Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная Российский патент 2025 года по МПК A61K39/135 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной.

Ящур является наиболее контагиозным вирусным заболеванием животных, характеризующимся интоксикацией, везикулезно-эрозивным (пузырьково-язвенным) поражением слизистых оболочек ротовой и носовой полости, а также кожи межпальцевых складок и околоногтевого ложа, серьезными поражениями внутренних органов с летальным исходом для молодняка [1].

В настоящее время известны семь следующих серотипов вируса ящура: O, A, C, SAT-1, SAT-2, SAT-3 и Азия-1. Вирус ящура серотипов SAT-1, SAT-2 и SAT-3 был впервые идентифицирован в 1948 г. Всемирной референтной лабораторией по ящуру (WRLFMD; Пирбрайт, Великобритания) в образцах, полученных от скота из Бечуаналенда (Ботсвана) и Северной Родезии (Замбия). Ретроспективное исследование вирусов, выделенных ранее, в 1931 и 1937 гг., в Южной Родезии (Зимбабве), показало близкое родство изолятам, полученным в 1948 г. Еще один вирусный изолят из Южной Родезии 1934 г. оказался третьим новым серотипом. В дальнейшем открытые серотипы были названы South Africa Territories 1, 2 и 3 (сокращенно SAT-1, SAT-2 и SAT-3) [2, 3]. Представители серотипа SAT-1 вируса ящура являются разнообразными и распространенными на территории Африки и Ближнего Востока [4], что определяет высокую актуальность изготовления вакцин для защиты животных от ящура данного серотипа.

Глубокие исследования генетики вируса ящура позволили сделать заключение о том, что каждый из семи серотипов разделен на более чем 60 сильно отличающихся друг от друга генотипов. Различия между ними определяют при анализе нуклеотидной последовательности высоковариабельного 1D-гена, который кодирует аминокислотную последовательность поверхностного белка VP₁ с существенным количеством аминокислотных замен [5].

Восстановление после переболевании ящуром животных каким-либо одним генотипом не обеспечивает иммунную защиту против другого [6, 7, 8].

В качестве основного инструмента контроля ящура в эндемичных районах используется иммунизация животных. Исходя из этого, анализ каждого пула по ящуру на земном шаре и генотипов в нем может позволить подобрать наиболее специфичные вакцины, соответствующих топотипам, присутствующим в этом пуле, вместо того, чтобы продолжать полагаться на более широко доступные в настоящее время генетические вакцины, которые уступают цельновирионным по своей эффективности в разы.

Для вируса ящура серотипа SAT-1 характерна высокая генетическая изменчивость, а именно он включает в себя следующие 13 топотипов: I (NORTHWEST ZIMBABWE, NWZ), II (SOUTHEAST ZIMBABWE, SEZ), III (WESTERП ZIMBABWE, WZ), IV (EAST AFRICA1, EA-1), V, VI, VII (EAST AFRICA 2, EA-2), VIII (EAST AFRICA 3, EA-3), IX, X, XI, XII, XIII [5]. Такое высокое генетическое и антигенное разнообразие приводит к проблемам в специфической профилактике ящура при применении культуральных инактивированных противоящурных вакцин. В результате возникает необходимость создания средства специфической профилактики в отношении ящура серотипа SAT-1, а именно SAT-1/X.

С целью недопущения возникновения ящура в хозяйствах Российской Федерации применяется комплекс мероприятий по борьбе и профилактике ящура, который направлен на предупреждение заноса вируса в страну, систематическую вакцинацию животных в буферной зоне, проведение мониторинга иммунного статуса крупного, мелкого рогатого скота и свиней.

Для иммунизации животных должна применяться вакцина, изготовленная из вируса, гомологичного полевым изолятам, что подтверждено исследованиями многих ученых [8-18].

Данная инфекция продолжает оставаться экономически значимой проблемой. Цельновирионные вакцины на сегодняшний день в отношении ящура по-прежнему признаются наиболее эффективными, что крайне важно для борьбы с самым контагиозным заболеванием в мире [11, 15, 16].

Для проведения эффективной кампании по вакцинации нужно наличие эффективной и безопасной вакцины, содержащей в качестве иммуногенной составляющей антиген вируса, соответствующей эпизоотическому распространяющемуся изоляту определенного генотипа. Создание подобных вакцин по-прежнему является крайне актуальной задачей. Достижение данной цели позволит эффективно применять вакцину в неблагополучных регионах и угрожаемой зоне для формирования иммунитета против конкретного генотипа вируса ящура с целью обеспечения ветеринарного благополучия [14, 15, 16].

Вакцины содержат инактивированные цельные вирусные частицы (146S компонент), которые сами по себе обладают невысокой иммуногенной активностью, поэтому необходимо использование адъювантов, усиливающих иммунный ответ [17]. В настоящее время в мире применяются два адъювантных состава: гель гидроксида алюминия (квасцы) (Al(OH)₃) с сапонином (SAP) и масляные адъюванты [18].

Применение адъювантов на основе масла предпочтительнее квасцов, поскольку эмульсионные вакцины могут вызывать раннюю защиту и эффективный иммунный ответ у крупного рогатого скота (КРС) и свиней [8]. При этом особое внимание уделяют составу и качеству масляных адъювантов, использование которых позволит без появления аллергических реакций повысить эффективность вакцинных препаратов против ящура. В настоящее время в этом отношении перспективными являются масляные адъюванты торговой марки «Coralvac» (Турция).

На территории многих стран Северной, Западной, Восточной, Центральной и Южной Африки, Ближнего Востока вспышки ящура генотипа SAT-1/X имеют спорадический характер. Анализируя вспышки, которые регистрировались на территории Африки, обнаружено, что были выявлены изоляты разных топотипов серотипа SAT-1, в частности, II (SAT-1 RV 11 37), III (SAT-1 BOT 1 68), IV (SAT-1 UGA BUFF 21 70), V (SAT-1 NIG 11 75), VI (SAT-1 SUD 3 76), VII (SAT-1 UGA 13 74), VIII (SAT-1 UGA 1 97), IX (SAT-1 ETH 3 2007), X (SAT-1/X), XI (SAT-1 TCH 1/72), XII (SAT-1/ANG/9/74), XIII (SAT 1 MOZP132010 B16). В последние годы, начиная с 2015 г. стали широко распространяться изоляты вируса ящура серотипа SAT-1 топотипа X. В частности, официально вспышки ящура генотипа SAT-1/X фиксировались в Нигерии, Камеруне. При этом есть высока вероятность нерегистрируемых случаев в отношении вируса ящура данного генотипа.

Известны производственные штаммы вируса ящура типа SАT-1, которые применяются или применялись в мире для производства средств специфической профилактики ящура:

- штамм «SAT-1 T 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 BOT 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/X» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 B16» (генотип XIII).

