Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная Российский патент 2025 года по МПК A61K39/135 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной сорбированной.

Ящур - самое контагизное опасное вирусное заболевание животных, которое вызывается РНК-содержащим вирусом семейства Picornaviridae рода Aphtovirus [1, 2, 3, 4]. Известно 7 серотипов вируса ящура: O, A, C, Азия-1, SAT-1, SAT-2 и SAT-3. Внутри каждого серотипа имеет место явление мутационной изменчивости, чтобы определять появление новых изолятов, отличных от ранее выделенных штаммов вируса ящура. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности 1D-гена (белок VP₁), который характеризуется высокой геномной и антигенной вариабельностью [1]. Вирус ящура серотипа SAT-2 имеет большую изменчивость последовательности в гене белка VP₁ по сравнению с вирусами серотипов О, А и С [2, 3], для которых он рассматривается как широкий антигенный вариант, поэтому в случае SAT-2 требуется тщательный отбор иммунодоминантного вакцинного штамма [3, 5, 6].

Для вируса ящура серотипа SAT-2 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 14 топотипов (I - XIV), внутри которых нет разделения на генетические группы. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин, а также затрудняет штаммоспецифическую диагностику выделенных изолятов вируса ящура. В результате возникает необходимость создания новых средств диагностики и специфической иммунопрофилактики в отношении вируса ящура серотипа SAT-2 [7-11].

По причине легкого и быстрого распространения возбудителя ящура данное заболевание может приобретать размах эпизоотий [12]. С целью недопущения возникновения болезни в хозяйствах Российской Федерации применяется система мероприятий по борьбе и профилактике ящура, которая направлена на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую иммунизацию крупного и мелкого рогатого скота в буферной зоне, а также проведение мониторинга иммунного статуса привитых животных.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам [10,12, 13]. Данная инфекция продолжает оставаться значимой экономической проблемой во всем мире. Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной, безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной части антиген вируса, соответствующий эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа [14]. Создание подобных вакцин является актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучном пункте и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура.

На территории Юго-Восточной, Южной, Восточной Азии вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV теперь имеют спорадический характер. Следует отметить, что в последние годы усилились торгово-экономические связи России со странами этого региона, в частности, Монголии, Китая, Индии и др., а также Африки. Исходя из этого, крайне высоки риски заноса возбудителя данного генотипа на территорию Российской Федерации, что угрожает биологической безопасности нашей страны по ящуру.

На протяжении многих лет периодически фиксировали вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV в странах Африки, однако в 2023 г. представители данного варианта вируса были обнаружены на территории Азиатского континента и Ближнего Востока, в частности, изоляты вируса ящура указанного генотипа были выделены в марте 2023 года в Иордании, Ираке, Грузии, Турции, в апреле 2023 - Омане, в мае 2023 в Бахрейне.

Известны производственные штаммы вируса ящура серотипа SАT-2, которые применяются или использовались ранее в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-2/ZIM/14/2002» (генотип SAT-2/I),

- штамм «SAT-2/ZIM/5/81» (генотип SAT-2/II),

- штамм «SAT-2/BOT/P3/98» (генотип SAT-2/III),

- штамм «SAT-2/ETH/1/90» (генотип SAT-2/IV),

- штамм «SAT-2/GHA/2/90» (генотип SAT-2/V),

- штамм «SAT-2/GAM/8/79» (генотип SAT-2/VI),

- штамм «SAT-2/SAU/6/2000» (генотип SAT-2/VII),

- штамм «SAT-2/RWO/1/00» (генотип SAT-2/VIII),

- штамм «SAT-2/KEN/2/84» (генотип SAT-2/IX),

- штамм «SAT-2/UGA/19/98» (генотип SAT-2/X),

- штамм «SAT-2/ANG/4/74» (генотип SAT-2/XI),

- штамм «SAT-2/UGA/51/75» (генотип SAT-2/XII),

- штамм «SAT-2/ETH/2/2007» (генотип SAT-2/XIII),

- штамм «SAT-2/ETH/2/91» (генотип SAT-2/XIV).

