КАССЕТА ДЛЯ СИСТЕМЫ КРИСТАЛЛИЗАЦИИ МЕМБРАННЫХ БЕЛКОВ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПОТОЧНОГО РЕНТГЕНОСТРУКТУРНОГО АНАЛИЗА Российский патент 2023 года по МПК C30B7/00 C30B29/58 B01L9/06 

Область техники

Изобретение используется в научных исследованиях в области изучения строения макромолекул в качестве узла системы для роста, анализа и хранения биологических кристаллов.

Уровень техники

Для проведения исследований, связанных с ростом и получением белковых кристаллов, их последующего отбора, анализа и хранения используют системы кристаллографии включающие комплекс лабораторного оборудования для создания условий роста кристаллов, обеспечения возможности предварительного анализа и отбора наиболее качественных образцов кристаллов, а также их хранения для последующего анализа кристаллической структуры образцов.

Известно устройство для выращивания монокристаллов белка, содержащее корпус, в котором расположены камеры для белкового и буферного растворов, разделенные полупроницаемой мембраной, и камеру осадителя, взаимодействующую с ними через соединительный канал. Формирование кристаллов происходит с использованием процесса диализа [1]. Недостатком устройства является сложная конструкция и одноканальность.

Известны многоканальные планшетные устройства с большим числом ячеек, накрытых пленкой или стеклом, реализующие метод диффузии паров в «висячей капле». [2]. Недостатком многоканальных планшетов является ограничения по объему в поиске оптимальных условий для роста кристаллов.

Для усовершенствования работы системы кристаллизации мембранных белков в липидной губчатой мезофазе для целей поточной кристаллографии необходимо решить несколько задач связанных с разработкой конструкции кассеты для размещения в ней контейнеров используемых для роста кристаллов, хранения и анализа результатов кристаллизации, а также идентификацией материалов, содержащих белковые кристаллы.

Известны пути решения задачи хранения биологических образцов для их последующего анализа. В лабораторной практике для хранения образцов широкого применения обычно используются настольные штативы в виде прямоугольных каркасов, имеющих верхнюю, промежуточную и нижнюю полки. В верхней и промежуточной полках сформированы отверстия, с возможностью установки пробирок, цилиндрических контейнеров в вертикальном или в наклонном положении [3]. Некоторые типы штативов снабжают цифровой индикацией рядов и пробирок в штативе [4]. Недостаток применения штативов связан с тем, что при установке контейнеров для роста белковых кристаллов в вертикальном положении контейнеров, липидная губчатая фаза, используемая для роста белковых кристаллов, будет подниматься в верхнюю часть контейнера над раствором преципитанта, образуя форму пробки, которая резко снижает эффективность диффузии молекул осадителя в толщу мезофазы и, соответственно, роста кристаллов.

Известно изобретение [5], в котором описана стойка для размещения пипеток в горизонтальном положении, которые используются для культивирования клеточных культур. В данной конструкции обеспечивают фиксацию пипеток с помощью сборной конструкции, состоящей из подвижных боковых пластин, двух пластин в верхней части в которых выполнено множество дуговых выемок, в которые устанавливают пипетки. Для фиксации пипеток сверху в средней их части используют дополнительную пластину, в нижней части которой выполнены дуговые выемки. Для проведения работ по разъединению пластин и извлечению пипеток используют вращающиеся валы и поворотные ручки.

Недостатком конструкции является ее сложность, большое число деталей и невозможность быстрого анализа состояния пробы, размещенной в пипетке, с помощью микроскопа без предварительного изъятия пипеток из стойки.

В изобретении [6] предлагается конструкция для размещения в кассете множества закрытых пробирок с жидкими пробами, имеющих различные диаметры и длины пробирок для работы с автоматическим пробоотборником, для работы которого необходимо четко поддерживать расстояние между центрами пробирок. Предложенная конструкция обеспечивает размещение пробирок вдоль кассеты с возможностью выравнивания центральных осей пробирок друг относительно друга для обеспечения пробоотбора. За счет сложной конструкции, содержащей узлы смещения для позиционирования осей пробирок с разными диаметрами друг относительно друга, снижается надежность работы устройства.

Таким образом, технические решения и конструкции известных штативов, боксов, кассет для хранения пробирок, контейнеров и пипеток не обеспечивают возможность их использования в качестве узлов для системы кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе для поточной кристаллографии.

Известна заявка на изобретение [7], которая выбрана в качестве прототипа, в которой описаны способ и платформа держателей контейнеров для системы кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе для поточной кристаллографии. В держателях платформы укреплен, по меньшей мере, один кристаллизационный контейнер, который выполнен в виде цилиндрического конуса с крышкой. В процессе роста кристаллов платформу устанавливают в термостат, по окончании процесса роста кристаллов контейнеры вынимают из держателей платформы и поочередно анализируют качество выращенных кристаллов и их количество с помощью микроскопа. К недостатку конструкции блока относится сложность в работе с отдельными контейнерами на разных этапах роста и анализа кристаллов и отсутствие их идентификации друг относительно друга на последующих этапах рентгеноструктурного анализа.

