этого пациента с АФ до трансплантации, являются убедительным конечным показателем клинического успеха, неожиданно достигнутого при этом способе лечения. Пять других пациентов с АФ подвергли трансплантации с использованием стандартных подходов отбора CD34, и ни один из них не демонстрировал кинетики энграфтмента, сопоставимой с кинетикой у пациента 1.

[00227] Безотносительно к теоретическим представлениям считается, что смесь популяций клеток, обогащенных по CD34 в условиях высокой жесткости (продукт 1.1) и низкой жесткости (продукт 1.2), дает селективное преимущество генно-модифицированным гемопоэтическим клеткам АФ in vivo и приводит к прогрессивному увеличению генно-модифицированных клеток с течением времени. Предполагается, что продукт 1.1 (популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях высокой жесткости) обеспечивает большую часть генно-модифицированных клеток, способствующих гемопоэзу, а продукт 1.2 (популяция клеток, обогащенная по CD34 в условиях низкой жесткости) способствует надежному энграфтменту клеток и репопуляции кроветворных клеток продуктом 1.1.

Пример 2

Сравнительная эффективность лечения популяцией клеток после истощения ростка

[00228] Пациент 2 поступил в медицинское учреждение с анемией Фанкони. Биологический образец периферической крови получили от пациента 2 путем мобилизованного афереза с использованием процедур, эквивалентных процедурам, описанным в примере 1. Популяцию клеток после истощения ростка получали путем мечения биологического образца реагентом CD3/CD14/CD16/CD19 и истощения образца меченых клеток с использованием системы Miltenyi Biotec CliniMACS® в режиме истощения. Селекция CD34 после истощения ростка привела к 56% выходу CD34⁺-клеток при относительной чистоте, равной 1,6%. Низкая чистота обусловлена присутствием гемопоэтических клеток других видов, которые не были отделены от CD34⁺-клеток в процессе отбора. Выход и чистота клеток CD34 были сравнимы с таковыми, достигнутыми у пациента 1 в популяции клеток, обогащенной по CD34 в условиях низкой жесткости. Популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, не получали. Популяцию клеток после истощения ростка трансдуцировали рекомбинантным вектором для генной терапии, кодирующим продукт гена FANCA, и обозначили как продукт 2.1.

[00229] Продукт 2.1 вводили пациенту 2 путем непрерывного внутривенного вливания в течение 10-30 минут, контролируя клинические показатели количества клеток, сопоставимые с показателями, использованными для пациента 1. В отличие от пациента 1, через шесть месяцев после трансплантации в крови пациента 2 не удалось обнаружить генно-модифицированные клетки. Таким образом, продукт 2.1, который считался аналогичным отдельно взятому продукту 1.2, не приводил к обнаружимому восстановлению кроветворения.

Пример 3

Модификация условий низкой жесткости для повышения выхода и лечение полученными популяциями клеток

[00230] Пациент 3 поступил в медицинское учреждение с анемией Фанкони. Биологический образец периферической крови получили от пациента 3 путем мобилизованного афереза с использованием процедур, эквивалентных процедурам, описанным в примере 1. После сбора клеток путем афереза собранные ГСКП разделили на два биологических образца периферической крови.

[00231] Отбор CD34 в условиях высокой жесткости: Первый биологический образец обогащали путем отбора CD34⁺-клеток в условиях высокой жесткости с использованием системы Miltenyi Biotec CliniMACS® в режиме обогащения с помощью реагента Miltenyi Biotec CD34 для обогащения, как описано в примере 1. Отбор CD34 в условиях высокой жесткости привел к более чем 20% выходу CD34⁺-клеток и относительной чистоте, равной более 20%. Программу отбора CD34 в системе CliniMACS® запускали с использованием образца, описанного выше, с параметрами, указанными в таблице 2. Продолжительность процесса составляла приблизительно 20-30 минут. «Пакет для клеток-мишеней» системы CliniMACS® содержал популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости.

Таблица 2

[00232] Отбор CD34 в условиях низкой жесткости: Второй биологический образец обогащали путем отбора CD34⁺-клеток в условиях низкой жесткости с использованием модификации режима истощения системы Miltenyi Biotec CliniMACS®, как описано в примере 1, причем модификация была предназначена для обеспечения более высокого выхода CD34⁺-клеток по сравнению с обогащением в условиях низкой жесткости, использованным для пациента 1.

[00233] Продукт афереза периферической крови с добавлением раствора антикоагулянта цитрат-декстрозы (ACD-A), получали в количестве от 60×10⁹ до 6×10⁸ общих клеток (при использовании одного флакона с реагентом для мечения CD34) или от 120⁹ до 12×10⁸ общих клеток (при использовании двух флаконов с реагентом для мечения CD34). Количество клеток, жизнеспособность клеток и количество субпопуляций CD3⁺-, CD19⁺- или CD34⁺-клеток измеряли в ламинарном боксе в стерильных условиях. Продукт афереза переносили в пакет для переноса, который заполняли до объема 600 мл физиологическим раствором с фосфатным буфером (ФСБ). Содержимое центрифугировали при 230 G в течение 15 минут, надосадочную жидкость удаляли, оставляя 90 мл, к которым добавляли 5 мл иммуноглобулина с последующим перемешиванием при комнатной температуре в течение 10 минут. В пакет вводили один или два 7,5-мл флакона с реагентом CliniMACS® CD34, перемешивали и инкубировали при перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Клетки центрифугировали при 230 G в течение 15 минут и ресуспендировали в 150 мл ФСБ.

[00234] Программу отбора CD34 в системе CliniMACS® запускали с использованием образца, описанного выше, с параметрами, указанными в таблице 2. Продолжительность процесса составляла приблизительно 20-30 минут. Программу прерывали до начала стадий промывки, обогащенные CD34-клетки и другие неспецифические клетки смывали в «пакет для клеток-мишеней». «Пакет для клеток-мишеней» системы CliniMACS® содержал популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости. «Пакет для неспецифических клеток» системы CliniMACS® содержал неспецифические клетки.

[00235] Отбор CD34 в условиях низкой жесткости привел к приблизительно 35-60% выходу CD34⁺-клеток и относительной чистоте, равной приблизительно 10-30%.

[00236] Затем как популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях высокой жесткости, так и популяцию клеток, обогащенную по CD34 в условиях низкой жесткости, трансдуцировали или объединяли и трансдуцировали рекомбинантным вектором для генной терапии, кодирующим продукт гена FANCA, как описано в Примере 1, и получали генетически модифицированные клетки, обозначенные как продукт 3.1 и продукт 3.2, соответственно.

[00237] Трансдуцированные по отдельности продукт 3.1 и продукт 3.2 смешивали друг с другом, а затем внутривенно болюсно вводили пациенту 3.

[00238] Пациент 3 демонстрировал быструю кинетику селективного энграфтмента in vivo. Данный протокол лечения приводил к стабилизации различных ростков гемопоэза, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов. Стабилизация гемопоэтических линий, угнетенных у пациента 3 до трансплантации, является убедительным конечным показателем клинического успеха.

Пример 4

Генная терапия с использованием CRISPR-Cas и популяций клеток, обогащенных по CD34 в условяих высокой и низкой жесткости

[00239] У дополнительных пациентов выполняли отбор биологических образцов и получали популяции клеток, обогащенные по CD34 в условиях высокой и низкой жесткости, как описано в примере 3. Разработали рекомбинантную генную терапию, предназначенную для доставки системы редактирования генов, способной к направленной репарации эндогенного гена FANC. Система редактирования генов включала белок Cas или полинуклеотид, кодирующий белок Cas; нРНК; и матрицу для репарации. Матрица для репарации содержала фрагмент последовательности, перекрывающий известную мутацию(и) в гене FANC (например, FANCA) у дополнительных пациентов. Одну или обе популяции, обогащенные по CD34 в условиях высокой и низкой жесткости, приводили в контакт с рекомбинантным вектором для генной терапии, а затем смеси двух популяций клеток, обогащенных по CD34, аутологически трансплантировали каждому из пациентов. Пациенты демонстрировали быструю кинетику селективного энграфтмента in vivo. Данный протокол лечения приводил к усилению различных ростков гемопоэза, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов. Восстановление гемопоэтических линий, угнетенных у пациентов до трансплантации, является убедительным конечным показателем клинического успеха.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Рокит Фармасьютикалз, Лтд.