Изолят вируса ящура был выделен в результате лабораторно-диагностических исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из патологического материала, отобранного от крупного рогатого скота на территории Иорданского Хашимитского Королевства в августе 2023 г. При проведении научных исследований в ФГБУ «ВНИИЗЖ» был охарактеризован и получил название - штамм «SAT-2/XIV/2023».

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит к генотипу SAT-2/XIV вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 (Фиг. 1).

По причине значительного увеличения торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африки, Ближнего Востока и Азии, в которых стабильно регистрируют вспышки ящура генотипа SAT-2/XIV, возникает опасность случаев возникновения ящура данного генотипа в Российской Федерации и особое значение приобретает проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания с целью формирования иммунитета у восприимчивых животных. Таким образом, возникла необходимость разработать вакцину против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральную инактивированную сорбированную для обеспечения биологической безопасности и ветеринарного благополучия территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран, эндемичных по ящуру, которые будут использовать данный препарат для профилактики заболевания.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина инактивированная сорбированная против ящура серотипа SAT-2 (штамм «SAT-2/SAU/6/2000»), содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма
«SAT-2/SAU/6/2000», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде гидроокиси алюминия и сапонина (адъювант): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание 10% раствора гидроокиси алюминия - 50% по объему, концентрация сапонина - 1,5 мг/см³, добавка в виде поддерживающей среды - до 1,0 см³ (прототип) [15 - 18].

В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую суспензионную клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого при рН среды 7,4-7,6.

Для инактивации вируса используют аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ). При изготовлении сорбированной вакцины в качестве адъюванта служит гидроксид алюминия (Al(OH)₃). Очистку вируссодержащей суспензии от балластных примесей осуществляют с применением полигексаметиленгуанидин гидрохлорида (ПГМГ).

Авирулентный и очищенный инактивированный антигенный материал из штамма «SAT-2/SAU/6/2000» вируса ящура серотипа SAT-2 представляет собой суспензию, состоящую из 146S+75S компонентов вируса ящура, то есть полных иммуногенных частиц и «пустых» капсидов.

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его очень низкой иммуногенной активности относительно изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/XIV, циркулирующих в странах Африки и Ближнего Востока. Кроме того, в прототипном варианте вакцины учитывается сумма компонентов 146S и 75S, при этом полноценными иммуногенными свойствами обладают только 146S частицы, которые являются полными вирионами, несущими абсолютно все иммуногенные сайты и структурные вирусные белки и вирусную РНК.

Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/XIV.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного 146S компонента из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 6,0 мкг; 2) гидроксид алюминия 10%-ный коллоидный раствор с содержанием 40% по объему (4,0 % в пересчете на сухое вещество), 3) сапонин в количестве 2,0 мг, 4) поддерживающая среда - до 1,0 см³.

Штамм вируса ящура «SAT-2/XIV/2023» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 - деп / 23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы используют предпочтительно перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5% от общего объема при рН среды 7,45-7,65. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,028% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,028% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую преимущественно инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Содержание компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [19]. Для приготовления вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 6,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Необходимую концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью сорбирования на поверхности коллоидных частиц гидроксида алюминия.

Вакцину против ящура из штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV культуральную инактивированную сорбированную получают путем смешивания очищенного антигена (инактивированный 146S иммуногенный компонент) и 10%-ной суспензии гидроксида алюминия в соотношении 60% на 40% по объему, соответственно. Для усиления иммунного ответа используют сапонин в количестве 2,0 мг в дозе. Полученная вакцина представляет собой суспензию, содержащую частицы не растворимого в воде гидроокиси алюминия, несущие на своей поверхности инактивированные 146S частицы вируса ящура, которые обеспечивают формирование иммунитета у животных.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральная инактивированная сорбированная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный 146S компонент штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученный в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 6,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

Из целевых добавок вакцина содержит адъювант.

Из целевых добавок вакцина содержит адъювант - гидроксид алюминия в комплексе с сапонином.