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является создание устройства обеспечивающего возможность проведения инкубирования образцов в контейнерах, а также последующее предварительное сканирование результатов кристаллизации и долговременное хранение образцов кристаллов, выполненного в виде портативной кассеты используемой в системе поточной кристаллизации мембранных белков.

Техническим результатом, обеспечиваемым заявленным устройством, является расширение арсенала средств и создание конструкции универсальной кассеты для размещения разных по объему и длине контейнеров, что позволяет повысить эффективность роста кристаллов мембранных белков в разных объемах и условиях. Дополнительный технический результат состоит в обеспечении возможности идентификации контейнеров за счет введения штрихкода на фронтальной части крышки кассеты и нумерации позиций контейнеров на основании кассеты.

Техническое решение поясняется чертежом, где на фиг. 1 показан фрагмент внешнего вида кассеты сверху со снятой крышкой, на фиг. 2 показано сечение фронтального фрагмента конструкции кассеты в разрезе.

Описание изобретения

Поставленная задача с достижением технического результата решается тем, что кассета для системы кристаллизации белков содержит основание (1) для размещения множества кристаллизационных контейнеров (2) в горизонтальном положении и общую крышку (3). При этом основание (1) выполнено в форме единой пластины, на верхней поверхности которой сформированы множество установочных канавок (4) треугольной формы с усеченной вершиной для установки контейнеров (2), где вершина треугольного сечения канавок направленна к нижней части основания (1) кассеты, при этом в глубине канавок выполнены сквозные прорези (5) размещенные вдоль оси канавок (4), определяя возможность подсветки образцов размещенных в прозрачных контейнерах (2) и последующего визуального контроля эффективности кристаллизации в объеме (6) контейнера (2). При этом канавки обеспечивают возможность размещения контейнера в горизонтальном положении на всех этапах проведения кристаллизации и анализа результатов без необходимости изъятия контейнера (2) из кассеты, при этом для обеспечения возможности фиксации горизонтального положения контейнеров и их прижима к боковым поверхностям канавок, на внутренней части крышки в зоне рядом с крышкой контейнера установлена гибкая силиконовая вставка (7), при этом в передней части верхней поверхности пластины основания контейнера сформирована выемка (8) для размещения выступающих частей пробок (9) контейнеров (2), где вдоль выемки размещена первая зона идентификации кассеты, на горизонтальной поверхности которой размещены данные номеров позиций контейнеров (10). На фронтальной поверхности крышки кассеты размещена вторая зона идентификации, на которой установлен кодовый идентификатор, с размещенной информацией в виде штрих-кода, с данными о дате эксперимента и другая информация, которая позволяет идентифицировать полученные образцы кристаллов размещенных в контейнерах.

Контейнеры (2) изготовлены в виде прозрачных пробирок с пробками или эппендорфов выполненных из прозрачного полипропилена с рабочим объемом не менее 100 мкл. Предпочтительная форма контейнеров выполнена в виде конусообразной пробирки или носика для дозирования. Достоинство носиков состоит в обеспечении возможности простой процедуры отрезания носика у контейнера для вывода липидной мезофазы, в которой сформированы кристаллы, при ее выдавливании из объема контейнера без нарушения целостности сформированных кристаллов.

Основание и пробка контейнера выполнены из светонепроницаемой пластмассы, что обеспечивает сохранение кристаллов от облучения светом, что необходимо при работе с фоточувствительными белками. Кассеты изготовлены из химически устойчивого полипропилена, что обеспечивает высокую стабильность при использовании в областях применения, предполагающих заморозку и возможность автоклавирования при максимальной температуре +110°С в стандартном режиме.

Длина кассеты зависит от количества размещаемых контейнеров. Форма кассеты обеспечивает возможность складирования кассет в штабели или размещения в многоярусных боксах для хранения. При этом идентификация и выбор необходимой кассеты в боксах для хранения обеспечивается за счет сканирования штрих кодов, нанесенных на фронтальной поверхности крышки кассет.

Устройство работает следующим образом. Исследователь заполняет контейнеры (2) раствором преципитанта, затем в наклонном положении в верхней части объема преципитанта шприцем вносится липидная губчатая фаза, в липидные биослои которой инкорпорированы молекулы мембранных белков. Контейнеры закрывают пробкой и устанавливают в канавки (4), выполненные в основании (1) кассеты. Закрывают основание с контейнерами светонепроницаемой крышкой (3) и размещают кассеты с контейнерами в термостат для инкубации роста кристаллов. По окончании фазы роста с кассеты снимают крышку и устанавливают на предметный столик светопольного микроскопа для предварительного анализа результатов кристаллизации белков. На следующем этапе проводят отбор контейнеров с высоким содержанием кристаллов и переносят выбранные контейнеры в новую кассету. Устанавливают на поверхности крышки новой кассеты новый штрих-код с данными о дате эксперимента и другой информацией, которая позволяет идентифицировать полученные образцы кристаллов.