Фундасьон Пара Ла Инвестигасьон Биомедика Дель Хоспиталь Инфантиль

Университарио Нино Хесус

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ТРАНСПЛАНТАЦИИ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК

<130> ROPA-008/01WO 326219-2068

<150> US 62/656 292

<151> 11.04.2018

<160> 37

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 234

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный элемент Rev-ответа

<400> 1

aggagctttg ttccttgggt tcttgggagc agcaggaagc actatgggcg cagcgtcaat

60

gacgctgacg gtacaggcca gacaattatt gtctggtata gtgcagcagc agaacaattt

120

gctgagggct attgaggcgc aacagcatct gttgcaactc acagtctggg gcatcaagca

180

gctccaggca agaatcctgg ctgtggaaag atacctaaag gatcaacagc tcct

234

<210> 2

<211> 126

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сигнала упаковки

<400> 2

ctctctcgac gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga

60

ctggtgagta cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag

120

agcgtc

126

<210> 3

<211> 181

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная укороченная последовательность 5ʹ-LTR ВИЧ-1

<400> 3

gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct ctggctaact agggaaccca

60

ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag tagtgtgtgc ccgtctgttg

120

tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt cagtgtggaa aatctctagc

180

a

181

<210> 4

<211> 234

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная укороченная самоинактивирующаяся

последовательность 3ʹ-LTR ВИЧ-1

<400> 4

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc

60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta

120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact

180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca

234

<210> 5

<211> 204

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный немедленный ранний промотор цитомегаловируса

человека

<400> 5

gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt

60

ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac

120

tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg

180

tgggaggtct atataagcag agct

204

<210> 6

<211> 118

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный центральный полипуриновый тракт и центральная

последовательность терминации ВИЧ-1

<400> 6

ttttaaaaga aaagggggga ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat

60

agcaacagac atacaaacta aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaatttt

118

<210> 7

<211> 511

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность промотора

фосфоглицераткиназы 1 человека

<400> 7

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc

60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc

120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc

180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac

240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc

300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag

360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct

420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct

480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g

511

<210> 8

<211> 4368

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кодон-оптимизированная последовательность FANCA