Вакцина содержит адъювант - 10% коллоидный раствор гидроксида алюминия 40,0% по объему (4,0% в пересчете на сухой остаток) в комплексе с сапонином в концентрации 2,0 мг в 1,0 см³ готового препарата.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, полученного в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, адъювант - гидроксид алюминия и сапонин, добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа
SAT-2/XIV вируса ящура не менее 6,0 мкг Гидроксид алюминия 4,0% (в пересчете на сухое вещество) Сапонин 2,0 мг Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-2/XIV, циркулирующего в странах Африки, Ближнего Востока и Азии.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой противоящурной вакцины в качестве активного вещества введен инактивированный 146S компонент штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, обладающий высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против изолятов вируса ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки заболевания в странах Африки, Ближнего Востока и Азии.

Сущность изобретения отражена на графических изображениях:

Фиг. 1 - Положение штамма «SAT-2/XIV/2023» на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁). Штамм выделен красным цветом и обозначен «SAT-2/XIV/2023».

Фиг. 2 - График инактивации штамма «SAT-2/XIV/2023» для получения антигена с целью изготовления вакцинного препарата.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот гена белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV.

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура имеет следующую таксономию: сфера Riboviria, царство Orthornavirae, тип Pisuviricota, класс Pisoniviricetes, отряд Picornavirales, семейство Picornaviridae, род Aphthovirus, вид Foot-and-mouth disease virus, серотип SAT-2, генотип SAT-2/XIV. Штамм возбудителя обладает следующими морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 23 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК и 60 копий полипептида, каждый из которых представлен белками VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

Антигенные свойства

По антигенным свойствам штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура относится к серотипу SAT-2. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой. Вирус не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-2/XIV (Фиг. 1).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура изучено в реакции микронейтрализации вируса, в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура: штамм «SAT-2/ZIM/14/2002», штамм «SAT-2/ZIM/5/81», штамм «SAT-2/BOT/P3/98», штамм «SAT-2/ETH/1/90», штамм «SAT-2/GHA/2/90», штамм «SAT-2/GAM/8/79», штамм «SAT-2/SAU/6/2000», штамм «SAT-2/RWO/1/00», штамм «SAT-2/KEN/2/84», штамм «SAT-2/UGA/19/98», штамм «SAT-2/ANG/4/74», штамм «SAT-2/UGA/51/75», штамм «SAT-2/ETH/2/2007», штамм «SAT-2/ETH/2/91».

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-2, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [7, 8, 9, 20].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 - исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются родственными;

при < 0,3 - исследуемый образец штамма вируса ящура значительно отличается от производственного штамма.

Максимальное родство отмечается при значении r₁ в РМН, стремящимся к 1,0.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-2/XIV/2023» составили r₁ от 0,01 до 0,27, что свидетельствует об отсутствии явного антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-2.

Гено- и хемотаксономическая характеристики

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура является РНК(+) - содержащим вирусом с молекулярной массой 8,079×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,84×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄. Липопротеидная оболочка отсутствует.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится приблизительно 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса, в том числе такой важный фермент как РНК-зависимую РНК-полимеразу (3D-ген), участвующую в репликации РНК для сборки вирионов.

Физические свойства

Масса вириона составляет 8,44×10^-18 г. Плавучая плотность 1,47 г/см³.

Устойчивость к внешним факторам

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура устойчив к эфиру, хлороформу, и ацетону. Наиболее стабилен при pH 7,44-7,70. Сдвиги pH в кислую и сильно щелочную сторону ведут к инактивации вируса. Чувствителен к формальдегиду, УФ-облучению, γ-облучению, высоким температурам (выше 38,7°С).

Дополнительные признаки и свойства

Реактогенность - антиген реактогенными свойствами не обладает.

Патогенность - антиген не патогенен для парнокопытных животных.

Вирулентность - антиген не вирулентен для естественно-восприимчивых животных при контактном, аэрозольном и парентеральном заражении.

Стабильность - штамм сохраняет исходные биологические свойства при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 5 пассажей (срок наблюдения) на перевиваемых культурах.

Биотехнологические характеристики

Штамм «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура репродуцируется в перевиваемых культурах клеток: почки сибирского горного козерога (ПСГК-30), почки свиньи (IB-RS-2), почки сирийского хомячка (ВНК-21).

