Амфифильные полимеры FABPEG для модификации липидных мембранных систем, используемых в биологии и медицине, способ получения амфифильных полимеров FABPEG для модификации липидных мембранных систем, способ модификации параметров липидных систем с использованием амфифильных полимеров FABPEG и способ смешивания многокомпонентных липидных мембранных систем Российский патент 2024 года по МПК C07C231/02 C08G65/08 A61K9/127 C08F6/04 

Изобретение относится к области органической химии и биотехнологии и может быть использовано в биологии и медицине, для кристаллизации мембранных белков и белковых комплексов, в том числе с большими водорастворимыми частями, а также для модификаций липидных мембран путем их добавления к матрикс-образующим липидам. Описанные соединения состоят из длинноцепочечных дикарбоновых кислот, бифункционализированных гидрофильными полимерами. Настоящее изобретение относится к веществам - производным (1,20)-эйкозен-10-диовой кислоты и полиэтиленгликолей, способам их получения и очистки, а также способу изменения параметров липидных мембранных систем при добавлении данных веществ, пригодных для контроля структурных параметров с помощью метода малоуглового рассеяния.

Введение

Многие важнейшие мембранные белки и белковые комплексы обладают большой немембранной (водорастворимой) частью [10.1038/s41580-021-00415-0]. Для современной фармакологии структуры белков представляют исключительную ценность, поскольку позволяют производить поиск подходящих агонистов и антагонистов с использованием компьютерного моделирования (в том числе машинного обучения), сокращая пространство поиска до нескольких перспективных мишеней [10.1016/j.sbi.2023.102548].

Мембранные белки являются ключевыми объектами в жизненно важных процессах, таких как перенос ионов через мембрану, преобразование энергии, передача сигналов и другие. Из-за их значительной роли в физиологии человека мембранные белки являются мишенями около 60% используемых в настоящее время лекарств [10.1038/nrd2199]. Для разработки лекарств нового поколения используется метод, основанный на получении атомарной структуры белка. Самый эффективный метод получения структуры мембранных белков до сих пор остаётся метод рентгеновской дифракции на белковых кристаллах, а одним из наиболее эффективных методов получения кристаллов мембранных белков является кристаллизация в липидных кубических фазах [10.1146/annurev.biophys.050708.133655].

Однако, получение кристаллов больших мембранных белков, например, рецепторов двухкомпонентных систем (гистидин-киназы, хемо- и фоторецепторы), АТФ-синтаз, рецепторов, сопряжённых с G-белком, и других крайне важных биологических систем, зачастую лимитировано размерами водных каналов липидных кубических фаз, стабилизацией мембранного белка в липидном матриксе, а также сложностями в солюбилизации и очистке мембранного белка для дальнейших исследований. В силу этих и других ограничений, уникальные структуры мембранных белков (https://blanco.biomol.uci.edu/mpstruc/) составляют всего лишь ~1% всех доступных уникальных белковых структур высокого разрешения, представленных в базе Protein Data Bank (www.rcsb.org).

Несмотря на стремительное развитие метода криоэлектронной микроскопии, его использование затруднительно в случае относительно малых (< 110 кДа) мембранных белков [10.1016/j.sbi.2020.05.009], для которых он не позволяет получить структуры с разрешением, сравнимым с рентгеновской кристаллографией. Даже для больших мембранных белковых комплексов, которые являются более удобными мишенями для метода криоэлектронной микроскопии, не удаётся достичь высокого разрешения (лучше 2.5 Å) структуры их трансмембранных доменов. В связи с этим метод криоэлектронной микроскопии может использоваться комплементарно с методом рентгеновской дифракции для уточнения структуры мембранной части белковых комплексов.

Преодоление существующих ограничений in meso кристаллизации мембранных белков позволит существенно повысить эффективность методов структурной биологии для разработки способов управления функциями белков-мишеней. Потенциальные применения усовершенствованной технологии in meso кристаллизации простираются от разработки селективных лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков нового поколения, до рационального дизайна оптогенетических инструментов.

С 1996 года кристаллизация мембранных белков в липидных кубических фазах позволила установить структуры сотен мембранных белков [10.1073/pnas.93.25.14532; 10.1016/j.sbi.2011.06.007]. Этот подход основан на липидах, таких как моноацил глицериды, создающих при смешивании с водой трехмерную периодическую липидную кубическую (мезо-) фазу, с близкими к нативным мембранам параметрами. Латеральная диффузия мембранных белков в липидном матриксе, имитирующем нативный мембранный бислой, позволяет образовываться кристаллическим контактам, формирующим объёмные кристаллы мембранных белков [10.1016/j.jmb.2020.02.024 ].