Таким образом, разработанная конструкция кассеты, используемая в качестве узла системы кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе для целей поточной кристаллографии выполняет все функции, заложенные в задаче изобретения. А именно: а) кассета обеспечивает возможность размещения контейнеров для кристаллизации мембранных белков в разных объемах липидной губчатой фазы с возможностью горизонтального размещения контейнеров для повышения эффективности роста кристаллов; б) кассета обеспечивает возможность проведения инкубации кристаллизационной смеси и последующий предварительный скрининг результатов кристаллизации; в) кассета обеспечивает возможность долговременного хранения образцов кристаллов в кассете и позволяет идентифицировать полученные образцы кристаллов для использования в последующих стадиях рентгеноструктурного анализа.

Применение портативной конструкции кассеты формирует синергетический эффект связанный: с экономией времени при инкубации, анализе и хранении за счет отсутствия необходимости изъятия контейнера из кассеты на разных этапах; с повышением надежности в идентификации образцов кристаллов; с портативностью и унификацией конструкции кассеты для разных типов контейнеров.

Источники информации

1. Митичкин О.В. и др. УСТРОЙСТВО ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МОНОКРИСТАЛЛОВ БЕЛКА. Патент РФ №RU 2040595 (25.07.1995).

2. Kenyon D.J. et al. CRYSTAL FORMING DEVICE AND AUTOMATED CRYSTALLIZATION SYSTEM. Международная заявка №WO 9307311 (1993-04-15).

3. Yang В., Chen K. Test tube rack for biosafety cabinet. Полезная модель Китая №CN 210103975 (U) (2020-02-21).

4. Ren Y., Gao Y. Coding test tube rack. Полезная модель Китая №CN 212943045 (U) (2021-04-13).

5. Zhou J., Peng Z. Light, handy, simple and convenient movable pipette rack. Полезная модель Китая №CN 213434597 (U) (2021-06-15).

6. Rothermel W., Matthews J. Cassette for supporting test tubes of different diameters and/or lengths. Патент США №US 4534465 (1985-08-13).

7. Селиханов Г.К., Фуфина Т.Ю., Васильева Л.Г., Габдулхаков А.Г. Способ кристаллизации мембранных белков в липидной мезофазе для поточной кристаллографии. Заявка РФ №RU 2020141784 (17.12.2020).

Изобретение относится к области биохимии и молекулярной биологии, а именно к конструкции кассеты для роста, отбора и хранения белковых кристаллов в контейнерах для системы поточной кристаллографии. Кассета содержит основание для размещения множества кристаллизационных контейнеров в горизонтальном положении, выполненное в форме единой пластины. На верхней поверхности пластины сформированы множество установочных канавок треугольной формы с усеченной вершиной для установки контейнеров. Вершина треугольного сечения канавок направлена к нижней части основания кассеты. В глубине канавок выполнены сквозные прорези, размещенные вдоль оси канавок, для обеспечения возможности подсветки образцов, размещенных в прозрачных контейнерах, и последующего визуального контроля эффективности кристаллизации. Канавки выполнены с возможностью обеспечения размещения контейнера в горизонтальном положении на всех этапах проведения кристаллизации, анализа и хранения результатов. Кассета дополнительно снабжена съемной крышкой, на внутренней части которой установлена гибкая силиконовая вставка для обеспечения возможности фиксации горизонтального положения контейнеров и их прижима к боковым поверхностям канавок. В передней части верхней поверхности пластины основания контейнера сформирована выемка для размещения выступающих частей пробок контейнеров. Изобретение обеспечивает расширение арсенала средств и создание конструкции универсальной кассеты для размещения разных по объему и длине контейнеров, что позволяет повысить эффективность роста кристаллов мембранных белков в разных объемах и условиях. 2 ил.

Кассета для роста, отбора и хранения белковых кристаллов в контейнерах для системы поточной кристаллографии белков, содержащая основание для размещения множества кристаллизационных контейнеров в горизонтальном положении, отличающаяся тем, что основание выполнено в форме единой пластины, на верхней поверхности которой сформированы множество установочных канавок треугольной формы с усеченной вершиной для установки контейнеров, где вершина треугольного сечения канавок направлена к нижней части основания кассеты, при этом в глубине канавок выполнены сквозные прорези, размещенные вдоль оси канавок для обеспечения возможности подсветки образцов, размещенных в прозрачных контейнерах, и последующего визуального контроля эффективности кристаллизации в объеме контейнера, при этом канавки выполнены с возможностью обеспечения размещения контейнера в горизонтальном положении на всех этапах проведения кристаллизации и анализа, и хранения результатов без необходимости изъятия контейнера из кассеты, где кассета дополнительно снабжена съемной крышкой, на внутренней части крышки установлена гибкая силиконовая вставка для обеспечения возможности фиксации горизонтального положения контейнеров и их прижима к боковым поверхностям канавок, при этом в передней части верхней поверхности пластины основания контейнера сформирована выемка для размещения выступающих частей пробок контейнеров.