Изолят «SAT-1/NIG/1/2015» вируса ящура был выделен от крупного рогатого скота на территории Федеративной Республики Нигерия в 2015 году и поступил в ФГБУ «ВНИИЗЖ» из Всемирной справочной лаборатории института Пирбрайта (the World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease, the Pirbright institute, Великобритания) для изучения и проведения научных исследований. Путем адаптации изолята «SAT-1/NIG/1/2015» к репродукции в первично-трипсинизированной монослойной клеточной линии почки свиньи СП, в перевиваемых культурах клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, IB-RS-2, ПСГК-30 был получен штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура.

По результатам сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей выделенный штамм принадлежит топотипу X серологическому типу SAT-1 вируса ящура, который значительно отличается от производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 (фиг. 1).

С увеличением торгово-экономических взаимоотношений между Россией и странами Африканского континента, может возникнуть проблема возможной экстренной профилактики данного заболевания для формирования иммунитета у восприимчивых животных в России. Таким образом, необходимо разработать вакцину против ящура генотипа SAT-1/X культуральную цельновирионную инактивированную эмульсионную для обеспечения биологической безопасности территории Российской Федерации, сопредельных государств и стран Африканского континента и Ближнего Востока.

Наиболее близкой предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является вакцина эмульсионная против ящура серотипа SAT-1 инактивированная (штамм «SAT-1 №96 Ахалкалакский/62») [19], содержащая активное вещество в виде авирулентного и очищенного культурального антигенного материала из гомологичного возбудителю ящура штамма «SAT-1 №96 Ахалкалакский/62», полученного в чувствительной биологической системе, и целевые добавки в виде масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG («Seppic», Франция): концентрация антигена (инактивированные 146S+75S компоненты вируса ящура) не менее 3,0 мкг/см³, содержание масляного адъюванта Montanide ISA-206 VG – 50% по массе, добавка в виде поддерживающей среды – до 1,0 см³ (прототип). В качестве чувствительной биологической системы для репродукции вируса ящура используют перевиваемую клеточную линию почки новорожденного сирийского хомячка ВНК-21/2-17, в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM без внесения сыворотки, с добавлением ферментативного гидролизата мышц сухого, гидролизата белков крови сухого. При изготовлении эмульсионной вакцины в качестве адъюванта служит масляный адъювант Montanide ISA-206 VG («Seppic», Франция).

Существенный недостаток вакцины-прототипа состоит в его низкой иммуногенной активности относительно появившихся штаммов/изолятов вируса ящура генотипа SAT-1/X. Кроме того, для повышения эффективности и стабильности эмульсионной вакцины требуется применять масляные адъюванты с улучшенной формулой. Такие адъюванты позволят получать простые эмульсии типа «вода в масле», которые значительно превосходят сложные эмульсии по стабильности во времени.

Для решения указанной проблемы было создано настоящее изобретение по разработке вакцины против ящура генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной. Данная вакцина предполагает высокое содержание 146S иммуногенного компонента в дозе препарата и применение масляного адъюванта «Coralvac RZ 506».

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала противоящурных инактивированных культуральных цельновирионных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура генотипа SAT-1/X.

Указанный технический результат достигнут созданием вакцины против ящура генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной, охарактеризованной следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.

Разработанная вакцина в 1,0 см³ препарата содержит следующие основные компоненты: 1) активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X) вируса ящура, репродуцированного в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, в количестве не менее 8,0 мкг; 2) масляный адъювант «Coralvac RZ 506» (Турция), обеспечивающий усиление иммунного ответа у животных с содержанием 60% по массе, 3) поддерживающая среда – до 1,0 см³.

Штамм вируса ящура «SAT-1/Нигерия/2015» депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №414 - деп / 22-48 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Штамм адаптирован к первично-трипсинизированным монослойным клеткам линии свиной почки (СП) и перевиваемым клеточным линиям из почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21/SUSP/ARRIAH), почки свиньи (IB-RS-2) и почки сибирского горного козерога (ПСГК-30).

Для изготовления вакцины в качестве чувствительной биологической системы предпочтительно используют перевиваемую суспензионную культуру клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH, а в качестве поддерживающей среды применяют среду Игла DMEM с двойным набором аминокислот без внесения сыворотки, но с добавлением гидролизата белков крови в количестве 5,0% от общего объема при рН среды 7,50-7,70. Инактивацию вируса проводят с использованием аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с концентрацией 0,025% от объема вируссодержащей суспензии. Инактивированный вирус очищают от балластных примесей с помощью полигексаметиленгуанидина (ПГМГ), который вносят в суспензию до концентрации 0,025% от общего объема.

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» (генотип SAT-1/X) вируса ящура представляет собой суспензию, содержащую инактивированный 146S иммуногенный компонент вируса ящура. Концентрацию компонента в продукте оценивают с помощью количественного варианта реакции связывания комплемента (РСК) [20, 21].

Для создания вакцины используют вирусный материал, содержащий в 1,0 см³ не менее 8,0 мкг инактивированных иммуногенных 146S частиц вируса ящура. Заявленную концентрацию иммуногенного компонента в вакцинном препарате обеспечивают благодаря концентрированию антигена с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall.

Вакцину против ящура генотипа SAT-1/X культуральную цельновирионную инактивированную эмульсионную получают путем смешивания очищенного антигена и масляного адъюванта «Coralvac RZ 506» в соотношении 40% и 60% по массе, соответственно. Полученная вакцина представляет собой стабильную простую обратную эмульсию белого или бледно-розового цвета, содержащую инактивированный 146S компонент вируса ящура генотипа SAT-1/X, который обеспечивают формирование специфического иммунитета.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:

1. Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная.

2. Активное вещество в виде авирулентного и очищенного антигенного материала из гомологичного возбудителю заболевания штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в эффективном количестве.

3. Целевые добавки.

Существенные отличительные признаки предлагаемой вакцины заключаются в том, что в качестве активного вещества она содержит авирулентный очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в эффективном количестве.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:

1. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в эффективном количестве.

2. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура, полученный предпочтительно в суспензионной перевиваемой культуре клеток BHK-21/SUSP/ARRIAH и представляющий собой суспензию, содержащую преимущественно 146S иммуногенный компонент вируса ящура в количестве не менее 8,0 мкг в 1,0 см³ готового вакцинного препарата.

3. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант «Coralvac RZ 506».

4. Вакцина содержит масляный адъювант «Coralvac RZ 506» в количестве 60% (по массе) в 1,0 см³ готового препарата.

5. Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура, полученного в перевиваемой суспензионной клеточной линии BHK-21/SUSP/ARRIAH, масляный адъювант «Coralvac RZ 506», добавка в готовом препарате в виде поддерживающей среды в следующих количествах:

Авирулентный и очищенный антиген штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа
SAT-1/X вируса ящура не менее 8,0 мкг/см³ Масляный адъювант «Coralvac RZ 506» 60% (по массе) Поддерживающая среда до 1,0 см³

Предлагаемая вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная обладает высокой иммуногенной активностью и обеспечивает надежную защиту против изолятов вируса ящура генотипа SAT-1/X.

Достижение технического результата от использования изобретения обеспечивается тем, что в состав предлагаемой вакцины против ящура генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной, обладающей высокой иммуногенной активностью, создающий эффективную защиту восприимчивых животных против ящура представленного генотипа, которые в последние годы вызывают вспышки в мире.

