Вакцина против ящура генотипа SAT-1/I из штамма "SAT-1/Танзания/2012" культуральная инактивированная сорбированная Российский патент 2024 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральной инактивированной сорбированной.

Ящур - острое вирусное заболевание из группы зоонозов, характеризующееся интоксикацией и везикулезно-эрозивным поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа [1, 2, 3, 4].

В настоящее время выделяют 7 серотипов вируса ящура: О, А, С, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Каждый серотип генетически разделен на различные топотипы, генетические линии и сублинии. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1].

В пределах семи серотипов были описаны более 60 генетических линий и сублиний. Важность их знания заключается в том, что требуется очень тщательно подбирать вакцину, которая должна быть адаптирована именно к интересующему генотипу. Животные после переболевания каким-либо одним серотипом не приобретают иммунную защиту против другого серотипа и даже некоторых других генетических линий [3]. Однако, вирусы ящура могут демонстрировать частичную перекрестную защиту в пределах одного серотипа.

Для выявления генетических связей между различными изолятами и штаммами обычно применяют нуклеотидное секвенирование. Следовательно, в условиях вспышки можно проследить происхождение вируса. Антигенные характеристики вируса, связанные с появлением новых штаммов, важны для характеристики вспышек и поиска оптимальных вакцинных препаратов [4, 6].

Репрезентативные штаммы/изоляты для каждого топотипа ящура перечислены ниже. Они могут образовывать основные опорные точки филогенетического дерева. В базе данных GenBank представлены нуклеотидные последовательности для различных генетических линий и сублиний.

Для вируса ящура серотипа SAT-1 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERN ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам при специфической профилактики ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-1 [5-11].

Данное многообразие представителей серотипа SAT-1 обусловлено высокой степенью изменчивости РНК-содержащих вирусов и активным перемещением данного возбудителя на территории Африки и Ближнего Востока.

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [6, 7, 8, 9, 10, 11].

Возникающие в мире вспышки ящура демонстрируют, что данная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Споры о наиболее эффективном способе реагирования на вспышки ящура в странах, свободных от болезней, по-прежнему сосредоточены на использовании вакцин [8, 9, 12, 13]. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующий эпизоотическому изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.

Одной из нескольких мер, которые могут быть применены для борьбы со вспышками ящура, является экстренная вакцинация. Критерии, определяющие успешное проведение данной вакцинации, включают в себя доступ к вакцине, которая отличается следующими характеристиками: 1) содержит штамм вируса ящура с достаточным антигенным родством по отношению к изолятам, циркулирующим в очаге; 2) относится к требуемому виду среди разработанных вакцин; 3) характеризуется приемлемой безвредностью и эффективностью; 4) имеет соответствующий доступ, в том числе объем партий и своевременность их поставок.

Планирование на случай непредвиденных обстоятельств должно включать обеспечение вакцинации и учитывать возможность сложных решений не только в отношении того, когда, где и как применять вакцину, но и экономическую целесообразность ее использования [14].

На территории Восточной Африки, в частности, в Нигерии, Кении, Танзании, Эфиопии вспышки ящура серотипа SAT-1 имеют спорадический характер и вызваны заносом возбудителя с территории сопредельных стран. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи со странами Африканского континента, в частности, Восточной Африки. Имеются риски заноса вируса ящура данного серотипа на территорию Российской Федерации.

Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-1, в частности, II («SAT-1 RV 11 37»), III («SAT-1 ВОТ 1 68»), IV («SAT-1 UGA BUFF 21 70»), V («SAT-1 NIG 11 75»), VI («SAT-1 SUD 3 76»), VII («SAT-1 UGA 13 74»), VIII («SAT-1 UGA 1 97»), IX («SAT-1 ETH 3 2007»), X («SAT-1/Х»), XI («SAT-1 TCH 1/72»), XII («SAT-1/ANG/9/74»), XIII («SAT 1 MOZP132010 B16»). В последние годы, начиная с 2012 г. стали широко распространяться изоляты вируса ящура серотипа SAT-1 топотипа I. В частности, вспышки ящура генотипа SAT-1/I фиксировались в Кении, Танзании, Уганде, Эфиопии.

Известны производственные штаммы вируса ящура типа SAT-1, которые применяются или применялись в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-1 Т 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 ВОТ 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип SAT-1/VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип SAT-1/VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип SAT-1/IX),

- штамм «SAT-1/Х» (генотип SAT-1/X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип SAT-1/XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип SAT-1/XII),

- штамм «SAT-1 MOZP132010 В16» (генотип SAT-1/XIII).

Изолят «SAT-1/TAN/11/2012» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Объединенной Республики Танзания в 2012 году и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» для проведения научных исследований. При адаптации на культурах клеток в 2022 году получения название штамм «SAT-1/Танзания/2012».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный изолят принадлежит к топотипу I, типа SAT-1 вируса ящура, который значительно отличается по своей генетике от производственных штаммов вируса ящура типа SAT-1 [16].