<400> 8

atgtccgact cgtgggtccc gaactccgcc tcgggccagg acccaggggg ccgccggagg

60

gcctgggccg agctgctggc gggaagggtc aagagggaaa aatataatcc tgaaagggca

120

cagaaattaa aggaatcagc tgtgcgcctc ctgcgaagcc atcaggacct gaatgccctt

180

ttgcttgagg tagaaggtcc actgtgtaaa aaattgtctc tcagcaaagt gattgactgt

240

gacagttctg aggcctatgc taatcattct agttcattta taggctctgc tttgcaggat

300

caagcctcaa ggctgggggt tcccgtgggt attctctcag ccgggatggt tgcctctagc

360

gtgggacaga tctgcacggc tccagcggag accagtcacc ctgtgctgct gactgtggag

420

cagagaaaga agctgtcttc cctgttagag tttgctcagt atttattggc acacagtatg

480

ttctcccgtc tttccttctg tcaagaatta tggaaaatac agagttcttt gttgcttgaa

540

gcggtgtggc atcttcacgt acaaggcatt gtgagcctgc aagagctgct ggaaagccat

600

cccgacatgc atgctgtggg atcgtggctc ttcaggaatc tgtgctgcct ttgtgaacag

660

atggaagcat cctgccagca tgctgacgtc gccagggcca tgctttctga ttttgttcaa

720

atgtttgttt tgaggggatt tcagaaaaac tcagatctga gaagaactgt ggagcctgaa

780

aaaatgccgc aggtcacggt tgatgtactg cagagaatgc tgatttttgc acttgacgct

840

ttggctgctg gagtacagga ggagtcctcc actcacaaga tcgtgaggtg ctggttcgga

900

gtgttcagtg gacacacgct tggcagtgta atttccacag atcctctgaa gaggttcttc

960

agtcataccc tgactcagat actcactcac agccctgtgc tgaaagcatc tgatgctgtt

1020

cagatgcaga gagagtggag ctttgcgcgg acacaccctc tgctcacctc actgtaccgc

1080

aggctctttg tgatgctgag tgcagaggag ttggttggcc atttgcaaga agttctggaa

1140

acgcaggagg ttcactggca gagagtgctc tcctttgtgt ctgccctggt tgtctgcttt

1200

ccagaagcgc agcagctgct tgaagactgg gtggcgcgtt tgatggccca ggcattcgag

1260

agctgccagc tggacagcat ggtcactgcg ttcctggttg tgcgccaggc agcactggag

1320

ggcccctctg cgttcctgtc atatgcagac tggttcaagg cctcctttgg gagcacacga

1380

ggctaccatg gctgcagcaa gaaggccctg gtcttcctgt ttacgttctt gtcagaactc

1440

gtgccttttg agtctccccg gtacctgcag gtgcacattc tccacccacc cctggttccc

1500

agcaagtacc gctccctcct cacagactac atctcattgg ccaagacacg gctggccgac

1560

ctcaaggttt ctatagaaaa catgggactc tacgaggatt tgtcatcagc tggggacatt

1620

actgagcccc acagccaagc tcttcaggat gttgaaaagg ccatcatggt gtttgagcat

1680

acggggaaca tcccagtcac cgtcatggag gccagcatat tcaggaggcc ttactacgtg

1740

tcccacttcc tccccgccct gctcacacct cgagtgctcc ccaaagtccc tgactcccgt

1800

gtggcgttta tagagtctct gaagagagca gataaaatcc ccccatctct gtactccacc

1860

tactgccagg cctgctctgc tgctgaagag aagccagaag atgcagccct gggagtgagg

1920

gcagaaccca actctgctga ggagcccctg ggacagctca cagctgcact gggagagctg

1980

agagcctcca tgacagaccc cagccagcgt gatgttatat cggcacaggt ggcagtgatt

2040

tctgaaagac tgagggctgt cctgggccac aatgaggatg acagcagcgt tgagatatca

2100

aagattcagc tcagcatcaa cacgccgaga ctggagccac gggaacacat tgctgtggac

2160

ctcctgctga cgtctttctg tcagaacctg atggctgcct ccagtgtcgc tcccccggag

2220

aggcagggtc cctgggctgc cctcttcgtg aggaccatgt gtggacgtgt gctccctgca

2280

gtgctcaccc ggctctgcca gctgctccgt caccagggcc cgagcctgag tgccccacat

2340

gtgctggggt tggctgccct ggccgtgcac ctgggtgagt ccaggtctgc gctcccagag

2400

gtggatgtgg gtcctcctgc acctggtgct ggccttcctg tccctgcgct ctttgacagc

2460

ctcctgacct gtaggacgag ggattccttg ttcttctgcc tgaaattttg tacagcagca

2520

atttcttact ctctctgcaa gttttcttcc cagtcacgag atactttgtg cagctgctta

2580

tctccaggcc ttattaaaaa gtttcagttc ctcatgttca gattgttctc agaggcccga

2640

cagcctcttt ctgaggagga cgtagccagc ctttcctgga gacccttgca ccttccttct

2700

gcagactggc agagagctgc cctctctctc tggacacaca gaaccttccg agaggtgttg

2760

aaagaggaag atgttcactt aacttaccaa gactggttac acctggagct ggaaattcaa

2820

cctgaagctg atgctctttc agatactgaa cggcaggact tccaccagtg ggcgatccat

2880

gagcactttc tccctgagtc ctcggcttca gggggctgtg acggagacct gcaggctgcg

2940

tgtaccattc ttgtcaacgc actgatggat ttccaccaaa gctcaaggag ttatgaccac

3000

tcagaaaatt ctgatttggt ctttggtggc cgcacaggaa atgaggatat tatttccaga

3060

ttgcaggaga tggtagctga cctggagctg cagcaagacc tcatagtgcc tctcggccac

3120

accccttccc aggagcactt cctctttgag attttccgca gacggctcca ggctctgaca

3180

agcgggtgga gcgtggctgc cagccttcag agacagaggg agctgctaat gtacaaacgg

3240

atcctcctcc gcctgccttc gtctgtcctc tgcggcagca gcttccaggc agaacagccc

3300

atcactgcca gatgcgagca gttcttccac ttggtcaact ctgagatgag aaacttctgc

3360

tcccacggag gtgccctgac acaggacatc actgcccact tcttcagggg cctcctgaac

3420

gcctgtctgc ggagcagaga cccctccctg atggtcgact tcatactggc caagtgccag

3480

acgaaatgcc ccttaatttt gacctctgct ctggtgtggt ggccgagcct ggagcctgtg

3540

ctgctctgcc ggtggaggag acactgccag agcccgctgc cccgggaact gcagaagcta

3600

caagaaggcc ggcagtttgc cagcgatttc ctctcccctg aggctgcctc cccagcaccc

3660

aacccggact ggctctcagc tgctgcactg cactttgcga ttcaacaagt cagggaagaa

3720

aacatcagga agcagctaaa gaagctggac tgcgagagag aggagctatt ggttttcctt

3780

ttcttcttct ccttgatggg cctgctgtcg tcacatctga cctcaaatag caccacagac

3840

ctgccaaagg ctttccacgt ttgtgcagca atcctcgagt gtttagagaa gaggaagata

3900

tcctggctgg cactctttca gttgacagag agtgacctca ggctggggcg gctcctcctc

3960

cgtgtggccc cggatcagca caccaggctg ctgcctttcg ctttttacag tcttctctcc

4020

tacttccatg aagacgcggc catcagggaa gaggccttcc tgcatgttgc tgtggacatg

4080

tacttgaagc tggtccagct cttcgtggct ggggatacaa gcacagtttc acctccagct

4140

ggcaggagcc tggagctcaa gggtcagggc aaccccgtgg aactgataac aaaagctcgt

4200

ctttttctgc tgcagttaat acctcggtgc ccgaaaaaga gcttctcaca cgtggcagag

4260

ctgctggctg atcgtgggga ctgcgaccca gaggtgagcg ccgccctcca gagcagacag

4320

caggctgccc ctgacgctga cctgtcccag gagcctcatc tcttctga

4368

<210> 9

<211> 380

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность энхансера ЦМВ человека

<400> 9

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc

60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca

120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga

180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc

240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct

300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat

360

tagtcatcgc tattaccatg

380

<210> 10

<211> 122

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сигнала полиА вируса обезьян

40

<400> 10

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca

60

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct

120

ta

122

<210> 11

<211> 136

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сайта инициации репликации

вируса обезьян 40

<400> 11

atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg actaattttt

60

tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa gtagtgagga

120

ggcttttttg gaggcc

136

<210> 12

<211> 28

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный центральный полипуриновый тракт и центральная

последовательность терминации ВИЧ-1

<400> 12

tttaaaagaa aaggggggat tggggggt

28

<210> 13

<211> 83

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сигнала dNEF

<400> 13

gaattcgagc tcggtacctt taagaccaat gacttacaag gcagctgtag atcttagcca

60

ctttttaaaa gaaaaggggg gac

83

<210> 14

<211> 795

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность KanR

<400> 14

atgattgaac aagatggatt gcacgcaggt tctccggcgg cttgggtgga gaggctattc

60

ggctatgact gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca

120

gcgcaggggc gtccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg

180

caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gcgacgacgg gcgttccttg cgcggctgtg

240

ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag

300

gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg

360

cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc

420

atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa

480

gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgtc tatgcccgac

540

ggcgaggatc tcgtcgtgac ccacggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat

600

ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cgtctgggtg tggcggaccg ctatcaggac

660

atagcgttgg ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc

720

cttgtgcttt acggtatcgc cgcgcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt

780

gacgagttct tctga

795

<210> 15

<211> 137

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность терминатора rrnG

<400> 15

gcattggcgc agaaaaaaat gcctgatgcg acgctgcgcg tcttatactc ccacatatgc

60

cagattcagc aacggatacg gcttccccaa cttgcccact tccatacgtg tcctccttac

120

cagaaattta tccttaa

137

<210> 16

<211> 589

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный сайт инициации репликации высококопийных ColE1,

pMB1, pBR322,

pUC

<400> 16

ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa acaaaaaaac caccgctacc

60

agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt tttccgaagg taactggctt

120

cagcagagcg cagataccaa atactgttct tctagtgtag ccgtagttag gccaccactt

180

caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc

240

tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa

300

ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac

360

ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg

420

gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga acaggagagc gcacgaggga

480

gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact

540

tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc ctatggaaa

589

<210> 17

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный сайт связывания CAP

<400> 17

taatgtgagt tagctcactc at

22

<210> 18

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность lac-промотора

<400> 18

tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt g

31

<210> 19

<211> 17

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность lac-оператора

<400> 19

ttgtgagcgg ataacaa

17

<210> 20

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность промотора T3

<400> 20

aattaaccct cactaaagg

19

<210> 21

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность промотора T7

<400> 21

cctatagtga gtcgtatta

19

<210> 22

<211> 429

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сайта инициации репликации

бактериофага f1

<400> 22

acgcgccctg tagcggcgca ttaagcgcgg cgggtgtggt ggttacgcgc agcgtgaccg

60

ctacacttgc cagcgcccta gcgcccgctc ctttcgcttt cttcccttcc tttctcgcca

120

cgttcgccgg ctttccccgt caagctctaa atcgggggct ccctttaggg ttccgattta

180

gtgctttacg gcacctcgac cccaaaaaac ttgattaggg tgatggttca cgtagtgggc

240

catcgccctg atagacggtt tttcgccctt tgacgttgga gtccacgttc tttaatagtg

300

gactcttgtt ccaaactgga acaacactca accctatctc ggtctattct tttgatttat

360

aagggatttt gccgatttcg gcctattggt taaaaaatga gctgatttaa caaaaattta

420

acgcgaatt

429

<210> 23

<211> 677

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Химерная последовательность wPRE

<400> 23

cgagcatctt accgccattt attcccatat ttgttctgtt tttcttgatt tgggtataca

60

tttaaatgtt aataaaacaa aatggtgggg caatcattta catttttagg gatatgtaat

120

tactagttca ggtgtattgc cacaagacaa acatgttaag aaactttccc gttatttacg

180

ctctgttcct gttaatcaac ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctgatattct

240

taactatgtt gctcctttta cgctgtgtgg atatgctgct ttaatgcctc tgtatcatgc

300

tattgcttcc cgtacggctt tcgttttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct

360

ttatgaggag ttgtggcccg ttgtccgtca acgtggcgtg gtgtgctctg tgtttgctga

420

cgcaaccccc actggctggg gcattgccac cacctgtcaa ctcctttctg ggactttcgc

480

tttccccctc ccgatcgcca cggcagaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac

540

aggggctagg ttgctgggca ctgataattc cgtggtgttg tcggggaagg gcctgctgcc

600

ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg

660

ggccgcctcc ccgcctg

677

<210> 24

<211> 11433

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pCCL-PGK-FANCA-WPRE или pCCL-SIN-cPPT CTS-hPGK-hFANCA-WPRE

<400> 24

catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa

60

gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa

120

aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc

180

gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag tgtagccgta

240

gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct

300

gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg

360

atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag

420

cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc

480

cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg

540

agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt

600

tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg

660

gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca

720

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg

780

agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc

840

ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag

900

ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag

960

ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg

1020

tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa

1080

gcgcgcaatt aaccctcact aaagggaaca aaagctggag ctgcaagctt ggccattgca

1140

tacgttgtat ccatatcata atatgtacat ttatattggc tcatgtccaa cattaccgcc

1200

atgttgacat tgattattga ctagttatta atagtaatca attacggggt cattagttca

1260

tagcccatat atggagttcc gcgttacata acttacggta aatggcccgc ctggctgacc

1320

gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat aatgacgtat gttcccatag taacgccaat

1380

agggactttc cattgacgtc aatgggtgga gtatttacgg taaactgccc acttggcagt

1440

acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc

1500

cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt atgggacttt cctacttggc agtacatcta

1560

cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg

1620

atagcggttt gactcacggg gatttccaag tctccacccc attgacgtca atgggagttt

1680

gttttggcac caaaatcaac gggactttcc aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac

1740

gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata agcagagctc gtttagtgaa

1800

ccggggtctc tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac

1860

ccactgctta agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg

1920

ttgtgtgact ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct

1980

agcagtggcg cccgaacagg gacttgaaag cgaaagggaa accagaggag ctctctcgac

2040

gcaggactcg gcttgctgaa gcgcgcacgg caagaggcga ggggcggcga ctggtgagta

2100

cgccaaaaat tttgactagc ggaggctaga aggagagaga tgggtgcgag agcgtcagta

2160

ttaagcgggg gagaattaga tcgcgatggg aaaaaattcg gttaaggcca gggggaaaga

2220

aaaaatataa attaaaacat atagtatggg caagcaggga gctagaacga ttcgcagtta

2280

atcctggcct gttagaaaca tcagaaggct gtagacaaat actgggacag ctacaaccat

2340

cccttcagac aggatcagaa gaacttagat cattatataa tacagtagca accctctatt

2400

gtgtgcatca aaggatagag ataaaagaca ccaaggaagc tttagacaag atagaggaag

2460

agcaaaacaa aagtaagacc accgcacagc aagcggccgc tgatcttcag acctggagga

2520

ggagatatga gggacaattg gagaagtgaa ttatataaat ataaagtagt aaaaattgaa

2580

ccattaggag tagcacccac caaggcaaag agaagagtgg tgcagagaga aaaaagagca

2640

gtgggaatag gagctttgtt ccttgggttc ttgggagcag caggaagcac tatgggcgca

2700

gcgtcaatga cgctgacggt acaggccaga caattattgt ctggtatagt gcagcagcag

2760

aacaatttgc tgagggctat tgaggcgcaa cagcatctgt tgcaactcac agtctggggc

2820

atcaagcagc tccaggcaag aatcctggct gtggaaagat acctaaagga tcaacagctc

2880

ctggggattt ggggttgctc tggaaaactc atttgcacca ctgctgtgcc ttggaatgct

2940

agttggagta ataaatctct ggaacagatt tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac

3000

agagaaatta acaattacac aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag

3060

caagaaaaga atgaacaaga attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg

3120

tttaacataa caaattggct gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg

3180

gtaggtttaa gaatagtttt tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat

3240

tcaccattat cgtttcagac ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga

3300

atagaagaag aaggtggaga gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatct

3360

cgacggtatc ggttaacttt taaaagaaaa ggggggattg gggggtacag tgcaggggaa

3420

agaatagtag acataatagc aacagacata caaactaaag aattacaaaa acaaattaca

3480

aaaattcaaa attttatcga tcacgagact agcctcgaga agcttgatat cgaattccac

3540

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc

3600

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc

3660

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc

3720

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac

3780

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc

3840

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag

3900

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct

3960

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct

4020

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccc ccgggctgca ggaattcatg

4080

tccgactcgt gggtcccgaa ctccgcctcg ggccaggacc cagggggccg ccggagggcc

4140

tgggccgagc tgctggcggg aagggtcaag agggaaaaat ataatcctga aagggcacag

4200

aaattaaagg aatcagctgt gcgcctcctg cgaagccatc aggacctgaa tgcccttttg

4260

cttgaggtag aaggtccact gtgtaaaaaa ttgtctctca gcaaagtgat tgactgtgac

4320

agttctgagg cctatgctaa tcattctagt tcatttatag gctctgcttt gcaggatcaa

4380

gcctcaaggc tgggggttcc cgtgggtatt ctctcagccg ggatggttgc ctctagcgtg

4440

ggacagatct gcacggctcc agcggagacc agtcaccctg tgctgctgac tgtggagcag

4500

agaaagaagc tgtcttccct gttagagttt gctcagtatt tattggcaca cagtatgttc

4560

tcccgtcttt ccttctgtca agaattatgg aaaatacaga gttctttgtt gcttgaagcg

4620

gtgtggcatc ttcacgtaca aggcattgtg agcctgcaag agctgctgga aagccatccc

4680

gacatgcatg ctgtgggatc gtggctcttc aggaatctgt gctgcctttg tgaacagatg

4740

gaagcatcct gccagcatgc tgacgtcgcc agggccatgc tttctgattt tgttcaaatg

4800

tttgttttga ggggatttca gaaaaactca gatctgagaa gaactgtgga gcctgaaaaa

4860

atgccgcagg tcacggttga tgtactgcag agaatgctga tttttgcact tgacgctttg

4920

gctgctggag tacaggagga gtcctccact cacaagatcg tgaggtgctg gttcggagtg

4980

ttcagtggac acacgcttgg cagtgtaatt tccacagatc ctctgaagag gttcttcagt

5040

cataccctga ctcagatact cactcacagc cctgtgctga aagcatctga tgctgttcag

5100

atgcagagag agtggagctt tgcgcggaca caccctctgc tcacctcact gtaccgcagg

5160

ctctttgtga tgctgagtgc agaggagttg gttggccatt tgcaagaagt tctggaaacg

5220

caggaggttc actggcagag agtgctctcc tttgtgtctg ccctggttgt ctgctttcca

5280

gaagcgcagc agctgcttga agactgggtg gcgcgtttga tggcccaggc attcgagagc

5340

tgccagctgg acagcatggt cactgcgttc ctggttgtgc gccaggcagc actggagggc

5400

ccctctgcgt tcctgtcata tgcagactgg ttcaaggcct cctttgggag cacacgaggc

5460

taccatggct gcagcaagaa ggccctggtc ttcctgttta cgttcttgtc agaactcgtg

5520

ccttttgagt ctccccggta cctgcaggtg cacattctcc acccacccct ggttcccagc

5580

aagtaccgct ccctcctcac agactacatc tcattggcca agacacggct ggccgacctc

5640

aaggtttcta tagaaaacat gggactctac gaggatttgt catcagctgg ggacattact

5700

gagccccaca gccaagctct tcaggatgtt gaaaaggcca tcatggtgtt tgagcatacg

5760

gggaacatcc cagtcaccgt catggaggcc agcatattca ggaggcctta ctacgtgtcc

5820

cacttcctcc ccgccctgct cacacctcga gtgctcccca aagtccctga ctcccgtgtg

5880

gcgtttatag agtctctgaa gagagcagat aaaatccccc catctctgta ctccacctac

5940

tgccaggcct gctctgctgc tgaagagaag ccagaagatg cagccctggg agtgagggca

6000

gaacccaact ctgctgagga gcccctggga cagctcacag ctgcactggg agagctgaga

6060

gcctccatga cagaccccag ccagcgtgat gttatatcgg cacaggtggc agtgatttct

6120

gaaagactga gggctgtcct gggccacaat gaggatgaca gcagcgttga gatatcaaag

6180

attcagctca gcatcaacac gccgagactg gagccacggg aacacattgc tgtggacctc

6240

ctgctgacgt ctttctgtca gaacctgatg gctgcctcca gtgtcgctcc cccggagagg

6300

cagggtccct gggctgccct cttcgtgagg accatgtgtg gacgtgtgct ccctgcagtg

6360

ctcacccggc tctgccagct gctccgtcac cagggcccga gcctgagtgc cccacatgtg

6420

ctggggttgg ctgccctggc cgtgcacctg ggtgagtcca ggtctgcgct cccagaggtg

6480

gatgtgggtc ctcctgcacc tggtgctggc cttcctgtcc ctgcgctctt tgacagcctc

6540

ctgacctgta ggacgaggga ttccttgttc ttctgcctga aattttgtac agcagcaatt

6600

tcttactctc tctgcaagtt ttcttcccag tcacgagata ctttgtgcag ctgcttatct

6660

ccaggcctta ttaaaaagtt tcagttcctc atgttcagat tgttctcaga ggcccgacag

6720

cctctttctg aggaggacgt agccagcctt tcctggagac ccttgcacct tccttctgca

6780

gactggcaga gagctgccct ctctctctgg acacacagaa ccttccgaga ggtgttgaaa

6840

gaggaagatg ttcacttaac ttaccaagac tggttacacc tggagctgga aattcaacct

6900

gaagctgatg ctctttcaga tactgaacgg caggacttcc accagtgggc gatccatgag

6960

cactttctcc ctgagtcctc ggcttcaggg ggctgtgacg gagacctgca ggctgcgtgt

7020

accattcttg tcaacgcact gatggatttc caccaaagct caaggagtta tgaccactca

7080

gaaaattctg atttggtctt tggtggccgc acaggaaatg aggatattat ttccagattg

7140

caggagatgg tagctgacct ggagctgcag caagacctca tagtgcctct cggccacacc

7200

ccttcccagg agcacttcct ctttgagatt ttccgcagac ggctccaggc tctgacaagc

7260

gggtggagcg tggctgccag ccttcagaga cagagggagc tgctaatgta caaacggatc

7320

ctcctccgcc tgccttcgtc tgtcctctgc ggcagcagct tccaggcaga acagcccatc

7380

actgccagat gcgagcagtt cttccacttg gtcaactctg agatgagaaa cttctgctcc

7440

cacggaggtg ccctgacaca ggacatcact gcccacttct tcaggggcct cctgaacgcc

7500

tgtctgcgga gcagagaccc ctccctgatg gtcgacttca tactggccaa gtgccagacg

7560

aaatgcccct taattttgac ctctgctctg gtgtggtggc cgagcctgga gcctgtgctg

7620

ctctgccggt ggaggagaca ctgccagagc ccgctgcccc gggaactgca gaagctacaa

7680

gaaggccggc agtttgccag cgatttcctc tcccctgagg ctgcctcccc agcacccaac

7740

ccggactggc tctcagctgc tgcactgcac tttgcgattc aacaagtcag ggaagaaaac

7800

atcaggaagc agctaaagaa gctggactgc gagagagagg agctattggt tttccttttc

7860

ttcttctcct tgatgggcct gctgtcgtca catctgacct caaatagcac cacagacctg

7920

ccaaaggctt tccacgtttg tgcagcaatc ctcgagtgtt tagagaagag gaagatatcc

7980

tggctggcac tctttcagtt gacagagagt gacctcaggc tggggcggct cctcctccgt

8040

gtggccccgg atcagcacac caggctgctg cctttcgctt tttacagtct tctctcctac

8100

ttccatgaag acgcggccat cagggaagag gccttcctgc atgttgctgt ggacatgtac

8160

ttgaagctgg tccagctctt cgtggctggg gatacaagca cagtttcacc tccagctggc

8220

aggagcctgg agctcaaggg tcagggcaac cccgtggaac tgataacaaa agctcgtctt

8280

tttctgctgc agttaatacc tcggtgcccg aaaaagagct tctcacacgt ggcagagctg

8340

ctggctgatc gtggggactg cgacccagag gtgagcgccg ccctccagag cagacagcag

8400

gctgcccctg acgctgacct gtcccaggag cctcatctct tctgatgaga attcgatatc

8460

aagcttatcg ataccgtcga atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt

8520

tattcccata tttgttctgt ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca

8580

aaatggtggg gcaatcattt acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg

8640

ccacaagaca aacatgttaa gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa

8700

cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt

8760

acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct

8820

ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc

8880

gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg

8940

ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc

9000

acggcagaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc

9060

actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ggcctgctgc cggctctgcg gcctcttccg

9120

cgtcttcgcc ttcgccctca gacgagtcgg atctcccttt gggccgcctc cccgcctgga

9180

attcgagctc ggtaccttta agaccaatga cttacaaggc agctgtagat cttagccact

9240

ttttaaaaga aaagggggga ctggaagggc taattcactc ccaacgaaga caagatctgc

9300

tttttgcttg tactgggtct ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct

9360

aactagggaa cccactgctt aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt

9420

gtgcccgtct gttgtgtgac tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt

9480

ggaaaatctc tagcagtagt agttcatgtc atcttattat tcagtattta taacttgcaa

9540

agaaatgaat atcagagagt gagaggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat

9600

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg

9660

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttatc atgtctggct ctagctatcc cgcccctaac

9720

tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat tctccgcccc atggctgact

9780

aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc tctgagctat tccagaagta

9840

gtgaggaggc ttttttggag gcctagggac gtacccaatt cgccctatag tgagtcgtat

9900

tacgcgcgct cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc

9960

caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc

10020

cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatggga cgcgccctgt

10080

agcggcgcat taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc

10140

agcgccctag cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc

10200

tttccccgtc aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg

10260

cacctcgacc ccaaaaaact tgattagggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga

10320

tagacggttt ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc

10380

caaactggaa caacactcaa ccctatctcg gtctattctt ttgatttata agggattttg

10440

ccgatttcgg cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt

10500

aacaaaatat taacgcttac aatttaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc

10560

ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct

10620

gataaatgct tcaataatag cacctagatc aagagacagg atgaggatcg tttcgcatga

10680

ttgaacaaga tggattgcac gcaggttctc cggccgcttg ggtggagagg ctattcggct

10740

atgactgggc acaacagaca atcggctgct ctgatgccgc cgtgttccgg ctgtcagcgc

10800

aggggcgccc ggttcttttt gtcaagaccg acctgtccgg tgccctgaat gaactgcaag

10860

acgaggcagc gcggctatcg tggctggcca cgacgggcgt tccttgcgca gctgtgctcg

10920

acgttgtcac tgaagcggga agggactggc tgctattggg cgaagtgccg gggcaggatc

10980

tcctgtcatc tcaccttgct cctgccgaga aagtatccat catggctgat gcaatgcggc

11040

ggctgcatac gcttgatccg gctacctgcc cattcgacca ccaagcgaaa catcgcatcg

11100

agcgagcacg tactcggatg gaagccggtc ttgtcgatca ggatgatctg gacgaagagc

11160

atcaggggct cgcgccagcc gaactgttcg ccaggctcaa ggcgagcatg cccgacggcg

11220

aggatctcgt cgtgacccat ggcgatgcct gcttgccgaa tatcatggtg gaaaatggcc

11280

gcttttctgg attcatcgac tgtggccggc tgggtgtggc ggaccgctat caggacatag

11340

cgttggctac ccgtgatatt gctgaagagc ttggcggcga atgggctgac cgcttcctcg

11400

tgctttacgg tatcgccgct cccgattcgc agc

11433

<210> 25

<211> 5554

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> pCCL-PGK-FANCAW-82-RO

<400> 25

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc

60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc

120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc

180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac

240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc

300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag

360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct

420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct

480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca gggggatccc ccgggctgca ggaattcatg