Сущность изобретения отражена на графическом изображении:

Фиг. 1 – Модель простой эмульсии «вода в масле».

Фиг. 2 – Дендрограмма, отражающая филогенетическое взаимоотношение штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура с эпизоотическими штаммами серологического типа SAT-1. Дендрограмма основана на сравнении полных нуклеотидных последовательностей гена VР₁.

Фиг. 3 – Кинетический график инактивации штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура.

Сущность изобретения пояснена следующими перечнями последовательностей:

SEQ ID NO:1 представляет последовательность нуклеотидов 1D-гена белка VР₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура генотипа SAT-1/X;

SEQ ID NO:2 представляет последовательность аминокислот белка VР₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура генотипа SAT-1/X.

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура серотипа SAT-1 относится к отряду Picornavirales, семейству Picornaviridae, роду Aphthovirus, виду Foot-and-Mouth Disease virus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя ящура: форма вириона иксаэдрическая, размер 24-25 нм. Вирион состоит из молекулы одноцепочечной положительно заряженной молекулы РНК, заключенной в белковую оболочку. 146S компонент состоит из молекулы РНК, заключенной в полипептидный комплекс, состоящий из 60 копий структурных белков VP₄, VP₂, VP₃, VP₁.

По антигенным свойствам штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура относится к серотипу SAT-1/X. Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой, не проявляет гемагглютинирующей активности. У переболевших животных в сыворотке крови образуются типоспецифические антитела, выявляемые в иммуноферментном анализе (ИФА) и реакции микронейтрализации (РМН).

Методом нуклеотидного секвенирования была определена первичная структура 1D-гена белка VP₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура. Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей показал, что штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура принадлежит к генотипу SAT-1/X (Фиг. 2).

Антигенное родство (r₁) штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура изучено в перекрестном исследовании штамма со специфическими сыворотками, полученными на следующие производственные штаммы вируса ящура:

- штамм «SAT-1 T 155 71» (генотип SAT-1/I),

- штамм «SAT-1 RV 11 37» (генотип SAT-1/II),

- штамм «SAT-1 BOT 1 68» (генотип SAT-1/III),

- штамм «SAT-1 UGA BUFF 21 70» (генотип SAT-1/IV),

- штамм «SAT-1 NIG 11 75» (генотип SAT-1/V),

- штамм «SAT-1 SUD 3 76» (генотип SAT-1/VI),

- штамм «SAT-1 UGA 13 74» (генотип VII),

- штамм «SAT-1 UGA 1 97» (генотип VIII),

- штамм «SAT-1 ETH 3 2007» (генотип IX),

- штамм «SAT-1/X» (генотип X),

- штамм «SAT-1 TCH 1/72» (генотип XI),

- штамм «SAT-1/ANG/9/74» (генотип XII),

- штамм «SAT 1 MOZP132010 B16» (генотип XIII) в РМН.

Титр референтных сывороток крови КРС, полученных путем иммунизации животных моновалентными вакцинами из производственных штаммов вируса ящура серотипа SAT-1, против 10² ТЦД₅₀ гомологичного и гетерологичного вируса определяли в РМН при перекрестном титровании, рассчитывая значения с использованием уравнения линейной регрессии, и выражали в lg. Значение r₁ определяли, как антилогарифм разности lg титров сыворотки против гетерологичного и гомологичного вируса [20, 21].

Значение r₁ в РМН интерпретировали следующим образом:

при ≥ 0,3 – исследуемый и производственный штаммы вируса ящура являются близкородственными;

при < 0,3 – исследуемый образец штамма вируса ящура отличается от производственного штамма.

Показатели антигенного родства при изучении штамма «SAT-1/Нигерия/2015» составили r₁ 0,01 – 0,28, что свидетельствует об отсутствии антигенного родства с производственными штаммами вируса ящура серотипа SAT-1.

Штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура является РНК-содержащим вирусом с молекулярной массой 7×10⁶ Д. Нуклеиновая кислота представлена одноцепочной линейной молекулой молекулярной массой 2,8×10⁶ Д. Вирион имеет белковую оболочку, состоящую только из четырех основных белков VP₁, VP₂, VP₃ и VP₄.

Основным антигенным белком является VP₁. В вирионе содержится 31,5% РНК и 68,5% белка. Вирусная РНК является положительно заряженной инфекционной и участвует в образовании белков-предшественников в инфицированных клетках. Предшественники, в свою очередь, расщепляются с образованием более стабильных структурных и неструктурных полипептидов вируса.

Исходя из полученных данных, можно утверждать, что штамм «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура по антигенному и иммунологическому спектрам является оригинальным вариантом вируса ящура генотипа SAT-1/X.

Для снижения эпизоотической опасности возникновения ящура, вызванного генотипом SAT-1/X, и предотвращения возникновения новых очагов болезни важна своевременная вакцинопрофилактика, что требует разработки безопасной и эффективной вакцины.

Получена безопасная и эффективная вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная, с использованием штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1. Генетическая характеристика штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура по данным ПЦР и нуклеотидного секвенирования.

Проводили анализ первичной структуры гена 1D (белок VP₁) штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура методом нуклеотидного секвенирования методом Сенгера и определении положения данного штамма на филогенетическом древе вируса ящура серотипа SAT-1. Метод основан на определении первичной структуры гена 1D (белок VP₁) испытуемого изолята/штамма с последующим анализом филогенетического родства с другими изолятами/штаммами вируса ящура серотипа SAT-1.

Было необходимо провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 1D, кодирующего белок VP₁ вируса ящура вакцинного штамма «SAT-1/Нигерия/2015» с другими изолятами и штаммами. Последовательность нуклеотидов гена белка VР₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура представлена SEQ ID NO:1. Последовательность аминокислот белка VР₁ штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура генотипа SAT-1/X отражена на SEQ ID NO:2.

Осуществлен филогенетический анализ для штамма «SAT-1/Нигерия/2015». Филогенетическое дерево выведено с использованием программы MEGA 6 и алгоритма Neighbor-Joining [22-25]. Процент повторяющихся ветвей, в которых связанные таксоны сгруппированы вместе в тесте начальной загрузки (количество повторов для анализа - 1000), показан рядом с ветвями [23, 24,]. Эволюционные расстояния были рассчитаны с использованием метода Maximum Composite Likelihood [24] и выражены в единицах количества замен оснований на сайт. Этот анализ включал 14 нуклеотидных последовательностей, в том числе последовательность 1D-гена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура. Все позиции, содержащие пробелы и отсутствующие данные, были удалены (вариант полного удаления). Эволюционный анализ проводился в MEGA 6 [25].

В результате проведенной работы по сравнению полных нуклеотидных последовательностей гена 1D (белок VP₁) штамма «SAT-1/Нигерия/2015» и других изолятов/штаммов вируса ящура серотипа SAT-1 определено положение исследуемого штамма на филогенетическом древе (Фиг. 2). Таким образом, исследуемый штамм «SAT-1/Нигерия/2015» относится к генотипу SAT-1/X, что подтверждают данные нуклеотидного и аминокислотного анализа.