Учитывая увеличение торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африканского континента, есть предпосылки возникновения ящура в РФ, при этом особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации и сопредельных государств.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура серотипа SAT-1 (с использованием штамма «SAT-1/Ахалкалакский/1962»), содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-1/Ахалкалакский/1962», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроокиси алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание 10% раствора гидроокиси алюминия - 50% по объему, концентрация сапонина - 1,5 мг/см³, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип).

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию ВНК-21, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,45-7,65.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении сорбированной вакцины в качестве адъюванта служит гидроксид алюминия (Al(ОН)₃). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Авирулентный и очищенный инактивированный антигенный материал из штамма вируса ящура серотипа SAT-1 представляет собой суспензию, состоящую из 146S+75S компонентов вируса ящура, то есть полных иммуногенных частиц и «пустых» капсидов.

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его очень низкой иммуногенной активности относительно изолятов вируса ящура генотипа SAT-1/I, циркулирующих в странах Африки и Ближнего Востока. Кроме того, в прототипном варианте вакцины учитывается сумма компонентов 146S и 75S, при этом полноценными иммуногенными свойствами обладают только 146S частицы, которые являются полными вирионами, несущими абсолютно все иммуногенные сайты и структурные вирусные белки и вирусную РНК.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральной инактивированной сорбированной.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против вируса ящура серотипа SAT-1 и, в частности, генотипа SAT-1/I.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Танзания/2012» (генотип SAT-1/I) вируса ящура, репродуцированного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,5 мкг; 2) гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 40% по объему (4% в пересчете на сухое вещество), 3) сапонин в количестве 1,5 мг, 4) поддерживающая среда - до 1,0 см³.

Штамм «SAT-1/Танзания/2012», который получен из изолята «SAT-1/TAN/11/2012», депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №411 - деп / 22-45 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5% от общего объема при рН среды 7,45-7,65. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,028% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,013% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [18]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 3,5 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроксида алюминия (Al(ОН)₃).

Вакцину против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена (инактивированный 146S иммуногенный компонент) и 10%-ной суспензии гидроксида алюминия в соотношении 60% на 40% по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в концентрации 1,5 мг/см³. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные вирионы вируса ящура, которые обеспечивают формирование иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральная инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 3,5 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.

4. Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроксид алюминия в комплексе с сапонином.

5. Вакцина содержит адъювант - алюминия гидроокись 4% в пересчете на сухой остаток в комплексе с сапонином в концентрации 1,5 мг в 1,0 см³ готового препарата.

6. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура, полученного предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии BNK-21/SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроксид алюминия и сапонин, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса не менее 3,5 мкг/см³ ящура Гидроокись алюминия 4% (в пересчете на сухое вещество) Сапонин 1,5 мг/см³ Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против ящура генотипа SAT-1/I, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Африки и Ближнего Востока.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Положение штамма «SAT-1/Танзания/2012» на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁). Штамм выделен красным цветок и обозначен «SAT-1/TAN/2012».

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO: 1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура генотипа SAT-1/I;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура генотипа SAT-1/I.

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура серотипа SAT-1 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 20-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной молекулы РНК с позитивным смыслом, заключенной в белковую оболочку. Она состоит из 32 капсомеров, расположенных в кубической симметрии.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура относится к серотипу SAT-1. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-1/I.

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «SAT-1 Т 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 ВОТ 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип SAT-1/VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип SAT-1/VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип SAT-1/IX),

- штамм «SAT-1/Х» (генотип SAT-1/X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип SAT-1/XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип SAT-1/XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 В16» (генотип SAT-1/XIII)

в реакции микронейтрализации. Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [15, 17, 19].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при <0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-1/Танзания/2012» составили r₁ 0,01-0,15, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-1 (таблица 1).

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура является РНК (+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁, который кодируется 1D-геном. В вирионе вируса ящура содержится около 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса. Из 8 неструктурных полипептидов, накапливающихся в инфицированных клетках, выделяют РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства. Масса вириона составляет 8,4×10^-18 г. Плавучая плотность 1,45 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам. Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура устойчив к детергентам и органическим растворителям, таким как эфир, хлороформ, фреон, ацетон. Наиболее стабилен при рН 7,4-7,6. Сдвиги рН как в кислую, так и в щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 37,7°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики. Штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным, в таксономическом отношении новым, не охарактеризованном вариантом вируса ящура генотипа SAT-1/I.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-1/I, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки высокоиммуногенной и эффективной вакцины.

Получена высокоиммуногенная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральная инактивированная сорбированная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проведенные исследования заключались в изучении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) (639 н.о.) штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-1. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами вируса ящура серотипа SAT-1.