В некоторых работах продемонстрировано, что метод криоэлектронной микроскопии может использоваться комплементарно с методом рентгеновской дифракции для уточнения структуры мембранной части белковых комплексов. Например, такой подход позволил получить структуру димера АТФ-синтазы (1.2 МДа) [10.1016/j.molcel.2016.05.037], что является недостижимым пределом для методов современной кристаллографии. Несмотря на стремительное развитие метода криоэлектронной микроскопии, на сегодняшний день его использование затруднительно в случае относительно малых (< 110 кДа) мембранных белков [10.1016/j.sbi.2020.05.009], для которых он не позволяет получить структуры с разрешением, сравнимым с рентгеновской кристаллографией. Даже для больших мембранных белковых комплексов, которые являются более удобными объектами для метода криоэлектронной микроскопии, не удаётся достичь высокого (лучше 2.5 Å) разрешения структуры их трансмембранных доменов. Это показывает, что несмотря на существенный прогресс метод криоэлектронной микроскопии не может заменить рентгеноструктурный анализ в задачах структурных исследований мембранных белков. Это обусловливает непрекращающийся интерес к развитию новых подходов к кристаллизации больших мембранных белковых комплексов.

Водные каналы в липидных кубических фазах обычно имеют диаметры в пределах 30-60 Å. Можно выделить два основных принципа расширения водных каналов липидной кубической фазы, описанных в литературе: модификация параметров бислоя (кривизны и жесткости) различными детергентами/холестерином и использование электростатического отталкивания заряженных липидов.

С помощью малых амфифильных молекул были получены “губчатые” (sponge) липидные мезофазы с параметром решётки около 160 Å (что для липидных кубических фаз соответствует диаметрам водных каналов от 50 до 90 Å). Для проверки пригодности кристаллизации системы в описанных условиях были получены кристаллы мембранного белка LH2 [10.1016/j.jmb.2006.01.049].

“Раздутие” кубической фазы с помощью заряженных липидов представляет большой интерес [10.1016/S0006-3495(02)75339-3; 10.1039/c2sm25249j; 10.1039/C4SM02343A; 10.1039/C5SM00311C], поскольку позволяет получать липидные мезофазы с периодами повторяемости 270-650 Å. Наилучшие результаты были получены либо при высоких температурах 40-50°C (450 Å), либо используя вакуумное высушивание с последующим добавлением воды (650 Å), однако оба варианта неприменимы в случае чувствительных мембранных белков. Лишь относительно недавно было продемонстрировано успешное применение “раздувания” кубической фазы с помощью заряженных липидов для кристаллизации мембранного белка и последующего получения структуры атомарного разрешения [10.1038/s41467-018-02996-5]. Проблемой данного подхода является эффект экранирования, когда электростатическое отталкивание нивелируется взаимодействием со стандартными преципитантами, обладающими большой ионной силой раствора. Невозможность использования стандартных наборов преципитатов является существенным ограничением при поиске условий кристаллизации белков, из-за которой, по-видимому, с 2018 года в литературе так и не появилось новых данных об успешных кристаллизационных экспериментах с использованием данной методики.

Также липидные мембранные системы с большими водными каналами считаются перспективными для доставки лекарств и изобретение потенциально может представлять интерес и с этой точки зрения [10.1039/c8sm02059k].

Задачи заявляемого изобретения

Задача, решаемая данным изобретением, состоит в модификации параметров липидных мембранных систем. Для решения задач был получен ряд соединений FABPEG, а также способ смешивания многокомпонентных липидных мембранных систем и способ их характеризации. Полученные липидные мембранные системы с увеличенными структурными параметрами делают возможной кристаллизацию мембранных белков и белковых комплексов с большими водорастворимыми частями (до 150 ангстремов), при этом не оказывающих негативного влияния на кристаллизацию мембранных белков в данной кубической фазе.

Технический результат состоит в осуществлении синтеза дипегилированной двухосновной жирной кислоты на примере 1,20 эйкозанен-10-диовой ПЕГами массой 2000 и 5000, характеризации структурных параметров получаемых трехкомпонентных липидных мембранных систем, и демонстрации пригодности полученных липидных мембранных систем для кристаллизации пробных мембранных белков.

Задачи решены путем

Для модификации параметров липидных мембранных систем описан способ получения соединений, имеющих гидрофобный мостик (рис. 1А), который соединяет два гидрофильных полиэтиленгликоля массами 2 кДа и выше (рис. 1Б). Подобные соединения “заякориваются” в липидном бислое, а их гидрофильные остатки вызывают энтропийное отталкивание между липидными бислоями, что, в свою очередь, вызывает расширение водных каналов липидных систем (рис. 2). Используемые гидрофильные полимеры биологически инертны и не оказывают резко негативного влияния на мембранные белки (например денатурацию), а также описан способ приготовления многокомпонентных липидных систем и измерения их структурных параметров методом малоуглового рассеяния. Показана пригодность полученных систем для кристаллизации мембранных белков.