540

tccgactcgt gggtcccgaa ctccgcctcg ggccaggacc cagggggccg ccggagggcc

600

tgggccgagc tgctggcggg aagggtcaag agggaaaaat ataatcctga aagggcacag

660

aaattaaagg aatcagctgt gcgcctcctg cgaagccatc aggacctgaa tgcccttttg

720

cttgaggtag aaggtccact gtgtaaaaaa ttgtctctca gcaaagtgat tgactgtgac

780

agttctgagg cctatgctaa tcattctagt tcatttatag gctctgcttt gcaggatcaa

840

gcctcaaggc tgggggttcc cgtgggtatt ctctcagccg ggatggttgc ctctagcgtg

900

ggacagatct gcacggctcc agcggagacc agtcaccctg tgctgctgac tgtggagcag

960

agaaagaagc tgtcttccct gttagagttt gctcagtatt tattggcaca cagtatgttc

1020

tcccgtcttt ccttctgtca agaattatgg aaaatacaga gttctttgtt gcttgaagcg

1080

gtgtggcatc ttcacgtaca aggcattgtg agcctgcaag agctgctgga aagccatccc

1140

gacatgcatg ctgtgggatc gtggctcttc aggaatctgt gctgcctttg tgaacagatg

1200

gaagcatcct gccagcatgc tgacgtcgcc agggccatgc tttctgattt tgttcaaatg

1260

tttgttttga ggggatttca gaaaaactca gatctgagaa gaactgtgga gcctgaaaaa

1320

atgccgcagg tcacggttga tgtactgcag agaatgctga tttttgcact tgacgctttg

1380

gctgctggag tacaggagga gtcctccact cacaagatcg tgaggtgctg gttcggagtg

1440

ttcagtggac acacgcttgg cagtgtaatt tccacagatc ctctgaagag gttcttcagt

1500

cataccctga ctcagatact cactcacagc cctgtgctga aagcatctga tgctgttcag

1560

atgcagagag agtggagctt tgcgcggaca caccctctgc tcacctcact gtaccgcagg

1620

ctctttgtga tgctgagtgc agaggagttg gttggccatt tgcaagaagt tctggaaacg

1680

caggaggttc actggcagag agtgctctcc tttgtgtctg ccctggttgt ctgctttcca

1740

gaagcgcagc agctgcttga agactgggtg gcgcgtttga tggcccaggc attcgagagc

1800

tgccagctgg acagcatggt cactgcgttc ctggttgtgc gccaggcagc actggagggc

1860

ccctctgcgt tcctgtcata tgcagactgg ttcaaggcct cctttgggag cacacgaggc

1920

taccatggct gcagcaagaa ggccctggtc ttcctgttta cgttcttgtc agaactcgtg

1980

ccttttgagt ctccccggta cctgcaggtg cacattctcc acccacccct ggttcccagc

2040

aagtaccgct ccctcctcac agactacatc tcattggcca agacacggct ggccgacctc

2100

aaggtttcta tagaaaacat gggactctac gaggatttgt catcagctgg ggacattact

2160

gagccccaca gccaagctct tcaggatgtt gaaaaggcca tcatggtgtt tgagcatacg

2220

gggaacatcc cagtcaccgt catggaggcc agcatattca ggaggcctta ctacgtgtcc

2280

cacttcctcc ccgccctgct cacacctcga gtgctcccca aagtccctga ctcccgtgtg

2340

gcgtttatag agtctctgaa gagagcagat aaaatccccc catctctgta ctccacctac

2400

tgccaggcct gctctgctgc tgaagagaag ccagaagatg cagccctggg agtgagggca

2460

gaacccaact ctgctgagga gcccctggga cagctcacag ctgcactggg agagctgaga

2520

gcctccatga cagaccccag ccagcgtgat gttatatcgg cacaggtggc agtgatttct

2580

gaaagactga gggctgtcct gggccacaat gaggatgaca gcagcgttga gatatcaaag

2640

attcagctca gcatcaacac gccgagactg gagccacggg aacacattgc tgtggacctc

2700

ctgctgacgt ctttctgtca gaacctgatg gctgcctcca gtgtcgctcc cccggagagg

2760

cagggtccct gggctgccct cttcgtgagg accatgtgtg gacgtgtgct ccctgcagtg

2820

ctcacccggc tctgccagct gctccgtcac cagggcccga gcctgagtgc cccacatgtg

2880

ctggggttgg ctgccctggc cgtgcacctg ggtgagtcca ggtctgcgct cccagaggtg

2940

gatgtgggtc ctcctgcacc tggtgctggc cttcctgtcc ctgcgctctt tgacagcctc

3000

ctgacctgta ggacgaggga ttccttgttc ttctgcctga aattttgtac agcagcaatt

3060

tcttactctc tctgcaagtt ttcttcccag tcacgagata ctttgtgcag ctgcttatct

3120

ccaggcctta ttaaaaagtt tcagttcctc atgttcagat tgttctcaga ggcccgacag

3180

cctctttctg aggaggacgt agccagcctt tcctggagac ccttgcacct tccttctgca

3240

gactggcaga gagctgccct ctctctctgg acacacagaa ccttccgaga ggtgttgaaa

3300

gaggaagatg ttcacttaac ttaccaagac tggttacacc tggagctgga aattcaacct

3360

gaagctgatg ctctttcaga tactgaacgg caggacttcc accagtgggc gatccatgag

3420

cactttctcc ctgagtcctc ggcttcaggg ggctgtgacg gagacctgca ggctgcgtgt

3480

accattcttg tcaacgcact gatggatttc caccaaagct caaggagtta tgaccactca

3540

gaaaattctg atttggtctt tggtggccgc acaggaaatg aggatattat ttccagattg

3600

caggagatgg tagctgacct ggagctgcag caagacctca tagtgcctct cggccacacc

3660

ccttcccagg agcacttcct ctttgagatt ttccgcagac ggctccaggc tctgacaagc

3720

gggtggagcg tggctgccag ccttcagaga cagagggagc tgctaatgta caaacggatc

3780

ctcctccgcc tgccttcgtc tgtcctctgc ggcagcagct tccaggcaga acagcccatc

3840

actgccagat gcgagcagtt cttccacttg gtcaactctg agatgagaaa cttctgctcc

3900

cacggaggtg ccctgacaca ggacatcact gcccacttct tcaggggcct cctgaacgcc

3960

tgtctgcgga gcagagaccc ctccctgatg gtcgacttca tactggccaa gtgccagacg

4020

aaatgcccct taattttgac ctctgctctg gtgtggtggc cgagcctgga gcctgtgctg

4080

ctctgccggt ggaggagaca ctgccagagc ccgctgcccc gggaactgca gaagctacaa

4140

gaaggccggc agtttgccag cgatttcctc tcccctgagg ctgcctcccc agcacccaac

4200

ccggactggc tctcagctgc tgcactgcac tttgcgattc aacaagtcag ggaagaaaac

4260

atcaggaagc agctaaagaa gctggactgc gagagagagg agctattggt tttccttttc

4320

ttcttctcct tgatgggcct gctgtcgtca catctgacct caaatagcac cacagacctg

4380

ccaaaggctt tccacgtttg tgcagcaatc ctcgagtgtt tagagaagag gaagatatcc

4440

tggctggcac tctttcagtt gacagagagt gacctcaggc tggggcggct cctcctccgt

4500

gtggccccgg atcagcacac caggctgctg cctttcgctt tttacagtct tctctcctac

4560

ttccatgaag acgcggccat cagggaagag gccttcctgc atgttgctgt ggacatgtac

4620

ttgaagctgg tccagctctt cgtggctggg gatacaagca cagtttcacc tccagctggc

4680

aggagcctgg agctcaaggg tcagggcaac cccgtggaac tgataacaaa agctcgtctt

4740

tttctgctgc agttaatacc tcggtgcccg aaaaagagct tctcacacgt ggcagagctg

4800

ctggctgatc gtggggactg cgacccagag gtgagcgccg ccctccagag cagacagcag

4860

gctgcccctg acgctgacct gtcccaggag cctcatctct tctgatgaga attcgatatc

4920

aagcttatcg ataccgtcga atcccccggg ctgcaggaat tcgagcatct taccgccatt

4980

tattcccata tttgttctgt ttttcttgat ttgggtatac atttaaatgt taataaaaca

5040

aaatggtggg gcaatcattt acatttttag ggatatgtaa ttactagttc aggtgtattg

5100

ccacaagaca aacatgttaa gaaactttcc cgttatttac gctctgttcc tgttaatcaa

5160

cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actgatattc ttaactatgt tgctcctttt

5220

acgctgtgtg gatatgctgc tttaatgcct ctgtatcatg ctattgcttc ccgtacggct

5280

ttcgttttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc

5340

gttgtccgtc aacgtggcgt ggtgtgctct gtgtttgctg acgcaacccc cactggctgg

5400

ggcattgcca ccacctgtca actcctttct gggactttcg ctttccccct cccgatcgcc

5460

acggcagaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctag gttgctgggc

5520

actgataatt ccgtggtgtt gtcggggaag ggcc

5554

<210> 26

<211> 858

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный элемент Rev-ответа

<400> 26

gatcttcaga cctggaggag gagatatgag ggacaattgg agaagtgaat tatataaata

60

taaagtagta aaaattgaac cattaggagt agcacccacc aaggcaaaga gaagagtggt

120

gcagagagaa aaaagagcag tgggaatagg agctttgttc cttgggttct tgggagcagc

180

aggaagcact atgggcgcag cgtcaatgac gctgacggta caggccagac aattattgtc

240

tggtatagtg cagcagcaga acaatttgct gagggctatt gaggcgcaac agcatctgtt

300

gcaactcaca gtctggggca tcaagcagct ccaggcaaga atcctggctg tggaaagata

360

cctaaaggat caacagctcc tggggatttg gggttgctct ggaaaactca tttgcaccac

420

tgctgtgcct tggaatgcta gttggagtaa taaatctctg gaacagattt ggaatcacac

480

gacctggatg gagtgggaca gagaaattaa caattacaca agcttaatac actccttaat

540

tgaagaatcg caaaaccagc aagaaaagaa tgaacaagaa ttattggaat tagataaatg

600

ggcaagtttg tggaattggt ttaacataac aaattggctg tggtatataa aattattcat

660

aatgatagta ggaggcttgg taggtttaag aatagttttt gctgtacttt ctatagtgaa

720

tagagttagg cagggatatt caccattatc gtttcagacc cacctcccaa ccccgagggg

780

acccgacagg cccgaaggaa tagaagaaga aggtggagag agagacagag acagatccat

840

tcgattagtg aacggatc

858

<210> 27

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сигнала упаковки

<400> 27

tgagtacgcc aaaaattttg actagcggag gctagaagga gaga

44

<210> 28

<211> 188

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная укороченная последовательность 5ʹ-LTR ВИЧ-1

<400> 28

gtctctctgg ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact

60

gcttaagcct caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg

120

tgactctggt aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag

180

tggcgccc

188

<210> 29

<211> 234

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная укороченная самоинактивирующаяся

последовательность 3ʹ-LTR ВИЧ-1

<400> 29

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatctgct ttttgcttgt actgggtctc