Провели сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «SAT-1/Танзания/2012» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1 вируса ящура представлена SEQ ID NO: 1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VP₁ штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура отражена на SEQ ID NO: 2.

Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA6 и алгоритма Neighbor-Joining [20]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (200 повторов), показан рядом с ветвями [21, 22]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [23] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 32 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). В окончательном наборе данных было всего 663 позиций. Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [24].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «SAT-1/Танзания/2012» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1).

По результатам всего анализа делаем вывод, что исследуемый штамм «SAT-1/Танзания/2012» относится к серотипу SAT-1 топотипу I, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «SAT-1/Танзания/2012» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт КРС (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,01 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 17-18 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,10±0,10 до 7,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,29±0,01 до 1,07±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,07±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 97,07 до 99,95%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура к перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-ого на 6-ого пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DMEM; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса с 3,0% гидролизата белков крови. Посевная концентрация клеток составляла 0,15-0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя на 90-100% в течение 13-32 ч. Результаты репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 2.

Из данных таблицы 2 видно, что при репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла DMEM, позволяющая за 13-14 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,07±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DMEM с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 80-100% в течение 13-32 ч (таблица 2). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой за 13-14 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,07±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-1/Танзания/2012» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла MEM с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-25 ч до специфического разрушения клеток на 90-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 2, наибольшее накопление «полных» частиц вируса достигалось при дозе заражения 0,1-0,01 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,07±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,85±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Игла DMEM; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С; 3) доза заражения вирусом - 0,1-0,01 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRI АН проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температуру и дозу заражения.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Водородный показатель рН поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,02°С, доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 10-13 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток представлены в таблице 3.

Как следует из таблицы 3, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» в ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 1,12±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 1,65±0,03 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 1,98±0,03 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 2,45±0,05 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура оптимальной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRTAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см³. Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 9,10±0,14 lg ТЦД₅₀/см³. Большая концентрация клеток позволяла получить такой же выход продукта с небольшим увеличением. С экономической точки зрения, таким образом, для репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура оптимально использовать суспензию клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с концентрацией 4,0 млн кл./см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние фактора температуры на суспензионное культивирование штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С.Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. Водородный показатель рН вирусной суспензии поддерживали в диапазоне 7,45-7,65. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного 90-100%, в течение 9-26 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в КК ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,02°С, при которой в течение 9-11 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,45±0,03 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 9,10±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения клеток при изучении условий суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 9-30 ч до цитопатического действия, равного 90-95%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 3, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл. (2,45±0,03 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 9,10±0,14 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-1/Танзания/2012» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH:

1) концентрация клеток перед заражением - 4,0 млн кл./см³;

2) температурный режим культивирования - 37,0±0,02°С;

3) доза заражения вирусом - 0,10-0,01 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012».

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования 37,0±0,02°С, в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,05%. Инактивацию вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,45-7,65 с перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 4.

Как видно из таблицы 4, полная инактивация инфекционной активности культурального вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения инактиванта.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в реакции связывания комплемента для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,42±0,10 мкг/см³, a 146S+75S компонента - 2,62±0,07 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012».

Суспензию вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012», полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергают инактивации и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,010, 0,013 и 0,016%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» в количественном варианте реакции связывания комплемента определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 5.

Как следует из данных таблицы 5, в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» с помощью ПГМГ в концентрации 0,010% отмечали снижение концентрации балластного белка на 17%, иммуногенных компонентов - на 3%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,013% наблюдали снижение количества балластного белка на 40%, 146S компонента - на 4%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,016% содержание балластного белка уменьшалось на 55, а иммуногенных компонентов - на 18%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-1/Танзания/2012», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально необходимо использовать ПГМГ с концентрацией 0,013%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «SAT-1/Танзания/2012», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 9 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью гидроокиси алюминия (10%-ный коллоидный раствор в количестве 40%, антиген вируса - 60% от общего объема).

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 6.

Как следует из данных таблицы 6, при концентрировании антигена штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 7,0 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 8,5 раз. Применяя метод сорбирования с помощью гидроксида алюминия, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура в суспензии в 8,9 раз (потери незначительны - 1,3%). Таким образом, оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» является метод сорбирования с применением коллоидного раствора гидроксида алюминия.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

Для изготовления противоящурной моновалентной сорбированной вакцины из антигена штамма «SAT-1/Танзания/2012» в качестве адъюванта был выбран гидроксид алюминия в комплексе с сапонином. При изготовлении моновалентной сорбированной вакцины против вируса ящура использовали 4% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 1,5 мг/см³.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Танзания/2012» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-1/I культуральную инактивированную сорбированную с применением в качестве адъювантов гидроокиси алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ готового антигена составило 20,78±0,10 мкг/см³ (таблица 6).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу КРС (№№1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после начала тестирования вакцины на авирулентность и безвредность и на 14 сутки после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 7, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС<50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной.