Пример 2. Адаптация штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X к перевиваемой монослойной культуре клеток почки свиньи IB-RS-2.

Для заражения перевиваемой монослойной культуры клеток почки свиньи IB-RS-2 использовали 30%-ную афтозную суспензию вируса ящура, полученную из афт свиньи (2 пассаж). Посевная концентрация клеток составляла 0,20-0,25 млн кл./см³, доза заражения вирусом – 0,001 ТЦД₅₀/кл. По результатам исследования репродукция вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» проходила при специфическом разрушении монослоя на 90-100% за 20 ч. В течение 6 последовательных пассажей отмечали рост значений титра инфекционной активности вируса от 6,12±0,10 до 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Максимальное значение титра инфекционной активности вируса было достигнуто на этапе 6 пассажа (7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³). Концентрация 146S частиц с 1 по 6 пассажи изменялась с 0,36±0,02 до 1,02±0,02 мкг/см³. При этом наибольшее количество 146S компонента отмечали на этапе 6 пассажа (1,02±0,02 мкг/см³). Степень достоверности (R²) результатов исследования в количественном варианте ОТ-ПЦР-РВ колебалась от 99,49 до 100,00%. Таким образом, на протяжении 6-ти последовательных пассажей была успешно проведена адаптация штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура к перевиваемой монослойной клеточной линии IB-RS-2.

Пример 3. Условия монослойного культивирования вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X в промышленных масштабах.

В процессе промышленного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в перевиваемой монослойной культуре клеток IB-RS-2 осуществляли подбор оптимальных условий культивирования вируса по поддерживающей среде, температурному фактору и дозе заражения исследуемым вирусом клеток.

На первом этапе исследования оценивали влияние состава поддерживающей среды на репродукцию штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной культуре клеток IB-RS-2 в масштабах производства (на этапе с 5-го на 6-ой пассажи). Для сравнения применяли три среды с добавлением 2,0% фетальной сыворотки крови телят: 1) среда Игла DМЕМ; 2) среда RPMI-1640; 3) раствор Хэнкса. Посевная концентрация клеток составляла 0,20 млн кл./см³, доза заражения вирусом – 0,1000-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли при температурах 35±0,2 - 38±0,2°С до разрушения клеточного монослоя не менее 85%. Результаты репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура с поддерживающими средами разного состава отражены в таблице 1.

Из данных таблицы видно, что при репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной культуре клеток IB-RS-2 с применением поддерживающих сред разного состава, оптимальной является среда Игла DMEM c 2% сыворотки крови КРС, позволяющая за 18-19 ч достичь специфического разрушения клеточного монослоя на 95-100% с накоплением в полученной суспензии 146S компонента в количестве 1,02±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³. При использовании среды RPMI-1640 и раствора Хэнкса показатели репродукции вируса были ниже.

На следующем этапе изучения условий монослойного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в культуре клеток IB-RS-2 в условиях производства оценивали влияние на процесс репродукции вируса температурного фактора. Для этого культивирование вируса проводили в среде Игла DМЕМ с 2% сыворотки КРС при следующих температурах: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом ящура составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса осуществляли до разрушения клеточного монослоя на 85-100% в течение 18-30 ч (табл. 1). По итогам исследования выявили, что для полной репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной культуре клеток IB-RS-2 оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой за 18-19 ч развитие ЦПД достигало 95-100% с накоплением 146S частиц, равным 1,02±0,02 мкг/см³ и титром инфекционной активности вируса 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Оценивали влияние дозы заражения монослоя клеток линии IB-RS-2 штаммом «SAT-1/Нигерия/2015» при культивировании в масштабах производства. Для этого использовали разные дозы вируса: 0,10-0,01; 0,010-0,001; 0,0010-0,0001 ТЦД₅₀/кл. В качестве поддерживающей среды применяли среду Игла МЕМ с 2% сыворотки крови КРС. Репродукцию вируса проводили при температуре 37,0±0,2°С в течение 18-30 ч до специфического разрушения клеток на 85-100%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S компонента и титр инфекционной активности вируса ящура. Как следует из данных таблицы 1, наибольшее накопление 146S компонента вируса достигалось при дозе заражения 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл. и составило 1,02±0,02 мкг/см³ с титром инфекционной активности вируса 7,25±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение условий монослойного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в культуре клеток ПСГК-30 в промышленных масштабах. В результате исследования определены следующие оптимальные параметры репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в монослойной клеточной линии IB-RS-2: 1) поддерживающая среда – среда Игла DMEM с 2% сыворотки крови КРС; 2) температурный режим культивирования – 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом – 0,01-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 4. Условия суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в промышленных масштабах.

При промышленном культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в перевиваемой суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH проводили поиск оптимальных параметров для успешной репродукции возбудителя ящура, используя разные концентрации клеток, температурные условия и дозу заражения вирусом.

На первом этапе работы определяли влияние посевной концентрации клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии на репродукцию штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в промышленных масштабах. Для анализа подготовили суспензии со следующими концентрации клеток: 3,0; 3,5; 4,0, 4,5 млн кл./см³. Температура культивирования вируса составляла 37,0±0,2°С, доза заражения вирусом – 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса проводили до специфической гибели клеток на 95-100%, которая осуществлялась в течение 13-25 ч. Результаты суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензии с разными концентрациями клеток представлены в таблице 2.

Как следует из таблицы 2, при культивировании вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разными концентрациями клеток, определили, что накопление 146S компонента в суспензии с концентрацией клеток 3,0 млн кл./см³ составило 1,09±0,02 мкг/см³, с концентрацией 3,5 млн кл./см³ – 1,45±0,02 мкг/см³, с концентрацией 4,0 млн кл./см³ – 2,96±0,02 мкг/см³, и с концентрацией 4,5 млн кл./см³ – 3,02±0,02 мкг/см³. Как следует из полученных данных для репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура достаточной является концентрация клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH в суспензии, равная 4,0 млн кл./см³ (при концентрации 4,5 млн кл./см³ концентрация незначительно выше, но затраты на производство по количеству клеток выше, исходя из этого, экономически целесообразно использовать концентрацию клеток, равную 4,0 млн кл./см³). Значение титра инфекционной активности вируса при этом составило 10,03±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

На следующем этапе работы исследовали влияние температурного фактора на репродукцию штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензионной культуре клеток линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Для этого репродукцию вируса проводили при следующих температурных условиях: 35,0±0,2; 36,0±0,2; 37,0±0,2; 38,0±0,2°С. Доза заражения культуры клеток вирусом составляла 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. Культивирование вируса проводили до ЦПД, равного не менее 85% (приоритет отдавали полной специфической деструкции клеток), в течение 13-24 ч. По результатам анализа определили, что для полной репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оптимальной является температура среды 37,0±0,2°С, при которой в течение 13-14 ч наблюдается специфическая гибель клеток на 95-100% с высоким накоплением 146S компонента (2,96±0,02 мкг/см³) и титром инфекционной активности вируса 10,03±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

В ходе работы по изучению условий суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в промышленных масштабах с применением культуры клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH оценивали влияние дозы заражения клеток. Для этого клеточные суспензии заражали вирусом в разных дозах: 0,10-0,01; 0,01-0,001; 0,001-0,0001 ТЦД₅₀/кл. Репродукцию вируса осуществляли при температуре 37,0±0,2°С в течение 13-25 ч до цитопатического действия, равного не менее 90%. По итогам культивирования определяли концентрацию 146S частиц и титр инфекционной активности вируса ящура. Как видно из данных таблицы 2, наибольшее накопление 146S компонента отмечали при дозе заражения 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл. (2,96±0,02 мкг/см³) с титром инфекционной активности вируса, равным 10,03±0,10 lg ТЦД₅₀/см³.