Способ получения и проверки действия FABPEG в общем виде

Синтез соединений состоит в получении гидрофобной основы (двухосновной карбоновой кислоты) с большей длиной углеродной цепи по сравнению с типичным липидом, и последующей конъюгации гидрофильного полимера с кислотными группами. Очистка от примесей после конъюгации заключается в последовательном использовании ионообменных смол, перекристаллизации или гель-фильтрации.

Существует четыре способа получения трехкомпонентных липидных кубических фаз (матрикс-образующий липид (например, моноолеин)/H₂O/FABPEG). Они базируются на двух способах гомогенизации и двух разных порядках смешивания компонентов. Способы гомогенизации: (А) смешивание в ПЦР-пробирках с использованием центрифуги; (Б) смешивание с использованием шприцевых смесителей. Порядок смешивания: (1) водный раствор FABPEG смешивается с моноолеином; (2) моноолеин смешивается с FABPEG в хлороформе, затем хлороформ выпаривается, после этого добавляется вода.

Кристаллизация мембранных белков осуществляется с использованием липидных кубических фаз в качестве кристаллизационного матрикса, содержащих моноолеин (или иной матрикс-образующий липид) и FABPEG.

Первый этап пробоподготовки при кристаллизации заключается в смешивании (одним из описанных способов) FABPEG, моноолеина и буферного раствора с мембранным белком, стабилизированным с помощью какого-либо мембрано-миметика (детергентные мицеллы, бицеллы, липосомы, фосфолипидные нанодиски с поясом из белка MSP (либо белка Saposin, либо сополимеров, либо ДНК) и так далее) или иным образом.

Второй этап пробоподготовки заключается в покрывании смесей липидных кубических фаз с белком преципитатом, состав которого, а также концентрации компонентов и pH, могут варьироваться для оптимизации скорости роста и размеров кристаллов мембранного белка. Наблюдение за ростом кристаллов производится с помощью методов оптической микроскопии. Сбор данных дифракции с кристалла мембранного белка и их обработка, конечной стадией которой является решение пространственной структуры мембранного белка, осуществляется с помощью рентгеноструктурного анализа (с использованием лабораторной рентгеновской установки, либо синхротронного источника, либо рентгеновского лазера на свободных электронах), либо метода микрокристаллической электронной дифракции (с использованием электронного микроскопа).

Контроль параметров (тип симметрии, период повторяемости, диаметры водных каналов) полученных кубических фаз осуществляется с помощью метода малоуглового рентгеновского или нейтронного рассеяния (с использованием лабораторного или синхронного источника в случае рентгеновских лучей и реакторов в случае нейтронного излучения). Первичная обработка экспериментальных данных (центровка, азимутальное усреднение 2D-изображений, калибровка и иные процедуры) производится для получения кривых I(q) (зависимость интенсивности от модуля вектора рассеяния q, которые, как правило, имеют несколько побочных максимумов. Вторичная обработка состоит в интерпретации данных малоуглового рассеяния, представленных в виде зависимости I(q): аппроксимация экспериментальной кривой суммой фоновой составляющей и набора пиков, индексация дифракционных пиков, проверка соответствия позиций пиков соотношению, характерному для кубических фаз определённого типа (с типом симметрии Ia3d, Pn3m либо Im3m) либо иных периодических структур, которые могут образовываться в смеси липид/H₂O/FABPEG (ламеллярная фаза (Lα), двумерная гексагональная фаза (p6m), и “спонж”-фаза (L3)). Если весь набор представленных на кривой рассеяния I(q) дифракционных пиков не может быть описан с удовлетворительной точностью определенным типом решётки с соответствующим периодом повторяемости, такой набор данных интерпретируется в соответствии с моделью смеси разных типов решётки и/или периодов повторяемости. После установления соответствия позиций пиков конкретным периодическим структурам производится вычисление периодов повторяемости и диаметров водных каналов.

Пример 1. Пример ПЕГилирования с использованием хлорангидрида

Синтез FABPEG состоит из двух основных шагов: построение углеродной цепи длинной двухосновной (α,ω)-карбоновой кислоты и ее пегилирование двумя α-метокси-ω-амино-полиэтиленгликолями.