При испытании было проведено 5 последовательных пассажей штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемых культурах клеток ПСГК-30, ВНК-21, IB-RS-2. Биологические свойства характеризовали путем определения инфекционной активности вируса каждого пассажа в перевиваемой клеточной линии IB-RS-2 и на естественно восприимчивых животных - крупном рогатом скоте (КРС) и свиньях.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-2/XIV, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная, высокоиммуногенная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-2. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами (19 представителей) вируса ящура серотипа SAT-2 (фиг. 1).

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «SAT-2/XIV/2023» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот 1D-гена, кодирующего белок VР₁ штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура отражена на SEQ ID NO:2.

Осуществлен филогенетический анализ для штамма «SAT-2/XIV/2023». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [21]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (увеличили со стандартных 100 до 1000 повторов для высокой степени достоверности), показан рядом с ветвями [22, 23]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 11 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). Эволюционный анализ проводился в MEGA 6.

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «SAT-2/XIV/2023» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (фиг. 1). Таким образом, исследуемый штамм «SAT-2/XIV/2023» относится к генотипу SAT-2/XIV, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «SAT-2/XIV/2023» к перевиваемой монослойной культуре клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки сибирского горного козерога ПСГК-30 использовали 10%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 13 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,05±0,10 до 7,05±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,05±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,30±0,02 до 0,88±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (0,88±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,21 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии ПСГК-30.

Пример 3. Изучение условий монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса, анализируя разный состав поддерживающей среды, температурный фактор и дозу заражения клеток (n=5).

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DМЕМ; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом - 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Хэнкса, позволяющая за 13-14 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 0,95±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и Игла DMEM показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DМЕМ с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 13-28 ч. По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной культуре клеток ПСГК-30 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 13-14 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 0,95±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии ПСГК-30 штаммом «SAT-2/XIV/2023» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла МЕМ с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-26 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 0,95±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,45±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в монослойной клеточной линии ПСГК-30: 1) поддерживающая среда - среда Хэнкса; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Изучение условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0 млн кл./см³. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 9-20 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 2,5 млн кл./см³ составило 1,02±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,0 млн кл./см³ - 1,15±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ - 1,23±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,0 млн кл./см³ - 1,29±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 3,5 млн кл./см³ (при концентрации 4,0 млн кл./см³ концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 3,5 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 8,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 12-20 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 12-13 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (1,23±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 8,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-22 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (1,23±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 8,50±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением - 3,5 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования - 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом - 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023».

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2°С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,6. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,028%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С и рН 7,45-7,65 с перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления АЭЭИ каждые 30 мин производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены в таблице 3 и фиг. 2.

Как видно из таблицы 3 и фиг. 2, полная инактивация инфекционной активности культурального вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», репродуцированного в культиваторах, произошла через 3 часа после внесения инактиванта.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в реакции связывания комплемента для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 1,20±0,03 мкг/см³, а общего вирусного белка - 1,64±0,03 мкг/см³.

Пример 6. Подбор условий очистки суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023».

Суспензию вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023», полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергли инактивации (как представлено в примере 5) и очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,024, 0,028 и 0,032%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» в количественном варианте реакции связывания комплемента определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4.

Как следует из данных таблицы 4, в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» с помощью ПГМГ в концентрации 0,024% отмечали снижение концентрации балластного белка на 7%, иммуногенных компонентов - на 1,0%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,028% наблюдали снижение количества балластного белка на 13%, 146S компонента - на 2,1%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,032% содержание балластного белка уменьшалось на 20%, а иммуногенных компонентов - на 9,3%. Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-2/XIV/2023», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,028%.

Пример 7. Подбор условий концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура.

Культуральную инактивированную суспензию штамма «SAT-2/XIV/2023», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 8 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч; 3) концентрирование с помощью гидроокиси алюминия (10% коллоидный раствор в количестве 40%, антиген вируса - 60% от общего объема).