Таким образом, проведено изучение трех параметров суспензионного культивирования штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH в промышленных масштабах. Выявлены оптимальные условия репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в суспензионной культуре клеток ВНК-21/SUSP/ARRIAH: 1) концентрация клеток перед заражением – 4,0 млн кл./см³; 2) температурный режим культивирования – 37,0±0,2°С; 3) доза заражения вирусом – 0,010-0,001 ТЦД₅₀/кл.

Пример 5. Инактивация суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X.

По окончании цикла репродукции вируса ящура, не прекращая процесс термостатирования (37,0±0,2⁰С), в вируссодержащую суспензию добавляли подкисленный раствор аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с рН, равным 8,2-8,5. Конечная концентрация АЭЭИ в вируссодержащей суспензии должна быть равной 0,025%. Инактивацию инфекционной активности вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X проводили в течение 12 часов при температуре 37,0±0,1°С с периодическим перемешиванием.

Для определения времени полной инактивации после добавления 1,2-АЭЭИ каждый час производили отбор проб. Полученные образцы проверяли на наличие инфекционной активности вируса ящура в первичной культуре клеток почки свиньи СП. Результаты представлены на фиг. 3 и в таблице 3, из данных которой видно, что полная инактивация вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015», репродуцированного в культиваторах, произошла через 6 часов после внесения 1,2-АЭЭИ.

Готовые вирусные инактивированные суспензии исследовали в РСК для оценки содержания в них компонентов вируса. Концентрация 146S компонента составила 2,96±0,02 мкг/см³.

Пример 6. Условия очистки суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X.

Суспензию вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X, полученную при репродукции в суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали очистке. Для получения очищенного антигена вируса ящура использовали полигексаметиленгуанидин (ПГМГ) с концентрациями 0,020, 0,025 и 0,030%. До и после процесса очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» в количественном варианте РСК определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов. Результаты анализа отражены в таблице 4, из которой следует, что в результате очистки антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» с помощью ПГМГ в концентрации 0,020% отмечали снижение концентрации балластного белка на 2%, иммуногенных компонентов – на 0,1%. При использовании ПГМГ в концентрации 0,025% наблюдали снижение количества балластного белка на 17%, 146S компонента – на 0,7%. Применяя ПГМГ в концентрации 0,030% содержание балластного белка уменьшалось на 22%, а иммуногенных компонентов – на 7,6%.

Таким образом, исследуя условия очистки антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015», пришли к выводу о том, что для получения очищенного продукта оптимально использовать ПГМГ с концентрацией 0,025%.

Пример 7. Условия концентрирования суспензии антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура генотипа SAT-1/X.

Культуральную инактивированною суспензию штамма «SAT-1/Нигерия/2015», полученную с применением суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH, подвергали концентрированию в 10 раз по объему. Для увеличения концентрации иммуногенных компонентов антигена вируса ящура использовали следующие приемы: 1) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 4 ч; 2) добавление полиэтиленгликоля (ПЭГ-6000) с концентрацией 50% к антигену в соотношении 1:4, с экспозицией 12 ч;
3) концентрирование с помощью установки тангенциальной фильтрации Centramate 500S Pall в течение 3 ч при рабочем давлении на фильтр 1,8-2,0 атм.

До и после процесса концентрирования суспензии антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» определяли концентрацию общего вирусного белка и иммуногенных компонентов в количественном варианте РСК. Результаты исследований представлены в таблице 5, из которой видно, что при концентрировании антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура с помощью ПЭГ-6000 в течение 4 ч отмечали увеличение содержания компонентов по сравнению с исходными значениями (до концентрирования) в 7,9 раз. Используя тот же полимер, но повышая время воздействия до 12 ч, увеличили концентрацию компонентов вируса в 8,7 раз. Применяя метод концентрирования с помощью тангенциальной фильтрации, удалось увеличить количество иммуногенных компонентов антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в суспензии в 9,9 раз. Таким образом, технология тангенциальной фильтрации позволила получить антиген штамма «SAT-1/X» с высокой концентрацией структурных вирусных белков.

Пример 8. Подбор адъюванта и соотношения антиген-адъювант.

При изготовлении данного вакцинного препарата использовали масляный адъювант «Coralvac RZ 506» в количестве 60% по массе.

Пример 9. Компоновка вакцины против ящура генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной.

Из полученного концентрата антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» изготовили вакцину против ящура генотипа SAT-1/X культуральную цельновирионную инактивированную эмульсионную с применением в качестве адъювантов масляного адъюванта «Coralvac RZ 506». Количество 146S иммуногенного компонента в 1,0 см³ антигена составило 29,11±0,02 мкг/см³ (табл. 5).

Пример 10. Иммунизация животных вакциной против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной инактивированной цельновирионной эмульсионной.

Из полученной вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) был приготовлен ряд разведений для свиней с 5-ти кратным шагом. 15 голов свиней разделили на 3 группы по 5 голов в каждой. Иммунизирующая доза составляла 2,0 см³. Первую группу животных (№№ 1-5) иммунизировали вакциной без разведения, вторую группу свиней (№№ 6-10) привили вакциной, разведенной 1/5, третья группа животных (№№ 11-15) – вакциной, разведенной 1/25. Препарат вводили внутримышечно в среднюю треть шеи. В качестве контроля вируса оставили 2 головы без вакцинации.

Пример 11. Исследование сывороток крови вакцинированных животных на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура.

Сыворотки крови от свиней, полученные до иммунизации и через 14 суток после иммунизации, исследовали на наличие антител к неструктурным белкам вируса ящура с помощью блокирующего варианта иммуноферментного анализа (ИФА) в соответствии с рекомендациями OIE (МЭБ) [3]. Тестирование полученных сывороток проводили с использованием тест-системы для ИФА «Prio CHECK^®FMDV NSP ELISA for in vitro detection of antibodies against Foot and Mouth Disease Virus in serum of cattle, sheep and pigs» (Prionics Lelystad B.V., Нидерланды). Полученные результаты исследований отражены в таблице 6, из которой видно, что сыворотки крови животных не содержали антител к неструктурным белкам вируса ящура (значения PI для сывороток крови свиней < 50%).