Для определения авирулентности вакцины на КРС отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали КРС массой 250-300 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на КРС проводили путем внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,3°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток.

По результатам исследований вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральная инактивированная сорбированная была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом исследовании некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [18]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 7,75±0,31 log₂ SN₅₀, с разведением 1/4 (5 голов) - 4,70±0,12 log₂ SN₅₀, с разведением 1/16 (5 голов) - 3,30±0,48 log₂ SN₅₀. (таблица 8). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Контрольное заражение естественно восприимчивых животных. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной на естественно восприимчивых видах животных.

Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 8, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде и в разведении 1/4, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

Препарат, инокулированный в разведении 1/16, защитил 4 из 5 животных. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 24,25 ПД₅₀ и 0,08 ИмД₅₀ для КРС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012 культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как экспериментальный резервный препарат для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного изобретения - вакцина, изготовленная из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа SAT-1, генотипа SAT-1/I, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральная инактивированная сорбированная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 03.09.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 14.08.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2015 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов A.H., Дудников А.И., Малярец П.В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А.П., Узюмов В.Л., Груздев К.Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Bamett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J.M. Pachecoa, T. Doel [et. al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 14.08.2022).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - P. 746-754.

13. Рахманов A.M. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля // Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Тауо Т. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Мельник P.H., Хаустова H.B., Мельник H.B., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С. 29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston В. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy / Phil. Trans. R. Soc. В (2009) 364. - P. 2657-2667.

17. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

18. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

19. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

20. Saitou N. and Nei М. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4: 406-42.

21. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39: 783-791.

22. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101: 11030-11035.

23. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C, and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35: 1547-1549.

24. Barnett P. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M / Garland, R.P. Kitching [et. al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - 2002. - V. 25. - P. 345-364.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"

dtdVersion="V1_3" fileName="Вакцина против ящура генотипа SAT-1

I.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2022-11-23">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-23</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>474</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-11-23</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

SAT-1/I из штамма «SAT-1/Танзания/2012» культуральная

инактивированная сорбированная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>663</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..663</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacatcggcgggtgaaggcgcagagcccgtgactaccgatgcatcac

agcatggcggtgggcgccgcgccacgcgcaggcaacacactgacgtggctttcctccttgaccggttcac

cctggtcgggaagactgctggcaacagattgacactggacctgctccagaccaaggagaaagcactggtg

ggcgcaatcctgcgcgctgccacgtactacttctcggacttggaggtggcttgtgttggtacgaacaagt

gggtcggctggacgccgaacggcgcgccagaactcagtgaggtcggcgacaacccagtcgtcttctctca

caacgggaccacacgctttgctctaccatacactgccccacacagatgtcttgctactgcctacaacggc

gactgcaagtacaaaccaaccagtgaggcaccgcggacgcacatccgtggggaccttgcggcactcgctg

agcgcatcgctagcgagacacacatcccaaccacctttaactatggcaggatctacacagaggcggaagt

cgacgtgtatgtgaggatgaagcgggcggagctctactgcccacgcccggtgctgactcactatgaccac

caggacaaggaccgctacaaagtggccctgacaaagcctgccaaacaactgtgc</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>221</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..221</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEPVTTDASQHGGGRRATRRQHTDVAFLLDRFTLVGKTAGNR

LTLDLLQTKEKALVGAILRAATYYFSDLEVACVGTNKWVGWTPNGAPELSEVGDNPVVFSHNGTTRFALP

YTAPHRCLATAYNGDCKYKPTSEAPRTHIRGDLAALAERIASETHIPTTFNYGRIYTEAEVDVYVRMKRA

ELYCPRPVLTHYDHQDKDRYKVALTKPAKQLC</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I культуральной инактивированной сорбированной. Вакцина содержит авирулентный и очищенный концентрированный антиген штамма «SAT-1/Танзания/2012» вируса ящура генотипа SAT-1/I, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии из почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21/SUSP/ARRIAH), представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура, адъювант гидроокись алюминия и сапонин в эффективных соотношениях. Вакцина обладает высокой иммуногенностью и способна обеспечить эффективную защиту от гомологичного возбудителя инфекции, циркулирующего в странах Африки и Ближнего Востока. 1 з.п. ф-лы, 1 ил., 8 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), под регистрационным номером: №411 - деп / 22-45 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 3,5 мкг; в качестве адьюванта гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 40% по объему 4,0% в пересчете на сухое вещество в комплексе с сапонином в количестве 1,5 мг и поддерживающую среду до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Танзания/2012» генотипа SAT-1/I, полученный предпочтительно в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура генотипа SAT-1/I.