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой следует, что при концентрировании антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 6,2 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 7,1 раз. Применяя метод сорбирования с помощью гидроксида алюминия, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензии в 8,0 раз (от теоретического 8,0 раз). Таким образом, исследуя условия концентрирования антигена штамма «SAT-2/XIV/2023», пришли к выводу о том, что оптимальным способом увеличения концентрации компонентов вируса ящура является метод сорбирования с применением коллоидного раствора гидроксида алюминия.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

При изготовлении моновалентной сорбированной вакцины против вируса ящура использовали 4,0% гидроокиси алюминия в пересчете на сухое вещество и сапонин в количестве 2,0 мг в дозе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральную инактивированную сорбированную с применением в качестве адъюванта гидроокиси алюминия и сапонина. Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ готового антигена составило 9,36±0,03 мкг (табл. 5).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной.

Из полученной вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV культуральной инактивированной сорбированной был приготовлен ряд разведений для КРС с 4-х кратным шагом. 15 голов КРС разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу КРС (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу КРС (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/4, третья группа КРС (№№ 11-15) - вакциной, разведенной 1/16. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от КРС, полученные до иммунизации животных, через 14 суток после начала тестирования вакцины на авирулентность и безвредность и на 14 сутки после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови КРС < 50%).

Пример 12. Определение авирулентности и безвредности вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной

Для определения авирулентности вакцины на КРС отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали КРС массой 250-300 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Данные результаты свидетельствовали об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на КРС проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³. Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 41,5°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток.

По результатам исследований вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная была безвредна, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной по способности индуцирования вируснейтрализующих антител у естественно восприимчивых животных.

На 21 сутки после введения вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной у КРС отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у КРС, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 8,30±0,11 log₂ SN₅₀, с разведением 1/4 (5 голов) - 4,40±0,14 log₂ SN₅₀, с разведением 1/16 (5 голов) - 3,10±0,22 log₂ SN₅₀ (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации (РМН) свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной путем контрольного заражения естественно восприимчивых животных.

Крупный рогатый скот, иммунизированный в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-2/XIV/2023» генотипа SAT-2/XIV вируса ящура, адаптированного к этим животным в слизистую оболочку языка в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная в цельном виде и в разведении 1/4, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает КРС от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

Вакцинный препарат, инокулированный в разведении 1/16, защитил 4 из 5 животных. По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 24,25 ПД₅₀ и 0,08 ИмД₅₀ для КРС.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура серотипа SAT-2 генотипа SAT-2/XIV, циркулирующего в странах Африки, Ближнего Востока и Азии.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная сорбированная»:

1. Ящур. Меры профилактики. URL: http://89.rospotrebnadzor.ru/directions/epid_nadzor/146902 (Дата обращения: 11.11.2022).

2. Опасность болезни ящура. URL: https://vet.astrobl.ru/press-release/opasnost-bolezni-yashchura (Дата обращения: 11.11.2022).

3. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 - Vol. 1, Chapter 2.1.5. - P. 166-169.

4. Бурдов А. Н., Дудников А. И., Малярец П. В. и др. Ящур. - М.: Агропромиздат, 1990. - 320 с.

5. Пономарев А. П., Узюмов В. Л., Груздев К. Н. Вирус ящура: структура, биологические и физико-химические свойства. - Владимир: Фолиант, 2006. - 250 с.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. - Paris, 2003. - p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et. al.] // Vaccine. - December 2005. - V. 23. - P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. - V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease - URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_reports.htm (Дата обращения 11.11.2022).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. - V. 16. - Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина мiжвiд. тем. наук. Харкiв, 2013. - С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. - 2011. - Vol. 4(10). - P. 475-479.

15. Доронин М.И. Опосредованное определение титра вируса ящура в сырье для вакцины с применением метода изотермической амплификации вирусной РНК (NASBA) // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. - 2022. - № 2. - С. 29-37.

16. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. - 2019. - №3. - С.29-31.

17. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. - P. 2657-2667.

18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. - V. 20. - P. 1505-1514.

19. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Утв. 21.09.17.

20. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

21. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

22. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

24. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

Таблица 1

Результаты адаптации штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток ПСГК-30 в разных условиях

(n=5, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Состав поддерживающей среды Среда Игла DМЕМ+ 2% S_КРС 23-24 95-100 0,54±0,02 6,26±0,10 Среда RPMI-1640 + 2% S_КРС 23-24 95-100 0,55±0,02 6,29±0,10 Раствор Хэнкса с 5 % ГБК +
2% S_КРС 13-14 95-100 0,95±0,02 7,45±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 27-28 85-90 0,46±0,02 6,00±0,10 36,0±0,2 22-23 85-90 0,56±0,03 6,27±0,10 37,0±0,2 13-14 95-100 0,95±0,02 7,45±0,10 38,0±0,2 19-20 90-95 0,66±0,02 6,50±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 13-14 90-95 0,85±0,02 7,02±0,10 0,01-0,001 13-14 95-100 0,95±0,02 7,45±0,10 0,001-0,0001 25-26 85-90 0,55±0,02 6,25±0,10

Примечание: S_КРС - сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК - гидролизат белков крови,

DМЕМ - название среды Игла,

RPMI-1640 - название культуральной среды,

ЦПД - цитопатическое действие.

Таблица 2

Результаты репродукции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=5, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивирования Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности, lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация клеток перед заражением,
млн кл./см³ 2,5 11-12 95-100 1,02±0,02 7,78±0,10 3,0 12-13 95-100 1,15±0,02 8,35±0,10 3,5 12-13 95-100 1,23±0,02 8,50±0,10 4,0 13 95-100 1,29±0,02 8,61±0,10 Температура, ⁰С 35,0±0,2 19-20 85-90 0,75±0,02 6,85±0,10 36,0±0,2 16-18 90-95 1,06±0,02 7,81±0,10 37,0±0,2 12-13 95-100 1,23±0,02 8,50±0,10 38,0±0,2 14-15 95-100 1,06±0,02 7,81±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 13 95-100 1,14±0,02 8,34±0,10 0,01-0,001 12-13 95-100 1,23±0,02 8,50±0,10 0,001-0,0001 21-22 90-95 0,95±0,02 7,02±0,10

Таблица 3

Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма «SAT-2/XIV/2023»

(n=5, p<0,05)

Время отбора проб с момента инактивации, ч Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД₅₀/см³ 0 7,70±0,10 1 5,00±0,10 2 3,00±0,10 3 0 6 0 12 0

Таблица 4

Содержание компонентов штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензиях до и после очистки

(n=5, M±m, p<0,005)

До очистки Условия очистки После очистки концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ 146S компонент общий вирусный белок 146S компонент общий вирусный белок 9,63±0,10 1,20±0,03 1,64±0,03 ПГМГ,
0,024% 8,96±0,10 1,19±0,03 1,62±0,03 ПГМГ, 0,028% 8,38±0,10 1,17±0,03 1,61±0,03 ПГМГ,
0,032% 7,70±0,10 1,09±0,03 1,49±0,03

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где, А₂₈₀ - значение оптической плотности при длине волны 280 нм, А₂₆₀ - значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ - полигексаметиленгуанидин (флокулянт).

Таблица 5

Содержание компонентов антигена штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования

(n=5, M±m, p<0,01)

Концентрация компонентов до концентрирования, мкг/см³ Методы концентрирования (теоретически в 8 раз) Концентрация компонентов после концентрирования, мкг/см³ ОВБ 146S компонент ОВБ 146S компонент 1,61±0,03 1,17±0,03 ПЭГ-6000, 4 ч 9,98±0,03 7,25±0,03 ПЭГ-6000, 12 ч 11,43±0,03 8,31±0,03 Гидроокись алюминия, 12 ч 12,88±0,03 9,36±0,03

Примечание: ПЭГ - полиэтиленгликоль,

ОВБ - общий вирусный белок.