Пример 12. Оценка авирулентности и безвредности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).

Для определения авирулентности вакцины для свиней отобранную пробу вакцинного препарата вводили внутрикожно по 0,1 см³. В исследовании использовали свиней массой 30-40 кг. В течение 10 суток наблюдения животные остались клинически здоровыми, и при патологоанатомическом исследовании не было обнаружено изменений, характерных для ящура. Это свидетельствовало об отсутствии вирулентных свойств разработанной вакцины.

Контроль безвредности продукта на животных проводили путём внутримышечного введения вакцины в дозе 6,0 см³ (тройная доза по 2,0 см³). Срок наблюдения также составлял 10 суток. Следует отметить, что после иммунизации температура тела животного может повышаться до 40,8°С и удерживаться на этом уровне в течение 1-2 суток, что не выходит за рамки нормы после введения вакцинного препарата.

По результатам исследований вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) была признана безвредной, все животные в период наблюдения оставались клинически здоровыми, при патологоанатомическом анализе некроза тканей на месте введения вакцины не обнаружено.

Пример 13. Изучение иммуногенных свойств вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение).

На 21 сутки после введения вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) у свиней отбирали кровь и проводили исследование полученных сывороток крови в реакции микронейтрализации [3]. Выявлено, что у свиней, иммунизированных вакциной в цельной дозе (5 голов), средние значения титра антител составили 8,57±0,06 log₂ SN₅₀, с разведением 1/5 (5 голов) – 3,97±0,12 log₂ SN₅₀, с разведением 1/25 (5 голов) – 3,06±0,23 log₂ SN₅₀ (табл. 7). Полученные данные реакции микронейтрализации свидетельствуют о том, что после введения вакцины в цельном виде обеспечивается формирование гуморального иммунитета с защитными титрами штаммоспецифических антител (5,5 и более log₂ SN₅₀), что соответствует требованиям международных стандартов [3].

Пример 14. Изучение защитной способности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) на естественно восприимчивых видах животных.

Свиньи, иммунизированные в количестве 15 голов, вакциной в цельном виде и в разведениях, заражали контрольным штаммом «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура, адаптированного к этим животным в дозе 10^4,0 ИД₅₀/0,20 см³ (в две точки по 0,10±0,05 см³). Спустя 7 суток после заражения всех животных подвергли эвтаназии и провели патологоанатомический осмотр. Защищенными от ящура считали животных, у которых на конечностях отсутствовали поражения. Первичные афты не учитывали.

Результаты контрольного заражения представлены в таблице 7, из которой следует, что вакцина против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральная инактивированная эмульсионная (предлагаемое изобретение) в цельном виде, а также в разведениях 1/5 и 1/25, введенная в однократной дозе (2,0 см³) защищает свиней от заражения гомологичным штаммом всех животных (5 из 5 голов).

По результатам контрольного заражения было установлено, что в прививном объеме данной вакцины содержится 40,52 ПД₅₀ и 0,05 ИмД₅₀ для свиней.

Пример 15. Исследование стабильности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) при разных температурных условиях.

После приготовления вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной (предлагаемое изобретение) проводили исследование ее стабильности при разных температурных условиях. Вакцину разливали по пробиркам и хранили при температурах плюс 4 и 20°С. За состоянием эмульсий наблюдали, отмечая появляющиеся изменения, в течение 24 месяцев. В течение этого времени хранения могут появляться следующие возможные фракции эмульсии: А - масло, B – опалесцирующий слой (масло с белым оттенком), C – собственно эмульсия, D – коалесцент (плотная эмульсия), E – антигенная составляющая вакцины (водная фракция).

По результатам исследования в течение 24 месяцев при температуре 4°С вакцина сохраняла стабильность – фракция С (собственно эмульсия) без отделения антигена и масла составила 100%. При хранении при температуре 20°С спустя 15 месяцев изменений не наблюдалось, начиная с 16-ного месяца хранения отмечали появление 5% фракции А (масло) с сохранением на 95% собственно эмульсии. Антигенная фаза не выделялась, в том числе по итогам наблюдения в течение 24 месяцев. Таким образом, вакцина в течение 24 месяцев стабильна при температуре 4°С и даже при 20°С в течение 15 месяцев, что свидетельствует о высоком качестве вакцинного продукта.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о том, что вакцина против ящура генотипа SAT-1/X из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена как резервная для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против эпизоотического штамма вируса ящура генотипа SAT-1/X. Кроме того, вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта «Coralvac RZ 506» для получения стабильной простой эмульсии типа «вода в масле».

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная»:

1. Jamal S.M., Belsham G.J. Foot-and-mouth disease: past, present and future. Vet. Res. 2013; 44 (1):116. DOI: 10.1186/1297-9716-44-116.

2. Guerrini L., Pfukenyi D.M., Etter E., Bouyer J., Njagu C., Ndhlovu F., et al. Spatial and seasonal patterns of FMD primary outbreaks in cattle in Zimbabwe between 1931 and 2016. Vet. Res. 2019; 50 (1):73. DOI: 10.1186/ s13567-019-0690-7.

3. Dhikusooka M.T., TjørnehøjK., Ayebazibwe C., Namatovu A., Ruhweza S., Siegismund H.R., et al. Foot-and-mouth disease virus serotype SAT 3 in long-horned Ankole calf, Uganda. Emerg. Infect. Dis. 2015; 21 (1): 111–114. DOI: 10.3201/eid2101.140995.

4. Duchatel F., Bronsvoort B.M. de C, Lycett S. Phylogeographic analysis and identification of factors impacting the diffusion of foot-andmouth disease virus in Africa. Front. Ecol. Evol. 2019; 7:371. DOI: 10.3389/ fevo.2019.00371.

5. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals - 24th Ed. - Paris, 2022 – Vol. 1, Chapter 2.1.5. – P. 166-169.

6. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. – V. 25. - P. 345-364.

7. Brown F. A brief history of FMD and its casual agent. FMD: Control Strateies: Proc. Jnt. Symp. 2-5. June 2002, Lyons, France. – Paris, 2003. – p. 13-21.

8. Vaccination against foot-and-mouth disease virus confers complete clinical protection in 7 days and partial protection in 4 days: Use in emergency outbreak response / T.G. William, J. M. Pachecoa, Т. Doel [et.al.] // Vaccine. - December 2005. – V. 23. – P. 5775-5782.

9. Aspects of emergency vaccination against foot-and-mouth disease / P. Barnett, J.M/ Garland, R.P. Kitching [et.al.] // Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Diseases. - October 2002. – V. 25. - P. 345-364.

10. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. - February 2002. – V. 20. – P. 1505-1514.

11. Официальный сайт The FAO World Reference Laboratory for Foot-and-Mouth Disease – URL: http://www.wrlfmd.org/ref_labs/fmd_ref_lab_
reports.htm (Дата обращения 11.10.2023).

12. Salt I.S. Emergency vaccination of pigs against foot-and-mouth disease: protection against disease and reduction in contact transmission / Vaccine. - April 1998. – V. 16. – Р. 746-754.