Двухосновная 1,20 эйкозен-10-диовая кислота (соед. 2) синтезируется метатезисом из 10-ундеценовой кислоты (соед. 1) под действием катализатора Граббса 2 поколения (рис. 3)

Коммерчески доступная 10-ундеценовая кислота 3,7 гр (20 мМ, фирма Sigma-Aldrich) смешивается с 17 мг (2 мкМ) катализатора Граббса 2-ого поколения (фирма Aldrich) в атмосфере аргона. Через реакционную смесь пропускается слабый ток аргона (~20 мл/мин) на протяжении всей реакции. Реакционная колба помещается на масляную баню при 5°С при перемешивании магнитной мешалкой. В течении 0,1-2 часов наблюдается формирование осадка. Спустя 48 часов реакционная смесь разбавляется 20 мл этилацетата, и фильтруется через воронку Шотта. Полученный осадок двукратно перекристаллизуется из ацетона (~40-60 мл). Белый осадок 1,20 эйкозен-10-диовой кислоты имеет температуру плавления 110°С (согл. литературе 108°С) [10.1007/S11746-006-1249-0]. Выход составляет 2.72 г (80 %). ¹H ЯМР (CDCl₃, 300 МГц): δ 5.37 (м, -CH=CH-, 2H), 2.28 (т, J = 7.4, -CH₂COOH, 4H), 2.00-1.92 (м, 4H, -CH₂CH=CHCH₂-), 1.69-1.57 (м, 4H, -CH₂CH₂COOH), 1.40-1.27 (м, 20H, -CH₂CH₂CH₂-). ¹³C ЯМР (CDCl₃, 75 Мгц): δ 179.65 (-COOH), 130.37 ( -CH=CH-), 33.98, 32.50, 29.54, 29.20, 29.12, 28.99, 28.95, 24.67. Rf=0.25 (CHCl₃/гексан/уксусная кислота = 1:1:0.1).

К 5 мг соед. 2 (14,7 мкМ) в 5 мл абсолютного хлороформа добавляется 25 мкл оксалилхлорида (300 мкМ) и 0,3 мкл диметилформамида (4 мкМ). (Рис. 4)

Реакция производится в течении 4 часов при 40°С. Более высокие температуры приводят к образованию коричневого продукта и уменьшают выход. Хлороформ и избыток оксалилхлорида удаляется при пониженном давлении при 40°С, оставляя легкоплавкий желтоватый хлорангидрид. К полученному хлорангидриду добавляется 30 мкМ α-метокси-ω-амино полиэтиленгликоля (фирма Rapp-polymer) и 33 мкМ 4,4 N,N-диметиламин пиридина (ДМАП) в 3 мл абсолютного хлороформа (рис. 5).

Спустя 48 часов реакционная смесь высушивается под пониженным давлением, растворяется в метаноле, последовательно пропускается через катионообменную смолу в H⁺-форме (Dowex®50WX8), анионообменную смолу в OH^- форме (Dowex® 1X-4) и высушивается под пониженным давлением. Полученный сухой остаток либо растворяется в абсолютном диэтиловом эфире (ПЕГ2000) и перекристаллизуется; либо растворяется в 60 % (об.) метаноле (ПЕГ5000), и пропускается через гель-фильтрационную колонку Superdex 30 Increase 10/300 GL (фирма cytiva). Выход составляет 30 % для ПЕГ-2000 (соед. 4а) и 10 % для ПЕГ-5000 (соед. 4б).

Пример 2. Синтез с использованием карбодиимида

К 5 мг (14,7 мкМ) 1,20 эйкозен-10-диовой кислоты (соед. 2, получена идентичным с примером 1 способом), растворенной в 2 мл ДМФА, добавляется 45 мкл (300 мкМ) N,N’-диизопропилкарбодиимида (ДИК), 4 мг N-гидроксисукцинимида (NHS) (34 мкМ) и 30 мкМ α-метокси-ω-амино полиэтиленгликоля. Реакция производится при 40 град в течении 24 часов (рис. 4).

К реакционной смеси добавляется 7 мл н-гептана и под пониженным давлением растворитель удаляется.

Сухой остаток очищается аналогичным с примером 1 образом. Выход составляет 40 и 30 % для соед 4а. и соед. 4б соответственно.

Пример 3. Способы смешивания многокомпонентных липидных систем, содержащих FABPEG и матрикс-образующий липид

Для приготовления трёхкомпонентных липидных систем (матрикс-образующий липид/H₂O/FABPEG) использовались четыре различных способа, основанных на двух различных порядках смешивания компонентов и на двух различных способах гомогенизации (см. Таблицу 3-1). Эти способы описаны на примере, когда в качестве матрикс-образующего липида используется моноолеин.