60

tctggttaga ccagatctga gcctgggagc tctctggcta actagggaac ccactgctta

120

agcctcaata aagcttgcct tgagtgcttc aagtagtgtg tgcccgtctg ttgtgtgact

180

ctggtaacta gagatccctc agaccctttt agtcagtgtg gaaaatctct agca

234

<210> 30

<211> 577

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность немедленного раннего

промотора цитомегаловируса человека

<400> 30

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc

60

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa

120

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac

180

tttccattga cgtcaatggg tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca

240

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg

300

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt

360

agtcatcgct attaccatgg tgatgcggtt ttggcagtac atcaatgggc gtggatagcg

420

gtttgactca cggggatttc caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg

480

gcaccaaaat caacgggact ttccaaaatg tcgtaacaac tccgccccat tgacgcaaat

540

gggcggtagg cgtgtacggt gggaggtcta tataagc

577

<210> 31

<211> 233

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность промотора вируса саркомы

Рауса

<400> 31

ttaatgtagt cttatgcaat actcttgtag tcttgcaaca tggtaacgat gagttagcaa

60

catgccttac aaggagagaa aaagcaccgt gcatgccgat tggtggaagt aaggtggtac

120

gatcgtgcct tattaggaag gcaacagacg ggtctgacat ggattggacg aaccactgaa

180

ttgccgcatt gcagagatat tgtatttaag tgcctagctc gatacaataa acg

233

<210> 32

<211> 16

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный центральный полипуриновый тракт и центральная

последовательность терминации ВИЧ-1

<400> 32

aaaagaaaag ggggga

16

<210> 33

<211> 121

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантный центральный полипуриновый тракт и центральная

последовательность терминации ВИЧ-1

<400> 33

ttggggggta cagtgcaggg gaaagaatag tagacataat agcaacagac atacaaacta

60

aagaattaca aaaacaaatt acaaaaattc aaaattttat cgatcacgag actagcctcg

120

a

121

<210> 34

<211> 156

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сайта инициации репликации

вируса обезьян 40

<400> 34

ggcctccaaa aaagcctcct cactacttct ggaatagctc agaggccgag gcggcctcgg

60

cctctgcata aataaaaaaa attagtcagc catggggcgg agaatgggcg gaactgggcg

120

gagttagggg cgggatgggc ggagttaggg gcggga

156

<210> 35

<211> 141

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность RNA-OUT

<400> 35

gtagaattgg taaagagagt cgtgtaaaat atcgagttcg cacatcttgt tgtctgatta

60

ttgatttttg gcgaaaccat ttgatcatat gacaagatgt gtatctacct taacttaatg

120

attttgataa aaatcattag g

141

<210> 36

<211> 4371

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Кодон-оптимизированная последовательность FANCA