13. Рахманов А.М. Современная эпизоотическая ситуация в мире по ящуру и меры ее контроля //Ветеринарная медицина, 2013. – С. 37-38.

14. Longjam N., Tayo T. Antigenic variation of Foot and Mouth Disease Virus // Vet. World. – 2011. – Vol. 4(10). – P. 475-479.

15. Мельник Р.Н., Хаустова Н.В., Мельник Н.В., Самуйленко А.Я., Гринь С.А., Святенко М.С., Литенкова И.Ю. Антигенная вариабельность вируса ящура серотипа А и обоснование необходимости получения новых актуальных производственных штаммов/ Ветеринария и кормление. – 2019. – №3. – С.29-31.

16. Paton D.J., Sumption K.J., Charleston B. Options for control of foot-and-mouth disease: knowledge, capability and policy/ Phil. Trans. R. Soc. B (2009) 364. – P. 2657–2667.

17. Mouton L, Dekker A, Bleijenberg M, Blanchet M, Coco-Martin J, Hudelet P, Goutebroze S. A foot-and-mouth disease SAT2 vaccine protects swine against experimental challenge with a homologous virus strain, irrespective of mild pathogenicity in this species. Vaccine. 2018 Apr 5;36(15):2020-2024.

18. Barnett P.V. A review of emergency foot-and-mouth disease (FMD) vaccines / Vaccine. – February 2002. – V. 20. – P. 1505-1514.

19. Maree FF, Kasanga CJ, Scott KA, Opperman PA, Melanie C, Sangula AK, Raphael S, Yona S, Wambura PN, King DP, Paton DJ, Rweyemamu MM. Challenges and prospects for the control of foot-and-mouth disease: an African perspective. Vet Med (Auckl). 2014 Oct 3;5:119-138. doi: 10.2147/VMRR.S62607. PMID: 32670853; PMCID: PMC7337166.

20. Методические рекомендации по определению концентрации 146S, 75S, 12S компонентов вакцинных штаммов культурального вируса ящура в реакции связывания комплемента (РСК) / ФГБУ «ВНИИЗЖ». – Утв. 21.09.17.

21. Методические указания по определению антигенного соответствия между эпизоотическими изолятами и производственными штаммами вируса ящура в перекрестной реакции микронейтрализации: утв. Россельхознадзором 13.09.2017 / ФГБУ «ВНИИЗЖ». - Владимир: 2017. - 24 с.

22. Saitou N. and Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Molecular Biology and Evolution 4:406-42.

23. Felsenstein J. (1985). Confidence limits on phylogenies: An approach using the bootstrap. Evolution 39:783-791.

24. Tamura K., Nei M., and Kumar S. (2004). Prospects for inferring very large phylogenies by using the neighbor-joining method. Proceedings of the National Academy of Sciences (USA) 101:11030-11035.

25. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., and Tamura K. (2018). MEGA 6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across computing platforms. Molecular Biology and Evolution 35:1547-1549.

Таблица 1

Результаты адаптации штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура при культивировании в перевиваемой монослойной культуре клеток
IB-RS-2 в разных условиях

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивиро-
вания Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным
ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности,
lg ТЦД₅₀/см³ Состав поддерживающей среды Среда Игла DМЕМ+ 2% S_КРС 18-19 95-100 1,02±0,02 7,25±0,10 Среда RPMI-1640 + 2% S_КРС 23-24 95-100 0,66±0,02 6,40±0,10 Раствор Хэнкса с 5 % ГБК +
2% S_КРС 21-22 95-100 0,72±0,02 6,51±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 29-30 85-90 0,32±0,02 5,15±0,10 36,0±0,2 23-24 85-90 0,44±0,03 6,01±0,10 37,0±0,2 18-19 95-100 1,02±0,02 7,25±0,10 38,0±0,2 22-23 90-95 0,70±0,02 6,47±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 21-22 90-95 0,70±0,02 6,44±0,10 0,01-0,001 18-19 95-100 1,02±0,02 7,25±0,10 0,001-0,0001 28-30 85-90 0,30±0,02 5,11±0,10

Примечание: S_КРС – сыворотка крови крупного рогатого скота,

ГБК – гидролизат белков крови,

DМЕМ – название среды Игла,

RPMI-1640 – название культуральной среды,

ЦПД – цитопатическое действие.

Таблица 2

Результаты репродукции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» вируса ящура в перевиваемой суспензионной клеточной линии ВНК-21/SUSP/ARRIAH с разной концентрацией клеток

(n=3, M±m, p<0,01)

Параметр Условия культивиро-
вания Время репродукции, ч ЦПД, % Концентрация 146S частиц по данным
ОТ-ПЦР-РВ, мкг/см³ Титр инфекционной активности,
lg ТЦД₅₀/см³ Концентрация клеток перед заражением,
млн кл./см³ 3,0 13-14 95-100 1,09±0,02 7,85±0,10 3,5 13-14 95-100 1,45±0,02 8,87±0,10 4,0 13-14 95-100 2,96±0,02 10,03±0,10 4,5 14-15 95-100 3,02±0,02 10,12±0,10 Температура, °С 35,0±0,2 23-24 85-90 0,73±0,02 6,84±0,10 36,0±0,2 20-21 90-95 1,12±0,02 7,88±0,10 37,0±0,2 13-14 95-100 2,96±0,02 10,03±0,10 38,0±0,2 15-16 95-100 1,52±0,02 8,95±0,10 Доза заражения 0,1-0,01 13-14 95-100 1,45±0,02 8,88±0,10 0,01-0,001 13-14 95-100 2,96±0,02 10,03±0,10 0,001-0,0001 24-25 90-95 1,10±0,02 7,86±0,10

Примечание: ОТ-ПЦР-РВ – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция,

ТЦД – тканевая цитопатическая доза,

ЦПД – цитопатическое действие вируса ящура.

Таблица 3

Исследование кинетики инактивации суспензии вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X

(n=3, M±m, p<0,05)

Время отбора проб с момента инактивации, ч Титр инфекционной активности вируса ящура, lg ТЦД₅₀/см³ 0 10,03±0,10 1 8,50±0,10 2 6,60±0,10 3 4,92±0,10 4 3,52±0,10 5 1,63±0,10 6 0 (полная инактивация) 12 -10

Таблица 4

Содержание компонентов штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в суспензиях до и после очистки

(n=3, M±m, p<0,005)

До очистки Условия очистки После очистки концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ концентрация балластного белка, мг/см³ концентрация иммуногенных компонентов, мкг/см³ 146S компонент общий вирусный белок 146S компонент общий вирусный белок 7,56±0,05 2,96±0,02 4,42±0,02 ПГМГ,
0,020% 7,74±0,05 2,95±0,02 4,41±0,02 ПГМГ, 0,025% 6,27±0,05 2,94±0,02 4,39±0,02 ПГМГ,
0,030% 5,90±0,05 2,74±0,02 4,08±0,02

Примечание: концентрацию балластного белка определяли по формуле Калькара:

С_{балластного белка}=1,45 × А₂₈₀-0,74 × А₂₆₀,

где А₂₈₀ – значение оптической плотности при длине волны 280 нм,

А₂₆₀ – значение оптической плотности при длине волны 260 нм,

ПГМГ – полигексаметиленгуанидин (флокулянт).