Первый способ (1) смешивания компонентов может быть выражен формулой “(H₂O + FABPEG) + липид”: сначала приготовляется водный раствор FABPEG заданной концентрации, а затем он добавляется к расплавленному моноолеину и производится смешивание. Второй способ (2) смешивания компонентов может быть выражен формулой “(моноолеин + FABPEG) + H₂O”: сначала моноолеин и FABPEG по отдельности растворяют в хлороформе, затем эти растворы смешивают в необходимом соотношении, хлороформ выпаривают под вакуумом (например, с использованием вакуумного лиофилизатора Freeze dryer Labconco), после чего добавляется вода и производится смешивание.

Первый способ (А) гомогенизации осуществляется в ПЦР-пробирках с использованием настольной центрифуги (например, Eppendorf Centrifuge 5417 R): смешиваемые компоненты помещаются в ПЦР-пробирки, после чего производится серия последовательных центрифугирований пробирок в течение 5 минут каждое на оборотах, соответствующих 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 и 10000 g, между которыми производился поворот пробирки относительно ротора на 90°. Второй способ (Б) гомогенизации осуществляется с помощью шприцевого липидного смесителя (https://cherezov.usc.edu/tools_slm.htm), состоящего из двух соединённых между собой шприцев на 100 мкл: в один шприц заливают расплавленный моноолеин (при способе смешивания (1)) либо расплавленную смесь моноолеин/FABPEG (при способе смешивания (2)), а во второй шприц заливают водный раствор FABPEG (при способе смешивания (1)) либо воду (при способе смешивания (2)), шприцы соединяют между собой, после чего сначала содержимое второго шприца выдавливается в первый шприц, а затем производится последовательное циклическое выдавливание содержимого одного шприца в другой, количество циклов повторения - 200 раз.

Таблица 3-1. Способы приготовления трёхкомпонентных липидных систем. \ Способ гомогенизации
---------------------
Порядок смешивания \ (А) Смешивание в ПЦР-пробирках с использованием центрифуги (Б) Смешивание с использованием шприцевых смесителей (1) Водный раствор FABPEG смешивается с моноолеином Способ приготовления A1 Способ приготовления Б1 (2) Моноолеин смешивается с FABPEG в хлороформе, затем хлороформ выпаривается, после этого добавляется вода Способ приготовления А2 Способ приготовления Б2

Пример 4. Кристаллизация мембранных белков с использованием липидных мембранных систем, содержащих моноолеин и FABPEG, в качестве кристаллизационного матрикса

Для экспериментов по кристаллизации мембранных белков использовался способ приготовления Б1 (см. Пример 3). Водный раствор FABPEG2000 смешивался с буферным раствором очищенного солюбилизированного в детергенте DDM мембранного белка, а затем итоговый раствор (20% FABPEG2000, 20 mg/mL белка) смешивался с расплавленным моноолеином в объёмном соотношении 2 к 1 с использованием шприцевых смесителей.

Для исследования кристаллизационных свойств этой системы были выбраны два белка (бактериородопсин из Halobacterium salinarum и OLPVR1 из Organic Lake Phycodnavirus). Эти белки являются микробными родопсинами, которые имеют 7 трансмембранных спиралей и молекулярную массу около 25 - 30 кДа.

Кристаллы были выращены в липидных мембранных системах (мезофазах), как описано в работах [10.1038/nature01109, 10.1038/nsmb.3002]. Смеси из липидных мембранных систем с белком были раскапаны на 96-луночные планшеты (Marienfeld), в объёме 150 нл на лунку, и накрыты 450 нл раствора пресипитанта с помощью робота NT8 Drop Setter (Formulatrix). Кристаллы были выращены при 20°C и достигли финального размера в течение 2 - 4 недель.

После того, как кристаллы достигли финального размера, мы открыли кристаллизационные лунки, как описано в [10.3791/4001], покрыли мезофазы 50 мкл раствора пресипитанта. Для сбора данных, кристаллы инкубировались в соответствующем растворе пресипитанта в течение примерно 5 минут. После инкубации, кристаллы были загружены на MicroMeshes и MicroMounts (MiTeGen), быстро заморожены и хранились в жидком азоте.

Данные рентгеновской дифракции были собраны в ESRF на измерительной станции ID23-1 [10.1107/S0909049506004341], укомплектованной детектором Dectris, при 100K. Дифракционные изображения были обработаны с помощью XDS [10.1107/S0907444909047337].

Фазовая проблема была решена с помощью молекулярного замещения в программе MOLREP [10.1107/S0907444909042589]. Конечные структурные модели были получены посредством итерирования ручной доработки модели в программе Coot и программы REFMAC5 [10.1107/S0907444911001314]. Карты электронной плотности были вычислены с помощью Coot [10.1107/S0907444910007493].