<400> 36

atgtccgact cgtgggtccc gaactccgcc tcgggccagg acccaggggg ccgccggagg

60

gcctgggccg agctgctggc gggaagggtc aagagggaaa aatataatcc tgaaagggca

120

cagaaattaa aggaatcagc tgtgcgcctc ctgcgaagcc atcaggacct gaatgccctt

180

ttgcttgagg tagaaggtcc actgtgtaaa aaattgtctc tcagcaaagt gattgactgt

240

gacagttctg aggcctatgc taatcattct agttcattta taggctctgc tttgcaggat

300

caagcctcaa ggctgggggt tcccgtgggt attctctcag ccgggatggt tgcctctagc

360

gtgggacaga tctgcacggc tccagcggag accagtcacc ctgtgctgct gactgtggag

420

cagagaaaga agctgtcttc cctgttagag tttgctcagt atttattggc acacagtatg

480

ttctcccgtc tttccttctg tcaagaatta tggaaaatac agagttcttt gttgcttgaa

540

gcggtgtggc atcttcacgt acaaggcatt gtgagcctgc aagagctgct ggaaagccat

600

cccgacatgc atgctgtggg atcgtggctc ttcaggaatc tgtgctgcct ttgtgaacag

660

atggaagcat cctgccagca tgctgacgtc gccagggcca tgctttctga ttttgttcaa

720

atgtttgttt tgaggggatt tcagaaaaac tcagatctga gaagaactgt ggagcctgaa

780

aaaatgccgc aggtcacggt tgatgtactg cagagaatgc tgatttttgc acttgacgct

840

ttggctgctg gagtacagga ggagtcctcc actcacaaga tcgtgaggtg ctggttcgga

900

gtgttcagtg gacacacgct tggcagtgta atttccacag atcctctgaa gaggttcttc

960

agtcataccc tgactcagat actcactcac agccctgtgc tgaaagcatc tgatgctgtt

1020

cagatgcaga gagagtggag ctttgcgcgg acacaccctc tgctcacctc actgtaccgc

1080

aggctctttg tgatgctgag tgcagaggag ttggttggcc atttgcaaga agttctggaa

1140

acgcaggagg ttcactggca gagagtgctc tcctttgtgt ctgccctggt tgtctgcttt

1200

ccagaagcgc agcagctgct tgaagactgg gtggcgcgtt tgatggccca ggcattcgag

1260

agctgccagc tggacagcat ggtcactgcg ttcctggttg tgcgccaggc agcactggag

1320

ggcccctctg cgttcctgtc atatgcagac tggttcaagg cctcctttgg gagcacacga

1380

ggctaccatg gctgcagcaa gaaggccctg gtcttcctgt ttacgttctt gtcagaactc

1440

gtgccttttg agtctccccg gtacctgcag gtgcacattc tccacccacc cctggttccc

1500

agcaagtacc gctccctcct cacagactac atctcattgg ccaagacacg gctggccgac

1560

ctcaaggttt ctatagaaaa catgggactc tacgaggatt tgtcatcagc tggggacatt

1620

actgagcccc acagccaagc tcttcaggat gttgaaaagg ccatcatggt gtttgagcat

1680

acggggaaca tcccagtcac cgtcatggag gccagcatat tcaggaggcc ttactacgtg

1740

tcccacttcc tccccgccct gctcacacct cgagtgctcc ccaaagtccc tgactcccgt

1800

gtggcgttta tagagtctct gaagagagca gataaaatcc ccccatctct gtactccacc

1860

tactgccagg cctgctctgc tgctgaagag aagccagaag atgcagccct gggagtgagg

1920

gcagaaccca actctgctga ggagcccctg ggacagctca cagctgcact gggagagctg

1980

agagcctcca tgacagaccc cagccagcgt gatgttatat cggcacaggt ggcagtgatt

2040

tctgaaagac tgagggctgt cctgggccac aatgaggatg acagcagcgt tgagatatca

2100

aagattcagc tcagcatcaa cacgccgaga ctggagccac gggaacacat tgctgtggac

2160

ctcctgctga cgtctttctg tcagaacctg atggctgcct ccagtgtcgc tcccccggag

2220

aggcagggtc cctgggctgc cctcttcgtg aggaccatgt gtggacgtgt gctccctgca

2280

gtgctcaccc ggctctgcca gctgctccgt caccagggcc cgagcctgag tgccccacat

2340

gtgctggggt tggctgccct ggccgtgcac ctgggtgagt ccaggtctgc gctcccagag

2400

gtggatgtgg gtcctcctgc acctggtgct ggccttcctg tccctgcgct ctttgacagc

2460

ctcctgacct gtaggacgag ggattccttg ttcttctgcc tgaaattttg tacagcagca

2520

atttcttact ctctctgcaa gttttcttcc cagtcacgag atactttgtg cagctgctta

2580

tctccaggcc ttattaaaaa gtttcagttc ctcatgttca gattgttctc agaggcccga

2640

cagcctcttt ctgaggagga cgtagccagc ctttcctgga gacccttgca ccttccttct

2700

gcagactggc agagagctgc cctctctctc tggacacaca gaaccttccg agaggtgttg

2760

aaagaggaag atgttcactt aacttaccaa gactggttac acctggagct ggaaattcaa

2820

cctgaagctg atgctctttc agatactgaa cggcaggact tccaccagtg ggcgatccat

2880

gagcactttc tccctgagtc ctcggcttca gggggctgtg acggagacct gcaggctgcg

2940

tgtaccattc ttgtcaacgc actgatggat ttccaccaaa gctcaaggag ttatgaccac

3000

tcagaaaatt ctgatttggt ctttggtggc cgcacaggaa atgaggatat tatttccaga

3060

ttgcaggaga tggtagctga cctggagctg cagcaagacc tcatagtgcc tctcggccac

3120

accccttccc aggagcactt cctctttgag attttccgca gacggctcca ggctctgaca

3180

agcgggtgga gcgtggctgc cagccttcag agacagaggg agctgctaat gtacaaacgg

3240

atcctcctcc gcctgccttc gtctgtcctc tgcggcagca gcttccaggc agaacagccc

3300

atcactgcca gatgcgagca gttcttccac ttggtcaact ctgagatgag aaacttctgc

3360

tcccacggag gtgccctgac acaggacatc actgcccact tcttcagggg cctcctgaac

3420

gcctgtctgc ggagcagaga cccctccctg atggtcgact tcatactggc caagtgccag

3480

acgaaatgcc ccttaatttt gacctctgct ctggtgtggt ggccgagcct ggagcctgtg

3540

ctgctctgcc ggtggaggag acactgccag agcccgctgc cccgggaact gcagaagcta

3600

caagaaggcc ggcagtttgc cagcgatttc ctctcccctg aggctgcctc cccagcaccc

3660

aacccggact ggctctcagc tgctgcactg cactttgcga ttcaacaagt cagggaagaa

3720

aacatcagga agcagctaaa gaagctggac tgcgagagag aggagctatt ggttttcctt

3780

ttcttcttct ccttgatggg cctgctgtcg tcacatctga cctcaaatag caccacagac

3840

ctgccaaagg ctttccacgt ttgtgcagca atcctcgagt gtttagagaa gaggaagata

3900

tcctggctgg cactctttca gttgacagag agtgacctca ggctggggcg gctcctcctc

3960

cgtgtggccc cggatcagca caccaggctg ctgcctttcg ctttttacag tcttctctcc

4020

tacttccatg aagacgcggc catcagggaa gaggccttcc tgcatgttgc tgtggacatg

4080

tacttgaagc tggtccagct cttcgtggct ggggatacaa gcacagtttc acctccagct

4140

ggcaggagcc tggagctcaa gggtcagggc aaccccgtgg aactgataac aaaagctcgt

4200

ctttttctgc tgcagttaat acctcggtgc ccgaaaaaga gcttctcaca cgtggcagag

4260

ctgctggctg atcgtgggga ctgcgaccca gaggtgagcg ccgccctcca gagcagacag

4320

caggctgccc ctgacgctga cctgtcccag gagcctcatc tcttctgatg a

4371

<210> 37

<211> 1015

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Рекомбинантная последовательность сайта инициации репликации

высококопийных ColE1, pMB1, pBR322,

pUC

<400> 37

ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga

60

ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac

120

ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa

180

tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat

240

cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc

300

taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg

360

gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc

420

acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg

480

ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg

540

ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa

600

cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg

660

aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga

720

gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct

780

gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca

840

gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc

900

ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg

960

ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaaga

1015

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу получения генетически модифицированной популяции клеток, обогащенной по CD34, содержащих полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид группы комплементации анемии Фанкони (FANC), или его функциональный вариант или фрагмент, функционально связанную с последовательностью промотора, активной у эукариот, и CD34⁺-клетки с чистотой < 30%. Изобретение эффективно для лечения анемии Фанкони у субъекта. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 4 пр.

1. Способ получения генетически модифицированной популяции клеток, обогащенной по CD34, для лечения анемии Фанкони у субъекта, нуждающегося в этом, включающий:

(i) получение популяции клеток, обогащенной по CD34, из биологического образца, полученного от субъекта, путем отбора CD34⁺-клеток путем:

a) нанесения биологического образца на матрицу для захвата, связывающую CD34⁺-клетки;

b) обеспечения возможности протекания несвязанной фракции биологического образца через матрицу для захвата; и

c) элюирования популяции клеток, обогащенной по CD34, с матрицы для захвата с помощью элюирующего буфера, при этом связанную фракцию не отмывают перед элюированием, и

(ii) генетическую модификацию элюированной популяции клеток, обогащенной по CD34:

a) рекомбинантным вектором для генной терапии, содержащим полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид группы комплементации анемии Фанкони (FANC), или его функциональный вариант или фрагмент; или

b) системой редактирования генов, направляющей прямую репарацию эндогенного мутированного гена FANC.

2. Способ по п. 1, включающий генетическую модификацию элюированной популяции клеток, обогащенной по CD34, рекомбинантным вектором для генной терапии, характеризующийся тем, что рекомбинантный вектор для генной терапии содержит полинуклеотидную последовательность, содержащую в порядке от 5' к 3':

(а) последовательность промотора, активного у эукариот; и

(b) последовательность, кодирующую полипептид гена FANC человека, его функциональный фрагмент или вариант;

причем последовательность, кодирующая полипептид гена FANC человека или его функциональный фрагмент или вариант, функционально связана с последовательностью промотора, активной у эукариот; а полипептид FANC выбран из полипептидов FANCA, FANCC и FANCG.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что полипептид FANC представляет собой полипептид FANCA.

4. Способ по п. 1, включающий генетическую модификацию элюированной популяции клеток, обогащенной по CD34, с использованием системы редактирования генов, причем система редактирования генов включает:

(a) белок Cas или полинуклеотид, кодирующий белок Cas;

(b) нРНК; и

(c) матрицу для репарации, содержащую последовательность, содержащую ген FANC или его фрагмент, перекрывающий одну или более мутаций в эндогенном мутированном гене FANC,

причем указанная нРНК сконфигурирована для направления матрицы для репарации к гену FANC, причем ген FANC выбран из FANCA, FANCC и FANCG, а система редактирования генов способна к прямой репарации эндогенного мутированного гена FANC.

5. Способ по любому из пп. 1-4, характеризующийся тем, что биологический образец представляет собой периферическую кровь или костный мозг.

6. Способ по п. 5, характеризующийся тем, что биологический образец представляет собой периферическую кровь, полученную после обработки субъекта ГКСФ, плериксафором или комбинацией ГКСФ и плериксафора.

7. Способ по любому из пп. 1-6, характеризующийся тем, что выбор CD34⁺-клеток выполняют с использованием антител или их функциональных фрагментов, специфично связывающихся с CD34.

8. Способ по любому из пп. 1-7, характеризующийся тем, что выбор CD34⁺-клеток выполняют с использованием скорости потока 10-20 мл/мин.

9. Способ по любому из пп. 1-8, включающий одно- или многократное выполнение афереза периферической крови.

10. Популяция клеток, обогащенная по CD34, для применения для лечения анемии Фанкони, при этом популяция клеток содержит генетически модифицированные CD34⁺-клетки, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид группы комплементации анемии Фанкони (FANC), или его функциональный вариант или фрагмент, функционально связанную с последовательностью промотора, активной у эукариот, при этом генетически модифицированная популяция клеток, обогащенная по CD34, содержит CD34⁺-клетки с чистотой < 30%.

11. Генетически модифицированная популяция клеток, обогащенная по CD34, по п. 10, характеризующаяся тем, что генетически модифицированная популяция клеток, обогащенная по CD34, содержит CD34⁺-клетки с выходом > 35%.

12. Генетически модифицированная популяция клеток, обогащенная по CD34, по любому из пп. 10, 11, полученная способом по п. 4.

13. Генетически модифицированная популяция клеток, обогащенная по CD34, по любому из пп. 10, 11, полученная способом по п. 2 или 3.

14. Применение генетически модифицированной популяции клеток, обогащенной по CD34, по любому из пп. 10-13 для лечения анемии Фанкони у субъекта.

15. Применение по п. 14, характеризующееся тем, что генетически модифицированную популяцию клеток, обогащенную по CD34, получали способом по п. 2 или 3.

16. Применение по п. 14, характеризующееся тем, что генетически модифицированную популяцию клеток, обогащенную по CD34, получали способом по п. 4.

17. Применение по любому из пп. 14-16, характеризующееся тем, что указанное применение подавляет развитие, останавливает прогрессирование и/или вызывает обратное прогрессирование гематологического проявления анемии Фанкони у субъекта; причем гематологическое проявление анемии Фанкони необязательно выбрано из одного или более из недостаточности костного мозга, тромбоцитопении, лейкопении, панцитопении, нейтропении и анемии.

18. Применение по любому из пп. 14-17, характеризующееся тем, что указанное применение приводит к восстановлению одного или более гемопоэтических линий, угнетенных у субъекта.

19. Применение по п. 18, характеризующееся тем, что одна или более из гемопоэтических линий содержат одно или более из лимфоцитов, эозинофилов, нейтрофилов, эритроцитов и тромбоцитов.

20. Применение по любому из пп. 14-17, характеризующееся тем, что указанное применение приводит к восстановлению одного или более гематологических параметров, пониженных у субъекта.

21. Применение по п. 20, характеризующееся тем, что гематологический параметр представляет собой уровень гемоглобина.

22. Фармацевтическая композиция для лечения анемии Фанкони, включающая генетически модифицированную популяцию клеток, обогащенную по CD34, по любому из пп. 10-13, и фармацевтически приемлемый носитель.