Таблица 5

Содержание компонентов антигена штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в суспензиях до и после концентрирования

(n=3, M±m, p<0,01)

Концентрация компонентов до концентрирования, мкг/см³ Методы концентрирования
(в 10 раз) Концентрация компонентов после концентрирования, мкг/см³ ОВБ 146S компонент ОВБ 146S компонент 4,39±0,02 2,94±0,02 ПЭГ-6000,
4 ч 34,68±0,02 23,22±0,02 ПЭГ-6000,
12 ч 38,19±0,02 25,58±0,02 Тангенциальная фильтрация,
4 ч 43,46±0,02 29,11±0,02

Примечание: ПЭГ – полиэтиленгликоль,

ОВБ – общий вирусный белок.

Таблица 6

Результаты исследования сывороток крови свиней на антитела к неструктурным белкам вируса ящура до и после вакцинации препаратом (предлагаемое изобретение), изготовленным с применением антигена вируса ящура штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X

№ жив-о п/п Значение оптической плотности пробы Процент ингибиции (PI), % тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации тип образца референс-значения до вакцинации на 14 сутки после вакцинации СПК 0,450 -//- СПК 54,96 -//- ПК 0,052 ПК 94,80 ОК 0,999 ОК 0,000 1 -//- 0,955 0,912 -//- 4,40 8,71 2 0,957 0,916 4,20 8,31

Примечание: СПК – слабоположительный контроль,

ПК – положительный контроль,

ОК – отрицательный контроль, сыворотка отрицательная при PI, меньшим 50%.

Таблица 7

Исследование гуморального иммунитета и иммуногенной активности вакцины против ящура из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной на свиньях (предлагаемое изобретение)

(n=5, p<0,01, M±m)

Наименование штамма для контрольного заражения Разведение вводимой вакцины № животных п/п Титр антител в РМН, log₂ SN₅₀ Результаты контрольного заражения ИмД₅₀/ПД₅₀ SAT-1/
Нигерия/2015 без разведения 1 8,56 ─ 0,05/
40,52 2 8,62 ─ 3 8,46 ─ 4 8,60 ─ 5 8,60 ─ M±m 8,57±0,06 0/5 1/5 6 4,12 ─ 7 3,98 ─ 8 3,78 ─ 9 4,02 ─ 10 3,95 ─ M±m 3,97±0,12 0/5 1/25 11 3,26 ─ 12 3,02 ─ 13 3,10 ─ 14 2,68 + 15 3,22 ─ M±m 3,06±0,23 1/5 контроль 1 ─ + контроль 2 ─ +

Примечание: «-» отсутствие генерализации процесса ящура,

РМН – реакция микронейтрализации,

ИмД₅₀ – иммуногенная доза,

ПД₅₀ – протективная доза.

--->

<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing

1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">

<ST26SequenceListing dtdVersion="V1_3" fileName="FMD SAT-1 X

vaccine emuls.xml" softwareName="WIPO Sequence"

softwareVersion="2.1.2" productionDate="2023-12-27">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-27</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<ApplicantFileReference>563</ApplicantFileReference>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>0</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2023-12-27</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФГБУ «Федеральный центр охраны

здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»)</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FGBI «ARRIAH»</ApplicantNameLatin>

<InventorName languageCode="ru">Доронин Максим

Игоревич</InventorName>

<InventorNameLatin>Doronin Maksim Igorevich </InventorNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Вакцина против ящура генотипа

SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная

эмульсионная</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>2</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>663</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..663</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q1">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>acaacgtcagcgggcgaaggtgcagaagtggtcacggtcgatgtttcgg

cccacggcggaaatgcccgcccgacacggcgtcagcacactgatgtcgcgttccttctggaccgtttcac

aaaaattggtaagacgacagacaacaagctggtccttgaccttctcaagactaaagagaaggcactggtg

ggcgcactcctccgctcagctacctactacttctgcgacctcgaggttgcggcagtgggtacgaacaagt

gggtcggatgggtgccaaacgggtccccggtcgtgaacgaagtggacgacaacccagtcgtcttctcaca

caacggggtcacccgctttgccttaccgtacaccgcaccacaccaagtgttggccacagtgtacaaaggg

agctgcaagtacaagcccaccacggaggcacaacccgccgccatccgcggcgatttcgccacgctggccg

cccgcctgtcctctgagacgcacattcccacatccttcaatttcggtatgatacttaccgagagcgaagt

tgacgtgtacgtgcgcatgaagcgggccgagttgtactgccctcggcccctactcacaacctacgcccac

accggcgataggtacaaggtgaaactggtggcgccagaaaaacagatggcaaac</INSDSeq_sequen

ce>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>221</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>AA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..221</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>protein</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier id="q2">

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>FMDV</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>TTSAGEGAEVVTVDVSAHGGNARPTRRQHTDVAFLLDRFTKIGKTTDNK

LVLDLLKTKEKALVGALLRSATYYFCDLEVAAVGTNKWVGWVPNGSPVVNEVDDNPVVFSHNGVTRFALP

YTAPHQVLATVYKGSCKYKPTTEAQPAAIRGDFATLAARLSSETHIPTSFNFGMILTESEVDVYVRMKRA

ELYCPRPLLTTYAHTGDRYKVKLVAPEKQMAN</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины против ящура генотипа SAT-1/X культуральной цельновирионной инактивированной эмульсионной. Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная, воплощающая предлагаемое изобретение, предназначена для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной вирусологии и биотехнологии; подтверждена возможность осуществления представленного; вакцина, изготовленная из штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X вируса ящура в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой иммуногенной активностью и способна обеспечить эффективную защиту восприимчивых животных против вируса ящура генотипа SAT-1/X. Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная изготовлена с применением масляного адъюванта «Coralvac RZ 506». Изобретение расширяет арсенал противоящурных инактивированных культуральных цельновирионных эмульсионных вакцин для защиты животных против изолятов и штаммов вируса ящура генотипа SAT-1/X. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 7 табл., 15 пр.

1. Вакцина против ящура генотипа SAT-1/X культуральная цельновирионная инактивированная эмульсионная, содержащая активное вещество и адъювант в соотношении по массе 40% и 60% соответственно, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного вещества авирулентный и очищенный антигенный материал из гомологичного возбудителю инфекции штамма «SAT-1/Нигерия/2015» генотипа SAT-1/X, вируса ящура Aphtae epizooticae, депонированного во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вирусов ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ», под регистрационным номером: №414 - деп / 22-48 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ», в количестве не менее 8,0 мкг; в качестве масляного адъюванта - «Coralvac RZ 506» и поддерживающей среды - до 1,0 см³.

2. Вакцина по п. 1, где в качестве иммуногенного компонента вируса ящура генотипа SAT-1/X используют 146S.