Лучшие кристаллы бактериородопсина, были получены при использовании 0,1 MES pH 5,8 20%(w/v) PEG 2000 mme (Qiagen) в качестве осадителя и выросли до 100 мкм (Рис. 7). Лучшие кристаллы OLPVR1 были получены при использовании 10 мМ CaCl2, 10 мМ MgCl2, 28% PEG 550, 100 мМ Tris, pH 8.2 в качестве осадителя, и выросли до 70 мкм (Рис.8).

Область основания Шиффа и ретиналь-связывающий карман для карт электронной плотности, полученных в результате кристаллографического эксперимента, показаны на (Рис. 9-12).

В результате было показано, что разработанные LCP подходят для высококачественной кристаллизации белков.

Таблица 4-1. Статистика сбора и уточнения данных для кристаллов бактериодопсина и OLPVR1, выращенных в разработанной кристаллизационной системе. BR (FABPEG) OLPVR1 (FABPEG) Сбор данных Группа симметрии P63 P22₁2₁ Параметры решётки a, b, c (Å) 61.0; 61.0; 111.1 54.2; 59.8; 106.8 α, β, γ (°) 90.0; 90.0; 120.0 90.0; 90.0; 90.0 Разрешение (Å) 47.69 - 1.47 (1.51 - 1.47) 47.98 - 1.84 (1.88 - 1.84) R_merge или R_split (%) 6.6 (363.8) 6.9 (191.8) I/σI 15.6 (0.52) 7.69 (0.45) CC_1/2 (%) 100.0 (28.5) 99.9 (20.5) Completeness (%) 99.9 (99.9) 93.4 (90.5) Unique reflections 39756 (2966) 28371 (1994) Обработка данных Разрешение (Å) 47.74 - 1.47 20.0 - 1.95 Количество рефлексов 37792 24409 R_work/R_free (%) 18.8/20.3 20.6/23.1 Среднеквадратичные отклонения Длины связей (Å) 0.002 0.003 Углы между связями (Å) 1.026 1.074

Пример 5. Контроль параметров (тип симметрии, период повторяемости, диаметры водных каналов) полученных кубических фаз методом малоуглового рассеяния

Перед измерениями с помощью метода малоуглового рентгеновского рассеяния (МУРР), образцы исследуемых трёхкомпонентных смесей (моноолеин/H₂O/FABPEG) помещались в ПЦР-пробирки. Способы приготовления А1 и А2 подразумевают, что образцы уже находятся в ПЦР-пробирках по завершении протокола приготовления. В случае способов приготовления Б1 и Б2, гомогенизированные смеси, полученные в результате использования шприцевых смесителей, выдавливались в ПЦР-пробирки объёмом от 2 до 20 мкл, после чего подвергались центрифугированию при 5000 g в течение 1 минуты для сброса смеси на дно пробирки.

ПЦР-пробирки с образцами были размещены на специально изготовленном держателе (Рис.13), который был помещён в измерительную камеру установки МУРР Rigaku Micromax-007HF [Murugova et al., 2015]. Рентгеновское излучение с длиной волны λ = 1.54 Å, рассеянное на исследуемом образце, фиксировалось позиционно-чувствительным детектором (ПЧД) ASM DTR Triton 200. Пространство между источником рентгеновского излучения и ПЦР-пробирками с исследуемыми образцами, а также пространство между образцами и детектором находится под вакуумом (давление не выше 10^-4 Бар). Предусмотрен режим измерений, при котором ПЦР-пробирки с образцами находятся при нормальном давлении (на воздухе), а область с ПЦР-пробирками отделена от вакуумированной области с помощью каптоновых окон.

Первичная обработка экспериментальных данных (азимутальное усреднение 2D-изображений, калибровка по модулю вектора рассеяния q) производилась в программе SaxsGui (Rigaku Innovative Technologies, Inc., and JJ X-ray System Aps). Полученные МУРР кривые I(q) (зависимость интенсивности от модуля вектора рассеяния q) как правило имеют несколько побочным максимумов. Один из эти максимумов (соответствует q ~ 0.04 Å и имеет ширину FWHM ~ 0.004 Å) появляется из-за паразитного рассеяния от пластика, из которого изготовлены ПЦР-пробирки. Остальные максимумы интенсивности соответствуют дифракционным пикам, которые появляются вследствие рассеяния на периодических структурах - липидных кубических фазах. Помимо липидных кубических фаз, смеси моноолеин/H₂O/FABPEG могут образовывать иные периодические и квазипериодические структуры липидных мембранных систем, такие как ламеллярная фаза (Lα), двумерная гексагональная фаза (p6m), и “спонж”-фаза (L3, sponge - губка).