Таблица 6

Результаты исследования сывороток крови КРС на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после введения разработанной вакцины (предлагаемое изобретение)

Таблица 7

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура генотипа SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральной инактивированной сорбированной (предлагаемое изобретение) на крупном рогатом скоте

Наименование штамма для контрольного заражения Разведение вводимой вакцины № животных п/п Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты контрольного заражения ИмД₅₀/ПД₅₀ «SAT-2/
XIV/2023» без разведения 1 8,25 ─ 0,08/
24,25 2 8,25 ─ 3 8,50 ─ 4 8,25 ─ 5 8,25 ─ M±m 8,30±0,11 0/5 1/4 6 4,50 ─ 7 4,25 ─ 8 4,50 ─ 9 4,25 ─ 10 4,50 ─ M±m 4,40±0,14 0/5 1/16 11 3,00 ─ 12 3,25 ─ 13 2,75 + 14 3,25 ─ 15 3,25 ─ M±m 3,10±0,22 1/5 контроль 1 - + -//- контроль 2 - +

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура, РМН - реакция микронейтрализации.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMD-Vaccine-SAT-2

XIV 2023.xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.1.2"

productionDate="2023-12-11">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-11</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>560</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-11</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ &quot;Федеральный центр охраны

здоровья животных&quot; (ФГБУ &quot;ВНИИЗЖ&quot;)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI &quot;ARRIAH&quot;</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

SAT-2/XIV из штамма «SAT-2/XIV/2023» культуральная инактивированная

сорбированная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>645</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..645</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>accacttcggccggtgagggcgctgacgtcgtgaccattgaccccacca

cacaaggcgggtccgtgacaccggccaggcgcatccacaccgatgtggcattccttctggaccgcagcac

gcacgtccacaccaacaagaccaccttcaacatcgacctcatggacacaaaggagaaggcactggtaggg

gccatactgcgctcagccacgtactacttctgtgacctggagatcgcgtgtgttggtgaacacaagaggg

tgttttggcaaccgaatggggcgcccagaacaacaacgctgggtgacaaccccatggtgtactcgcacaa

cggagtcactagatttgccattccgtacacggcaccgcaccggttgctttccactgtatacaacggtgag

tgcgactacaagaaagcctctaccgccatccgcggtgacagggccgtccttgcggccaagtacgctaaca

ccaagcacactctcccaagcactttcaactttggtcatgtgacggctgacgcacccgtcgacgtgtacta

taggatgaaacgtgctgagttgtactgtccacgcgctcttcttcccgcgtacgaccacgtgggacgtgac

agatttgacgcgccaattggagtggagagacaactc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>215</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..215</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGADVVTIDPTTQGGSVTPARRIHTDVAFLLDRSTHVHTNKTTF

NIDLMDTKEKALVGAILRSATYYFCDLEIACVGEHKRVFWQPNGAPRTTTLGDNPMVYSHNGVTRFAIPY

TAPHRLLSTVYNGECDYKKASTAIRGDRAVLAAKYANTKHTLPSTFNFGHVTADAPVDVYYRMKRAELYC

PRALLPAYDHVGRDRFDAPIGVERQL</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество авирулентный и очищенный антигенный материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №489 - деп/23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 6,0 мкг; в качестве адъюванта содержит 10%-ный коллоидный раствор гидроокиси алюминия с содержанием 40% по объему, что составляет 4,0% в пересчете на сухое вещество, сапонин в количестве 2,0 мг и поддерживающую среду - до 1,0 см³. Изобретение обеспечивает расширение арсенала инактивированных культуральных сорбированных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура серотипа SAT-2 и, в частности, генотипа SAT-2/XIV. 2 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл., 14 пр.

1. Вакцина против ящура культуральная инактивированная сорбированная, содержащая активное вещество и адъювант, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества содержит авирулентный и очищенный антигенный материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: №489 - деп/23-39 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 6,0 мкг; в качестве адъюванта содержит 10%-ный коллоидный раствор гидроокиси алюминия с содержанием 40% по объему, что составляет 4,0% в пересчете на сухое вещество, сапонин в количестве 2,0 мг и поддерживающую среду - до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV, полученный в высокочувствительной биологической системе, адъювант гидроокись алюминия в комплексе с сапонином в эффективном соотношении: 60% и 40% по объему соответственно.

3. Вакцина по п. 2, отличающаяся тем, что она содержит авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-2/XIV/2023» вируса ящура генотипа SAT-2/XIV, полученный в перевиваемой суспензионной клеточной линии почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура серотипа SАT-2.