Тип дифракционной решётки определялся по соотношению позиций (значения модуля вектора рассеяния q) дифракционных пиков : … : , в соответствии с Таблицей 5-1. Параметр решётки (период повторяемости) d вычисляется по формуле:

,

где - позиция первого дифракционного пика, соответствующего идентифицированному типу решётки, N - минимальное (соответствующее первому не запрещенному рефлексу) значение, указанное в соотношении координат пиков (1 для Lα, для p6m, для кубических решёток с типами симметрии Pn3m и Im3m, для кубической решетки Ia3d). “Спонж”-фаза L3 характеризуется низким уровнем упорядоченности, поэтому для нее наблюдается не набор дифракционных пиков, а один корреляционный пик.

Таблица 5-1. Соотношения позиций дифракционных пиков для различных типов периодических структур, которые могут образовываться в смесях моноолеин/H₂O/FABPEG. Тип решётки Соотношение позиций дифракционных пиков Кубическая (Ia3d) Кубическая (Pn3m) Кубическая (Im3m) Ламеллярная (Lα) Гексагональная (p6m)

Для количественной характеризации “раздувания” липидных кубических фаз используется такой параметр, как диаметр водного канала , который выражается формулой:

где T - толщина липидного бислоя моноолеина (~35 Å), χ - характеристика Эйлера-Пуанкаре, A* - площадь поверхности в элементарной ячейке с параметром решетки, равным единице. Значения χ и A* для разных типов кубических решёток приведены в Таблице 5-2.

Таблица 5-2. Значения топологических коэффициентов χ и A*, а также упрощённая формула для вычисления диаметра водного канала для трёх типов симметрии, которые могут наблюдаться в липидных кубических фазах. Ia3d Pn3m Im3m χ -8 -2 -4 A* 3.091 1.919 2.345 0.496 d - T 0.782 d - T 0.611 d - T

Если весь набор представленных на кривой рассеяния I(q) дифракционных пиков не может быть описан с удовлетворительной точностью определенным типом решётки с соответствующим периодом повторяемости, такой набор данных интерпретируется в соответствии с моделью смеси разных типов решётки и/или периодов повторяемости. В этом случае требуется указать принадлежность каждого обнаруженного дифракционного пика к одной из решёток. Примеры наборов дифракционных пиков для случая одного типа решётки показан на Рис.14, для смеси - на Рис. 15.

Диаметр водных каналов в липидных кубических фазах, образованных смесью моноолеин/H₂O/FABPEG, зависит от соотношения компонентов, а также от типа FABPEG - от его молекулярной массы. Использование FABPEG с большей молекулярной массой даёт возможность получения больших диаметров водных каналов, как видно из сравнения, приведенного на Рисунке 5-4. Диаметр водных каналов растёт при добавлении большего количества воды к системе сначала растёт, а затем выходит на насыщение (см. Рис.16).

Таким образом, разработаны амфифильные вещества FABPEG, состоящих из дипегилированных производных (1,20)-эйкозен-10-диовой кислоты для модификации параметров липидных мембранных систем используемых в биологии и медицине.

Для этого разработан способ получения химических соединений вида FABPEG, а также разработан способ смешивания многокомпонентных липидных мембранных систем, содержащих матрикс-образующий липид и FABPEG, пригодных для кристаллизации мембранных белков и белковых комплексов, в том числе с большими водорастворимыми частями, пригодных для контроля характерных размеров методом малоуглового рассеяния.

Подписи к рисункам

Рис. 1. Принципиальная схема FABPEG. Молекула состоит из гидрофобного моста (А), необходимого для заякоривания молекулы в липидных мембранах, и двух гидрофильных фрагментов (Б) полиэтиленгликоля.

Рис. 2. Схема расширения водных каналов липидных мембранных систем в присутствии молекул FABPEG. Длинные гидрофильные остатки взаимно отталкиваются в т.н. режиме “щетки”

Рис. 3. Метатезис двухосновной карбоновой кислоты с использованием катализатора Граббса 2-ого поколения. Синтез производится в атмосфере аргона.

Рис. 4. Синтез хлорангидрида двухосновной карбоновой кислоты. ДМФА добавляется в каталитических количествах.

Рис. 5. Пегилирование хлорангидрида двухосновной кислоты (α,ω)-аминометоксипегом различных длин

Рис. 6. Пегилирование двухосновной кислоты (α,ω)-аминометоксипегом различных длин с помощью карбодиимида

Рис. 7. Изображение кристаллов бактериородопсина внутри многокомпонентных липидных мембранных систем, приготовленных с использованием добавки FABPEG.

Рис. 8. Изображение кристаллов бактериородопсина внутри многокомпонентных липидных мембранных систем, приготовленных с использованием добавки OLPVR1.

Рис. 9. Область основания Шиффа бактериородопсина. Карты электронной плотности (2Fo - Fc, 1,5σ) показаны черным цветом.

Рис. 10. Область основания Шиффа OLPVR1. Карты электронной плотности (2Fo - Fc, 1,5σ) показаны черным цветом.

Рис. 11. Ретиналь-связывающий карман бактериородопсина. Карты электронной плотности (2Fo - Fc, 1,5σ) показаны черным цветом.

Рис. 12. Ретиналь-связывающий карман OLPVR1. Карты электронной плотности (2Fo - Fc, 1,5σ) показаны черным цветом.

Рис. 13. Фотография держателя, разработанного специально для измерений липидных мембранных систем в ПЦР-пробирках методом малоуглового рентгеновского рассеяния. Слева - пустой держатель, справа - с установленными в держатель ПЦР-пробирками.

Рис. 14. Кривая малоуглового рассеяния, полученная для смеси с соотношением компонентов моноолеин /H₂O/ FABPEG5000 = 1 / 1 / 1. Серым цветом показаны экспериментальные точки, чёрная и красная сплошные линии соответствуют аппроксимации фоновой составляющей и кривой рассеяния целиком. Справа сверху показано двумерное изображение картины рассеяния с ПЧД (маской закрыты области прерывателя прямого пучка и паразитного рассеяния). Дифракционные пики соответствуют липидной кубической фазе Pn3m с параметром решётки d = 117 Å и диаметром водных каналов dW = 57 Å.

Рис. 15. Кривая малоуглового рассеяния, полученная для смеси с соотношением компонентов моноолеин/H₂O/ FABPEG5000 = 1 / 10 / 1. Серым цветом показаны экспериментальные точки, чёрная и красная сплошные линии соответствуют аппроксимации фоновой составляющей и кривой рассеяния целиком. Справа сверху показано двумерное изображение картины рассеяния с ПЧД (маской закрыты области прерывателя прямого пучка и паразитного рассеяния). Набор пиков соответствует смеси двух липидных кубических фаз, которые имеют одинаковый тип симметрии - Im3m, но разные параметры решётки и диаметры водных каналов. Для кубической фазы, обозначенной индексом I: d = 335 Å, dW = 170 Å. Для кубической фазы, обозначенной индексом II: d = 141 Å, dW = 52 Å.

Рис. 16. Зависимость диаметра водного канала от массового соотношения MO : H₂O при MO : FABPEG = 1 : 1 (w/w). Красные квадраты соответствует FABPEG2000, синие круги - FABPEG5000.

Изобретение относится к области модификации липидных мембран. Предложены вещества ряда амфифильных полимеров (FABPEG) для модификации липидных мембранных систем, состоящие из дипроизводных (1,20)-эйкозен-10-диовой кислоты с линейными амино-полиэтиленгликолями (аминоПЕГ) с числом звеньев одного фрагмента ПЕГ больше 40 и массой больше 2000 а.е.м; способ получения предложенных химических соединений FABPEG и применение предложенных химических соединений FABPEG для модификации размеров водных каналов липидных мембранных систем. Технический результат – получение амфифильных полимеров, состоящие из дипроизводных (1,20)-эйкозен-10-диовой кислоты с линейными амино-полиэтиленгликолями, получение характеристики структурных параметров получаемых трехкомпонентных липидных мембранных систем, и демонстрации пригодности полученных липидных мембранных систем для кристаллизации пробных мембранных белков. 3 н. и 1 з.п. ф-лы, 16 ил., 4 табл., 5 пр.

1. Вещества ряда амфифильных полимеров (FABPEG) для модификации липидных мембранных систем, состоящие из дипроизводных (1,20)-эйкозен-10-диовой кислоты с линейными амино-полиэтиленгликолями (аминоПЕГ) с числом звеньев одного фрагмента ПЕГ больше 40, массой больше 2000 а.е.м.

2. Способ получения химических соединений по п.1. FABPEG, заключающийся в их синтезе путем химического сочетания дипроизводных (1,20)-эйкозен-10-диовой кислоты с аминоПЕГом на основе либо выделения хлорангидрида кислоты с последующей реакцией с аминоПЕГом либо прямой конъюгацией кислоты с аминоПЕГОМ с использованием карбодиимидов и последующей очистке синтезированного химического соединения с использованием ионообменной хроматографии и последующей перекристаллизацией и/или очисткой на гель-фильтрационной колонке.

3. Применение химического соединения, описанного в п.1. (FABPEG), для модификации размеров водных каналов липидных мембранных систем.

4. Применение по п.3, характеризующееся тем, что модификация осуществляется путём либо смешивания FABPEG с матрикс-образующим липидом в хлороформе с последующими высушиванием в вакууме и гидратацией при центрифугировании или экструзии, либо смешивания водного раствора FABPEG c матрикс-образующим липидом с помощью экструзии или центрифугирования.